DE2738135A1

DE2738135A1 - Enzymatic colorimetric determination of glucose in blood - without removal of pptn. protein, by haemolysing the sample then pptd. with mercury

Info

Publication number: DE2738135A1
Application number: DE19772738135
Authority: DE
Inventors: Ewald Blees
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1977-08-24
Filing date: 1977-08-24
Publication date: 1979-03-01

Abstract

Method for determination of glucose in blood comprises pptn. of protein; treatment of the supernatant with glucose oxidase, peroxidase and a chromogen, then spectrophotometric measurement of the colour intensity which is used to calculate the glucose content. The method is now improved by first adding sufficient of a haemolysing substance (I) to dissolve protein plus blood cells, then pptn. by adding Hg2+ ions in neutral or slightly alkaline soln. Pref. (I) is an aq. soln. of a protein-pptg. acid, esp. trichloroacetic, perchloric or sulphosalicyclic acids. The pptd. protein need not be removed so a single cell can be used for pptn. and analysis. No blank value is needed (there is no autoxidation of the chromogen) and a constant correction can be applied. (Ie stabilises the sample so that it can be stored for longer before pptn. and measurement.

Description

"Verfahren zur Bestimmung von Glucose im Blut" "Method for the determination of glucose in the blood"

Ein wichtiges, weil besonders spezifisches Verfahren zur Bestimmung von Glucose im Blut, ist das sogenannte Glucoseoxydase-Peroxydase-Verfahren. Dieses Verfahren beruht darauf, daß Giucose in wäßriger Lösung und in Gegenwart von Luftsauerstoff durch Glucoseoxydase zu Gluconsäure oxydiert wird, wobei nebenbei Wasserstoffperoxyd gebildet wird. In Gegenwart von Peroxydase vermag das gebildete Wasserstoffperoxyd gewisse als Chromoqene bezeichnete Stoffe zu oxydieren, die dabei in gefärbte Verbindungen übergehen. Die Stärke der Färbung läßt sich spektralfotometrisch bestimmen und die dabei erhaltenen Werte können zur Berechnung der ursprünglichen Glucosekonzentration verwendet werden.An important, because particularly specific, method of determination of glucose in the blood, is the so-called glucose oxidase-peroxidase process. This The method is based on the fact that giucose is in aqueous solution and in the presence of atmospheric oxygen is oxidized to gluconic acid by glucose oxidase, with hydrogen peroxide is formed. In the presence of peroxidase, the hydrogen peroxide formed can to oxidize certain substances known as chromogenes, which in the process result in colored compounds pass over. The strength of the coloration can be determined spectrophotometrically and the values obtained in this way can be used to calculate the original glucose concentration be used.

Wichtig ist dabei, daß zunächst die Eiweiße aus der Probe beispielweise mit Perchlorsäure, Trichloressigsäure oder Uranylacetat ausgefällt und durch Zentrifugieren abgeschieden werden und der Überstand von der Fällung abgetrennt wird. Die Fällung der Eiweiße ist nötig, weil bei einer derartigen enzymatischen Bestimmung von Glucose in Blut das anwesende Hämoglobin einerseits wegen seiner hohen Absorption und andererseits auch wegen seiner Oxydasewirkung die Nachweisreaktion beeinträchtigt. Die Fällung nuß außerdem vor einer Weiterverarbeitung abgetrennt werden, da nämlich bei Zusatz der neutralen bis schwach alkalischen Reaktionslösung, welche Glucoseoxydase und Peroxydase enthält entweder eine teilweise Wiederauflölsung der gefällten Eiweiße oder eine Denaturierung bzw. Fällung der zu Nachweis zugesetzten Enzyme erfolgen kann.It is important that first the proteins from the sample, for example precipitated with perchloric acid, trichloroacetic acid or uranyl acetate and centrifuged are deposited and the supernatant is separated from the precipitation. The precipitation the protein is necessary because in such an enzymatic determination of glucose in blood the hemoglobin present on the one hand because of its high absorption and on the other hand the detection reaction is also impaired because of its oxidase effect. The precipitation must also be separated prior to further processing, because that is when added the neutral to weakly alkaline reaction solution, which glucose oxidase and Peroxidase contains either a partial redissolution of the precipitated proteins or denaturation or precipitation of the enzymes added for detection take place can.

Die Notwendigkeit der Gewinnung eines von der Fällung befreiten Überstandes verkonpliziert das Verfahren. Insbesondere steht es einer heute allgemein geforderten Durchführung der Analyse als Eingefäßreaktion (Küvettentest) entgegen.The need to obtain a supernatant from which precipitation has been removed complicates the process. In particular, it is one that is generally required today Execution of the analysis as a one-vessel reaction (cuvette test).

Der Erfindung lag unmher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der oben beschriebenen Art zu schaffen, bei welchen es nicht mehr nötig ist, die gefällten Eiweiße vor Zugabe der Reaktionslösung abzutrennen.The invention was always based on the object of a method of the above to create the kind described, in which it is no longer necessary to use the felled Separate proteins before adding the reaction solution.

Es wurde gefunden, daß bei einer besonderen Irt der Eiweißrillung es möglich ist, die Reaktionslösung der Probe nit den gefällten Eiweiß direkt zuzusenden, ohne daß die weitere Bestimmung gestört wird.It has been found that with a particular type of protein grooving it is possible to send the reaction solution to the sample with the precipitated protein directly, without disturbing the further determination.

ßonit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestiiiung von Glucose in Blut, durch ausfällen der Eiweiße, Versetzen des Vberstandes nit Gluchoseoxydase Peroxydase und einen Chronogen, spektralfotometrische Bestimmung der Fsrbintensität und Ermittlung des Glucosegehalts aus letzterer, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß zur Ausfällung der Eiweiße zunächst eine Hämolysiersubstanz in einer zur Auflösung der Eiweiße sant Blutzilen ausreichenden Menge zugegeben wird und hierauf eine Fällung durch Zusatz von Quecksilber(II)-ionen in neutraler oder schwach alkalischer Lösung durchgeffihrt wird.The invention relates to a method for determining glucose in blood, through precipitation of the proteins, adding gluchose oxidase to the supernatant Peroxidase and a chronogen, spectrophotometric determination of the color intensity and determining the glucose content from the latter, which is characterized by is that for the precipitation of the proteins first a hemolysing substance in a to Dissolution of the proteins sant blood cells sufficient amount added and then a precipitation by adding mercury (II) ions in neutral or a weakly alkaline solution.

Die Enteiweißung gliedert sich beim erfindungsgemäßen Verfahren in swei Schritte: 1. Vorbereitende Denaturierung: Es wird eine Hämolysiersubstanz zugegeben, und zwar vorzugsweise als wäßrige Lösung. Als Hämolysiersubstanz kann eine eiweißfällende Säure, wie s.B. Trichloressigsäure, Perchlorsäure oder Sulfosulicylsäure, verwendet werden, die bei Verwendung in höherer Konzentration eiweißfällend wirkt. Die Lösung der eiweißfällenden Säure ist vorzugeweise 5 bis 20 in, insbesondere 10 in (mH . nillinolar).In the process according to the invention, the deproteinization is divided into Two steps: 1. Preparatory denaturation: a hemolyzing substance is added, and preferably as an aqueous solution. A protein precipitating substance can be used as a hemolyzing substance Acid, as s.B. Trichloroacetic acid, perchloric acid or sulfosulicylic acid is used which has a protein-precipitating effect when used in higher concentrations. The solution the protein-precipitating acid is preferably 5 to 20 in, especially 10 in (mH. nillinolar).

2. Nachfolgende Fällung durch Quecksilber(II)-ionen: Diese wird in neutraler oder schwach alkalischer Lösung durchgeführt. Die Quecksilber (II)-ionen werden vorzugsweise in Porn des Chlorids zugesetzt. Auch der Zusatz der Quesckeilber(II)-ionen erfolgt vorzugsweise als wäßrige Lösung. Diese wäßrige Lösung besitzt vorzugsweise eine Konzentration von 1 bis 5 in, insbesondere 3 in. Es ist zwar möglich, die Probe schwach alkalisch zu wachen, beispielaweise durch Zusatz eines Puffers, Jedoch wird es bevorzugt, die Fällungslösung mit einem eine schwach alkalische Reaktion ergebenden Puffer zu versetzen. Hierzu kann insbesondere K2HPO4 verwendet werden.2. Subsequent precipitation by mercury (II) ions: This is in neutral or weakly alkaline solution. The mercury (II) ions are preferably added in Porn's Chloride. Also the addition of the Quesckeilber (II) ions takes place preferably as an aqueous solution. This aqueous solution preferably has a concentration of 1 to 5 in, especially 3 in. It is possible to use the sample to be weakly alkaline, for example by adding a buffer, however it is preferable to react the precipitating solution with one which gives a weakly alkaline reaction Move buffer. In particular, K2HPO4 can be used for this purpose.

Der Überschuß an Queckeilbar (II)-ionen kann mit einem Komplexbildner maskiert werden, wozu insbesondere Äthylendiamintetraessigsäure oder ein Rodanid dienen können. Der Zusatz eines Komplexbildners kann von Vorteil sein, da Quecksilberionen unter Umständen auf die nachfolgende Nachweisreaktion störend einwirken können.The excess of mercury (II) ions can be mixed with a complexing agent be masked, including in particular ethylenediaminetetraacetic acid or a rodanide can serve. The addition of a complexing agent can be advantageous, as mercury ions may interfere with the subsequent detection reaction.

denaturieren können.can denature.

Als Chromogen kann beispielsweise Aminophenazon in Verbindung mit Phenol oder aber 2,2'-Azino-di-(3-äthyl-benzthiazolinsulfonsäure-6)-diammoniumsalz verwendet werden. Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann das Chromogen bereits mit einer der oben erwähnten Säurelösungen, die für die Hämolysierung dienen, zugegeben werden, da nämlich das Chromogen in saurer Lösung nicht oxydationsempfindlich ist. Die Verwendung von Aminophenazon plus Phenol als Chromogen ist bei einer solchen frühen Zugabe des Chromogenes von Vorteil, weil nämlich Phenol die hämolytische Wirkung der erwähnten zur Hämolysierung zugesetzten Säuren verstärkt.As a chromogen, for example, aminophenazone can be used in conjunction with Phenol or 2,2'-azino-di- (3-ethyl-benzthiazolinesulfonic acid-6) -diammonium salt be used. In the method according to the invention, the chromogen can already be with one of the above-mentioned acid solutions, which are used for hemolysis, is added because the chromogen in acidic solution is not sensitive to oxidation. The use of aminophenazone plus phenol as a chromogen is one of these early addition of the chromogen is beneficial because phenol is the hemolytic Effect of the acids mentioned for hemolysis increased.

Durch deh-.Zusatz der erwähnten Hämolysiersäuren wird aufgrund der Denaturierung der Probeneiweiße die Probe vor Abbaureaktionen geschützt und stabilisiert, so daß sie über längere Zeiträume aufbewahrt werden kann, bevor mit der Fällung und der Bestimmung fortgefahren wird.By adding the mentioned hemolyzing acids, due to the Denaturation of the sample proteins protects and stabilizes the sample from degradation reactions, so that it can be stored for extended periods of time prior to precipitation and the determination is continued.

In der Folge sei ein Beispiel für mögliche Zusammensetzungen der nötigen Reagenzien angegeben: Hämolysierlösung (1) : 10 mM Trichloressigsäure 20 mM Phenol 0,4 mM Aminophenazon) Chromogsn 8 mM inerte Metalle zur Bildung gelatinöser Hydroxyde und Phosphate, z.B. Mg, Be (als Zentrifugierhilfe) 0,25% Netzmittel Fällungsreagenz (2) : 2 M KHPO4 3 mM HgCl2 Enzymreagenz (3) : 1 KU/ml GOD 250 U/ml POD 100 mM KSCN 2,25% Stabilisator Eine Analyse auf Blutzucker kann wie folgt durchgeführt werden: 2,0 ml Hämolysierlösung (1) werden in eine Küvettenflasche gegeben, worauf 20,um Blut zugesetzt werden und das Ganze durchgemischt wird.The following is an example of possible compositions of the necessary Reagents indicated: Hemolyzing solution (1): 10 mM trichloroacetic acid 20 mM phenol 0.4 mM aminophenazone) Chromogsn 8 mM inert metals for the formation of gelatinous hydroxides and phosphates, e.g. Mg, Be (as centrifugation aid) 0.25% wetting agent, precipitation reagent (2): 2 M KHPO4 3 mM HgCl2 enzyme reagent (3): 1 KU / ml GOD 250 U / ml POD 100 mM KSCN 2.25% stabilizer An analysis for blood sugar can be done as follows are: 2.0 ml of hemolysis solution (1) are placed in a cuvette bottle, whereupon 20 to be added to blood and the whole is mixed.

Dann werden 0,5 ml Fällungsreagenz (2) zugegeben, worauf gemischt und zentrifugiert wird.Then 0.5 ml of precipitation reagent (2) are added, whereupon mix and centrifuged.

Nun wird eine Leermessung durchgeführt.An empty measurement is now carried out.

Hierauf wird 1 Tropfen Enzymreagenz (3) zugegeben und durchgemischt.Then 1 drop of enzyme reagent (3) is added and mixed.

Nach 30 bis 60 min wird gemessen und die Differenz aus den beiden Messungen gebildet.After 30 to 60 minutes, a measurement is made and the difference between the two Measurements formed.

Die weitere spektralfotometrische Bestimmung erfolgt in üblicher Weise.The further spectrophotometric determination takes place in the usual way.

Es ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß die Fällung und Messung in ein und derselben Küvette durchgeführt werden kann. DarUber hinaus ist die Mitführung eines Leerwert-Ansatzes nicht erforderlich, da das Chromogen bei Anwesenheit einer der erwähnten für die Hämolysierung dienenden Säure keiner Autoxydation unterliegt. Es kann ein konstanter Korrekturwert vorgegeben werden (z.B. 4 mg% Leerwertabzug).It is a particular advantage of the method according to the invention that the precipitation and measurement can be carried out in one and the same cuvette. About that In addition, it is not necessary to carry out a blank value approach, since the chromogen in the presence of one of the acids mentioned for hemolysis, none Subject to autoxidation. A constant correction value can be specified (e.g. 4 mg% blank value deduction).

Ebenso ist es auch möglich auf die Mitführung eines Standards als Bezugsgröße zu verzichten und die Auswertung mittels eines Berechnungsfaktors vorzunehmen.It is also possible to carry a standard as a To waive the reference value and to carry out the evaluation by means of a calculation factor.

Claims

PATENT CLAIMS 1. Method for the determination of glucose in blood, by precipitating the proteins, adding glucose oxidase, peroxidase to the supernatant and a chromogen, spectrophotometric determination of color intensity and determination the glucose content from the latter, characterized in that for the precipitation of the Proteins first a hemolyzing substance in one to dissolve the proteins together Blood cells sufficient amount is added and then a precipitation by addition of mercury (II) ions in neutral or weakly alkaline solution will.

2. The method according to claim 1, characterized in that the hemolyzing substance is added as an aqueous solution.

3. The method according to claim 2, characterized in that the hemolysing substance a protein-precipitating acid is used.

4. The method according to claim 3, characterized in that as protein precipitating Acid trichloroacetic acid, perchloric acid or sulfosalicylic acid is used.

5. The method according to any one of claims 3 or 4, that the protein precipitating Acid is added as a 5 to 20 mM solution.

6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that the mercury (II) ions are added in the form of the chloride.

7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that the mercury (II) ions are added as an aqueous solution.

8. The method according to claim 6 or 7, characterized in that the mercury (II) ions are added as a 1 to 5 mM solution.

9. The method according to claim 6, 7 or 8, characterized in that the aqueous solution is weakly alkaline buffered.

10. The method according to claim 9, characterized in that the aqueous Solution as buffer contains K2HPO4.

11, method according to any one of the preceding claims, characterized in that that the excess of mercury (II) ions is masked with a complexing agent.

12. The method according to claim 11, characterized in that as a complexing agent Ethylenediaminetetraacetic acid or a rodanide is used.

13. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that that as a chromogen aminophenazone plus phenol or 2,2'-azino-di- (3-ethyl-benzthiazolinesulfonic acid-6) -diammonium salt is used.

14. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that after the protein precipitation, the reaction solution is centrifuged and the glycose oxidase, the peroxidase and the chromogen can be added directly to the supernatant.