DD235115A1 - METHOD FOR QUANTITATIVE TRACE DETECTION OF HYDROGEN PEROXIDE - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum quantitativen Spurennachweis von Wasserstoffperoxid durch oxydative Bildung von photometrisch auswertbaren Farbstoffen aus Farbstoffvorstufen (Leukofarbstoffe). Ziel der Erfindung ist die einfache quantitative Bestimmung von H2O2-Spuren ohne grossen apparativen Aufwand. Aufgabe der Erfindung ist es, die oxydative Bildung des Farbstoffes so zu verstaerken, dass eine photometrisch auswertbare Faerbung entsteht. Die Loesung der Aufgabe erfolgt durch Verwendung eines Leukotriphenylfarbstoffes, der nach Bildung des Farbstoffes durch die anwesenden H2O2-Spuren in Gegenwart von Polyhalogenkohlenwasserstoff mit Licht der Absorptionswellenlaenge des entsprechenden Farbstoffes bestrahlt wird. Dabei tritt ein Verstaerkungseffekt der Faerbung auf, die dadurch photometrisch auswertbar wird. Die Erfindung wird in der medizinischen Diagnostik, beispielsweise bei der Glukosebestimmung sowie bei der biotechnologischen Prozesskontrolle angewendet.The invention relates to a method for quantitative trace detection of hydrogen peroxide by oxidative formation of photometrically evaluable dyes from dye precursors (leuco dyes). The aim of the invention is the simple quantitative determination of H2O2 traces without great expenditure on equipment. The object of the invention is to reinforce the oxidative formation of the dye in such a way that a photometrically evaluable dyeing results. The object is achieved by using a Leukotriphenylfarbstoffes which is irradiated after formation of the dye by the presence of H2O2 traces in the presence of polyhalocarbon with light of the absorption wavelength of the corresponding dye. In this case, an amplification effect of the dyeing occurs, which can be evaluated photometrically. The invention is used in medical diagnostics, for example in the determination of glucose and in biotechnological process control.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum quantitativen Spurennachweis von Wasserstoffperoxid. Sie wird in der medizinischen Diagnostik, beispielsweise bei der Glukosebestimmung sowie bei der biotechnologischen Prozeßkontrolle angewendet.The invention relates to a method for quantitative trace detection of hydrogen peroxide. It is used in medical diagnostics, for example in the determination of glucose and in biotechnological process control.
Wasserstoffperoxid besitzt als Träger der analytischen Information Bedeutung beim Nachweis von Substraten bzw. bei der Bestimmung der Aktivität spezifischer Oxidasen, beispielsweise bei der Glukosebestimmung mittels Glukoseoxidase in physiologischen Flüssigkeiten wie Blut und Urin sowie bei der biotechnologischen Prozeßkontrolle. Auch bei der Nutzung spezifischer Oxidasen, beispielsweise Glukoseoxidase als Markerenzym für immunologische Tests („Enzym-Immuno-Assays") tritt Wasserstoffperoxid als Informationsträger auf. Die Anwendung von Farbstoffvorstufen („Chromogenen"), beispielsweise von Leukofarbstoffen, die durch Wasserstoffperoxid, meistens unter Katalyse von Peroxidase, mehr oder weniger quantitativ in Farbstoffe umgewandelt werden, ist seit langem bekannt. Dabei muß die gesamte, für die photometrische Auswertung erforderliche Farbstoffmenge durch Oxidation mittels Wasserstoffperoxid gebildet werden, was die Empfindlichkeit der Systeme limitiert, entweder wegen der geringen Konzentration des Primäranalyts oder der begrenzten Funktionsstabilität bzw. der geringen Konzentration der Markerenzyme, beispielsweise Glukoseoxidase oder Peroxidase, oder der niedrigen spezifischen Absorption des gebildeten Farbstoffs.Hydrogen peroxide has as a carrier of the analytical information importance in the detection of substrates or in the determination of the activity of specific oxidases, for example in the glucose determination by glucose oxidase in physiological fluids such as blood and urine and in biotechnological process control. Hydrogen peroxide also acts as an information carrier in the use of specific oxidases, for example glucose oxidase as a marker enzyme for immunological tests ("enzyme immunoassays") The application of dye precursors ("chromogens"), for example of leuco dyes, by hydrogen peroxide, usually under catalysis of peroxidase, more or less quantitatively converted to dyes has long been known. The total amount of dye required for the photometric evaluation must be formed by oxidation by means of hydrogen peroxide, which limits the sensitivity of the systems, either because of the low concentration of the primary analyte or the limited functional stability or the low concentration of the marker enzymes, for example glucose oxidase or peroxidase, or the low specific absorption of the dye formed.
Ziel der Erfindung ist es H2O2-Spuren, wie sei bei Ausführung der genannten Tests mit geringsten Analvtkonzentrationen auftreten, ohne großen apparativen Aufwand quantitativ zu bestimmen.The aim of the invention is H 2 O 2 traces, as may occur in the execution of the above tests with lowest Analvtkonzentrationen, to determine quantitatively without much equipment.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, beim quantitativen H2O2-Nachweis die Konzentration der üblicherweise durch das H2O2 oxidativ aus Farbstoffvorstufen („Chromogenen") gebildeten Farbstoffe im Falle des Vorliegens von Spuren an H2O2 proportional zur H2O2-Menge so zu verstärken, daß eine photometrisch auswertbare Menge an Farbstoff entsteht. Die Lösung der Aufgabe erfolgt nach einem Verfahren zum quantitativen Nachweis von H2O2, das dadurch gekennzeichnet ist, daß als Chromogene Leukotriphenylmethanfarbstoffe verwendet werden, die in wäßrigen Lösungen in Gegenwart von Peroxidase(n) stöchiometrisch in die entsprechenden Farbstoffe umgewandelt werden. Diese Farbstoffe werden mit in Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, vorzugsweise Ketonen wie Cyclohexanon, extrahiert, und aliquote Teile des Extrakts werden unter Lichtausschluß in einer 0,01 bis 0.5 molare Lösung des Leukotriphenylmethanfarbstoffs, die im molaren Verhältnis von 1:10 bis 10:1, vorzugsweise von 1:1 zum Leukotriphenylmethanfarbstoff ein bromhaltiger Polyhalogenkohlenwasserstoff, vorzugsweise Tetrabrommethan, enthält, in einem Keton, vorzugsweise Aceton, gegeben. Durch Bestrahlen mit Licht der Absorptionswellorvänge des Triphenylmethanfarbstoffs wird proportional zur Initialmenge des Ti'iphenylmethanfarbstoi rs Leukofarbstoff in den Farbstoff umgewandelt, wodurch ein Verstärkereffekt eintritt, der um so größer ist, je größer die Bestrahlungsdauer und -intensität sind, weshalb erfindungsgemäß Bestrahlungsdauer und -intensität so gewählt werden, daß nach 10 bis ca. 30 Minuten je nach Konzentration des initialen Analyte Extinktionen zwischen 0.1 und 1.5 erhalten werden. Durch Kontrollmessungen ist eine Überprüfung der erforderlichen Extinktion ohne weiteres möglich. Die Berechnung des H2O2-Gehaltes bzw. des Gehalts an H2O2-generierendem Analyt im Probegut erfolgt durch Vergleich des zeitlichen Verlaufs einer gleichbehandelten Probe bekannten Gehalts an H2O2 bzw. Primäranalyt, wobei vorteilhafterweise zwei Messungen im zeitlichen Abstand von ca. 10 Minuten vorgenommen werden. Diese Verfahrensweise hat darüber hinaus den Vorteil, daß das Ergebnis nicht durch geringe Mengen von möglicherweise autoxidativ entstandenem Farbstoff beeinflußt wird. Prinzipiell ist jedoch auch eine Einzelmessung und die Berechnung des Analytgehalts anhand einer vorher aufzustellenden Eichkurve möglich.The invention is based on the object in the quantitative H 2 O 2 detection, the concentration of the dyes normally formed by the H 2 O 2 oxidatively from dye precursors ("chromogens") in the presence of traces of H 2 O 2 proportional to H 2 O to reinforce 2 amount so that a photometrically evaluated amount of dye is produced. the object is achieved by a method for the quantitative detection of H 2 O 2, which is characterized in that there are used as chromogens Leukotriphenylmethanfarbstoffe that in aqueous solutions in the presence of peroxidase (s) are stoichiometrically converted to the corresponding dyes These dyes are extracted with water immiscible solvents, preferably ketones such as cyclohexanone, and aliquots of the extract are removed in the absence of light in a 0.01 to 0.5 molar solution of Leukotriphenylmethanfarbstoffs, in the molar ratio of 1:10 to 10: 1, vorzu 1: 1 to the leuco triphenylmethane dye containing a bromine-containing polyhalogenated hydrocarbon, preferably tetrabromomethane, in a ketone, preferably acetone. By irradiation with light of the absorption wave length of the triphenylmethane dye, leuco dye is converted into the dye in proportion to the initial amount of the Ti'-diphenylmethane dye, whereby an enhancement effect occurs which is greater the longer the irradiation time and intensity, and therefore the irradiation duration and intensity are as follows be chosen that after 10 to about 30 minutes, depending on the concentration of the initial analyte extinctions between 0.1 and 1.5 are obtained. By control measurements, a check of the required extinction is readily possible. The calculation of the H 2 O 2 content or the content of H 2 O 2 -generating analyte in the sample is carried out by comparing the time course of an identically treated sample known content of H 2 O 2 or primary analyte, advantageously two measurements at a time interval be made of about 10 minutes. This procedure also has the advantage that the result is not affected by small amounts of possibly autoxidatively developed dye. In principle, however, it is also possible to carry out a single measurement and to calculate the analyte content on the basis of a calibration curve to be set up beforehand.
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Als mit Wasser mischbare Lösungsmittel werden Ketone, Alkohole oder Ether eingesetzt und als Polyhalogenkohlenwasserstoffe bromhaltige Poly-halogenkohlenwasserstoffe, wie Tetrabrommethan, Hexabrommethan, Dichlordibrommethan, (Tribrommethyl)-benzol.As water-miscible solvents ketones, alcohols or ethers are used and as polyhalogenated hydrocarbons bromine-containing poly-halogenated hydrocarbons, such as carbon tetrabromide, Hexabrommethan, Dichlordibrommethan, (tribromomethyl) benzene.
Als Triphenylfarbstoffe eignen sich Verbindungen der allgemeinen Formel I, beispielsweise Rosanilin, Malachitgrün und Kristallviolett.Suitable triphenyl dyes are compounds of the general formula I, for example rosaniline, malachite green and crystal violet.
Die Leukoform wird durch Oxydation in den Farbstoff überführtThe leuco form is converted by oxidation into the dye
Als Oxydationsmittel fungiert des nachzuweisende H2O2 H2O2-generierendes System H2O2 The oxidizing agent is the H 2 O 2 H 2 O 2 -generating system H 2 O 2 which is to be detected
2DH+ H2O2 2 <D+X") + 2 H 2°2DH + H 2 O 2 2 < D + X ") + 2 H 2 °
Die Verstärkungsreaktion wird durch die Bestrahlung mit Licht der Wellenlänge 600 nm eingeleitet ,,.+ν-. Bestrahlung (D * J Ö'ÖÖ nroThe amplification reaction is initiated by the irradiation with light of the wavelength 600 nm ,,. + Ν-. Irradiation ( D * J Ö'ÖÖ nro
+X") + DH + CBr 2 (D+X" + X ") + DH + CBr 2 (D + X)
(D+X") + DH + CBr4 2 (D+X") * CHBr3 (D + X ") + DH + CBr 4 2 (D + X") * CHBr 3
Die Erfindung gestattet auf einfache Weise die quantitative Bestimmung von H2O2 in so geringen Konzentrationen, deren Bestimmung bisher nur mittels spezieller ultramikroanalytischer Verfahren, wie Immunotechniken o.a., in speziell ausgerüsteten Laboratorien möglich war.The invention allows in a simple manner the quantitative determination of H 2 O 2 in such low concentrations, the determination of which was hitherto only possible by means of special ultramicroanalytical methods, such as immunotechniques or the like, in specially equipped laboratories.
Lösungen:Solutions:
I. Phosphatpuffer 0.1 Molar, pH = 7,0, luftgesättigtI. phosphate buffer 0.1 molar, pH = 7.0, saturated with air
II. Leukomalachitgrünlösung 0,005 Molar (165 mg/100 mil.)II. Leukomalachite Green Solution 0.005 Molar (165 mg / 100 mils)
III. Glukoselösung 0.5 Molar (9 g/100 ml I)III. Glucose solution 0.5 molar (9 g / 100 ml I)
IV. Meerrettichperoxidase (EC 1.11.1.7.); (frisch bereiten) ca. 10 Units in 0.1 ml IIV. Horseradish peroxidase (EC 1.11.1.7.); (prepare fresh) about 10 units in 0.1 ml of I
V. Verstärkerlösung (unter Lichtausschluß bereiten und aufbewahren!)V. Prepare amplifier solution (with exclusion of light and store it!)
1.2 g Leukomalachitgrün + 1.2g Tetrabrommethan in 18 ml Aceton p. A., frisch destilliert, gelöst.1.2 g leucomalachite green + 1.2 g tetrabromomethane in 18 ml acetone p. A., freshly distilled, dissolved.
VI. Verdünnungsreihe: 0,01 bis 0,001 Units Glukoseoxidase (EC 1.1.3.4.) in jeweils 1 ml I gelöst. Temperatur: 25°CVI. Serial dilution: 0.01 to 0.001 units of glucose oxidase (EC 1.1.3.4.) Each dissolved in 1 ml of I. Temperature: 25 ° C
2,47 ml der Lösung Il werden mit 0,5 ml der Lösung III versetzt und 0,01 ml der Lösung IV zugefügt. Durch Zugabe von 0,02 ml der Proben der Verdünnungsreihe Vl wird die Reaktion gestartet und nach 5 Minuten durch Zugabe von 0,5 ml Cyclohexanon p. A., frisch destilliert, gestoppt. Kurz schütteln, in der Laborzentrifuge die Phasen trennen und unter Lichtausschluß 0,25ml der Oberphase zu 2,5 ml der Verstärkerlösung V geben, mit einer 100-W-Kollimatorleuchte, die mit einem Filter, der unterhalb 600ηm lichtundurchlässig ist, 30 Minuten unter Fremdlichtausschluß bestrahlen. Danach wird im Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 625 nm, Schichtdicke 1 cm, die Extinktion gegen eine Blindprobe, zu deren Herstellung an Stelle von Glukoseoxidaselösung nur Puffer verwendet wurde, gemessen. Resultate s. Abb. 1.2.47 ml of the solution II are mixed with 0.5 ml of the solution III and 0.01 ml of the solution IV added. By adding 0.02 ml of the samples of the dilution series VI, the reaction is started and after 5 minutes by addition of 0.5 ml of cyclohexanone p. A., freshly distilled, stopped. Briefly shake, separate the phases in the laboratory centrifuge and, under exclusion of light, add 0.25 ml of the upper phase to 2.5 ml of the amplifier solution V, with a 100 W collimator lamp which is opaque with a filter which is opaque below 600 μm, for 30 minutes with extraneous light irradiate. Thereafter, in the spectrophotometer at a wavelength of 625 nm, layer thickness 1 cm, the absorbance against a blank, for the production of which only buffer was used in place of glucose oxidase solution, measured. Results s. Fig. 1.
Die Bestimmung unbekannter Glukoseoxidaseaktivität gelingt damit mit einer Genauigkeit von ± 15%, bezogen auf die tatsächlich erhaltene Aktivität.The determination of unknown glucose oxidase activity succeeds with an accuracy of ± 15%, based on the actual activity obtained.
Wie Beispiel 1, nur daß an Stelle der Verstärkerlösung V die Verstärkerlösung Va folgender Zusammensetzung Verwendung findet:As in Example 1, except that instead of the amplifier solution V, the amplifier solution Va of the following composition is used:
Va Verstärkerlösung 0,3g LeukomalachitgrünVa amplifier solution 0.3g leucomalachite green
0,3 g Tetrabrommethan0.3 g of tetrabromomethane
in 18ml Aceton p. A., frisch destilliert, gelöst.in 18ml acetone p. A., freshly distilled, dissolved.
Die Verdünnungsreihe Vl wird im Konzentrationsbereich von 0,1 bisД01 Units Glukoseoxidase in jeweils 1 und I. angesetzt. Resultate: Abb. 1 Die Bestimmung unbekannter Glukoseoxidaseaktivitäten gelingt damit mit einer Genauigkeit von ± 10%.The dilution series VI is used in the concentration range of 0.1 to 10 units of glucose oxidase in each of 1 and I. Results: Fig. 1 The determination of unknown glucose oxidase activities is thus achieved with an accuracy of ± 10%.
Lösungen I, II, IV und V wie im Beispiel 1Solutions I, II, IV and V as in Example 1
An Stelle von Lösung III eine Lösung von ca. 5 Units Glukoseoxidase in 0,1 ml I (Lösung lila) VIa. Verdünnungsreihe von 5 · 10~9 bis 10~7 Mol Glukose in jeweils 1 ml I gelöst Temperatur: 25°CInstead of solution III, a solution of about 5 units of glucose oxidase in 0.1 ml of I (solution purple) VIa. Dilution series of 5 x 10 -9 to 10 -7 moles of glucose dissolved in 1 ml each I Temperature: 25 ° C
2,47 ml der Lösung Il werden mit 0,5ml der jeweiligen Probe der Eichlösung Vl a versetzt und 0,01 ml der Lösung IV zugefügt.2.47 ml of the solution II are admixed with 0.5 ml of the respective sample of the calibration solution VIa and 0.01 ml of the solution IV are added.
Durch Zugabe von 0,02 ml III a wird die Reaktion gestartet. Weiter wie im Beispiel 1.By adding 0.02 ml of III a, the reaction is started. Continue as in Example 1.
Resultate: Abb. 2Results: Fig. 2
Die Bestimmung unbekannter Glukosekonzentrationen (-mengen) gelingt damit im angegebenen Konzentrationsbereich mit einer Genauigkeit von ± 10%.The determination of unknown glucose concentrations (amounts) thus succeeds in the specified concentration range with an accuracy of ± 10%.
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| DD27376485A DD235115A1 (en) | 1985-03-04 | 1985-03-04 | METHOD FOR QUANTITATIVE TRACE DETECTION OF HYDROGEN PEROXIDE |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD27376485A DD235115A1 (en) | 1985-03-04 | 1985-03-04 | METHOD FOR QUANTITATIVE TRACE DETECTION OF HYDROGEN PEROXIDE |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD235115A1 true DD235115A1 (en) | 1986-04-23 |
Family
ID=5565752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD27376485A DD235115A1 (en) | 1985-03-04 | 1985-03-04 | METHOD FOR QUANTITATIVE TRACE DETECTION OF HYDROGEN PEROXIDE |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD235115A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108822005A (en) * | 2018-06-13 | 2018-11-16 | 郑州大学 | A kind of reversible colorimetric probe and its preparation, application based on malachite green and bisulfite addition product |
-
1985
- 1985-03-04 DD DD27376485A patent/DD235115A1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108822005A (en) * | 2018-06-13 | 2018-11-16 | 郑州大学 | A kind of reversible colorimetric probe and its preparation, application based on malachite green and bisulfite addition product |
| CN108822005B (en) * | 2018-06-13 | 2021-04-09 | 郑州大学 | Reversible colorimetric probe based on malachite green and bisulfite addition product, and preparation and application thereof |
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