DE2548834C2

DE2548834C2 - Device for spreading cells in cell suspensions for microscopic specimens

Info

Publication number: DE2548834C2
Application number: DE2548834A
Authority: DE
Inventors: Manuel Dr.Med. 1000 Berlin Cuadra
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1975-10-30
Filing date: 1975-10-30
Publication date: 1978-11-02
Also published as: DE2548834B1

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Ausbreitung der Zellen von Zellsuspensionen auf Objektträgern für mikroskopische Präparate.The invention relates to a device for spreading cells from cell suspensions on slides for microscopic specimens.

Eine derartige Vorrichtung errr'iglicht es, ausgebreitete Zellen auf Objektträgern für mikroskopische Beobachtungen herzustellen und ramit eine richtige Identifizierung und Differenzierung von Zellen zu erreichen, da ausgebreitete Zellen ihre strukturellen Einzelheiten deutlicher zeigen als normale oder geschrumpfte Zellen.Such a device makes it possible to spread the word Prepare cells on microscope slides for microscopic observation and ramit a correct one Identification and differentiation of cells to be achieved because cells spread their structural Show details more clearly than normal or shrunken cells.

Die Methode, die bis heute für die Vorbereitung der Zellen von Zellsuspensionen für die Färbung und mikroskopische Beobachtung bekannt ist, besteht darin, daß man direkt auf einen Objektträger einige Tropfen der Suspension bringt, sie ausbreitet oder einen Ausstrich macht (wenn die Suspension dicht ist) und sie an der Luft trocknen läßt. Die vorherige Zentrifugierung der Suspension ist erforderlich, wenn sie arm an Zellen ist. Nach der Färbung sehen die Zellen von Suspensionen, die auf diese Weise behandelt sind, im Mikroskop verkleinert und piknotisch aus, besonders die kugelförmigen Zellen (Leukozyten) und etwas weniger die Plattenzeilen (Epithelzellen); sehr oft kann man die Kerne und die Zytoplasmen nicht erkennen, ausgenommen sind Blutausstriche, welche einen besonderen Fall darstellen (spätere Erklärung). Der für diesen Mangel verantwortliche Faktor ist die Trocknung der Zellsuspension an der Luft durch Verdunstung. Das Gewicht der Zellen setzt sich aus 60-90% Wasser (intrazelluläres Wasser) und 10-40% fester Substanz (organische und anorganische Stoffe) zusammen. Die Zellen, die in isotonischen Lösungen (7 g NaCI per Liter) suspendiert werden, haben ein normales Volumen. Wenn sie in hypertonischen Lösungen (NaCI über 7 g per Liter) suspendiert werden, wird das intrazelluläre Wasser aufgesaugt und die Zellen vermindern ihr Volumen. Wenn sie dagegen in hypotonischen Lösungen suspendiert werden (NaCI unter 7 g per Liter), saugen sie das extrazelluläre Wasser auf und folglich vergrößert sich ihr Volumen, Lassen wir eine Suspension von Zellen in isotonischer Lösung trocknen (A b b, 1), verdunstet das Wasser und das Volumen der Suspension reduziert sich allmählich; gleichzeitig steigt die Salzkonzentration; da der Hypertonus in der suspendierenden Lösung zunimmt, verlieren die Zellen immer mehr ihren Wassergehalt, was eine Volumen-Reduktion der Zellen zur Folge hatThe method used to date for the preparation of cells from cell suspensions for staining and known microscopic observation consists in placing a few drops directly on a microscope slide brings the suspension, spreads it, or smears a smear (if the suspension is tight) and them let air dry. Prior centrifugation of the suspension is required if it is poor Cells is. After staining, cells from suspensions treated in this way will see im Microscope downsized and picnotic, especially the spherical cells (leukocytes) and something less the squamous cells (epithelial cells); very often the nuclei and cytoplasms cannot be seen, exceptions are blood smears, which represent a special case (later explanation). The one for this one Deficiency responsible factor is the drying of the cell suspension in the air by evaporation. That Cell weight is made up of 60-90% water (intracellular water) and 10-40% solid matter (organic and inorganic substances) together. The cells in isotonic solutions (7 g NaCI per liter) are suspended have a normal volume. When in hypertonic solutions (NaCl over 7 g per liter) are suspended, the intracellular water is sucked up and the cells reduce it Volume. If, on the other hand, they are suspended in hypotonic solutions (NaCI less than 7 g per liter), They soak up the extracellular water and consequently their volume increases, let's leave a suspension drying of cells in isotonic solution (A b b, 1), the water and the volume of the evaporates Suspension gradually reduces; at the same time the salt concentration increases; because the hypertension in the suspending solution increases, the cells lose their water content increases, which results in a reduction in the volume of the cells

to Die Schrumpfung der Zellen ist bei kugelförmigen Zellen (Leukozyten) viel mehr ausgeprägt als bei Plattenzellen (Epithelzellen). Wenn diese geschrumpften Zellen gefärbt werden, sehen sie im Mikroskop verkleinert und piknotisch aus, und es ist schwierig oder unmöglich, die ZellenteUe und ihre Organellen (Zytoplasma, Kerne, Nucleolus, Mitochondria, Einschlüsse, Vakuolen) sowie die Affinität für Farbstoff zu erkennen.The shrinkage of the cells is much more pronounced in spherical cells (leukocytes) than in Squamous cells (epithelial cells). When these shrunken cells are stained, see them under a microscope and it is difficult or impossible to identify the cellular elements and their organelles (cytoplasm, Nuclei, nucleolus, mitochondria, inclusions, vacuoles) and the affinity for dye can be recognized.

Bei üblichen Blutausstrichen erscheinen zwar dieWith normal blood smears, the

Leukozyten auch ausgebreitet Bis jetzt fehlte eine richtige Erklärung des Mechanismus der Ausbreitung. Obgleich Blutausstriche seit fast zwei Jahrhunderten bekannt sind, gab es keine Erklärung für den Mechanismus der Ausbreitung der Leukozyten. Jetzt begreifen wir den Mechanismus: Bei Blutausstreichung werden die Leukozyten ausgebreitet, weil das Plasma (suspendierende Lösung) sich in einer sehr dünnen Schicht, die eine große Oberfläche (Glas und rote und weiße Blutkörpereben) überzieht, ausbreitet. Diese dünne Schicht trocknet durch Verdunstung schnell aus und durch den sich ergebenden geringen Hypertonus schrumpfen die Zellen nicht, mit Ausnahme der Zellen der dickeren Teile des Ausstrichs, wo sich das Plasma in größerer Menge befindet. Außer bei Blut, ist die Ausstreichungsmthode nicht wirksam für die Ausbreitung der Zellen von anderen Suspensionen.Leukocytes also spread Until now, a correct explanation of the mechanism of spread was lacking. Although blood smears have been known for nearly two centuries, there has been no explanation for that Mechanism of the spread of leukocytes. Now we understand the mechanism: With blood smear The leukocytes are spread because the plasma (suspending solution) is in a very thin Layer that covers a large surface (glass and red and white blood cells) spreads out. These thin layer dries up quickly due to evaporation and due to the resulting low hypertension the cells do not shrink, with the exception of the cells in the thicker parts of the smear, where the plasma is in larger amount is located. Except for blood, the streaking method is not effective for spread of cells from other suspensions.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Zellen von der suspendierenden Lösung der Zellensuspension vollständig zu trennen, wobei die verbleibenden Zellen während des ganzen Absaugprozesses nicht dem hypertonischen Risiko ausgesetzt werden dürfen. Die Zellen haben die Eigenschaft, sich auszubreiten, wenn sie von ihrem flüssigen Milieu getrennt werden.The invention is based on the object of removing the cells from the suspending solution of the cell suspension completely separate, with the remaining cells not demolishing during the entire suction process may be exposed to hypertonic risk. The cells have the property to spread when they are separated from their liquid environment.

Diese Aufgabe wird gemäß Anspruch I durch zwei, a) und b) genannte Vorrichtungen gelöst.This object is achieved according to claim I by two devices mentioned a) and b).

Vorrichtung a). Mit Löschpapier wird das Suspensionsmittel vollständig abgesaugt (A b b. 2). Dies wird in einem Gerät, das in A b b. 4 und A b b. 5 dargestellt ist, vorgenommen. Die Zelllsuspension wird in den Raum 5, der von dem parallelliegenden Glasobjeklträger 3 und Deckglas 4 gebildet wird, gebracht. Dann, nach 1—2 Stunden Wartezeit, in welcher die Zellen sich an die Oberfläche des Objektträgers 3 setzen, wird eine Spitze des quadratischen Löschpapiers 9 mittels der Schiebewalze 8 mit der Suspension in Berührung gebracht. Die suspendierende Lösung wird dann abgesaugt, und die Zellen bleiben fest und ausgebreitet am Objektträger 3 haften. Nimmt man den Objektträger 3 heraus, erscheint auf seiner Oberfläche eine dünne und nasse Schicht von Zellen, die schnell trocknet. Das Präparat, so angefertigt, eignet sich für mikroskopische Beobachtungen, besonders nach Färbung mit den üblichen Methoden. Durch Drehen des Triebknopfes 6 kann man die Größe des Zwischenraumes 5 regulieren. Die Größe des Raumes richtet sich nach der Konzentration der Zellsuspension. Das Gerät soll in feuchter Luft funktionieren und steht deswegen in einer Glaskammer.Device a). The suspension medium is completely sucked off with blotting paper (A b b. 2). This is done in a device described in A b b. 4 and A b b. 5 is made. The cell suspension is transferred to room 5, which is formed by the parallel glass object carrier 3 and cover glass 4, brought. Then after 1–2 Hours of waiting in which the cells settle on the surface of the slide 3 becomes a peak of the square blotting paper 9 brought into contact with the suspension by means of the slide roller 8. the suspending solution is then aspirated, and the cells remain firm and spread out on slide 3 be liable. If you take out the slide 3, a thin and wet layer of appears on its surface Cells that dries quickly. The preparation, made in this way, is suitable for microscopic observations, especially after staining with the usual methods. By turning the drive knob 6 you can adjust the size regulate the gap 5. The size of the room depends on the concentration of the Cell suspension. The device should work in moist air and is therefore in a glass chamber.

1 Tisch mit 4 Fußschrauben für Nivellieren, 21 table with 4 foot screws for leveling, 2

Fußschraube, 3 Objektträger, 4 Deckglas, 5 Zwischen-Foot screw, 3 microscope slides, 4 cover slip, 5 intermediate

raum (Zellsuspension), 6 Triebknopf für Heben oder Senken des Deckglases (Schraube mit Mutter), 7 Klammer zum Befestigen des Deckglases, 8 Schiebewalze für das Löschpapier, 9 Löschpapier, 10 Triebknopf zur Löschpapierzentrierung, 11 Fixachse für die Deckglastriebschraube, 12 Führungsstifl, 13 Klammer zum Befestigen des Objektträgers, 14 Klammer zum Befestigen des Objektträgers.space (cell suspension), 6 button for raising or lowering the cover glass (screw with nut), 7 Bracket for attaching the cover glass, 8 sliding roller for the blotting paper, 9 blotting paper, 10 drive button for centering the blotting paper, 11 fixed axis for the cover glass drive screw, 12 guide pin, 13 clamp for fastening the slide, 14 clamps for fastening the slide.

Vorrichtung b). Die Zellsuspension wird auf einen dünnen Film aus Agarose (gelierende Bestandteile des Agars) gebracht, welcher auf einem Filterpapier liegt, und das wiederum auf einer porösen Platte aus Gips oder Ton liegt. Die zellsuspendierende Lösung wird dann von der porösen Platte durch den Agarosefilm abgesaugt (osmotisches Absaugen), und die Zellen bleiben zurück, befestigt am Agarfilm (A b b. 3). Mikroskopisch stellt man fest, daß die Zellen vollkommen ausgebreitet worden sind.Device b). The cell suspension is spread on a thin film of agarose (gelling constituents of Agars), which lies on a filter paper, and that in turn on a porous plate made of plaster of paris or clay lies. The cell suspending solution is then removed from the porous plate through the agarose film aspirated (osmotic aspiration), and the cells remain, attached to the agar film (A b b. 3). Microscopically it can be seen that the cells have spread out completely.

Den höchsten Grad des Ausbreitens erreicht man mit der Agarosemethode; etwas weniger mit dem oben beschriebenen Gerät, weil beim letzteren durch das Absaugen eine ganz dünne Schicht von suspendierender Lösung zurück bleibt, während mit der Ag.irosefilm-Methode die Flüssigkeit vollkommen abgesaugt wird.The highest degree of spreading is achieved with the agarose method; a little less with the one above described device, because in the latter a very thin layer of suspending due to the suction Solution remains, while with the Ag.irosefilm method the liquid is completely sucked off.

Um die am Agarosefilm befestigten Zellen zu färben, war es notwendig, eine neue Methode zu entwickeln, weil bei Versuchen mit den gewöhnlichen Methoden (Tauchen des Zellen-Agarosefilm-Präparats in Farbstofflösung) die Färbung sowohl die Zellen als auch den Agarfilm erfaßte und daher eine Kontrastierung bei jo mikroskopischer Beobachtung fehlte. Mit der neuen Methode lassen sich dagegen die Zellen selektiv färben und die Agarose bleibt sehr schwach oder kaum gefärbt, und es gibt keine Störung bei mikroskopischer Beobachtung. Bei dieser neuen Methode Webt man dus Zellen-Agarfilm-Präparat an einen anderen dicken, vorher gelärbten Agarfilm (»Katalysator«), Die zusammengeklebten Filme werden I -2 Stunden in Farbstoff· lösung (z. B. Giemsa) getaucht. Danach wird der dünne Film vom »Katalysator« getrennt, auf einen Objektträger aufgetragen und getrocknet. Weil derselbe dicke gefärbte Agarosefilm für mehrere Verfahren brauchbar ist, ist die Benennung »Katalysator« richtig.In order to stain the cells attached to the agarose film, it was necessary to develop a new method, because when trying the usual methods (dipping the cell agarose film preparation in a dye solution) the staining detected both the cells and the agar film and therefore a contrast in jo microscopic observation was absent. With the new method, however, the cells can be stained selectively and the agarose remains very faint or barely colored, and there is no interference with microscopic Observation. This new method involves weaving the cell agar film preparation onto another thick, Agar film previously colored (»catalyst«), the stuck together films are immersed in dye for 1-2 hours solution (e.g. Giemsa) submerged. After that, the thin The film was separated from the "catalyst", applied to a microscope slide and dried. Because the same fat one stained agarose film is useful for several processes, the term "catalyst" is correct.

Der dünne Agarosefilm wird wie folgt hergestellt: 1 — 2% warme Agaroselösung wird in den Zwischenraum von zwei zueinander parallelstehenden (C,45 mm Entfernung) Glasplatten gegossen. Nach Abkühlung wird der Film von der Glasplatte getrennt (alle Arbeiten werden unter Wasser ausgeführt) und auf silikonisiertes Glas oder eine Plastikstoffplatte aufgetragen und im Brutschrank (37°C) getrocknet. Schließlich wird der Film abgetrennt und ist fertig zum Gebrauch. Der dicke Agarosefilm wird mit derselben Methode hergestellt (1 mm Entfernung zwischen den Glas^'itten).The thin agarose film is produced as follows: 1 - 2% warm agarose solution is placed in the space poured from two parallel (C, 45 mm distance) glass plates. After cooling down the film is separated from the glass plate (all work is carried out under water) and siliconized on Glass or a plastic plate applied and dried in an incubator (37 ° C). Eventually the Film separated and ready to use. The thick agarose film is made using the same method (1 mm distance between the glass ^ 'itten).

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen besonders darin, daß die ausgebreiteten Zellen deutlicher ihre strukturellen Einzelheiten zeigen als normale oder geschrumpfte Zellen. Diese Vorteile sind wichtig für die Identifizierung und Differenzierung der Zellen von Ze'iisuspensionen, insbesondere in der Medizin, wo das zytologische Studium der Zellsuspensionen (Blut. Urin, Liquor cerebro spinalis, Milch. Speichel, Prostata-Sekrete, Pleura- Perikardium-Pertioneum-Exudaien. Eiter, Sputum, Spülflüssigkeiten von Organen [Magen, Vagina], Zellkultursuspensionen) eine große diagnostische Bedeutung hat.The advantages achieved by the invention are, in particular, that the cells spread more clearly their structural details show up as normal or shrunken cells. These benefits are important for the identification and differentiation of cells of cell suspensions, especially in medicine, where the cytological study of cell suspensions (blood, urine, cerebro spinal fluid, milk, saliva, prostate secretions, Pleural-pericardium-pertioneum exudia. Pus, sputum, rinsing fluids from organs [stomach, Vagina], cell culture suspensions) is of great diagnostic importance.

Hierzu 4 Blatt ZeichnungenFor this purpose 4 sheets of drawings

Claims

Patent claims:

1. Device for spreading cells in cell suspensions for microscopic specimens, characterized in that either

a) two parallel glass plates are provided, in the space between which the Cell suspension is brought and from which, after spontaneous sedimentation of the cells, the supernatant The suspension medium is sucked off with blotting paper, or

b) a porous plate made of plaster of paris or clay is provided on which an agarose film is applied to which the cell suspension is applied, after which the suspending agent is removed by osmosis so that the cells remain in the agarose film.

2. Apparatus according to claim 1, characterized by a horizontally adjustable table (1) with Holding means (13, 14) for the slide (3) and with holding devices (7) for the cover glass (4) and Adjusting means (6) for the distance between slide (3) and cover glass (4) and through a Double roller (8) for introducing the blotting paper (9) into the suspension (5).