DE2741431A1

DE2741431A1 - NEW KANAMYCIN-C DERIVATIVES, THE PROCESS FOR THEIR MANUFACTURING AND THE MEDICINAL PRODUCTS CONTAINING THESE

Info

Publication number: DE2741431A1
Application number: DE19772741431
Authority: DE
Inventors: Shinichi Kondo; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1976-10-12
Filing date: 1977-09-14
Publication date: 1978-04-13
Also published as: JPS5346940A; GB1567560A; FR2367775A1; DE2741431C3; CA1081693A; DE2741431B2; FR2367775B1; JPS6043356B2

Description

DR. A. VAN DERWERTH DR. FRANZ LEDERER REINER F. MEYERDR. A. VAN DERWERTH DR. FRANZ LEDERER REINER F. MEYER

DlPL-ING. (1934-1974) DIPU-CHEM. DIPL.-ING.DlPL-ING. (1934-1974) DIPU-CHEM. DIPL.-ING.

8000 MÜNCHEN 80 LUCILE-GRAHN-STRASSE 228000 MUNICH 80 LUCILE-GRAHN-STRASSE 22

TELEFON: (089)47 2947 TELEX: 524624 LEOEH 0 TELEGR.: LEDERERPATENTTELEPHONE: (089) 47 2947 TELEX: 524624 LEOEH 0 TELEGR .: LEATHER PATENT

9. September 1977September 9, 1977

ZAIDAN HOJIN BISEIBUTSU KAGAKU KENKYU KAI No.14-23, 3-chome, Kamiosaki, Shinagawa-ku Tokyo / JapanZAIDAN HOJIN BISEIBUTSU KAGAKU KENKYU KAI No.14-23, 3-chome, Kamiosaki, Shinagawa-ku Tokyo / Japan

Neue Kanamycin-C-derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende ArzneimittelNew kanamycin C derivatives, processes for their preparation and pharmaceuticals containing them

Die Erfindung betrifft neue Kanamycin-C-derivate, welche gegenüber einer großen Vielzahl von kanamycinresistenten Bakterien aktiv sind, ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Kanamycin-C-derivate und diese enthaltende Arzneimittel. Insbesondere betrifft die Erfindung neue und vorteilhafte 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-derivate von Kanamycin-C, 3'-DeoxykanamycinC und 3¹ ,4-' -Dideoxykanamycin-C und das Verfahren zu ihrer Herstellung.The invention relates to new kanamycin-C derivatives which are active against a large number of kanamycin-resistant bacteria, a process for the preparation of these new kanamycin-C derivatives and medicaments containing them. In particular, the invention relates to new and advantageous 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) derivatives of kanamycin-C, 3'-deoxykanamycin-C and 3 ¹ , 4- '-dideoxykanamycin-C and the process for their preparation .

Es ist bereits bekannt, daß Butirosin-B, d. h. 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-ribostamycin nach einer Fermentationsmethode hergestellt werden kann, siehe Tetrahedron Letters, 28 (1971), S. 2617-2620 und daß,1-N-(L-4~Amino-2-hydroxybutyryl)-derivate von Kanamycin-A und Kanamycin-BIt is already known that butirosin-B, i.e. H. 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) ribostamycin can be prepared by a fermentation method, see Tetrahedron Letters, 28 (1971), pp. 2617-2620 and that, 1-N- (L-4 ~ amino-2-hydroxybutyryl) derivatives of kanamycin-A and kanamycin-B

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synthetisiert wurden, siehe US-Patentschrift 3 781 268. 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-derviate von einigen anderen aminoglycosidisehen Antibiotika wurden ebenfalls synthetisiert, siehe britische Patentschrift 1 426 908. Weiterhin wurden Deoxyderivate von Kanamycinen ebenfalls auf der Grundlage der früheren Entdeckungen synthetisiert, welche von H. Umezawa et al. hinsichtlich des Hesistenzmechanismus von Bakterien gegenüber aninoglycosidischen Antibiotika als Folge der verschiedenen, inaktivierenden, von den resistenten Bakterien erzeugten Enzymen erhalten wurden. Beispielsweise wurden 3',4'-Dideoxykanaraycin-B und 3'-Deoxykanamycin-B synthetisiert, welche gegenüber den resisteriten, Aminoglycosid-3'-phosphotransferase ^Λ erzeugenden Bakterien aktiv sind, siehe US-Patentschriften 3 753 973 und 3 929 762 und H. Umezawa "Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry¹¹, j50 (1974), S. 183 und "Drug Action and Drug Resistance in Bacteria", 2 (1975), S. 211. 3¹ ,V-Dideoxykanamycin-B wurde bei der therapeutischen Behandlung von Infektionen, welche durch eine Vielzahl von resistenten Bakterien einschließlich Pseudomonas aeruginosa verursacht wurden, weitverbreitet eingesetzt. Jedoch wurde gefunden, daß diese Deoxyderivate von Kanamycin-B das Wachstum von solchen resistenten Bakterien nicht hemmen, welche zur Erzeugung von Aminoglycosid-6¹-acetyltransferase und 2"-Nucleotidyltransferase in der Lage sind. Als Ergebnis weiterer Untersuchungen gelang es der Anmelderin, die 6'-Aminogruppe von Kanamycin-B oder dessen Deoxyderivaten synthetisch in die Hydroxylgruppe umzuwandeln und dadurch Kanamycin-C und dessen Deoxyderivate herzusteilen, welche durch die 6'-Acetyltransferase selbstverständlich nicht inaktiviert werden können, siehe die britische Patentanmeldung 12266/77 und die US-Patentanmeldung SN 799 806 der Anmelderin. Jedoch sind auf diese Weise erhaltenes Kanamycin-C, 3'-Deoxykanamycin-C und 3'»4'-Dideoxykanamycin-C nicht in der Lage, das Wachstum von solchenSee U.S. Patent No. 3,781,268. 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) derivatives of some other aminoglycosidic antibiotics have also been synthesized, see British Patent No. 1,426,908. Deoxy derivatives of kanamycins have also been synthesized synthesized based on the earlier discoveries made by H. Umezawa et al. regarding the mechanism of resistance of bacteria to aninoglycosidic antibiotics as a result of the various inactivating enzymes produced by the resistant bacteria. For example, 3 ', 4'-Dideoxykanaraycin-B and 3'-deoxykanamycin B were synthesized, which is opposite to the resisteriten, aminoglycoside 3'-phosphotransferase ^Λ producing bacteria are active, see US Patents 3,753,973 and 3,929,762 and H . Umezawa "Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry ^11, J50 (1974), p 183 and" Drug Action and Drug Resistance in Bacteria ", 2 (1975), p 211. 3 ^1, V-dideoxykanamycin B was used in the therapeutic treatment of infections caused by a variety of resistant bacteria including Pseudomonas aeruginosa, however, it has been found that these deoxy derivatives of kanamycin-B do not inhibit the growth of such resistant bacteria which produce aminoglycoside-6 ¹ - acetyltransferase and 2 "nucleotidyltransferase are capable. As a result of further investigations, the applicant succeeded in synthetically converting the 6'-amino group of kanamycin-B or its deoxy derivatives into the hydroxyl group and thereby producing kanamycin-C and its deoxy derivatives, which of course cannot be inactivated by the 6'-acetyltransferase, see British patent application 12266/77 and applicant's US patent application SN 799 806. However, kanamycin-C, 3'-deoxykanamycin-C and 3 '»4'-dideoxykanamycin-C obtained in this way are incapable of the growth of such

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resistenten Bakterien zu hemmen, welche 2"-Nucleotidyltransf era se erzeugen.to inhibit resistant bacteria that produce 2 "-nucleotidyltransferences.

Daher wurden von der Anmelderin weitere Untersuchungen durchgeführt, wobei die neuen Verbindungen synthetisiert werden konnten, nämlich 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-derivate von Kanamycin-C, 3' -Deoxykanamycin-C und 3',V-Dideoxykanamycin-C, welche gegenüber einer großen Vielzahl von aminoglycosidresistenten Bakterien einschließlich den 2'-Nucleotidyltransferase erzeugenden Bakterien, aktiv sind.Therefore, further investigations were carried out by the applicant, with the new compounds being synthesized could be, namely 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) derivatives of kanamycin-C, 3 '-deoxykanamycin-C and 3', V-dideoxykanamycin-C, resistant to a wide variety of aminoglycoside resistant bacteria including the 2'-nucleotidyltransferase producing bacteria, are active.

Aufgabe der Erfindung war daher die Bereitstellung solcher neuen Kanamycin-C-derivate, welche von Natur aus nicht durch die stark in einer Vielzahl der aminoglycosidresistenten Bakterien vorkommenden 3'-Phosphotransferase inaktiviert werden können, und die ebenfalls nicht durch die 6'-Acetyltransferase und die 2"-Nucleotidyltransferase inaktiviert werden können, so daß die neuen Verbindungen nicht nur gegenüber den aminoglycosidresistenten, 3'-Phosphotransferase erzeugenden Bakterien aktiv sind, sondern auch gegenüber den 6'-Acetyltransferase erzeugenden, aminoglycosidresistenten Bakterien und den 2"-Nucleotidyltransferase erzeugenden, aminoglycosidresistenten Bakterien aktiv sind und die dennoch eine sehr geringe Toxizität aufweisen. Weitere Aufgabe der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung dieser erfindungsgemäßen Kanamycin-C-derivate, das in einfacher Weise und mit vernünftiger Wirksamkeit durchgeführt werden kann.The object of the invention was therefore to provide such new kanamycin C derivatives which by nature are not through inactivates the 3'-phosphotransferase found in a large number of aminoglycoside-resistant bacteria can be, and also not by the 6'-acetyltransferase and inactivates the 2 "nucleotidyl transferase can be, so that the new compounds not only against the aminoglycoside-resistant, 3'-phosphotransferase producing bacteria are active, but also against the 6'-acetyltransferase producing, aminoglycoside-resistant Bacteria and the 2 "nucleotidyltransferase producing, aminoglycoside-resistant bacteria are active and which nevertheless have a very low toxicity. Another object of the invention is a new method for Preparation of these kanamycin C derivatives according to the invention in a simple manner and with reasonable effectiveness can be carried out.

Die Erfindung wird im folgenden im einzelnen näher erläutert.The invention is explained in more detail below.

Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird als neue Verbindung das 1-N-(L-4~Amino-2-hydroxybutyryl)-derivat von Kanamycin-C, 3'-Deoxykanamycin-C oderAccording to a first embodiment of the invention, the 1-N- (L-4 ~ amino-2-hydroxybutyryl) derivative is used as a new compound from kanamycin-C, 3'-deoxykanamycin-C or

80981 5/0576 "80981 5/0576 "

27AH3127AH31

3' ,V-Dideoxykanamycin-C, welches durch die folgende allgemeine Formel wiedergegeben wird:3 ', V-dideoxykanamycin-C, which is represented by the following general Formula is reproduced:

6"6 "

HO .-.HO .-.

(D(D

CH₂NH₂ CH ₂ NH ₂

worin R,. und B₂ jeweils eine Hydroxylgruppe oder ein Wasserstoff atom darstellen,
und die Säureadditionssalze hiervon geliefert.wherein R ,. and B ₂ each represent a hydroxyl group or a hydrogen atom,
and the acid addition salts thereof supplied.

Sie erfindungsgemäßen, neuen Verbindungen umfassen 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin-C_t d. h. die Verbindung der Formel (I)₁ worin beide Beste B. und Bp eine Hydroxylgruppe darstellen, 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3'-deoxykanamycin-C, d. h. die Verbindung der Formel (I), worin B_x. ein Wasserstoff atom und Bp eine Hydroxylgruppe bedeuten,The novel compounds according to the invention include 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -kanamycin-C _t ie the compound of the formula (I) ₁ in which both Best B. and Bp represent a hydroxyl group, 1-N- (L-4-Amino-2-hydroxybutyryl) -3'-deoxykanamycin-C, ie the compound of the formula (I) in which B _x . a hydrogen atom and Bp a hydroxyl group,

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274Η31274-31

sowie 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3' ,4'-dideoxykanamycin-C, d. h. die Verbindung der Formel (I), worin beide Reste R^. und Rp ein Wasserstoffatom bedeuten, sowie ebenfalls die pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze hiervon. Die chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften dieser neuen Verbindungen sind wie folgt:and 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -3 ', 4'-dideoxykanamycin-C, d. H. the compound of formula (I) in which both radicals R ^. and Rp represent a hydrogen atom, as well as the pharmaceutically acceptable acid addition salts thereof. The chemical, physical and biological Properties of these new compounds are as follows:

1-N-(L-ü—Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin-C ist eine Substanz in Form eines farblosen Pulvers, welche keinen definierten Schmelzpunkt hat, sich aber bei 167-180 ⁰C zersetzt. Es zeigt eine spezifische, optische Drehung Ca]^ = +91 (c = 1, Wasser). Seine Elementaranalyse stimmt mit den theoretischen Werten für ΟρρΗ^,Ν^Ο.-,.ΗρΟ überein (C = 4-3,77 %\ H = 7,51 %; N = 11,60 %).1-N- (L-u-amino-2-hydroxybutyryl) -kanamycin-C is, however, a decomposed substance in the form of a colorless powder which has no definite melting point at 167-180 ⁰ C. It shows a specific optical rotation Ca] ^ = +91 (c = 1, water). Its elemental analysis agrees with the theoretical values for ΟρρΗ ^, Ν ^ Ο .- ,. ΗρΟ (C = 4-3.77 % \ H = 7.51%; N = 11.60 %) .

Diese Substanz ergibt einen einzigen, gegenüber Ninhydrin positiven Fleck bei Rf = 0,18 bei der Dünnschichtchromatographie auf Kieselerdegel (Warenbezeichnung "ART 5721" von Merck Co., Deutschland) bei der Entwicklung mit Butanol-Äthanol-Chloroform-17 %igem wäßrigem Ammoniak (4:5:2:8 in Volumen) und bei Rf = 0,19 bei der gleichen Dünnschichtchromatographie und der Entwicklung mit Chloroform-Methanol-28 %igem wäßrigem Ammoniak (1:4:2:1 in Volumen) als Entwicklerlösung smittel.This substance gives a single ninhydrin positive spot at Rf = 0.18 on thin layer chromatography on silica gel (trade name "ART 5721" from Merck Co., Germany) when developed with butanol-ethanol-chloroform-17 % aqueous ammonia (4: 5: 2: 8 by volume) and at Rf = 0.19 with the same thin layer chromatography and development with chloroform-methanol-28% aqueous ammonia (1: 4: 2: 1 by volume) as a developing solution resources.

1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3'-deoxykanamycin-C ist eine Substanz in Form eines farblosen Pulvers mit keinem definierten Schmelzpunkt, welche sich jedoch bei 151-160 ⁰C zersetzt. Es zeigt eine spezifische, optische Drehung Ca]^ = +83 (c = 1, Wasser). Seine Elementaranalyse stimmt mit den theoretischen Werten für CppELJÜj-O.p.HpO überein (C = 44,96 %; H = 7,72 %; N = 11,92 %). Diese Substanz ergibt einen einzigen, gegenüber Ninhydrin positiven Fleck bei Rf = 0,22 bei der zuvor genannten DünnschichtChromatographie auf Kieselerdegel und der Entwicklung mit dem zuerst genannten1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -3'-deoxykanamycin-C is a substance in the form of a colorless powder with no definite melting point, but which decomposes at 151-160 ⁰ C. It shows a specific optical rotation Ca] ^ = +83 (c = 1, water). Its elemental analysis agrees with the theoretical values for CppELJÜj-OpHpO (C = 44.96%; H = 7.72%; N = 11.92%). This substance gives a single, ninhydrin-positive spot at Rf = 0.22 in the aforementioned thin-layer chromatography on silica gel and development with the former

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4040

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EntwicklerlÖsungsmittel und bei Ef = 0,24 bei der gleichen DünnschichtChromatographie und Entwicklung mit dem zweitgenannten EntwicklerlÖsungsmittel.Developer solvent and at Ef = 0.24 with the same thin-layer chromatography and development with the the second-mentioned developer solvent.

-^¹ ,4'-dideoxykanamycin-C ist ebenfalls eine Substanz in Form eines farblosen Pulvers mit keinem definierten Schmelzpunkt, welche sich jedoch bei 142-158 ⁰C zersetzt. Es zeigt eine spezifische, optische Drehung [a]p = +76 (c - 1 , Wasser). Seine Elementaranalyse stimmt mit den theoretischen Werten für CppH^NcO^^HpO überein (C - 46,22 %; H = 7,94 %; N = 12,25 %). Es ergibt einen einzigen, gegenüber Ninhydrin positiven Fleck bei Rf 0,31 bei der zuvor genannten Dünnschichtchromatographie auf Kieselerdegel und der Entwicklung mit dem zuerst genannten EntwicklerlÖsungsmittel und bei Ef = 0,30 bei der gleichen Dünnschichtchromatographie und der Entwicklung mit dem als zweiten genannten EntwicklerlÖsungsmittel. Die Molekülstruktur dieser neuen Kanamycin-C-derivate wurde durch Säurehydrolyse und durch die Absorptionsspektren der kernmagneti-- ^ ¹ , 4'-dideoxykanamycin-C is also a substance in the form of a colorless powder with no defined melting point, but which decomposes ^{at 142-158 0 C.} It shows a specific optical rotation [a] p = +76 (c - 1, water). Its elemental analysis agrees with the theoretical values for CppH ^ NcO ^^ HpO (C - 46.22%; H = 7.94%; N = 12.25%). There is a single, ninhydrin-positive spot at Rf 0.31 in the aforementioned thin-layer chromatography on silica gel and development with the first-mentioned developer and at Ef = 0.30 in the same thin-layer chromatography and development with the second-mentioned developer. The molecular structure of these new kanamycin-C derivatives was determined by acid hydrolysis and by the absorption spectra of the nuclear magnetic

1 1 "5 sehen Resonanz von H und C identifiziert.1 1 "5 see resonance of H and C identified.

Die minimalen Hemmkonzentrationen (ug/ml) von 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin-C (im folgenden abgekürzt als AHB-KC), von 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3'-deoxykanamycin-C (im folgenden als AHB-DKC abgekürzt) und von 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3',4'-dideoxykanamycin-C (im folgenden abgekürzt als AHB-DDKC) gegenüber verschiedenen Mikroorganismen wurden nach der Reihenverdünnungsmethode auf Nähragarmedium bei 37 °C bestimmt, wobei die Abschätzung nach einer Inkubation von 18 Stunden durchgeführt wurde. Zum Vergleich wurden ebenfalls die minimalen Hemmkonzentrationen von 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin-A (Amikacin) in der gleichen, zuvor beschriebenen Weise bestimmt.The minimum inhibitory concentrations (µg / ml) of 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -kanamycin-C (hereinafter abbreviated as AHB-KC), from 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -3'-deoxykanamycin-C (hereinafter abbreviated as AHB-DKC) and from 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -3 ', 4'-dideoxykanamycin-C (hereinafter abbreviated as AHB-DDKC) against various microorganisms were after the serial dilution method on nutrient agar medium determined at 37 ° C, the assessment being carried out after an incubation of 18 hours. To the The minimum inhibitory concentrations of 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -kanamycin-A (amikacin) were also compared. determined in the same manner previously described.

Die antibakteriellen Spektren dieser Substanzen sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.The antibacterial spectra of these substances are compiled in Table I below.

809815/0576"809815/0576 "

Table I.

CD CD COCD CD CO

Minimale Hemmkonzentrationen iMinimal inhibitory concentrations i

Test"OrganismenTest "organisms

AiiiikacinAiiiikacin

Staphylococcus aureus FDA 209P Mycobacterium smegnatis ATCC Escherichia coli NIHJ " " K-12 " " K-12 R5 ¹¹ " K-12 ML 1629 ¹¹ ■ " K-12 ML 1630 " " K-12 ML 1410 ¹¹ " K-12 ML 1410 R81 ¹¹ " LA 290 R55 " » LA 290 R56 ■ ¹¹ " LA 290 R64Staphylococcus aureus FDA 209P Mycobacterium smegnatis ATCC Escherichia coli NIHJ "" K-12 "" K-12 R5 ¹¹ "K-12 ML 1629 ¹¹ ■" K-12 ML 1630 "" K-12 ML 1410 ¹¹ "K-12 ML 1410 R81 ¹¹ "LA 290 R55" »LA 290 R56 ■ ¹¹ " LA 290 R64

AHB-KCAHB-KC AHB-DKCAHB-DKC AHB-DDKCAHB-DDKC (vergieicn;(shed; 6.256.25 6.256.25 12.512.5 0.39-0.39- 3 · 133 · 13 12.512.5 6.256.25 < 0.20<0.20 6.256.25 6.256.25 12.512.5 0.780.78 12.5
6.2512.5
6.25 6.25
6.256.25
6.25 12.5
12.5.12.5
12.5. 0.78 λ
0.39 ·*'0.78 λ
0.39 * ' 6.256.25 6.256.25 6.256.25 0.780.78 12.512.5 12.512.5 12.512.5 0.780.78 2525th 6.256.25 2525th 0.780.78 Vd. 5
12.5 Vd . 5
12.5 12.512.5 ■°5
12.5■ ° 5
12.5 1.56
NJ
0.78 J^1.56
NJ
0.78 J ^ 6.256.25 6.25 .6.25. 6.256.25 °·39 ^° 39 ^ 12,512.5 3.133.13 12.512.5 0.39 ⁰^0.39 ⁰ ^

Tabelle I (Fortsetzung)Table I (continued)

Escherichia coli W 677 ¹¹ " JR 66/W677Escherichia coli W 677 ¹¹ "JR 66 / W677

Klebsiella pneumoniae PCI ¹¹ ·' 22 No. 3038Klebsiella pneumoniae PCI ¹¹ '22 No. 3038

Pseudomonas aeruginosa A3 " " ^N°· " " TI-13Pseudomonas aeruginosa A3 "" ^N ° · "" TI-13

1212th .5.5 6.6th 2525th 12.12th 55 2525th 12.12th VJlVJl ■ 25■ 25 33 .13.13 3.3. 1313th 6.6th 2525th 1212th .5.5 6.6th 2525th 2525th 1212th .5.5 6.6th 25 ■25 ■ 12.12th VJlVJl 5050 5050 100100 5050 5050 100100 5050 5050 100100 100100 100100 • loo• loo 100100 5050 100100

< ο<ο .20.20 11 .56.56 00 .39.39 11 .56.56 33 .13.13 33 .13.13 33 .13.13 100100 6,6, .25.25 12.12th ,5, 5

27AH3127AH31

Aus der Tabelle I ist ersichtlich, daß die neuen, erfindungsgemäßen Verbindungen das Wachstum von zahlreichen Arten von Bakterienstämmen hemmen. Die neuen, erfindungsgemaßen Verbindungen weisen außerdem eine äußerst niedrige, akute Toxizität bei Tieren und beim Menschen auf. Es wurde abgeschätzt, daß AHB-KC und AHB-DKC einen LD_5Q-Wert von mehr als 400 mg/kg bei der intravenösen Injektion bei Mäusen haben. Daher können die neuen, erfindungsgemaßen Verbindungen als chemotherapeutische Mittel zar therapeutischen Behandlung von Infektionen, welche durch graa-negative und gram-positive Bakterien hervorgerufen wurden, eingesetzt werden.It can be seen from Table I that the novel compounds of the invention inhibit the growth of numerous types of bacterial strains. The new compounds according to the invention also have an extremely low acute toxicity in animals and in humans. It was estimated that AHB-KC and AHB-DKC had an LD _5Q greater than 400 mg / kg when injected intravenously in mice. The novel compounds according to the invention can therefore be used as chemotherapeutic agents for the therapeutic treatment of infections which have been caused by graa-negative and gram-positive bacteria.

1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kananycin-A (Amikacin) und 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin-B wurden von Kawaguchi et al., US-Patentschrift 3 781 268, synthetisiert, und diese bekannten Verbindungen werden durch eine 6'-Acetyltransferase acetyliert, welche aus aminoglycosidresistenten Stämmen wie Pseudomonas aeruginosa GN315> siehe M. Yagisawa et al., J. Antibiot., 28 (1975), S. 486, erhalten wurde, und in dieser Hinsicht unterscheiden sie sich von den neuen, erfindungsgemäßen Verbindungen, welche durch die ö'-Acetyltransferase nicht inaktiviert werden.1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -kananycin-A (Amikacin) and 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -kanamycin-B were obtained from Kawaguchi et al., U.S. Patent 3,781,268, synthesized and these known compounds are activated by a 6'-acetyltransferase acetylated, which are derived from aminoglycoside-resistant strains such as Pseudomonas aeruginosa GN315> see M. Yagisawa et al., J. Antibiot., 28: 486 (1975), and in this respect they differ from the new compounds according to the invention, which are produced by δ'-acetyltransferase cannot be deactivated.

Die neuen, erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) können leicht in die Form eines pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzes umgewandelt werden, z. B. in das Hydrochlorid, Sulfat, Phosphat, Nitrat, Acetat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat, Oxalat, Citrat, Ascorbat, Methansulf onat, Äthansulfonat und dergleichen, und zwar durch Umsetzung der freien Base in Form des 1-N-(L-4~Amino-2-hydroxybutyryl)-derivates von Kanamycin-C, 3'-Deoxykanamyc.Tn-C oder 3'Λ'-Dideoxykanamycin-C mit der geeigneten Säure in wäßrigem Medium. Die neuen, erfindungsgemäßen Kanamycin-C-verbindungen und ihre pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze können oral, intraperitoneal, intravenös, subkutanThe novel compounds of the formula (I) according to the invention can easily be converted into the form of a pharmaceutically acceptable one Acid addition salt are converted, e.g. B. in the hydrochloride, sulfate, phosphate, nitrate, acetate, maleate, Fumarate, succinate, tartrate, oxalate, citrate, ascorbate, methane sulf onate, ethanesulfonate and the like, namely by reacting the free base in the form of the 1-N- (L-4 ~ amino-2-hydroxybutyryl) derivative of Kanamycin-C, 3'-Deoxykanamyc.Tn-C or 3'Λ'-Dideoxykanamycin-C with the appropriate acid in aqueous medium. The new kanamycin C compounds according to the invention and their pharmaceutically acceptable acid addition salts can be oral, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous

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. 27AH31. 27AH31

oder intramuskulär unter Anwendung einer beliebigen, auf dem Fachgebiet an sich bekannten, pharmazeutischen Form für eine solche Applikation und in ähnlicher Weise wie die bekannten Kanamycine appliziert werden. Beispielsweise können die neuen, erfindungsgemäßen Verbindungen oral unter Benutzung einer beliebigen pharmazeutischen, an sich bekannten Form für die orale Applikation appliziert werden. Beispiele der pharmazeutischen Formen für die orale Applikation sind Pulver, Kapseln, Tabletten, Sirup und dergleichen. Eine geeignete Dosierung der neuen, erfindungsgemäßen Verbindungen zur effektiven Behandlung von bakteriellen Infektionen liegt in einem Bereich von 0,5 bis 4 g pro Person pro Tag bei der oralen Gabe. Es wird bevorzugt, daß diese Dosierung oral in drei oder vier Teilmengen pro Tag appliziert wird. Die neuen, erfindungsgemäßen Verbindungen können ebenfalls durch intramuskuläre Injektion in einer Dosismenge von 200 bis 2000 mg pro Person zweimal bis viermal pro Tag appliziert werden. Darüber hinaus können die neuen, erfindungsgemäßen Verbindungen zu einer Salbe für den äußeren Auftrag, welche die aktive Verbindung in einer Konzentration von 0,5 bis 5 Gew.-% in Verbindung mit einer bekannten Salbengrundlage wie Polyäthylenglykol enthält, formuliert werden. Darüber hinaus sind die neuen, erfindungsgemäßen Verbindungen zur Sterilisation von chirurgischen Instrumenten brauchbar.or intramuscularly using any pharmaceutical one known in the art Form for such an application and are applied in a similar manner to the known Kanamycins. For example the new compounds according to the invention can be taken orally using any pharmaceutical, form known per se for oral administration. Examples of pharmaceutical forms for oral Application are powder, capsules, tablets, syrup and the like. A suitable dosage of the new, according to the invention Compounds for effectively treating bacterial infections range from 0.5 to 4 g per person per day for oral administration. It is preferred that this dosage be taken orally in three or four aliquots each Day is applied. The new compounds according to the invention can also by intramuscular injection in a Dosage amount of 200 to 2000 mg per person can be applied twice to four times per day. In addition, the new, Compounds according to the invention to form an ointment for external application, which contains the active compound in a concentration from 0.5 to 5% by weight in connection with a known ointment base such as polyethylene glycol contains. In addition, the new compounds according to the invention useful for sterilizing surgical instruments.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform betrifft die Erfindung daher ein antibakteriell wirkendes Arzneimittel, welches als aktiven Bestandteil 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin-C, 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3'-deoxykanamycin-C oder 1-N-(L-4~Amino-2-hydroxybutyryl)-3',V-dideoxykanamycin-C oder ein Säureadditionssalz hiervon in einer antibakteriell wirksamen Menge zur Hemmung des Wachstums von Bakterien in Kombination mit einem Träger oder Verdünnungsmittel für den aktiven Inhaltsstoff umfaßt.According to a second embodiment, the invention relates to therefore an antibacterial drug which contains 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -kanamycin-C, 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -3'-deoxykanamycin-C or 1-N- (L-4 ~ amino-2-hydroxybutyryl) -3 ', V-dideoxykanamycin-C or an acid addition salt thereof in an antibacterially effective amount to inhibit growth of bacteria in combination with a carrier or diluent for the active ingredient.

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- y>c-- y> c-

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Gemäß einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-derivates von Kanatnycin-C, 3¹ -Deoxykanamycin-C oder 3¹,V-Dideoxykanamycin-C entsprechend der allgemeinen, zuvor angegebenen Formel (I), wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:According to a further embodiment, the invention provides a process for the preparation of the 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) derivative of Kanatnycin-C, 3-C or 3 -Deoxykanamycin ¹ ^1, V-dideoxykanamycin-C according to of the general formula (I) given above, the process comprising the following steps:

Acylierung der 1-Amino-Gruppe von Kanamycin-C, 3'-Deoxykanamycin-C oder 3¹»^¹-Dideoxykanamycin-C, welche durch die allgemeine Formel (II) wiedergegeben werden:Acylation of the 1-amino group of kanamycin-C, 3'-deoxykanamycin-C or 3 ¹ »^ ¹ -dideoxykanamycin-C, which are represented by the general formula (II):

R₁ 4'R ₁ 4 '

worin R. und Rp eine Hydroxylgruppe oder ein Wasserstoffatornwherein R. and Rp represent a hydroxyl group or a hydrogen atom

darstellen,represent,

durch Reaktion mit einem an der Aminogruppe geschützten Derivat von L-4—Araino-2-hydroxybuttersäure oder einem funktionellen Äquivalent hiervon unter Bildung des 1-N-Acylierungs-by reaction with one protected on the amino group Derivative of L-4-araino-2-hydroxybutyric acid or a functional one Equivalent of this with formation of the 1-N-acylation

produktes der Ausgangsverbindung (II), undproduct of the starting compound (II), and

Entfernung der Aminoschutzgruppe aus dem entstandenen 1-N-Acylierungsprodukt unter Bildung der Verbindung der Formel (I).Removal of the amino protective group from the 1-N-acylation product formed to form the compound of Formula (I).

Das erfindungsgemäße Verfahren kann eine weitere Stufe der Umsetzung der so erhaltenen Verbindung der Formel (I) mit einer pharmazeutisch annehmbaren Säure zur Bildung des entsprechenden, pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzes der Verbindung der Formel (I), falls gewünscht, umfassen.The inventive method can take a further step Reaction of the compound of formula (I) thus obtained with a pharmaceutically acceptable acid to form the corresponding, pharmaceutically acceptable acid addition salt of the compound of formula (I) if desired.

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Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Verfahren die folgenden Stufen umfassen:According to one embodiment of the method according to the invention, the method can comprise the following stages:

Umsetzung der Ausgangsverbindung der Formel (II), worin die Aminogruppen nicht geschützt sind, mit einem Derivat von L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure mit geschützter Aminogruppe, welches durch die folgende Formel (III) wiedergegeben wird:Implementation of the starting compound of the formula (II), wherein the Amino groups are not protected, with a derivative of L-4-amino-2-hydroxybutyric acid with a protected amino group, which is represented by the following formula (III):

HOOc-CH(OH)-CH₂CH₂- n( (in)HOOc-CH (OH) -CH ₂ CH ₂ - n ( (in)

worin E, ein Wasserstoff atom ist und B^ eine bekannte, einwertige Aminoschutzgruppe wie eine Alkyloxycarbonyl-, Cycloalkyloxycarbonyl- oder Aralkyloxycarbonylgruppe ist, oder H_ und B^ zusammen eine zweiwertige Amino schutzgruppe wie eine Ehthaloylgruppe, oder eine Schiffsche Basengruppe (N-CHHc, worin B,- ein Wasserstoff a torn, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4-Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe wie die Phenylgruppe ist) bilden, where E, is a hydrogen atom and B ^ is a known, monovalent amino protective group such as an alkyloxycarbonyl, cycloalkyloxycarbonyl or aralkyloxycarbonyl group, or H_ and B ^ together is a divalent amino protective group such as an ethaloyl group, or a Schiff base group (N-CHHc, in which B, - form a hydrogen atom, an alkyl group with 1 to 4 carbon atoms or an aryl group such as the phenyl group) ,

in an sich zur Acylierung der Aminogruppe bekannter Weise unter Bildung von Mischacylierungsprodukten, welche ein 1-N-(L-4-geschütztes-Amino-2-hydroxybutyryl)-derivat der Ausgangsverbindung der Formel (II) umfassen, Behandlung der Mischacylierungsprodukte in an sich bekannter Weise zur Entfernung der Amino schutzgruppe hiervon, und anschließende Isolierung des gewünschten 1-N-(L-^-Amino-2-hydroxybutyryl)-derivates des Antibiotikums entsprechend der Formel (I) durch chromatographische Trennung der Acylierungsprodukte, aus denen die Aminoschutzgruppe entfernt wurde, zur Gewinnung der gewünschten Verbindung der Formel (I).in a manner known per se for the acylation of the amino group with the formation of mixed acylation products which are a 1-N- (L-4-protected-amino-2-hydroxybutyryl) derivative of Starting compounds of the formula (II) include treatment of the mixed acylation products in a manner known per se Way to remove the amino protecting group therefrom, and then isolating the desired 1-N- (L - ^ - amino-2-hydroxybutyryl) derivative of the antibiotic according to formula (I) by chromatographic separation of the acylation products, from which the amino protecting group has been removed to obtain the desired compound of formula (I).

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Ausgangsverbindungen Kanamycin-C, 3'-Deoxykanamycin-CWhen carrying out the process according to the invention, the starting compounds kanamycin-C, 3'-deoxykanamycin-C

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oder 3',V-Dideoxykanamycin-C der Formel (I), deren Aminogruppennicht geschützt sind, entweder in Form der freien Base oder in Form ihres Säureadditionsssalzes mit einer geeigneten Säure wie Salzsäure oder Schwefelsäure eingesetzt werden. Bei der Acylierungsstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Reaktion im allgemeinen so durchgeführt werden, wie dies in der britischen Patentschrift 1 426 908 oder der US-Patentschrift 4 001 208 beschrieben ist. Vorzugsweise wird die Ausgangsverbindung der Formel (II) in Wasser aufgelöst, und die erhaltene, wäßrige Lösung wird auf einen pH-Wert von 6 bis 8 und vorteilhafterweise auf einen pH-Wert von 6,5 t>is 7,0 durch Zugabe einer üblichen Säure wie Salzsäure oder Schwefelsäure oder einer üblichen Base wie wäßriger Natriumhydroxidlösung oder wäßriger Kaliumhydroxidlösung eingestellt. Zu dieser Lösung in der zuvor erwähnten, partiell protonierten Form der Ausgangsverbindung wird eine Lösung eines an der Aminogruppe geschützten Derivates von L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure entsprechend der Formel (III) oder ein reaktionsfähiges Derivat hiervon, das als funktionelles Äquivalent des zuvor genannten an der Aminogruppe geschützten Buttersäurederivates (III) wirkt, zugesetzt. Auf diesem Weg wird die 1-Aminogruppe der Ausgangs-kanf.mycin-C-verbindung (II) mit der Säure (III) acyliert.or 3 ', V-dideoxykanamycin-C of formula (I), the amino groups of which are not are protected, either in the form of the free base or in the form of its acid addition salt with a suitable acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid can be used. In the acylation stage of the invention In the process, the reaction can generally be carried out as described in British Patent 1,426,908 or U.S. Patent 4,001,208. Preferably the starting compound of the formula (II) is dissolved in water, and the resulting aqueous solution is on a pH from 6 to 8 and advantageously at a pH from 6.5 t> is 7.0 by adding a common acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid or a customary base such as aqueous Sodium hydroxide solution or aqueous potassium hydroxide solution. To this solution in the previously mentioned, partial The protonated form of the starting compound is a solution of an amino-protected derivative of L-4-amino-2-hydroxybutyric acid corresponding to the formula (III) or a reactive derivative thereof, which is used as a functional Equivalent of the above-mentioned butyric acid derivative (III) protected on the amino group is added. This way becomes the 1-amino group of the starting kanf.mycin-C-compound (II) acylated with the acid (III).

Die verfügbare Amino schutzgruppe für R₃. und/oder R₂, in bei der Acylierungsstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten an der Aminogruppe geschützten L-4~Amino-2-hydroxybuttersäurederivates (III) kann eine bekannte Aminoschutzgruppe sein, wie sie üblicherweise bei der konventionellen Synthese von Peptiden verwendet wird. Jedoch muß die verwendete Aminoschutzgruppa-so beschaffen sein, daß sie leicht auf eine solche Weise und unter solchen Reaktionsbedingungen entfernt werden kann, welche die zwischen dem L—4-Amino-2-hydroxybutyrylsubstituenten und der 1-Aminogruppe der aminoglycosidischen Einheit des erhaltenen AcylierungsproduktesThe available amino protecting group for R ₃ . and / or R ₂ in the amino group-protected L-4 ~ amino-2-hydroxybutyric acid derivative (III) used in the acylation step of the process according to the invention can be a known amino protective group, as is customarily used in the conventional synthesis of peptides. However, the amino protecting group used must be such that it can be easily removed in such a manner and under such reaction conditions that those between the L-4-amino-2-hydroxybutyryl substituent and the 1-amino group of the aminoglycosidic moiety of the acylation product obtained

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vorhandene Amidobindung nicht aufbrechen, wenn die Entfernung der Aminoschutzgruppe von dem 1-N-Aminoalkanoylsubstituenten des Acylierungsproduktes durchgeführt wird. Geeignete Beispiele für einwertige Aminoschutz- gruppen, welche (als Gruppe B^) für den oben genannten Zweck verfügbar sind, umfassen eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen wie die tert.-Butoxycarbonyl- und tert.-Amyloxycarbonylgruppe; eine Cycloalkyloxycarbonylgruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen wie die Cyclohexyloxycarbonylgruppe; eine Aralkyloxycarbonylgruppe wie die Benzyloxycarbonylgruppe und p-Methoxybenzyloxycarbonylgmppe; sowie eine substituierte Alkanoylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen wie die Trifluoracetylgruppe oder o-Nitrophenoxyacetylgruppe. Bevorzugte Beispiele für die verfügbare, zweiwertige Amino schutzgruppe (die Gruppen R, und R^, zusammengefaßt) für den zuvor genannten Zweck umfassen die Phthaloylgruppe oder eine Gruppe vom Typ einer Schiff sehen Base wie die Salicylidengruppe. Die Einführung der Aminoschutzgruppe in die L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure kann dadurch erreicht werden, daß die Säure mit einem geeigneten Reagens zur Einführung der Aminoschutzgruppe, welche in Form eines Säurehalogenids, eines Säureazids, eines aktiven Esters oder eines Säureanhydrids vorliegt, in der gleichen Weise umgesetzt wird, w: e dies beispielsweise in den US-Patentschriften 3 929 762 unö 3 939 wie auch in der bereits zuvor genannten britischen Patentschrift 1 426 908 beschrieben ist.existing amido bond does not break upon removal of the amino protecting group from the 1-N-aminoalkanoyl substituent of the acylation product is carried out. Suitable examples of monovalent amino protective groups, which (as group B ^) for the above Purpose available include an alkoxycarbonyl group having 2 to 6 carbon atoms such as the tert-butoxycarbonyl and tert-amyloxycarbonyl group; a cycloalkyloxycarbonyl group having 3 to 7 carbon atoms such as cyclohexyloxycarbonyl group; an aralkyloxycarbonyl group such as benzyloxycarbonyl group and p-methoxybenzyloxycarbonyl group; as a substituted alkanoyl group having 2 to 5 carbon atoms such as trifluoroacetyl group or o-nitrophenoxyacetyl group. Preferred examples of the available, divalent amino protecting group (the groups R 1 and R ^, combined) for the aforementioned purpose include the phthaloyl group or a Schiff-type group see base such as the salicylid group. The introduction of the amino protecting group into L-4-amino-2-hydroxybutyric acid can be achieved by treating the acid with a suitable reagent for introducing the Amino protecting group, which is in the form of an acid halide, an acid azide, an active ester or an acid anhydride is present, is implemented in the same way as w: e this, for example in U.S. Patents 3,929,762 and 3,939 as well as in the aforementioned British patent 1,426,908.

Die Acylierung der 1-Aminogruppe der Ausgangs-kanamycin-C-verbindung der Formel (II) mit der an der Aminogruppe geschützten L-4-Amino-2-hydroxybuttersäure (III) kann nach den konventionellen Methoden zur Synthese von Amiden unter Verwendung des Acylierungsreagens (III) in Form des aktiven Esters wie des N-Hydroxysuccinimxdesters, eines gemischten Säureanhydrids oder eines Säureazids durchgeführt werden. Venn die Ausgangs-kanamycin-C-verbindung (II) in einemThe acylation of the 1-amino group of the starting kanamycin C compound of the formula (II) with the L-4-amino-2-hydroxybutyric acid (III) protected on the amino group can according to the conventional methods for synthesizing amides using the acylating reagent (III) in the form of the active one Esters such as the N-hydroxysuccinim xdester, a mixed one Acid anhydride or an acid azide. Venn the parent kanamycin C compound (II) in one

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beliebigen organischen Lösungsmittel unlöslich oder nur kaum löslich, jedoch in Wasser löslich ist, wird die Acylierungsreaktion bevorzugt in einem wäßrigen Reaktionsmedium durchgeführt, wobei das Acylierungsagens (III) in Form seines aktiven Esters eingesetzt wird. Beispielsweise kann eine Lösung, welche einen 1 bis 2 molaren Anteil des N-Hydroxysuccinimidesters von L-4— tert.-Butoxycarbonylamino-2-hydroxybuttersäure in einem mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel wie 1 ,2-Dimethoxyäthan oder Dimethylformamid enthält, mit einer wäßrigen Lösung eines 1 molaren Anteils der Ausgangs-kanamycin-C-verbindung (II) bei einem pH-Wert von 6 bis 8 bei Umgebungstemperatur unter Rühren zur Herbeiführung der gewünschten Acylierung zusammengemischt werden. Die Reaktionstemperatur kann gegebenenfalls erhöht werden. Die Reaktionszeit kann mehrere Stunden betragen, vorzugsweise beträgt sie 5 bis 6 Stunden.Any organic solvent is insoluble or only sparingly soluble, but soluble in water, the acylation reaction preferably carried out in an aqueous reaction medium, the acylating agent (III) in the form of its active ester is used. For example, a solution containing a 1 to 2 molar proportion of the N-hydroxysuccinimide ester of L-4- tert -butoxycarbonylamino-2-hydroxybutyric acid in a water-miscible organic solvent such as 1,2-dimethoxyethane or dimethylformamide contains, with an aqueous solution of a 1 molar proportion of the starting kanamycin-C compound (II) at pH from 6 to 8 are mixed together at ambient temperature with stirring to effect the desired acylation. The reaction temperature can optionally be increased. The reaction time can be several hours, preferably it is 5 to 6 hours.

Das so erhaltene Acylierungsprodukt liegt tatsächlich in Form der gemischten Acylierungsprodukte vor, welche das gewünschte 1-N-(L-4-geschützte-Amino-2-hydroxybutyryl)-derivat wie auch die nicht-gewünschten übrigen mono-N-acylierten, di-N-acylierten und poly-N-acylierten Produkte umfassen, in denen eine oder mehrere der 1-Amino-, 3-Amino-, 2'-Amino- und möglicherweise 3"-Aminogruppen der Kanamycin-C-einheit mit dem L-4-geschützten-Amino-2-hydroxybutyrylsubstituenten eine Bindung eingegangen ist bzw. sind. Das Acylierungsprodukt, d. h. die gemischten Acylierungsprodukte, kann als solches direkt in der zweiten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Entfernung der Aminoschutzgruppe behandelt werden, wobei dies in für die Peptidsynthese an sich bekannter Weise durchgeführt wird. Alle Aminoschutzgruppen der zuvor genannten Art können leicht durch schwache Säurehydrolyse unter Verwendung einer wäßrigen Lösung von Trifluoressigsäure oder Essigsäure oder verdünnter Salzsäure durchgeführt werden. Wenn die Aminoschutzgruppe eine Aralkyloxycarbonylgruppe ist, kann dieseThe acylation product thus obtained is actually in the form of the mixed acylation products, which the desired 1-N- (L-4-protected-amino-2-hydroxybutyryl) derivative as well as the undesired other mono-N-acylated, include di-N-acylated and poly-N-acylated products, in which one or more of the 1-amino, 3-amino, 2'-amino and possibly 3 "amino groups of the kanamycin C unit has bonded with the L-4 protected amino-2-hydroxybutyryl substituent. The acylation product, d. H. the mixed acylation products can be used as such directly in the second stage of the process according to the invention treated to remove the amino protecting group, wherein this is carried out in a manner known per se for peptide synthesis will. All amino protecting groups of the aforementioned kind can easily be used by weak acid hydrolysis an aqueous solution of trifluoroacetic acid or acetic acid or dilute hydrochloric acid. When the amino protecting group is an aralkyloxycarbonyl group, this can

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ebenfalls durch gewöhnliche Hydrogenolyse bzw. Wasserstoffspaltung entfernt werden.also by ordinary hydrogenolysis or hydrogen splitting removed.

Das bei der zweiten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltene, von den Schutzgruppen befreite Acylierungsprodukt liegt tatsächlich ebenfalls in Form der gemischten Produkte vor, welche sowohl das gewünschte 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin-C, -3'-deoxykanamycin-C oder -3',4'-dideoxykanamycin-C der Formel (I) wie auch die nicht gewünschten, in anderer Weise acylierten Derivate der Ausgangs-kanamycin-C-verbindung zusammen mit nicht umgesetzter Ausgangs-kanamycin-C-verbindung (II) enthalten. Zur Isolierung des gewünschten 1-N-Acylierungsproduktes (I) aus den duvor genannten, gemischten Produkten können letztere einer chromatographischen Trennmethode unterzogen werden, z. B. einer Ionenaustauscher-Chromatographie unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes, das Carboxylfunktionen enthält (z. B. Amberlite CG-50, Produkt von Böhm & Haas Co., USA, CM-Sephadex-C-25, Produkt von Pharmacia Co., Schweden)und Carboxymethylcellulose; durch Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung eines starken Anionenaustauscherharzes, z. B. von Dowex 1-X2 (Produkt von Dowex Co., USA), sowie durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselerdegel. Auf diese Weise kann die Isolierung und Gewinnung des gewünschten Produktes (I) mit hoher Wirksamkeit erreicht werden. Insbesondere ist es empfehlenswert, das von den Schutzgruppen befreite, gemischte Acylierungsprodukt auf einem schwachen Kationenaustauscherharz, welches Carboxylfunktionen enthält (Amberlite CG-50) zu chromatographieren, wobei verdünntes, wäßriges Ammoniak als Entwicklerlösungsmittel verwendet wird, da diese Arbeitsweise zur Chromatographie es ermöglicht, sowohl das gewünschte Produkt (I) als auch die nicht umgesetzte Ausgangs-kanamycin-C-verbindung (II) in wirksamer Weise und in reinem Zustand zu gewinnen. Entsprechend diesen chromatographischen Methoden wird das gewünschte Kanamycin-C-derivat der Formel (I) üblicherweise in Form seiner freien Base, des Hydrates oder des Carbonates gewonnen. 8O_981570576"The acylation product obtained in the second stage of the process according to the invention and freed from the protective groups is actually also in the form of the mixed products which contain both the desired 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -kanamycin-C, - 3'-deoxykanamycin-C or -3 ', 4'-dideoxykanamycin-C of the formula (I) as well as the undesired, otherwise acylated derivatives of the starting kanamycin-C compound together with unreacted starting kanamycin-C -compound (II) included. To isolate the desired 1-N-acylation product (I) from the mixed products mentioned above, the latter can be subjected to a chromatographic separation method, e.g. B. ion exchange chromatography using a cation exchange resin which contains carboxyl functions (e.g. Amberlite CG-50, product of Böhm & Haas Co., USA, CM-Sephadex-C-25, product of Pharmacia Co., Sweden) and carboxymethyl cellulose; by ion exchange chromatography using a strong anion exchange resin, e.g. From Dowex 1-X2 (product of Dowex Co., USA) and by column chromatography using silica gel. In this way, the desired product (I) can be isolated and obtained with high efficiency. In particular, it is advisable to chromatograph the freed of the protective groups, mixed acylation product on a weak cation exchange resin which contains carboxyl functions (Amberlite CG-50), using dilute, aqueous ammonia as developer solvent, since this procedure for chromatography enables both that to obtain the desired product (I) as well as the unreacted starting kanamycin-C compound (II) in an effective manner and in a pure state. According to these chromatographic methods, the desired kanamycin-C derivative of the formula (I) is usually obtained in the form of its free base, the hydrate or the carbonate. 8O _981570576 "

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Lie Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert.The invention is illustrated below by means of examples explained in more detail.

example 1

Synthese von 1-N-(L-4—Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin-CSynthesis of 1-N- (L-4-Amino-2-hydroxybutyryl) -kanamycin-C

Eine Lösung von 500 mg = 1,02 mMol der freien Base von Kanamycin-C (Hemihydrat) in 10 ml Wasser wurde auf pH = 6,35 durch Zugabe von 3,2 ml 1N Salzsäure eingestellt. Zu dieser Lösung wurde tropfenweise während 5 Minuten eine Lösung von 500 mg = 1,58 mMol des N-Hydroxysuccinimidesters von L-4— tert.-Butoxycarbonylamino-2-hydroxybuttersäure in 5 ml Dimethylformamid bei Umgebungstemperatur unter Rühren zugesetzt. Die so erhaltene Mischung wurde weitere 6 Stunden zur Herbeiführung der Acylierung gerührt. Die Reaktionslösung, welche das so gebildete 1-N-(L-4-tert.-Butoxycarbonylamino-2-hydroxybutyryl)-kanaraycin-C enthielt, wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, und der feste Rückstand wurde mit 16 ml einer wäßrigen Lösung von 90 %iger Trifluoressigsäure vermischt. Das Gemisch wurde 1 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, um die Entfernung der tert.-Butoxycarbonyl-aminoschutzgruppe herbeizuführen. Die Reaktionslösung wurde zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt, und der Rückstand wurde zweimal mit 20 ml Äthyläther gewaschen, wobei 1,55 g eines farblosen Pulvers erhalten wurden, welche ein rohes Produkt von 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin-C umfaßte.A solution of 500 mg = 1.02 mmol of the free base of Kanamycin-C (hemihydrate) in 10 ml of water was adjusted to pH = 6.35 adjusted by adding 3.2 ml of 1N hydrochloric acid. To this Solution was added dropwise over 5 minutes a solution of 500 mg = 1.58 mmol of the N-hydroxysuccinimide ester of L-4— tert-butoxycarbonylamino-2-hydroxybutyric acid in 5 ml of dimethylformamide added at ambient temperature with stirring. The mixture thus obtained was allowed to induce for an additional 6 hours the acylation stirred. The reaction solution containing the 1-N- (L-4-tert-butoxycarbonylamino-2-hydroxybutyryl) -kanaraycin-C was concentrated to dryness under reduced pressure and the solid residue was added with 16 ml mixed with an aqueous solution of 90% trifluoroacetic acid. The mixture was stirred at ambient temperature for 1 hour to remove the tert-butoxycarbonyl amino protecting group bring about. The reaction solution was concentrated to dryness under reduced pressure, and the residue was extracted twice washed with 20 ml of ethyl ether to give 1.55 g of a colorless powder which is a crude product of 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -kanamycin-C included.

Dieses Rohprodukt wurde in 15 ml Wasser aufgenommen, und die entstandene Lösung wurde auf pH = 7,2 durch Zugabe von 1N wäßrigem Ammoniak eingestellt, und dann wurde sie durch eine Säule mit einem Innendurchmesser von 20 mm mit 190 ml eines Carboxylgruppen aufweisenden Kationenaustauscherharzes in der NH^-Form (Amberlite CG-50) zur Adsorption des gewünschten Produktes durchgeschickt.Nachdem die Säule mit 660 ml WasserThis crude product was taken up in 15 ml of water, and the resulting solution was adjusted to pH = 7.2 by adding 1N aqueous ammonia, and then it was passed through a column having an inner diameter of 20 mm with 190 ml of a Carboxyl group-containing cation exchange resin in the NH ^ form (Amberlite CG-50) for the adsorption of the desired Afterwards the column with 660 ml of water

8098 15/05768098 15/0576

274H31274H31

gewaschen worden war, wurde sie mit 1940 ml O,1N wäßrigem Ammoniak und dann mit 1540 ml 0,4N wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 20-ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 75-106 des unter Verwendung von O,1N wäßrigem Ammoniak erhaltenen Eluates wurden miteinander vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 199 mg von nicht umgesetztem Kanamycin-C (Ausbeute der Gewinnung 40 %) wiedergewonnen wurden. Die Fraktionen 152-175 des unter Verwendung von 0,4N wäßrigem Ammoniak erhaltenen Eluates wurden ebenfalls miteinander vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 214 mg eines farblosen Pulvers, welches das gewünschte Produkt enthielt, erhalten wurden. Dieses Pulver wurde in 2 ml eines Mischlösungsmittels aus Chloroform-Methanol-17 %igem wäßrigem Ammoniak (1:4:2 in Volumen) suspendiert, und die erhaltene Suspension wurde durch eine Säule mit einem Innendurchmesser von 14 mm mit 50 g Kieselerdegel durchgeschickt. Die Kieselerdegelsäule wurde dann mit dem zuvor genannten Mischlösungsmittel entwickelt und das Eluat wurde in 10-ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 86-114 wurden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen. Die erhaltene, wäßrige Lösung wurde in einer Säule von 5 ml des zuvor verwendeten, Carboxylgruppen aufweisenden Kationenaustauscherbarzes in der NH^- Form (Amberlite CG-50) unter Anwendung von 0,5N wäßrigem Ammoniak als Elutionsmittel chromatographiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 49 mg reines iN-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin-C in Form eines farblosen Pulvers mit einer Ausbeute von 8,0 % erhalten wurden. Dieses Pulver besaß keinen definierten Schmelzpunkt und zersetzte sich bei 167-180 ⁰C. "⁶ = +91° (c = 1, Wasser).was washed, it was eluted with 1940 ml of 0.1N aqueous ammonia and then with 1540 ml of 0.4N aqueous ammonia. The eluate was collected in 20 ml fractions. The fractions 75-106 of the eluate obtained using 0.1N aqueous ammonia were combined and concentrated to dryness under reduced pressure, whereby 199 mg of unreacted kanamycin-C (yield 40%) were recovered. Fractions 152-175 of the eluate obtained using 0.4N aqueous ammonia were also combined and concentrated to dryness under reduced pressure to give 214 mg of a colorless powder containing the desired product. This powder was suspended in 2 ml of a mixed solvent of chloroform-methanol-17% aqueous ammonia (1: 4: 2 by volume), and the resulting suspension was passed through a column having an inner diameter of 14 mm containing 50 g of silica gel. The silica gel column was then developed with the aforementioned mixed solvent and the eluate was collected in 10 ml fractions. Fractions 86-114 were combined and concentrated to dryness under reduced pressure and the residue was taken up in water. The aqueous solution obtained was chromatographed in a column of 5 ml of the previously used, carboxyl group-containing cation exchange resin in the NH 4 form (Amberlite CG-50) using 0.5N aqueous ammonia as the eluent. The eluate was concentrated to dryness under reduced pressure, 49 mg of pure iN- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -kanamycin-C being obtained in the form of a colorless powder with a yield of 8.0%. This powder had no definite melting point and decomposed at 167-180 ⁰ C. ^"6 = + 91 ° (c = 1, water).

809815/0576809815/0576

¹¹ 274U31 ¹¹ 274U31

Example 2

Synthese von 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3' -deoxy-Synthesis of 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -3 '-deoxy-

kanamycin-Ckanamycin-C

Eine Lösung von 440 mg = 0,92 mMol der freien Base 3'-Deoxykanamycin-C (Hemihydrat) in 8,8 ml Wasser wurden auf pH =6,60 durch Zugabe von 2,75 ml 1N Salzsäure eingestellt. Zu der erhaltenen Lösung wurde tropfenweise während 10 Minuten eine Lösung von 44-9 mg = 1,42 mMol des N-Hydroxysuccinimidesters von L-4-tert.-Butoxycarbonylamino-2-hydroxybuttersäure in 4,7 ml Dimethylformamid bei Umgebungstemperatur unter Rühren zugesetzt. Die so erhaltene Mischung wurde weitere 6 Stunden bei Umgebungstemperatur zur Herbeiführung der Acylierung gerührt. Die Reaktionslösung, welche das so gebildete 1-N-(L-4-tert.-Butoxycarbonylamino-2-hydroxybutyryl) -3'-deoxykanamycin-C enthielt, wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der feste Rückstand wurde mit 11 ml einer wäßrigen Lösung von 90 %iger Trifluoressigsäure vermischt, und das Gemisch wurde auf Umgebungstemperatur zur Durchführung der Entfernung der tert.-Butoxycarbonyl-aminoschutzgruppe gerührt. Die Reaktionslösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, und der Rückstand wurde zweimal mit 20 ml Äthyläther gewaschen, wobei 2,12 g eines rohen Produktes von 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3'-deoxykanamycin-C als farbloses Pulver erhalten wurden.A solution of 440 mg = 0.92 mmol of the free base 3'-deoxykanamycin-C (Hemihydrate) in 8.8 ml of water were adjusted to pH = 6.60 by adding 2.75 ml of 1N hydrochloric acid. To the The resulting solution became a solution of 44-9 mg = 1.42 mmol of the N-hydroxysuccinimide ester dropwise over 10 minutes of L-4-tert-butoxycarbonylamino-2-hydroxybutyric acid in 4.7 ml of dimethylformamide were added at ambient temperature with stirring. The mixture thus obtained was further 6 hours stirred at ambient temperature to effect acylation. The reaction solution containing the 1-N- (L-4-tert-butoxycarbonylamino-2-hydroxybutyryl) thus formed -3'-deoxykanamycin-C contained, under reduced pressure to Concentrated to dryness. The solid residue was mixed with 11 ml of an aqueous solution of 90% trifluoroacetic acid, and the mixture was brought to ambient temperature to effect removal of the tertiary butoxycarbonyl amino protecting group touched. The reaction solution was concentrated to dryness under reduced pressure, and the residue was washed with twice Washed 20 ml of ethyl ether, with 2.12 g of a crude product of 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -3'-deoxykanamycin-C were obtained as a colorless powder.

Dieses rohe Produkt wurde in 15 ml Wasser aufgenommen, und die erhaltene, wäßrige Lösung wurde auf pH = 7,8 durch Zugabe von 1N wäßrigem Ammoniak eingestellt, und dann durch eine Säule mit einem Innendurchmesser von 20 mm mit 220 ml Carboxylgruppen aufweisendem Kationenaustauscherharz in der NH^- Form (Amberlite CG-50) zur Durchführung der Adsorption des gewünschten Produktes geschickt. Nachdem die Säule mit 1040 ml Wasser gewaschen worden war, wurde sie mit 1340 ml 0,2N wäßrigem Ammoniak und dann mit 1320 ml 0,5N wäßrigem AmmoniakThis crude product was taken up in 15 ml of water and the resulting aqueous solution was adjusted to pH = 7.8 by addition adjusted by 1N aqueous ammonia, and then through a column with an internal diameter of 20 mm with 220 ml of carboxyl groups having cation exchange resin in the NH ^ - form (Amberlite CG-50) to carry out the adsorption of the desired product. After the column was washed with 1040 ml of water, it was washed with 1340 ml of 0.2N aqueous ammonia and then with 1320 ml of 0.5N aqueous ammonia

809815/0576 "809815/0576 "

- 2ßr- - 2ßr-

^t¥ 27AH31 ^{t ¥} 27AH31

eluiert. Das Eluat wurde in 20-ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 71-80 des unter Verwendung von 0,2N wäßrigem Ammoniak erhaltenen Eluates wurden miteinander vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 149 mg von nicht-umgesetztem 3'-Deoxykanamycin-C (Ausbeute der Gewinnung 34 %) wiedergewonnen wurden. Die Fraktionen 134-145 des unter Verwendung von 0,5N wäßrigem Ammoniak erhaltenen Eluates wurden ebenfalls miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 155 mg eines farblosen, das gewünschte Produkt enthaltenden Pulvers erhalten wurden. Dieses Pulver wurde in 2 ml eines Mischlösungsmittels aus Chloroform-lthanol-17 %igem wäßrigem Ammoniak (1:4:2 in Volumen) suspendiert, und die so erhaltene Suspension wurde durch eine Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm mit 25 g Kieselerdegel hindurchgeschickt, diese wurde mit den zuvor genannten Hischlösungsmitteln anschließend entwickelt. Die abgegebene Flüssigkeit wurde in 3,2-ml-Fraktionen gesammelt. Die vereinigten Fraktionen 99-140 wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, und der feste Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und in einer Säule von 5 ml eines Carboxylgruppen aufweisenden Kationenaustauscherharzes in der NEL-Form (Amberlite CG-50) unter Verwendung von 0,5N wäßrigem Ammoniak als Elutionsmittel chromatographiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Es wurde 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3'-deoxykanamycin-C als farbloses Pulver in einer Ausbeute von 46 mg =» 8,5 % erhalten. Dieses Pulver besaß keinen definierten Schmelzpunkt, sondern zersetzte sich bei 151-160 ⁰C.
[a]j = +83° (c a 1, Wasser).eluted. The eluate was collected in 20 ml fractions. Fractions 71-80 of the eluate obtained using 0.2N aqueous ammonia were combined and concentrated to dryness under reduced pressure to recover 149 mg of unreacted 3'-deoxykanamycin-C (yield 34%). Fractions 134-145 of the eluate obtained using 0.5N aqueous ammonia were also combined and concentrated to dryness under reduced pressure to give 155 mg of a colorless powder containing the desired product. This powder was suspended in 2 ml of a mixed solvent of chloroform-ethanol-17% aqueous ammonia (1: 4: 2 by volume), and the suspension thus obtained was passed through a column having an inner diameter of 10 mm containing 25 g of silica gel, this was then developed with the aforementioned solvent solvents. The dispensed liquid was collected in 3.2 ml fractions. The combined fractions 99-140 were concentrated to dryness under reduced pressure, and the solid residue was taken up in water and placed in a column of 5 ml of a carboxyl group-containing cation exchange resin in the NEL form (Amberlite CG-50) using 0.5N chromatographed aqueous ammonia as the eluent. The eluate was concentrated to dryness under reduced pressure. 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -3'-deoxykanamycin-C was obtained as a colorless powder in a yield of 46 mg = 8.5 % . This powder had no definite melting point but decomposed at 151-160 ⁰ C.
[a] j = + 83 ° (approx. 1, water).

Example 3

Synthese von 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3' ,4* -dideoxy-Synthesis of 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -3 ', 4 * -dideoxy-

kanamycin-Ckanamycin-C

Eine Lösung von 34-0 mg » 0,74 mMol der freien Base 3'»^'-Dideoxykanamycin-C (Hemihydrat) in 7 ».5 ml Wasser wurde aufA solution of 34-0 mg » 0.74 mmol of the free base 3 '» ^' - Dideoxykanamycin-C (hemihydrate) in 7.5 ml of water was added

809815/0576809815/0576

pH = 6,70 durch Zugabe von 2,4-5 ml 1N Salzsäure eingestellt. Zu dieser Lösung wurde tropfenweise während 5 Minuten eine Lösung von 573 mg = 1,18 mMol des N-Hydroxysuccinimidesters von L-4- tert.-Butoxycarbonylamino-2-hydroxybuttersäure in 3,75 ml Dimethylformamid bei Umgebungstemperatur unter Rühren zugegeben. Das so erhaltene Gemisch wurde weiter während 6 Stunden zur Herbeiführung der Acylierung gerührt. Die das so gebildete 1-N-(L-4-tert.-Butoxycarbonylamino-2-hydroxybutyryl)-3'^'-dideoxykanamycin-C enthaltende Reaktionslösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, und der feste Rückstand wurde mit 8,5 ml einer wäßrigen Lösung von 90 %iger Trifluoressigsäure vermischt. Das Gemisch wurde während 1 Stunde bei Umgebungstemperatur zur Herbeiführung der Entfernung der tert.-Butoxycarbonyl-aminoschutzgruppe gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, und der Rückstand wurde zweimal mit 20 ml Äthyläther gewaschen, wobei 1,46 g eines rohen Produktes von 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3·,4'-dideoxykanamycin-C als farbloses Pulver erhalten wurden.Adjusted pH = 6.70 by adding 2.4-5 ml of 1N hydrochloric acid. A solution of 573 mg = 1.18 mmol of the N-hydroxysuccinimide ester was added dropwise to this solution over 5 minutes of L-4-tert-butoxycarbonylamino-2-hydroxybutyric acid in 3.75 ml of dimethylformamide at ambient temperature with stirring admitted. The mixture thus obtained was further stirred for 6 hours to cause acylation. The the 1-N- (L-4-tert-butoxycarbonylamino-2-hydroxybutyryl) -3 '^' - dideoxykanamycin-C thus formed reaction solution containing was concentrated to dryness under reduced pressure, and the solid residue was mixed with 8.5 ml of an aqueous solution of 90% trifluoroacetic acid. The mixture was during Stirred for 1 hour at ambient temperature to bring about the removal of the tert-butoxycarbonylamino protective group. That The reaction mixture was then concentrated to dryness under reduced pressure, and the residue was washed twice with 20 ml of ethyl ether washed, whereby 1.46 g of a crude product of 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -3.4'-dideoxykanamycin-C were obtained as a colorless powder.

Dieses rohe Produkt wurde in 14- ml Wasser aufgenommen, und die erhaltene, wäßrige Lösung wurde auf pH = 7>8 durch Zugabe von 1N wäßrigem Ammoniak eingestellt. Die Lösung wurde dann durch eine Säule mit einem Innendurchmesser von 20 mm mit 220 ml Carboxylgruppen aufweisendem Kationenaustauscherharz in der NH^-IOrm (Amberlite CG-50) zur Adsorption der aktiven Verbindungen hindurchgeschickt. Nachdem die Säule mit 1040 ml Wasser gewaschen worden war, wurde sie mit 1560 ml 0,2N wäßrigem Ammoniak und dann mit 1460 ml 0,5N wäßrigem Ammoniak eluiert, wobei das Eluat in 20-ml-Fraktionen aufgefangen wurde. Die Fraktionen 74—93 des mit.0,2N wäßrigem Ammoniak erhaltenen Eluates wurden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 143 dg von nicht umgesetztem 3',4'-Dideoxykanamycin-C (Ausbeute derThis crude product was taken up in 14 ml of water, and the aqueous solution obtained was adjusted to pH = 7> 8 by adding 1N aqueous ammonia. The solution then became through a column with an internal diameter of 20 mm with 220 ml of cation exchange resin containing carboxyl groups in the NH ^ -IOrm (Amberlite CG-50) for adsorption of the active Connections sent through. After the column was washed with 1040 ml of water, it was washed with 1560 ml of 0.2N aqueous ammonia and then with 1460 ml of 0.5N aqueous ammonia, the eluate being collected in 20 ml fractions became. Fractions 74-93 of the 0.2N aqueous ammonia Eluates obtained were combined with one another and concentrated to dryness under reduced pressure, whereby 143 dg of unreacted 3 ', 4'-dideoxykanamycin-C (yield of

809815/0576809815/0576

274H31274H31

Gewinnung 45 %) wiedergewonnen wurden. Die Fraktionen 152-168 des mit O,5N wäßrigem Ammoniak erhaltenen Eluates wurden ebenfalls miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 116 mg eines farblosen Pulvers erhalten wurden, welches das gewünschte Produkt enthielt.Recovery 45 %) were recovered. The fractions 152-168 of the eluate obtained with 0.5N aqueous ammonia were also combined with one another and concentrated to dryness under reduced pressure, 116 mg of a colorless powder containing the desired product being obtained.

Dieses Pulver wurde in 2 ml eines Mischlösungsmittels aus Chloroform-Äthanol-17 %igem wäßrigem Ammoniak (1:4:2 in Volumen) suspendiert, und die erhaltene Suspension wurde auf eine Säule mit einem Innendurchmesser von 10 mm von 25 g Kieselerdegel aufgegeben, diese wurde dann mit dem zuvor genannten Mischlösungsmittel eluiert. Die abgegebene Flüssigkeit wurde in 3,2-ml-Fraktionen aufgefangen, und die Fraktionen 71-96 wurden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in Wasser aufgelöst, und die Lösung wurde in einer Säule von 5 ml Carboxylgruppen aufweisendem Kationenaustauscherharz in der NH^-Form (Amberlite CG-50) in der gleichen Weise wie zuvor unter Verwendung von 0,5N wäßrigem Ammoniak als Elutionsmittel chromatographiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 35 mg 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-3',4^l-dideoxykanamycin-C als farbloses Pulver in einer Ausbeute von 8,3 % erhalten wurden. Dieses Produkt zeigte keinen definierten Schmelzpunkt, sondern zersetzteThis powder was suspended in 2 ml of a mixed solvent of chloroform-ethanol-17% aqueous ammonia (1: 4: 2 by volume), and the resulting suspension was applied to a column having an inner diameter of 10 mm of 25 g of silica gel, this was then eluted with the aforementioned mixed solvent. The discharged liquid was collected in 3.2 ml fractions, and fractions 71-96 were combined and concentrated to dryness under reduced pressure. The residue was dissolved in water and the solution was chromatographed on a column of 5 ml of carboxyl group-containing cation exchange resin in the NH 4 form (Amberlite CG-50) in the same manner as before using 0.5N aqueous ammonia as the eluent. The eluate was concentrated to dryness under reduced pressure, 35 mg of 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -3 ', 4 ^l -dideoxykanamycin-C being obtained as a colorless powder in a yield of 8.3% became. This product did not show a defined melting point, but rather decomposed

ei 142-158 ⁰C.ei 142-158 ⁰ C.

= +76° (c = 1, Wasser).= + 76 ° (c = 1, water).

Example 4

Es wurden die folgenden Untersuchungen durchgeführt, um abzuschätzen, wie der pH-Wert des Reaktionsmediums, in welchem die Acylierungsreaktion ablief, die Ausbeute an gewünschtem, erhaltenem Acylierungsprodukt, 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin-C, beeinflußte.The following tests were carried out to estimate such as the pH of the reaction medium in which the acylation reaction took place, the yield of the desired, acylation product obtained, 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -kanamycin-C, influenced.

809815/0576 -809815/0576 -

sich bei 142-158 ⁰C.at 142-158 ⁰ C.

27AU3127AU31

Es wurden Lösungen, von denen jede 50 mg = 0,10 mMol der freien Base von Kanamycin-C (Hemihydrat) in 0,5 - 1,0 ml Wasser enthielt hergestellt und auf unterschiedliche pH-Werte durch Zugabe von variierenden Volumina an 1N Salzsäure eingestellt. Zu jeder Lösung wurde tropfenweise eine Lösung von 49 mg = 0,15 mMol des N-Hydroxysuccinimidesters von L-4-tert.-butoxycarbonylamino-2-hydroxybuttersäure bei Umgebungstemperatur unter Rühren hinzugesetzt. Das auf diese Weise erhaltene Gemisch wurde 6 Stunden zur Herbeiführung der Acylierung gerührt. Die Reaktionslösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, und der feste Rückstand wurde in 1,2 - 1,4 ml wäßriger 90 %iger Trifluoressigsäure aufgenommen. Die erhaltene Lösung wurde 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt, und die Reaktionslösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde mit Äthyläther gewaschen, wobei ein rohes Produkt anfiel. Dieses rohe Produkt wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 unter Verwendung einer Säule mit einem Innendurchmesser von 12 mm mit 20 ml des Carboxylgruppen aufweisenden Kationenaustauscherharzes in der NH^-Form (Amberlite CG-50) chromatographiert, so daß das nicht umgesetzte Kanamycin-C in reinem Zustand gewonnen wurde und ein rohes Pulver, welches 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin-C enthielt, erhalten wurde. Die Gehalte von 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin-C in den so erhaltenen, rohen Pulvern wurden durch Messung der antibakteriellen Potenz nach einer standardmäßigen Schalen-Platten-Untersuchungsmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 als Testorganismus bestimmt. In der folgenden Tabelle II sind die Ausbeuten von wiedergewonnenem, nicht umgesetztem Kanamycin-C und die Ausbeuten des gebildeten, gewünschten Produktes zusammen mit dem pH-Wert der wäßrigen Lösung des Ausgangs-Kanamycin-C, des zur Auflösung des Ausgangs-Kanamycin-C verwendeten Wasservolumens und des zur Einstellung des pH-Wertes zugesetzten Volumens der 1N Salzsäure angegeben.There were solutions, each of which 50 mg = 0.10 mmol of the Kanamycin-C free base (hemihydrate) contained in 0.5-1.0 ml of water and prepared on different pH values by adding varying volumes of 1N hydrochloric acid set. A solution of 49 mg = 0.15 mmol of the N-hydroxysuccinimide ester was added dropwise to each solution of L-4-tert-butoxycarbonylamino-2-hydroxybutyric acid Ambient temperature added with stirring. The mixture thus obtained was used for 6 hours Induction of acylation stirred. The reaction solution was concentrated to dryness under reduced pressure, and the solid residue became more aqueous in 1.2-1.4 ml 90% trifluoroacetic acid added. The resulting solution was stirred at ambient temperature for 1 hour, and the The reaction solution was concentrated to dryness under reduced pressure. The residue was washed with ethyl ether, whereby a raw product was obtained. This crude product was prepared in the same manner as in Example 1 using a Column with an internal diameter of 12 mm with 20 ml of the cation exchange resin containing carboxyl groups in the NH ^ form (Amberlite CG-50) chromatographed so that the unreacted kanamycin-C was obtained in the pure state and a crude powder containing 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -kanamycin-C was obtained. The contents of 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -kanamycin-C in the The raw powders thus obtained were determined by measuring the antibacterial potency by a standard dish and plate inspection method using Bacillus subtilis PCI 219 as the test organism. In the following table II are the yields of recovered unreacted kanamycin-C and the yields of the desired one formed Product together with the pH of the aqueous solution of the starting kanamycin-C, the one used to dissolve the starting kanamycin-C volume of water used and the volume of 1N hydrochloric acid added to adjust the pH.

809815/0576 -809815/0576 -

Table II

pH- Wasser- Volumen Ausbeute an wie- Ausbeute an gebil-Wert volumen von 1N dergewonnenem detem, gewünschtem (ml) HCl (ml) Kanamycin-C (%) Produkt (%)pH- water- volume yield of as- yield of gebil value volume of 1N of the recovered, desired (ml) HCl (ml) Kanamycin-C (%) product (%)

6,306.30 0,50.5 0,320.32 ^3^ 3 6,756.75 1,01.0 0,300.30 3838 7,407.40 0,50.5 0,210.21 2727 8,358.35 1,01.0 0,100.10 2222nd

18 23 19 1218 23 19 12

Die in den Beispielen 2 und 3 verwendeten Verbindungen 3'-Deoxykanamycin-C und 3',^-'-Dideoxykanamycin-C sind neue Verbindungen, die nach der folgenden Arbeitsweise hergestellt werden können (siehe britische Patentanmeldung 12 266/77 und US-Patentanmeldung SN 799 806 der Anmelderin):The compounds 3'-deoxykanamycin-C used in Examples 2 and 3 and 3 ', ^ -'- Dideoxykanamycin-C are new compounds, which can be prepared by the following procedure (see British patent application 12 266/77 and US patent application SN 799 806 of the applicant):

3^I-Deoxykanamycin-B oder 3¹,^'-Dideoxykanamycin-B wird mit tert.-Butylchlorformiat oder ter^-Butyl-S-^-jo-dimethylpyrimid-2-ylthiocarbonat, das als Reagens zur Einführung der tert.-Butoxycarbonyl-aminoschutzgruppe bekannt ist, umgesetzt. Auf diese Weise wird 6^l-N-tert.-Butoxycarbonyl-3'-deoxykanamycin-B oder -3' ,V-dideoxykanamycin-B hergestellt. Diese werden dann mit Essigsäureanhydrid zum Schützen der 1,3»2'- und 3"-Aminogruppen der Deoxykanamycin-B-Verbindung mit der anderen Art von Aminoschutzgruppe, der Acetylgruppe, umgesetzt, wodurch 6¹-N-tert.-Butoxycarbonyl-tetra-N-acetyl-3'-deoxykanamycin-B oder -3¹ ,V-dideoxykanamycin-B hergestellt wird. Wenn dieses Produkt mit wäßriger 90 %iger Trifluoressigsaure behandelt wird, erfolgt die bevorzugte Entfernung der tert.-Butoxycarbonylgruppe, wobei 1,3»2',3"-Tetra-N-acetyl-3^l-deoxykanamycin-B oder -3' ,V-dideoxykanamycin-B erhalten wird. 1,3,2' ,3^M-Tetra-N-acetyl-3'-deoxykanamycin-B oder -3¹,^'-dideoxykanamycin-B wird in wäßriger Essigsäure aufgelöst, und die erhaltene Lösung wird mit wäßrigem Natriumnitrit behandelt, wobei die 6'-Aminogruppe in die 6*-Hydroxylgruppe umgewandelt wird und 1,3»2',3"-Tetra-N-acetyl^'-deoxykanamycin-C oder -3¹ ,^'-dideoxykanamycin-C3 ^I -Deoxykanamycin-B or 3 ¹ , ^ '- Dideoxykanamycin-B is treated with tert-butyl chloroformate or tert-butyl-S - ^ - jo-dimethylpyrimid-2-ylthiocarbonate, which is used as a reagent to introduce the tert-butoxycarbonyl -amino protective group is known, implemented. In this way, 6 ^l -N-tert-butoxycarbonyl-3'-deoxykanamycin-B or -3 ', V-dideoxykanamycin-B is prepared. These are then reacted with acetic anhydride to protect the 1,3 »2 'and 3" amino groups of the deoxykanamycin B compound with the other type of amino protective group, the acetyl group, whereby 6 ¹ -N-tert-butoxycarbonyl-tetra -N-acetyl-3'-deoxykanamycin-B or -3 ¹ , V-dideoxykanamycin-B. When this product is treated with aqueous 90% trifluoroacetic acid, the preferred removal of the tert-butoxycarbonyl group occurs, with 1,3 "2 ', 3" -Tetra-N-acetyl-3 ^l -deoxykanamycin-B or -3', V-dideoxykanamycin-B is obtained. 1,3,2 ', 3 ^M -Tetra-N-acetyl-3'-deoxykanamycin-B or -3 ¹ , ^' - dideoxykanamycin-B is dissolved in aqueous acetic acid and the resulting solution is treated with aqueous sodium nitrite, whereby the 6'-amino group is converted to the 6 * -hydroxyl group and 1,3 »2 ', 3" -Tetra-N-acetyl ^' - deoxykanamycin-C or -3 ¹ , ^ '- dideoxykanamycin-C

8 0 9 8 15/0576"8 0 9 8 15/0576 "

erhalten wird. Wenn die zuletzt genannten Verbindungen zur Entfernung der Acetyl-aminoschutzgruppen behandelt werden, z. B. durch alkalische Hydrolyse mit wäßriger 2N wäßriger Natriumhydroxidlösung, wird 3¹ -Deoxykanarnycin-C oder 3'»4'-Dideoxykanamycin-C gebildet.is obtained. If the latter compounds are treated to remove the acetyl-amino protecting groups, e.g. B. by alkaline hydrolysis with aqueous 2N aqueous sodium hydroxide solution, 3 ¹ -deoxykanamycin-C or 3 '»4'-dideoxykanamycin-C is formed.

Die Herstellung von 3¹-Deoxykanamycin-C oder 3'»4'-Dideoxykanamycin-C kann i~ einer ähnlichen Weise wie dem zuvor beschriebenen Verfahrensweg durch Schützen der 6'-Aminogruppe von 3' -Deoxykanamycin-B oder 3' ,4-' -Dideoxykanamycin-B mit der Benzyloxycarbonylgruppe durchgeführt werden. Zu diesem Zweck wird Benzyloxycarbonylchlorid als Reagens zur Einführung der Benzyloxycarbonyl-aminoschutzgruppe verwendet. In diesem Fall kann die Entfernung der Benzyloxycarbonylgruppe aus dem 6'-N-Benzyloxycarbonyl-tetra-N-acetyl-3'-deoxykanamycin-B oder -3¹,4'-dideoxykanamycin-B, welche als Zwischenprodukt gebildet werden, durch konventionelle Hydrogenolyse bzw. Wasserstoffspaltung über einem Palladiumkatalysator oder Platinkatalysator durchgeführt werden.The preparation of 3 ¹ -deoxykanamycin-C or 3 '»4'-dideoxykanamycin-C can i ~ in a manner similar to the previously described process route by protecting the 6'-amino group of 3' -deoxykanamycin-B or 3 ', 4- '-Dideoxykanamycin-B can be carried out with the benzyloxycarbonyl group. For this purpose, benzyloxycarbonyl chloride is used as the reagent for introducing the benzyloxycarbonyl-amino protecting group. In this case, the removal of the benzyloxycarbonyl group from the 6'-N-benzyloxycarbonyl-tetra-N-acetyl-3'-deoxykanamycin-B or -3 ¹ , 4'-dideoxykanamycin-B, which are formed as an intermediate, by conventional hydrogenolysis or hydrogen splitting can be carried out over a palladium catalyst or platinum catalyst.

Die Herstellung von 3'-Deoxykanamycin-C und 3¹»4¹-Dideoxykanamycin-C wird im folgenden in den Beispielen 5 und 6 näher erläutert.The preparation of 3'-deoxykanamycin-C and 3 ¹ »4 ¹ -dideoxykanamycin-C is explained in more detail in Examples 5 and 6 below.

Example 5

Synthese von 3'-Deoxykanamycin-CSynthesis of 3'-deoxykanamycin-C

(a) Eine Lösung von 2,0 g = 4,3 mMol 3'-Deoxykanamycin-B in 40 ml Wasser wurde mit einer Lösung von 1,03 6 = 4,7 mMol t-Butyl-S^^-dimethylpyrimid^-ylthiocarbonat in 40 ml Dioxan zusammengemischt, und das so erhaltene Gemisch wurde 24 Stunden bei Umgebungstemperatur geinihrt. Das Reaktionsgemisch wurde dann unter vermindertem Druck zur Trockne (a) A solution of 2.0 g = 4.3 mmol of 3'-deoxykanamycin-B in 40 ml of water was with a solution of 1.03 6 = 4.7 mmol t-Butyl-S ^^ - dimethylpyrimid ^ -ylthiocarbonate in 40 ml Dioxane mixed together and the resulting mixture became Aging for 24 hours at ambient temperature. The reaction mixture then went to dryness under reduced pressure

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27ΑΗ3127-31

eingeengt, und der feste Rückstand wurde in 32 ml Wasser aufgenommen. Die erhaltene» wäßrige Lösung wurde durch eine Säule von 160 ml des zuvor genannten Kationenaustauscherharzes in der Ammoniumform (Amberlite CG-50) zur Adsorption des gebildeten 6'-N-t-Butoxycarbonyl-3'-äeoxykanamycin-B geschickt. Die Ionentauscherharzsäule wurde mit 800 ml Wasser gewaschen und dann mit 800 ml 0,1N wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 15-ml-Fraktionen aufgefangen, und die Fraktionen 26 - 42 wurden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 1,06 g eines weißgefärbten Pulvers erhalten wurden, welches 6'-N-t-Butoxycarbonyl-3'-deoxykanamycin-B enthielt. Ausbeute » 44 %. Die Ionenaustauscherharzsäule wurde weiter mit 0,5N wäßrigem Ammoniak eluiert, wobei 452 mg von nicht umgesetztem 3'-Deoxykanamycin-B erhalten wurden.concentrated, and the solid residue was taken up in 32 ml of water. The aqueous solution obtained was passed through a column of 160 ml of the aforementioned cation exchange resin in the ammonium form (Amberlite CG-50) for adsorption of the 6'-Nt-butoxycarbonyl-3'-eoxykanamycin-B formed. The ion exchange resin column was washed with 800 ml of water and then eluted with 800 ml of 0.1N aqueous ammonia. The eluate was collected in 15 ml fractions and fractions 26-42 were combined and concentrated to dryness under reduced pressure to give 1.06 g of a white colored powder containing 6'-Nt-butoxycarbonyl-3'- contained deoxykanamycin-B. Yield »44 %. The ion exchange resin column was further eluted with 0.5N aqueous ammonia to obtain 452 mg of unreacted 3'-deoxykanamycin-B.

(b) Eine Lösung von 211 mg = 0,37 mMol 6'-N-t-Butoxycarbonyl-3¹-deoxykanamycin-B in 5 ml Methanol wurde mit 2,5 ml Essigsäureanhydrid zusammengemischt, und das Gemisch wurde 5 Stunden bei Umgebungstemperatur zur Acetylierung der restlichen Aminogruppen gerührt. Die Reaktionslösung wurde mit einem Volumen Wasser zusammengemischt und dann zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein Pulver erhalten wurd?, welches 6^l-N-t-Butoxycarbonyl-tetra-N-acetyl-3^l-deoxykanamycin-B enthielt. Ausbeute » 296 mg.(b) A solution of 211 mg = 0.37 mmol of 6'-Nt-butoxycarbonyl-3 ¹ -deoxykanamycin-B in 5 ml of methanol was mixed together with 2.5 ml of acetic anhydride and the mixture was allowed to acetylate for 5 hours at ambient temperature remaining amino groups stirred. The reaction solution was mixed together with one volume of water and then concentrated to dryness under reduced pressure to obtain a powder containing 6 ^L -Nt-butoxycarbonyl-tetra-N-acetyl-3 ^L -deoxykanamycin-B. Yield »296 mg.

(c) 235 mg des in der vorangegangenen Strafe (b) dieses Beispiels erhaltenen Produktes wurden in 2 ml einer wäßrigen Lösung von 90 %iger Trifluoressigsäure aufgelöst, und die erhaltene Mischung wurde 45 Minuten bei Umgebungstemperatur stehen gelassen, um die Entfernung der 6'-Butoxycarbonylgruppe herbeizuführen. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, und der erhaltene, feste Rückstand wurde mit etwa 2 ml Äthyläther gewaschen, wobei(c) 235 mg of the product obtained in the previous item (b) of this example was dissolved in 2 ml of an aqueous Solution of 90% trifluoroacetic acid dissolved, and the The resulting mixture was allowed to stand for 45 minutes at ambient temperature to remove the 6'-butoxycarbonyl group bring about. The reaction mixture was concentrated to dryness under reduced pressure, and the resulting solid The residue was washed with about 2 ml of ethyl ether, whereby

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- vr- - vr-

H 27AU31H 27AU31

227 mg eines weiß gefärbten Pulvers erhalten wurden, welches das Tetra-N-acetylderivat, nämlich 1,3,2',3"-Tetra-N-acetyl-3'-deoxykanamycin-B , enthielt.227 mg of a white colored powder were obtained, which the tetra-N-acetyl derivative, namely 1,3,2 ', 3 "-Tetra-N-acetyl-3'-deoxykanamycin-B , contained.

(d) 193 mg des in der vorangegangenen Stufe (c) dieses Beispiels erhaltenen, pulverförmigen Produktes wurden in 3*2 ml einer wäßrigen Lösung von 33 %iger Essigsäure aufgelöst, und zu der erhaltenen Lösung wurden eine Lösung von 265 mg Natriumnitrit in 3>2 ml Wasser und dann 1,6 ml Essigsäure unter Kühlung mit Eis und Rühren hinzugegeben. Las so erhaltene Gemisch wurde 1 Stunde unter Kühlung mit Eis und anschließend 16 Stunden bei Umgebungstemperatur zur Durchführung der Reaktion, bei welcher die 6¹-Aminogruppe in die 6'-Hydroxylgruppe umgewandelt wurde, gerührt. Die Reaktionslösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 240 mg eines festen Rückstandes erhalten wurden. Dieser Feststoff, welcher 1,3,2',3"-Tetra-N-acetyl-3'-deoxykanamycin-C enthielt, wurde in 4 ml wäßriger 2N Natriumhydroxidlösung aufgenommen, und die erhaltene Mischung wurde 7 Stunden unter Rückfluß erhitzt, um die Entfernung der Acetylgruppen herbeizuführen .(d) 193 mg of the powdery product obtained in the previous step (c) of this example was dissolved in 3 × 2 ml of an aqueous solution of 33% acetic acid, and a solution of 265 mg of sodium nitrite in 3% was added to the resulting solution 2 ml of water and then 1.6 ml of acetic acid were added while cooling with ice and stirring. The resulting mixture was stirred for 1 hour while cooling with ice and then for 16 hours at ambient temperature to conduct the reaction in which the 6 ¹ -amino group was converted to the 6'-hydroxyl group. The reaction solution was concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 240 mg of a solid residue. This solid, which contained 1,3,2 ', 3 "-Tetra-N-acetyl-3'-deoxykanamycin-C, was taken up in 4 ml of aqueous 2N sodium hydroxide solution, and the resulting mixture was refluxed for 7 hours to obtain the To bring about removal of the acetyl groups.

Die so erhaltene Reaktionslösung wurde mit 200 ml Wasser vermischt und dann durch eine Säule mit einem Innendurchmesser von 1,6 cm mit 50 ml des zuvor genannten Kationenaustauscherharzes mit 70 % in der Ammoniumform (Amberlite CG-50) zur Adsorption des so gebildeten Kanamycin-C-derivates geschickt. Die Harzsäule wurde mit 250 ml Wasser gewaschen und dann mit 0,5^ wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 10-ml-Fraktionen aufgefangen, und die Fraktionen 58 und wurden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 89 mg eines rohen Pulvers von 3'-Deoxykanamycin-C erhalten wurden. Dieses rohe Pulver wurde in 2 ml Wasser aufgenommen, und die erhaltene, wäßrige LösungThe reaction solution thus obtained was mixed with 200 ml of water and then passed through a column having an inner diameter 1.6 cm with 50 ml of the aforementioned cation exchange resin with 70% in the ammonium form (Amberlite CG-50) for adsorption of the kanamycin-C derivative formed in this way sent. The resin column was washed with 250 ml of water and then eluted with 0.5 ^ aqueous ammonia. The eluate was collected in 10 ml fractions, and fractions 58 and were combined and concentrated to dryness under reduced pressure, yielding 89 mg of a crude powder of 3'-deoxykanamycin-C were obtained. This crude powder was taken up in 2 ml of water, and the aqueous solution obtained

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274U31274U31

wurde erneut unter Verwendung einer Säule mit einem Innendurchmesser von 0,75 cm mit 10 ml des zuvor genannten Kationenaustauscherharzes in der Ammoniumform (Amberlite CG-50) in einer solchen Weise chromatographiert, daß nach dem Waschen mit 30 ml Wasser die Harzsäule mit 45 ml O,1N wäßrigem Ammoniak und dann mit 45 ml 0,2N wäßrigem Ammoniak eluiert wurde. Das Eluat wurde in 1-ml-Fraktionen aufgefangen, und die Fraktionen 78-91 wurden nach ihrer Vereinigung unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Es wurden 54 mg =■ 0,11 mMol farbloses, gereinigtes Pulver von 3'-Deoxykanamycin-C erhalten. Ausbeute = 45 %. was again chromatographed using a column with an inner diameter of 0.75 cm with 10 ml of the aforesaid cation exchange resin in the ammonium form (Amberlite CG-50) in such a manner that after washing with 30 ml of water, the resin column with 45 ml of O , 1N aqueous ammonia and then with 45 ml of 0.2N aqueous ammonia. The eluate was collected in 1 ml fractions, and fractions 78-91 after being combined were concentrated to dryness under reduced pressure. 54 mg = 0.11 mmol of colorless, purified powder of 3'-deoxykanamycin-C were obtained. Yield = 45 %.

Example 6

Synthese von 3',4^I-Dideoxykanamycin-CSynthesis of 3 ', 4 ^I -dideoxykanamycin-C

(a) Zu einer Lösung von 13»53 g = 30 mMol 3¹,4'-Dideoxykanamycin-B in 135 ml Wasser wurde tropfenweise während 1 Stunde 5,61 g = 33 mMol Benzyloxycarbonylchlorid unter Kühlung mit Eis und fiühren gegeben. Nach dem Abschluß der tropfenweisen Zugabe wurde das so erhaltene Gemisch 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt, und der gebildete Niederschlag wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde mit 135 ml Ithyläther gewaschen und die wäßrige Schicht wurde durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak neutralisiert und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Die so erhaltene, konzentrierte Lösung wurde durch eine Säule mit 480 ml eines Carboxylgruppen aufweisenden Kationenaustauscherharzes in der Ammoniumform (Amberlite CG-50) zur Adsorption des gebildeten 6'-N-Benzyloxycarbonyl-3' ,4-'-dideoxykanamycin-B geschickt. Die Ionentauschersäule wurde mit 1920 ml Wasser gewaschen und dann mit O,1N wäßrigem Ammoniak eluiert. Der erste Durchlauf von 960 ml des Eluates wurde verworfen, und der nachfolgende Durchlauf von 780 ml wurde aufgefangen und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 5,4-3 S eines weiß gefärbten Pulvers erhalten wurden, welches 6'-N-Benzyloxycarbonyl-3',4*-dideoxykanamycin-B enthielt. Ausbeute =■ 31 %·(a) To a solution of 13.53 g = 30 mmol of 3 ¹ , 4'-dideoxykanamycin-B in 135 ml of water, 5.61 g = 33 mmol of benzyloxycarbonyl chloride was added dropwise over 1 hour while cooling with ice and stirring. After the completion of the dropwise addition, the resulting mixture was stirred at ambient temperature for 1 hour and the precipitate formed was removed by filtration. The filtrate was washed with 135 ml of ethyl ether, and the aqueous layer was neutralized by adding aqueous ammonia and then concentrated under reduced pressure. The concentrated solution thus obtained was passed through a column with 480 ml of a carboxyl group-containing cation exchange resin in the ammonium form (Amberlite CG-50) to adsorb the 6'-N-benzyloxycarbonyl-3 ', 4 -'-dideoxykanamycin-B formed. The ion exchange column was washed with 1920 ml of water and then eluted with 0.1N aqueous ammonia. The first pass of 960 ml of the eluate was discarded and the subsequent pass of 780 ml was collected and concentrated to dryness under reduced pressure to give 5.4-3% of a white colored powder containing 6'-N-benzyloxycarbonyl- 3 ', 4 * -dideoxykanamycin-B. Yield = ■ 31%

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^Ji 27AU31 ^Ji 27AU31

Die Säule wurde weiter mit 0,5N wäßrigem Ammoniak eluiert, wobei 2,7 g nicht umgesetztes 3' »4-¹ -Dideoxykanamycin-B gewonnen wurden.The column was further eluted with 0.5N aqueous ammonia, whereby 2.7 g of unreacted 3 '»4- ¹ -dideoxykanamycin-B was obtained.

(b) 1,59 g = 2,72 mMol 6' -N-Benzyloxycarbonyl-3' ,V-dideoxykanamycin-B wurden mit 160 ml Essigsäureanhydrid und 16 g Natriumacetat vermischt, und das so erhaltene Gemisch wurde 2 Stunden unter Rückfluß auf 110 ⁰C erhitzt;, um die Acetylierung herbeizuführen. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, und der feste Rückstand wurde mit etwa 100 ml Aceton extrahiert. Der Extrakt in Aceton wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 2,5 g eines Feststoffes zurückblieben. Dieser Feststoff wurde in 10 ml Chloroform aufgenommen, und die erhaltene Lösung wurde durch eine Säule mit einem Innendurchmesser von 2,6 cm mit 150 g Kieselerdegel zur Adsorption des gebildeten Acetylierungsproduktes geschickt. Die Kieselerdegelsäule wurde mit 350 ml Chloroform gewaschen und dann auf einanderfolgend mit 900 ml Chloroform-Methanol (30:1 in Volumen), mit 900 ml Chloroform-Methanol (15:1 in Volumen) und mit Chloroform-Methanol (10:1 in Volumen) eluiert. Das Eluat wurde in etwa 14-ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 91-1^-9 wurden nach der Vereinigung unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 1,80 g eines weiß gefärbten Pulvers erhalten wurden, welches 6'-N-Benzyloxycarbonyltetra-N-acetyl-tetra-0-acetyl-3',4'-dideoxykanamycin-B enthielt,(b) 1.59 g = 2.72 mmol of 6 '-N-benzyloxycarbonyl-3', V-dideoxykanamycin-B were mixed with 160 ml of acetic anhydride and 16 g of sodium acetate, and the resulting mixture was refluxed at 110 for 2 hours ⁰ C heated; in order to bring about the acetylation. The reaction mixture was concentrated to dryness under reduced pressure and the solid residue was extracted with about 100 ml of acetone. The extract in acetone was concentrated to dryness under reduced pressure, leaving 2.5 g of a solid. This solid was taken up in 10 ml of chloroform, and the resulting solution was passed through a column with an inner diameter of 2.6 cm with 150 g of silica gel to adsorb the acetylation product formed. The silica gel column was washed with 350 ml of chloroform and then successively with 900 ml of chloroform-methanol (30: 1 by volume), with 900 ml of chloroform-methanol (15: 1 by volume) and with chloroform-methanol (10: 1 by volume ) eluted. The eluate was collected in approximately 14 ml fractions. Fractions 91-1 ^ -9 were combined to dryness under reduced pressure to give 1.80 g of a white colored powder which was 6'-N-benzyloxycarbonyl-tetra-N-acetyl-tetra-0-acetyl-3 ', 4'-dideoxykanamycin-B contained,

(c) 1,18 g des in der vorangegangenen Stufe (b) dieses Beispiels erhaltenen, weiß gefärbten Pulvers wurden in einem Gemisch aus 20 ml Methanol und 5 ^l Wasser aufgelöst, und die erhaltene Lösung wurde der katalytischen Reduktion während 4-5 Minuten unter einer Wasserstoff strömung über 1,61 g eines 5 % Palladium-auf-Bariumcarbonat-katalysators, welcher zu der(c) 1.18 g of the white colored powder obtained in the foregoing step (b) of this example was dissolved in a mixture of 20 ml of methanol and 5 ^ 1 of water, and the resulting solution was subjected to catalytic reduction for 4-5 minutes under a hydrogen flow over 1.61 g of a 5 % palladium-on-barium carbonate catalyst, which to the

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27AU3127AU31

Lösimg zugesetzt worden war, unterworfen, so daß die Benzyloxycarbonylgruppe entfernt wurde. Nach der Entfernung des Katalysators durch Filtration wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 942 mg eines weiß gefärbten Pulvers des 6'-Aminoderivates erhalten wurden, d. h. 1,3,2' ,3"-Tetra-N-acetyl-5,2" ,4" ,6"-tetra-0-acetyl-3¹,4'-dideoxykanamycin-B. Dissolution had been added, so that the benzyloxycarbonyl group was removed. After removing the catalyst by filtration, the reaction mixture was concentrated to dryness under reduced pressure to give 942 mg of a white colored powder of the 6'-amino derivative, ie 1,3,2 ', 3 "-etra-N-acetyl-5 , 2 ", 4", 6 "-tetra-0-acetyl-3 ¹ , 4'-dideoxykanamycin-B.

(d) 942 mg des in der vorangegangenen Stufe (c) dieses Beispiels erhaltenen, weiß gefärbten Pulvers wurden in 16 ml einer Lösung von 33 % Essigsäure in Wasser aufgelöst, und zu der erhaltenen Lösung wurden 16 ml einer Lösung von 1,24 g Natriumnitrit und dann 8 ml Essigsäure unter Kühlung mit Eis und Rühren hinzugegeben. Das so erhaltene Gemisch wurde 1 Stunde unter Kühlung mit Eis und dann 3 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, um die Umwandlung der 6'-Aminogruppe in die 6*-Hydroxylgruppe herbeizuführen. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, und der feste Rückstand wurde in 3 nil Chloroform aufgelöst. Die Chlorofornilösung wurde durch eine Säule mit einem Innendurchmesser von 2 cm mit 100 g Kieselerdegel hindurchgeschickt, diese wurde dann mit 210 ml Chloroform gewaschen und anschließend aufeinander folgend mit 660 ml Chloroform-Methanol (50:1 in Volumen), mit 1750 ml Chloroform-Methanol (30:1 in Volumen), mit 900 ml Chloroform-Methanol (10:1 in Volumen) und mit 700 ml Chloroform-Methanol (5:1 in Volumen) eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von etwa 14 ml aufgefangen. Die Fraktionen 220-270 wurden nach der Vereinigung unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 587 mg eines weiß gefärbten Pulvers von Tetra-N-acetyl-tetra-0-acetyl-3',4'-dideoxykanamycin-C erhalten wurden.(d) 942 mg of the white colored powder obtained in the previous step (c) of this example was dissolved in 16 ml of a solution of 33 % acetic acid in water, and to the resulting solution was added 16 ml of a solution of 1.24 g of sodium nitrite and then 8 ml of acetic acid were added while cooling with ice and stirring. The resulting mixture was stirred for 1 hour while cooling with ice and then for 3 hours at ambient temperature to effect the conversion of the 6'-amino group to the 6 * -hydroxyl group. The reaction mixture was concentrated to dryness under reduced pressure, and the solid residue was dissolved in 3 ml of chloroform. The chloroform solution was passed through a column having an inner diameter of 2 cm with 100 g of silica gel, which was then washed with 210 ml of chloroform and then successively with 660 ml of chloroform-methanol (50: 1 by volume) with 1750 ml of chloroform-methanol (30: 1 by volume), eluted with 900 ml of chloroform-methanol (10: 1 by volume) and with 700 ml of chloroform-methanol (5: 1 by volume). The eluate was collected in fractions of approximately 14 ml. The fractions 220-270 after the combination were concentrated to dryness under reduced pressure to give 587 mg of a white colored powder of tetra-N-acetyl-tetra-0-acetyl-3 ', 4'-dideoxykanamycin-C.

234 mg dieses weiß gefärbten Pulvers wurden in 4 ml 2JS wäßriger Natriumhydroxidlösung aufgenommen, und die erhaltene Lösung wurde 7 Stunden unter Rückfluß erhitzt, um die Entfernung der Acetylgruppen herbeizuführen. Die Reaktionslösung wurde in 200 ml Wasser aufgelöst und dann durch eine Säule mit einem234 mg of this white colored powder was taken up in 4 ml of 2JS aqueous sodium hydroxide solution, and the resulting solution was refluxed for 7 hours to remove the acetyl groups. The reaction solution was dissolved in 200 ml of water and then passed through a column with a

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Innendurchmesser von 1,6 cm mit 50 ml eines Carboxylgruppen aufweisenden Kationenaustauscherharzes mit 70 % in der Ammoniumform (Amberlite CG-50) zur Adsorption des gewünschten Produktes hindurchgeschickt. Nach dem Waschen mit 250 ml Wasser wurde die Ionenaustauschersäule mit 0,5N wäßrigem Ammoniak eluiert, wobei 122 mg eines rohen Pulvers von 3',V-Dideoxykanamycin-C erhalten wurden. Eine Lösung dieses rohen Pulvers in 2 ml Wasser wurde durch eine Säule mit einem Innendurchmesser von 0,8 cm mit 14- ml des zuvor genannten Kationenaustauscherharzes in der NH^-Form (Amberlite CG-50) zur Adsorption des gewünschten Produktes hindurchgeschickt. Nach dem Waschen mit 4-5 ml Wasser wurde die Ionenaustauschersäule mit 4-0 ml 0,05N wäßrigem Ammoniak, dann mit 70 ml O,1N wäßrigem Ammoniak und abschließend mit 70 ml 0,2N wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in 1-ml-Fraktionen aufgefangen, und die Fraktionen 119-14-6 wurden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei 90 mg eines farblosen, gereinigten Pulvers von 3'»V-Dideoxykanamycin-C anfielen. Gesamtausbeute = 23 %· Inside diameter of 1.6 cm with 50 ml of a cation exchange resin containing carboxyl groups with 70% in the ammonium form (Amberlite CG-50) passed through for adsorption of the desired product. After washing with 250 ml of water, the ion exchange column was eluted with 0.5N aqueous ammonia to obtain 122 mg of a crude powder of 3 ', V-dideoxykanamycin-C. A solution of this crude powder in 2 ml of water was passed through a column with an inner diameter of 0.8 cm with 14 ml of the aforementioned cation exchange resin in the NH 4 form (Amberlite CG-50) to adsorb the desired product. After washing with 4-5 ml of water, the ion exchange column was eluted with 4-0 ml of 0.05N aqueous ammonia, then with 70 ml of 0.1N aqueous ammonia and finally with 70 ml of 0.2N aqueous ammonia. The eluate was collected in 1 ml fractions and fractions 119-14-6 were combined and concentrated to dryness under reduced pressure to give 90 mg of a colorless, purified powder of 3 "V-dideoxykanamycin-C. Total yield = 23 %

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Claims

where R ^. and Rp each represent a hydroxyl group or Represent hydrogen atom, as well as acid addition salts thereof.

2. A compound according to claim 1, characterized in that they 1-N- (L-A ~ amino-2-hydroxybutyryl) -kanamycin-C or their acid addition salt is.

3. A compound according to claim 1, characterized in that they 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -3'-deoxykanamycin-C or its acid addition salt.

4. A compound according to claim 1, characterized in that they 1-N- (L-4-amino-2-hydroxybutyryl) -3 ', 4 ·' -dideoxykanamycin-G or its acid addition salt.

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ORIGINAL INSPECTED

27AU31

5. Process for the preparation of the compound of formula (I) according to claim 1, characterized in that it comprises the following stages:

Acylation of the 1-amino group of kanamycin-C, 3'-deoxykanamycin-C or 3 ', V-dideoxykanamycin-C by the following formula (II):

(ID

where R _x . and Hp each represent a hydroxyl group or a hydrogen atom,

by reaction with one protected on the amino group Derivative of L-4-amino-2-hydroxybutyric acid or a functional equivalent thereof to form the 1-N-acylation product of the starting compound (II), and removal of the amino protective group from the 1-N-acylation product obtained to form the compound of Formula (I).

Method according to claim 5, characterized in that it comprises the following stages:

Reaction of the starting compound of the formula (II), whose amino groups are not protected, with one on the amino group protected derivative of L-4-amino-2-hydroxybutyric acid of the following formula (III):

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(L) / 3

Ch ₀ CH ₀ - ν; (ιιι)

where R-, eir hydrogen atom and R ,, is a known, monovalent amino protective group, or R ₇ . and R ^ together form a divalent amino protective group in the form of a phthaloyl group or a Schiff base group (N = CHR ₁ -, where R ₁ - is a hydrogen atom, an alkyl group with 1 to 4 carbon atoms or an aryl group),

known per se for acylation of the amino group Manner to form the mixed acylation products which is a 1-N- (L-4-protected-amino-2-hydroxybutyryl) derivative the starting compound of the formula (II), treatment of the mixed acylation products in a known manner Manner to remove the amino protecting group therefrom, and then isolate the desired 1-N- (L-4 ~ Amino-2-hydroxybutyryl) derivative of the antibiotic corresponding to formula (I) by chromatographic analysis Separation of the acylation products from which the amino protecting group has been removed to obtain the desired compound of formula (I).

7. The method according to claim 5 or 6, characterized in that that the amino protective group which is used in the derivative of L-4-amino-2-hydroxybutyric acid used in the amino-protected derivative is present, an alkoxycarbonyl group having 2 to 6 carbon atoms, a cycloalkyloxycarbonyl group having 2 to 7 carbon atoms, an aralkyloxycarbonyl group or a salicylidene group.

8. The method according to claim 5, characterized in that kanamycin-C, 3 ¹ -deoxykanamycin-C or 3 ', 4-' -dideoxykanamacin-C is used as the starting compound in the acylation stage without any protection of the amino groups.

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9- The method according to claim 5> characterized in that Kanamycin-C, 3'-Deoxykanamycin-C or 3 ', 4 ·' -Dideoxykanamycin-C with the N-hydroxysuccinimide ester of L-4-protected-amino-2-hydroxybutyric acid is acylated in an aqueous solution at pH = 6-8.

10. Antibacterial composition, characterized in that it contains at least one compound as the active ingredient according to claim 1 in an antibacterially effective amount to inhibit the growth of bacteria, if appropriate in combination with a carrier or diluent for the active ingredient.

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