DE2615958A1 - STABILIZED COENZYME SOLUTION - Google Patents

STABILIZED COENZYME SOLUTION

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DE2615958A1
DE2615958A1 DE19762615958 DE2615958A DE2615958A1 DE 2615958 A1 DE2615958 A1 DE 2615958A1 DE 19762615958 DE19762615958 DE 19762615958 DE 2615958 A DE2615958 A DE 2615958A DE 2615958 A1 DE2615958 A1 DE 2615958A1
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Harald Dr Gallati
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F Hoffmann La Roche AG
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F Hoffmann La Roche AG
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/008—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions for determining co-enzymes or co-factors, e.g. NAD, ATP
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C07H19/207—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids the phosphoric or polyphosphoric acids being esterified by a further hydroxylic compound, e.g. flavine adenine dinucleotide or nicotinamide-adenine dinucleotide

Description

Patentanwälte'Patent attorneys'

Dr. Fr3-Iz Leclerer 1 2. April 1976Dr. Fr 3 -Iz Leclerer 1 April 2, 1976

DäpL-lig. R-i,iör F. MeyerDäpL-lig. R-i, iör F. Meyer

SOOO München 80
LucÜB-Grahn-Str. 22, Tel. (089) 472942 . · 2615958 SOOO Munich 80
LucÜB-Grahn-Str. 22, Tel. (089) 472942 . 2615958

RAN 4091/9 RAN 4091/9

F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/SchweizF. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel / Switzerland

Stabilisierte QoenzymlösungStabilized oenzyme solution

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung des reduzierten ß-Nicotinamid-adenindinucleotid (NADH) in Lösung.The present invention relates to a method for stabilizing the reduced β-nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) in solution.

Das NADH wird als Coenzym der Oxidoreductasen in der klinischen Chemie beispielsweise für folgende Arten von enzymatischen Tests eingesetzt:The NADH is used as a coenzyme of the oxidoreductases in clinical chemistry, for example for the following types of enzymatic tests used:

a. zur Aktivitätsbestimmung der Oxidoreductasen (z.B. Lactat-Dehydrogenase, a-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase, Glutamat-Dehydrogenase, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Malat-Dehydrogenase) a. to determine the activity of oxidoreductases (e.g. lactate dehydrogenase, a-hydroxybutyrate dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, malate dehydrogenase)

b. zur Bestimmung der Substratkonzentration in biologischen Flüssigkeiten mit Hilfe von substratspezifischen Oxidoreductasen (z.B. Pyruvat)b. for determining the substrate concentration in biological fluids with the help of substrate-specific Oxidoreductases (e.g. pyruvate)

» Hen/8.1.1976»Hen / 8.1.1976

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c. zur Aktivxtätsbestiinmung anderer Enzyme (z.B. Kreatinkinase, Glutamatpyruvat-Transaminase, Glutamatoxalacetat-Transaminase), oder zur Konzentrationsmessung anderer Substrate, deren Test mit einer Oxidoreductase-Indikatorreaktion gekoppelt ist (z.B. Adenosindiphosphat). c. to determine the activity of other enzymes (e.g. creatine kinase, glutamate pyruvate transaminase, glutamate oxalacetate transaminase), or to measure the concentration of other substrates, test them with an oxidoreductase indicator reaction coupled (e.g. adenosine diphosphate).

NADH ist jedoch in wässriger Lösung instabil, und es ist daher selbstverständlich, dass das Problem der Stabilisierung dieses teuren und viel benützten Coenzyms sehr intensiv untersucht wurde. Dabei ist zu beachten, dass die Instabilität des NADH sich nicht nur auf die reduzierte Form, sondern auch auf die Bildung eines Inhibitors bezieht, der schon in kleinsten Mengen die Aktivitätsbestimmung der Oxidoreductasen wesentlich zu stören .vermag.However, NADH is unstable in aqueous solution, and therefore it goes without saying that the problem of stabilization this expensive and widely used coenzyme has been studied very intensively. It should be noted that the instability of NADH refers not only to the reduced form, but also to the formation of an inhibitor that is already in Smallest amounts of the determination of the activity of the oxidoreductases significantly disturb.

Zur Verbesserung der Stabilität von NADH in Lösung wurde bereits der Einfluss verschiedener Puffersysteme, des pH-Wertes der NADH-Lösung, von Anionen und Kationen sowie der NADH-Konzentration bei einzelnen Lagertemperaturen untersucht.To improve the stability of NADH in solution, the influence of various buffer systems, des pH value of the NADH solution, of anions and cations as well as the NADH concentration at individual storage temperatures examined.

Diese Versuche konnten jedoch nicht zu befriedigenden Resultaten führen, unter anderem weil es keinen idealen pH-Wert für die Aufbewahrung des NADH in Lösung gibt. Mit steigendem pH-Wert nimmt nämlich die Geschwindigkeit der Inhibitorenbildung zu, während bei geringerem pH-Wert die Stabilität des NADH abnimmt.However, these attempts could not lead to satisfactory results, among other things because there is no ideal pH value for storing the NADH in solution. The higher the pH, the slower the Inhibitor formation increases, while the stability of the NADH decreases at a lower pH value.

In wässrigen Lösungen wurde bisher bestenfalls eine Stabilität von NADH von einem Tag bei Raumtemperatur und von einer Woche bei 2-8°C festgestellt (vgl. Gerhardt et al., Scand. J. elin. Lab. Invest. 33, 3-51, 1974).In aqueous solutions, at best a stability of NADH of one day at room temperature and one week at 2-8 ° C. has been found (cf. Gerhardt et al., Scand. J. Elin. Lab. Invest. 33, 3-51, 1974).

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Andererseits ist es bekannt, dass festes NADH-SaIz eine gute Lagerstabilität aufweist, sofern es unter Ausschluss von Wasser und oxidierenden Substanzen wie Sauerstoff aufbewahrt wird.On the other hand, it is known that solid NADH salt is a has good storage stability, provided it is stored in the absence of water and oxidizing substances such as oxygen will.

Das NADH sollte jedoch in kleinen Portionen (z.B. "Tages-Portionen") konfektioniert werden. Denn wenn von einem NADH-BuIk täglich eine gewisse Menge abgewogen werden muss, ist es kaum zu vermeiden, dass sich durch Kontakt mit Luft Sauerstoff und Feuchtigkeit im NADH-Präparat anreichert, wodurch die Autoxydation des NADH und die Bildung des Inhibitors ermöglicht und begünstigt wird.However, the NADH should be in small portions (e.g. "daily portions") can be assembled. Because if a certain amount has to be weighed out daily from a NADH buIk, it is hardly to prevent oxygen and moisture from building up in the NADH preparation through contact with air, thereby causing autoxidation of NADH and the formation of the inhibitor is made possible and promoted.

Die vorliegende Erfindung macht es möglich eine NADH-Lösung mit guter Stabilität zu erhalten und dem Benutzer in fertiger Form zur Verfügung zu stellen, wobei die bei den bisherigen Lösungen und festen Präparaten in Kauf genommenen Nachteile beseitigt worden sind.The present invention makes NADH solution possible with good stability and to make available to the user in finished form, with the previous Solutions and solid preparations accepted disadvantages have been eliminated.

Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Stabilisierung von NADH in Lösung, dadurch gekennzeichnet, dass man als Lösungsmittel eine oder mehrere organische Verbindungen verwendet.More precisely, the present invention relates to a method for stabilizing NADH in solution, characterized in that that one or more organic compounds are used as the solvent.

Weiter bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine stabile Lösung von NADH in einem organischen Lösungsmittel.The present invention further relates to a stable solution of NADH in an organic solvent.

Die erfindungsgemässe stabile Lösung kann für alle enzymatischen Tests, in welchen NADH als Coenzym benützt wird, verwendet werden. In diesem Zusammenhang ist die Verwendung dieser Lösung in den am Anfang der Beschreibung spezifisch erwähnten Tests besonders bevorzugt.The stable solution according to the invention can be used for all enzymatic Tests in which NADH is used as a coenzyme can be used. In this context is the use this solution is particularly preferred in the tests specifically mentioned at the beginning of the description.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist es erwünscht, dass das organische Lösungsmittel möglichst wasserfrei ist. Oft lässt sich jedoch nicht "vermeiden, dass bei der Herstellung der Lösung, bei deren Abfüllung und während der Lagerung eineFor the purposes of the present invention it is desirable that the organic solvent be as free of water as possible. Often However, it is not possible to “avoid the problem of a

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gewisse Menge an Wasser aufgenommen wird. Der Gehalt an Wasser sollte jedoch zweckmässigerweise 5% nicht überschreiten. Das Lösungsmittel, die Konzentration an NADH im Lösungsmittel und die Menge an Lösungsmittel im Verhältnis zur Menge an Testlösung hängen von den durchzuführenden spezifischen Enzymtests ab.a certain amount of water is absorbed. The water content should, however, expediently not exceed 5%. That Solvent, the concentration of NADH in the solvent and the amount of solvent in relation to the amount of test solution depend on the specific enzyme tests to be performed.

Im allgemeinen ist jedoch erforderlich, dass das verwendete organische Lösungsmittel das NADH nicht oxydiert und den entsprechenden enzymatischen Test nicht beeinflusst. Weiter sollte das Lösungsmittel bezüglich Testdurchführung eine gute Praktikabilität (Viskosität, Dampfdruck, hygroskopische Eigenschaften, Mischbarkeit mit der entsprechenden Testlösung) aufweisen. In general, however, it is necessary that the organic solvent used does not oxidize the NADH and does not affect the corresponding enzymatic test. Furthermore, the solvent should have good practicability with regard to carrying out the test (Viscosity, vapor pressure, hygroscopic properties, miscibility with the corresponding test solution).

Besonders geeignete organische Lösungsmittel sind einzelne Alkohole (z.B. Methanol, Aethylenglykol) oder Gemische von Alkoholen.Particularly suitable organic solvents are individual alcohols (e.g. methanol, ethylene glycol) or mixtures of Alcohols.

Ferner kann das organische Lösungsmittel weitere organische Zusätze wie z.B. organische Puffer oder organische reduzierende Substanzen, usw. enthalten. Als organische Puffer eignen sich insbesondere Tris-Puffer [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan] und Triäthanolamin. Als reduzierende Substanzen könnten Mercaptane wie z.B. Mercaptoäthanol eingesetzt werden.Furthermore, the organic solvent can contain other organic additives such as organic buffers or organic reducing agents Contain substances, etc. Tris buffers [tris (hydroxymethyl) aminomethane] and are particularly suitable as organic buffers Triethanolamine. Mercaptans such as mercaptoethanol could be used as reducing substances.

Die Konzentration an NADH in der erfindungsgemässen Lösung ist nicht kritisch und wird so gewählt, dass der entsprechende Enzymtest unter optimalen Bedingungen verläuft. Diese Konzentration liegt jedoch mit Vorteil zwischen 1 mmol/1 und 40 mmol/1, insbesondere zwischen 10.mmol/1 bis 20 mmol/1.The concentration of NADH in the solution according to the invention is not critical and is chosen so that the corresponding Enzyme test runs under optimal conditions. However, this concentration is advantageously between 1 mmol / 1 and 40 mmol / 1, in particular between 10.mmol / 1 to 20 mmol / 1.

Das Verhältnis der Menge an erfindungsgemässer stabilen Lösung zur Menge an Testlösung ist ebenfalls nicht kritisch und wird so gewählt, dass der Enzymtest durch die Menge an Lösungsmittel nicht beeinflusst wird. Das Verhältnis liegt jedochThe ratio of the amount of stable according to the invention Solution to the amount of test solution is also not critical and is chosen so that the enzyme test through the amount of solvent is not affected. However, the ratio is

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vorzugsweise zwischen 1:25 und 1:150, insbesondere zwischen
1:50 bis 1:100.preferably between 1:25 and 1: 150, in particular between
1:50 to 1: 100.

Die erfindungsgemässe stabile Lösung kann hergestellt
werden, indem man NADH (getrocknetes oder lyophilisiertes
NADH-SaIz) bei Raumtemperatur auf übliche Weise im organischen Lösungsmittel löst.The stable solution according to the invention can be produced
by using NADH (dried or lyophilized
NADH salt) dissolves in the organic solvent at room temperature in the usual way.

Die erhaltene stabile Lösung kann in geeigneten Behältern eingefüllt werden und behält - selbst bei höherer Temperatur ihre Aktivität während mehreren Monaten.The stable solution obtained can be poured into suitable containers and retains its - even at higher temperatures Activity for several months.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden
Beispielen näher erläutert.The present invention is made based on the following
Examples explained in more detail.

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Beispiel 1example 1

In 25 ml Aethylenglykol wurden bei Raumtemperatur und unter leichtem Rühren 150 mg Tris-Puffer (50 mmol/1) gelöst. Zu dieser klaren, farblosen, leicht viskosen Lösung wurden anschliessend 4,5 mg/ml NADH-Dinatriumsalz (NADH-Gehalt = 80%, NADH-Konzentration =5,4 mmol/1) zugegeben. Für einen Stabilitätsvergleich wurde parallel dazu die gleiche Menge NADH-Dinatriumsalz von der selben Charge in dest. Wasser gelöst. Zur Festlegung der Anfangswerte wurde mit der wässrigen und der organischen NADH-Lösung die Extinktion bei der Wellenlänge 366 nm sowie die Lactat-Dehydrogenase Aktivität (LDH-Aktivität) in einem Kontrollserum bestimmt.Die beiden NADH-Lösungen wurden anschliessend in je 5 Glasampullen mit Schraubverschluss aufgeteilt und bei den Temperaturen 2-8°C, 19-22°C, 35°C, 45°C und 600C inkubiert. Nach bestimmten Zeitintervallen wurden mit den einzelnen NADH-Lösungen von neuem die Extinktion bei der Wellenlänge 366 nm sowie die LDH-Aktivität gemessen. Die Resultate der Stabilitätsprüfung sind in der Weise dargestellt, dass die jeweils gemessene Extinktion und die LDH-Aktivität in Prozent der Anfangswerte ausgedrückt sind.150 mg Tris buffer (50 mmol / l) were dissolved in 25 ml of ethylene glycol at room temperature and with gentle stirring. 4.5 mg / ml NADH disodium salt (NADH content = 80%, NADH concentration = 5.4 mmol / l) were then added to this clear, colorless, slightly viscous solution. For a stability comparison, the same amount of NADH disodium salt from the same batch was dissolved in distilled water in parallel. Dissolved in water. To determine the initial values, the absorbance at the wavelength 366 nm and the lactate dehydrogenase activity (LDH activity) were determined in a control serum with the aqueous and the organic NADH solution. The two NADH solutions were then each placed in 5 glass ampoules with screw caps divided and incubated at temperatures 2-8 ° C, 19-22 ° C, 35 ° C, 45 ° C and 60 0 C. After certain time intervals, the absorbance at the wavelength 366 nm and the LDH activity were measured again with the individual NADH solutions. The results of the stability test are shown in such a way that the absorbance measured in each case and the LDH activity are expressed as a percentage of the initial values.

a) Stabilität der NADH-Lösung bei 2-8°C a) Stability of the NADH solution at 2-8 ° C

Nach 136 Tagen beträgt der NADH-Gehalt in Aethylenglykol-50 mmol/1 Tris-Puffer noch immer 92%, während in dest. Wasser nur noch 29% des eingesetzten NADH vorhanden sind. Wird mit diesen beiden NADH-Lösungen die LDH-Aktivität im Enzymkontrollserum gemessen, so erhält man eine 100%ige Aktivität, wenn das NADH in Aethylenglykol-50 mmol/1 Tris-Puffer gelöst wurde, in dest. Wasser aber beträgt die LDH-Aktivität nur noch 30%.After 136 days the NADH content in ethylene glycol is 50 mmol / 1 Tris buffer still 92%, while in dist. Water only 29% of the NADH used are available. Will with If the LDH activity is measured in the enzyme control serum in these two NADH solutions, then 100% activity is obtained if that NADH was dissolved in ethylene glycol 50 mmol / 1 Tris buffer, in least. In water, however, the LDH activity is only 30%.

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— V —- V -

b) Stabilität der NADH-Lösung bei 19-220C b) Stability of NADH-solution at 19-22 0 C

Schon innerhalb von 10 Tagen sinkt der NADH-Gehalt in der wässrigen Lösung auf 26%, während in der Aethylenglykol-50 mmol/1 Tris-Puffer-Lösung nach 136 Tagen noch immer 83% des ursprünglich vorhandenen NADH enthalten sind. Entsprechend sinkt auch die LDH-Aktivität mit der wässrigen NADH-Lösung nach 10 Tagen Inkubation auf 9%. Die LDH-Aktivität mit dsm NADH, das in Aethylenglykol-50 mmol/1 Tris-Puffer gelöst und 136 Tage bei 19-22°C inkubiert wurde, beträgt noch 98%.Within 10 days, the NADH level drops in the aqueous solution to 26%, while in the ethylene glycol 50 mmol / 1 Tris buffer solution after 136 days it is still 83% of the originally present NADH are included. The LDH activity decreases accordingly with the aqueous NADH solution 10 days incubation at 9%. The LDH activity with dsm NADH, which dissolved in ethylene glycol 50 mmol / 1 Tris buffer and 136 days at 19-22 ° C is still 98%.

c) Stabilität der NADH-Lösung bei 35°C c) Stability of the NADH solution at 35 ° C

Die Abnahme des NADH-Gehaltes in der wässrigen Lösung geht bei. der Inkubationstemperatur von 35°C noch schneller vor sich (nach 8 Tagen sind noch 11% NADH vorhanden), während das NADH in Aethylenglykol-50 mmol/1 Tris-Puffer nach 136 Tagen nocK immer zu 69% vorhanden ist."Die Bestimmung der LDH-Aktivität mit der wässrigen NADH-Lösung ergibt nach 10 Tagen Inkubation 7% des anfänglichen Wertes. Mit der Aethylenglykol-50 mmol/1 Tris-NADH-Lösung wird nach einer 136 tägigen Inkubation noch 97% der ursprünglichen LDH-Aktivität gemessen.The decrease in the NADH content in the aqueous solution continues at. the incubation temperature of 35 ° C even faster (After 8 days, 11% NADH is still present), while the NADH in ethylene glycol 50 mmol / 1 Tris buffer after 136 days 69% is always present. "The determination of the LDH activity with the aqueous NADH solution shows after 10 days of incubation 7% of the initial value. The ethylene glycol 50 mmol / 1 Tris-NADH solution is used after a 136 day incubation 97% of the original LDH activity measured.

d) Stabilität der NADH-Lösung bei 45°C und 60°C d) Stability of the NADH solution at 45 ° C and 60 ° C

Bei diesen Inkubationstemperaturen wird das NADH in der wässrigen Lösung schon nach wenigen Stunden vollständig zerstört, und es kann keine LDH-Aktivität mehr gemessen werden. Bei der Inkubationstemperatur von 45°C beträgt dagegen in Aethylenglykol-50 mmol/1 Tris-Puffer der NADH-Gehalt nach Tagen noch 17%, während bei 60°Cnach 17 Tagen noch 46% des ursprünglichen NADH vorhanden sind. Die Bestimmung der LDH-Aktivität mit der entsprechenden NADH-Lösung ergibt folgende Werte: Bei 45°C inkubiert nach 136 Tagen noch 49%,At these incubation temperatures, the NADH in the aqueous solution is completely destroyed after a few hours, and LDH activity can no longer be measured. In contrast, at an incubation temperature of 45 ° C, in Ethylene glycol 50 mmol / 1 Tris buffer the NADH content after days was 17%, while at 60 ° C after 17 days it was still 46% original NADH are present. The determination of the LDH activity with the corresponding NADH solution gives the following Values: 49% after 136 days incubated at 45 ° C,

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und bei 6O0C inkubiert nach 17 Tagen 76% der anfänglichen LDH-Äktivität. and at 6O 0 C incubated after 17 days 76% of the initial LDH Äktivität.

Beispiel 2Example 2

In 25 ml Methanol wurden bei Raumtemperatur und unter leichtem Rühren 150 mg Tris-Puffer (=50 mmol/l) gelöst. Zu dieser klaren, farblosen, leicht viskosen Lösung wurden anschliessend 4,5 mg/ml NADH-Dinatriumsalz (NADH-Gehalt = 80%, NADH-Konzentration = 5,4 mmol/l)zugegeben. Zur Festlegung der Anfangswerte wurde mit der organischen NADH-Lösung die Extinktion bei der Wellenlänge 366 nm sowie die Lactat-Dehydrogenase Aktivität (LDH-Aktivität) in einem Kontrollserum bestimmt. Die NADH-Lösung wurde anschliessend in 3 Glasampullen mit Schraubverschluss aufgeteilt und bei den Temperaturen 2-8°C, 19-22°C und 35 C inkubiert. Nach 4 Monaten wurde mit den einzelnen NADH-Lösungen von neuem die Extinktion bei der Wellenlänge 366 nm sowie die LDH-Aktivität gemessen. Die Resultate der Stabilitätsprüfung sind in der Weise dargestellt, dass die jeweils gemessene Extinktion und die LDH-Aktivität in Prozent des Anfangswertes ausgedrückt sind.150 mg Tris buffer (= 50 mmol / l) were dissolved in 25 ml of methanol at room temperature and with gentle stirring. to this clear, colorless, slightly viscous solution were then 4.5 mg / ml NADH disodium salt (NADH content = 80%, NADH concentration = 5.4 mmol / l) was added. The organic NADH solution was used to determine the initial values at a wavelength of 366 nm and lactate dehydrogenase Activity (LDH activity) determined in a control serum. The NADH solution was then placed in 3 glass ampoules with screw caps divided and incubated at temperatures 2-8 ° C, 19-22 ° C and 35 C. After 4 months it was with the individual NADH solutions again measured the absorbance at the wavelength 366 nm and the LDH activity. The results of the stability test are shown in such a way that the measured absorbance and the LDH activity as a percentage of the Initial values are expressed.

a) Stabilität der NADH-Lösung bei 2-8°C a) Stability of the NADH solution at 2-8 ° C

Nach 4 Monaten beträgt der NADH-Gehalt in Methanol-50 mmol/l Tris-Puffer noch immer 93% des eingesetzten NADH. Wird mit.dieser NADH-Lösung die LDH-Aktivität im Enzymkontrollserum gemessen, so erhält man eine 100%ige Aktivität.After 4 months the NADH content in methanol is -50 mmol / l Tris buffer still 93% of the NADH used. With this NADH solution, the LDH activity in the enzyme control serum measured, 100% activity is obtained.

b) Stabilität der NADH-Lösung bei 19-22°C b) Stability of the NADH solution at 19-22 ° C

Nach 4 Monaten beträgt der NADH-Gehalt in der Methanol-50 mmol/l Tris-Puffer^Lösung noch immer 82% des ursprünglich vorhandenen NADH. Die LDH-Aktivität beträgt noch 95% der ursprünglich gemessenen LDH-Aktivität.After 4 months, the NADH content in the methanol 50 mmol / l Tris buffer solution is still 82% of the original existing NADH. The LDH activity is still 95% of the originally measured LDH activity.

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c) Stabilität der NADH-Lösung bei 35°C c) Stability of the NADH solution at 35 ° C

Nach 4 Monaten beträgt der NADH-Gehalt in der Methanol-50 minol/1 Tris-Puffer-Lösung noch 58% des ursprünglich vorhandenen NADH. Die LDH-Aktivität beträgt noch 84% der ursprünglich gemessenen LDH-Aktivität.After 4 months, the NADH content in the methanol is 50 minol / 1 Tris buffer solution still 58% of the originally present NADH. The LDH activity is still 84% of the originally measured LDH activity.

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Claims (1)

PatentansprücheClaims 1. Verfahren zur Stabilisierung von reduziertem ß-Uicotinamid-adenin-dinucleotid in Lösung, dadurch gekennzeichnet, dass man als Lösungsmittel eine oder mehrere organische "Verbindungen verwendet.1. Method for the stabilization of reduced ß-uicotinamide adenine dinucleotide in solution, characterized in that one or more organic solvents are used "Connections used. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel wasserfrei ist.2. The method according to claim 1, characterized in that the solvent is anhydrous. 5· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel nicht mehr als 5 G-ewichtsprozente Wasser enthält.5. The method according to claim 1, characterized in that the solvent does not contain more than 5 weight percent water contains. 4. Verfahren nach einem "'der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel ein Alkohol ist.4. The method according to one of Claims 1 to 5 »thereby characterized in that the solvent is an alcohol. 5 · Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 > dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel ein Gemisch von Alkoholen ist.5 · Method according to one of Claims 1 to 3> characterized in that the solvent is a mixture of alcohols. 6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol Aethylenglycol ist.6. The method according to claim 4, characterized in that the alcohol is ethylene glycol. 7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol Methanol ist.7. The method according to claim 4, characterized in that the alcohol is methanol. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel zusätzlich noch einen organischen Puffer enthält.8. The method according to any one of claims 1 to 7 »characterized in that the solvent also has one contains organic buffer. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass9. The method according to claim 8, characterized in that '609845/1034'609845/1034 der organische Puffer Tris(hydroxymethyl)-aminomethan ist.the organic buffer is tris (hydroxymethyl) aminomethane. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass · der organische Puffer Triäthanolamin ist.10. The method according to claim 9, characterized in that the organic buffer is triethanolamine. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 6 bis11. The method according to any one of claims 1 to 4 and 6 to 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel ein Gemisch von Aethylenglyeol und Tris(hydroxymethyl)aminomethan ist.10, characterized in that the solvent is a mixture of ethylene glycol and tris (hydroxymethyl) aminomethane. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel ein Gemisch von Methanol und Tris(hydroxymethyl)aminomethan ist.12. The method according to any one of claims 1 to 4 and 6 to 10, characterized in that the solvent is a mixture of methanol and tris (hydroxymethyl) aminomethane. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel zusätzlich noch eine organische reduzierende Substanz enthält.13. The method according to any one of claims 1 to 12, characterized in that the solvent also has a contains organic reducing substance. 14· Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die organische reduzierende Substanz ein Mercaptan ist.14. The method according to claim 13, characterized in that the organic reducing substance is a mercaptan. 15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die organische reduzierende Substanz Mercaptoäthanol ist.15. The method according to claim 14, characterized in that the organic reducing substance is mercaptoethanol. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von reduziertem ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid in organischen Lösungsmittel zwischen 1 mmol/l und 40 mmol/l liegt.16. The method according to any one of claims 1 to 15, characterized in that the concentration of reduced ß-Nicotinamide adenine dinucleotide in organic solvent is between 1 mmol / l and 40 mmol / l. 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von reduziertem ß-Nieotinamid-adenin-dinucleotid im organischen Lösungsmittel zwischen 10 mmol/l und 20 mmol/l liegt.17. The method according to claim 16, characterized in that the concentration of reduced ß-nieotinamide adenine dinucleotide in the organic solvent is between 10 mmol / l and 20 mmol / l. 18. Stabile Lösung von reduziertem ß-NicOtinamid-adenin-18. Stable solution of reduced ß-nicotinamide adenine dinucleotid in einem organischen Lösungsmittel.dinucleotide in an organic solvent. 60984S/1Ö3460984S / 1Ö34 19. Stabile Lösung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet,19. Stable solution according to claim 18, characterized in that das? das Lösungsmittel "wasserfrei ist.the? the solvent "is anhydrous. 20. Stabile Lös-mg nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel nicht mehr als 5 Gewichtsprozente Wasser enthält.20. Stable Lös-mg according to claim 18, characterized in, that the solvent does not contain more than 5 percent by weight of water. 21. Stabile Lösung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel ein Alkohol ist.21. Stable solution according to one of claims 18 to 20, characterized in that the solvent is an alcohol. 22. Stabile Lösung nach einem der Ansprüche 18 bis 20,
dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel ein Gemisch
von Alkoholen ist.22. Stable solution according to one of claims 18 to 20,
characterized in that the solvent is a mixture
of alcohol is. 23. Stabile Lösung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol Aethylenglycol ist.23. Stable solution according to claim 21, characterized in that that the alcohol is ethylene glycol. 24. Stabile Lösung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol Methanol ist,24. Stable solution according to claim 21, characterized in that that the alcohol is methanol, 25. Stabile Lösung nach einem der Ansprüche 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel zusätzlich noch
einen organischen Puffer enthält.25. Stable solution according to one of claims 18 to 24, characterized in that the solvent also has
contains an organic buffer. 26. Stabile .L"sung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der organische Puffer Tris(hydroxymethyl)-aminomethan ist.26. Stable solution according to claim 25, characterized in that that the organic buffer is tris (hydroxymethyl) aminomethane. 27. Stabile Lesung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass der organische Puffer Triethanolamin ist.27. Stable reading according to claim 26, characterized in that that the organic buffer is triethanolamine. 28. " Stabile Lösung nacii einem der Ansprüche 18 bis 21 und
23 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel ein Gemisch von AeihylenglyooX unl 3ris(hydroxymethyl)affiinosiethan ist,28. "Stable solution nacii one of claims 18 to 21 and
23 to 27, characterized in that the solvent is a mixture of AeihylenenglyooX and 3ris (hydroxymethyl) affiinosiethan, 103845/1034103845/1034 29. Stabile Lösung nach einem der Ansprüche 18 bis 21 und 23 bis 27, dadurch gekennzeichnet;, dass das Lösungsmittel ein G-emisch von Methanol und Sris(hyarosymei;hyl)aminoisieth.an ist.29. Stable solution according to one of claims 18 to 21 and 23 to 27, characterized; that the solvent is a G-emic of methanol and Sris (hyarosymei; hyl) aminoisieth.an is. 30. Stabile Lösung nach einem der Ansprüche 18 bis 29» dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel zusätzlich noch eine organische reduzierende Substanz enthält.30. Stable solution according to one of claims 18 to 29 »characterized in that the solvent additionally still contains an organic reducing substance. 31. Stabile Lösung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet5 dass die organische reduzierende Substanz ein Mercaptan ist.31. A stable solution as claimed in claim 30, characterized in 5 that the organic reducing substance is a mercaptan. 32. Stabile Lösung nach Anspruch 3I5. dadurch gekennzeichnet, dass die organische reduzierende Substanz Mercaptoäthanol ist.32. Stable solution according to claim 3I 5 . characterized in that the organic reducing substance is mercaptoethanol. 33« Stabile Lösung nach einem der Ansprüche 18 bis 32, dadurch gekennzeichnets dass die Eonsentration von reduziertem ß-Ni'cotinamid-adenin-dinucleotid im organischen Lösungsmittel zwischen 1 mmol/l und 40 mmol/l liegt.33 «A stable solution according to any one of claims 18 to 32, characterized in that the s Eonsentration of reduced ß-Ni'cotinamid adenine dinucleotide in the organic solvent is between 1 mmol / l and 40 mmol / l. 34= Stabile Lösung nach Anspruch 53$ dadurch gekennzeichnet;. dass die Konzentration -yon redusisrtem ß-H5 ootinamid-adeninainucleotid im organischen Lösungsmittel zwischen IC amol/l und 20 mmol/l liegt.34 = stable solution according to claim 53, characterized; that the concentration -yon redusisrtem ß-H5 ootinamide adenine nucleotide in the organic solvent is between IC amol / l and 20 mmol / l. 35 c Verfahren zur Herstellung einer stabilen Lösung gemäss einem der Ansprüche IS bis 34? dadurch gekennzeichnet, dass man ein getrocknetes oder lyophilisiertes Salz von reduziertem ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid auf übliche Weise im organischen Lösungsmittel löst.35 c method for producing a stable solution according to one of claims IS to 34? characterized in that a dried or lyophilized salt of reduced ß-nicotinamide adenine dinucleotide is dissolved in the usual way in the organic solvent. 36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Salz das Dinatriumsalz ist.36. The method according to claim 35, characterized in that the salt is the disodium salt. 37. Verwendung einer stabilen Lösung gemäss einem der Anspruchs37. Use of a stable solution according to one of the claims 18 bis 34 in einer enzymatischem. Bestimmung, wo reduziertes18 to 34 in one enzymatic. Determination where reduced 109845/1034109845/1034 p-Nicotinamid-adenin-dinucleotid als Coensym "benutzt wird.p-nicotinamide adenine dinucleotide is used as coensym ". 33. Verwendung nach Anspruch. 37» dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Bestimmung eine Bestimmung von Lactat-Dehydrogenase ist.33. Use according to claim. 37 »characterized by that the enzymatic determination is a determination of lactate dehydrogenase is. 39· Verwendung nach Anspruch. 37» dadurch, gekennzeichnet, dass die enzymatische Bestimmung eine Bestimmung von cc-Eydroxybutyrat-Dehyarogenase ist.39 · Use according to claim. 37 »characterized, that the enzymatic determination is a determination of cc-hydroxybutyrate dehyarogenase is. 40. Verwendung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Bestimmung eine Bestimmung von 3-lutamat-Dehydrogenase ist.40. Use according to claim 37, characterized in that the enzymatic determination is a determination of 3-lutamate dehydrogenase is. 4L Verwendung nach Anspruch 37» dadurch gekennzeichnet, dass die ehsymatische Bestimmimg eine Bestimmung von Glucose-β-Phosphat-Dehydrogenase ist.4L use according to claim 37 »characterized in that that the ehsymatic determination is a determination of glucose-β-phosphate dehydrogenase is. 42. Verwendung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatisch^ Bestimmung eine Bestimmung von Pyruvat ist.42. Use according to claim 37, characterized in that that the enzymatic ^ determination is a determination of pyruvate is. 43. Verwendung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Bestimmung eine Bestimmung von Adenosindiphosphat ist.43. Use according to claim 37, characterized in that that the enzymatic determination is a determination of adenosine diphosphate is. 44· Verwendung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Bestimmung eine Bestimmung von Kreatinkinase ist.44 · Use according to claim 37, characterized in that that the enzymatic determination is a determination of creatine kinase is. 45. Verwendung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet,45. Use according to claim 37, characterized in that 6 0 9845/10346 0 9845/1034 dass die enzymatisch^ Bestimmung eine Bestimmung von G-lutamatpyruvat-Transaminase ist.is that the enzymatically ^ Best in mung determination of G-lutamatpyruvat transaminase. 46. Verwendung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatisch^ Bestimmung eine Bestimmung von Giutamatoxalacetat-Transaminase ist.46. Use according to claim 37, characterized in that the enzymatically ^ Best in mung is a determination of Giutamatoxalacetat transaminase. 47. Verwendung nach einem der Ansprüche 37 his 46·, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der Menge an stabiler Lösung zur Menge an Testlösung zwischen 1:25 und 1:150 liegt.47. Use according to one of Claims 37 to 46, characterized in that the ratio of the amount of stable solution to the amount of test solution is between 1:25 and 1: 150. 48. Verwendung nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der Menge an stabiler Lösung zur Menge an Testlösung zwischen 1:50 und 1:100 liegt.48. Use according to claim 47, characterized in that that the ratio of the amount of stable solution to the amount of test solution is between 1:50 and 1: 100. 49. Reagenziengarnitur für diagnostische Bestimmungen, in welchen reduziertes ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid als Coenzyni "benutzt wird, enthaltend einen Behälter mit einer stabilen Lösung gemäss einem der Ansprüche 18 bis 34.49. Reagent kit for diagnostic in order rules in which reduced beta-nicotinamide adenine dinucleotide is used as Coenzyni ", comprising a container having a stable solution according to any one of claims 18 to 34th 609845/1034609845/1034
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