DE2532051A1

DE2532051A1 - METHOD FOR MANUFACTURING CYCLODEXTRIN

Info

Publication number: DE2532051A1
Application number: DE19752532051
Authority: DE
Inventors: Toshiyuki Kato; Tsuyoshi Kochi; Sadakazu Matsubara; Fumio Misawa; Masayuki Okimoto; Naohisa Saito; Atsuyuki Shima; Yoji Suzuki
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1974-07-19
Filing date: 1975-07-17
Publication date: 1976-01-29
Also published as: JPS5112941A; FR2284675A1; DE2532051B2; FR2284675B1

Description

Case F3085-K435(Teijin)/MSCase F3085-K435 (Teijin) / MS

TEIJIN LIMITED, Osaka/JapanTEIJIN LIMITED, Osaka / Japan

Verfahren zur Herstellung von CyclodextrinenProcess for the production of cyclodextrins

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur vorteilhaften Herstellung von Cyclodextrinen in höheren Ausbeuten innerhalb kürzerer Reaktionszeiten unter Verwendung einer wäßrigen Lösung eines Stärkehydrolysats in einer höheren Konzentration, welches Verfahren eine gute Reproduzierbarkeit von Ausbeuten schafft und keine Verfahrensnachteile mit sich bringt, die auf die Verwendung von hochkonzentrierten Lösungen zurückzuführen sind.The invention relates to an improved method for the advantageous Production of cyclodextrins in higher yields within shorter reaction times using an aqueous solution of a starch hydrolyzate in a higher concentration, which method has good reproducibility of yields and does not entail any procedural disadvantages due to the use of highly concentrated Solutions are due.

Cyclodextrine, ebenso als Cycloamylase oder Schardinger-Dextrine bekannt, können aus Stärke durch die Einwirkung eines Enzyms hergestellt werden, das im allgemeinen als Cyclodextrin-transglycosylase (B. macerans amylase) bekannt ist. Die Quelle des Enzyms ist im allgemeinen eine Kultur von Bacillus macerans. Diese Cyclodextrine werden auf Grund der Anzahl von Glucose-Einheiten klassifiziert bzw. eingeteilt und werden als a-Cyclodextrin (6 Glucose-Einheiten), ß-Cyclodextrin (7 Glucose-Einheiten) und y—Cyclodextrin (8 Glucose-Einheiten) bezeichnet.Cyclodextrins, also known as cycloamylase or Schardinger dextrins, can be made from starch by the action of an enzyme commonly known as cyclodextrin transglycosylase (B. macerans amylase). The source of the enzyme is generally a culture of Bacillus macerans. These cyclodextrins are classified on the basis of the number of glucose units, or divided and are used as a-cyclodextrin (6 glucose units), (7 glucose units) and y-cyclodextrin cyclodextrin ß (8 glucose units), respectively.

Die Verfahren zur Herstellung dieser Cyclodextrine werden z.B. von E.B. Tilden und CS. Hudson in "J. Am.Chem.Soc. ", 44,The processes for the production of these cyclodextrins are, for example, by EB Tilden and CS. Hudson in "J. Am. Chem. Soc.", 44 ,

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1432 (1942) und von D. French in "J.Am.Chem.Soc.", 21» ³⁵³ (1949) beschrieben. Gemäß den in diesen Literaturstellen beschriebenen Verfahren wird eine Kulturbrühe bzw. Kulturflüssigkeit von Bacillus macerans mit einer Stärkelösung gemischt, um eine ezymatische Reaktion bei 35 bis 40 C zu bewirken. Wenn die Konzentration der Stärke in der Reaktionslösung auf über 5 Gewichts-% erhöht wird, wird die Viskosität der Lösung jedoch ebenfalls höher. Als Folge davon unterliegt die Lösung einer "Retrogression"("Retrogradation")bei der verwendeten Temperatur und wird halbfest. Das halbfeste Material ist schwer zu handhaben und verringert merklich die Wirkung des Enzyms, was eine Verringerung der Ausbeute des Endproduktes zur Folge hat. Aus diesem Grunde beträgt die bei diesem Verfahren erreichbare Konzentration des Ausgangsmaterials etwa 5 Gewichts-% höchstens, so daß die Verfahren gemäß dem Stand der Technik eine geringe Effizienz bzw. einen niedrigen Wirkungsgrad aufweisen, wenn sie industriell durchgeführt werden.1432 (1942) and by D. French in "J.Am.Chem.Soc.", 21 » ³⁵³ (1949). According to the method described in these references, a culture broth or culture liquid of Bacillus macerans is mixed with a starch solution in order to bring about an enzymatic reaction at 35 to 40.degree. However, if the concentration of the starch in the reaction solution is increased above 5% by weight, the viscosity of the solution also becomes higher. As a result, the solution undergoes "retrogression"("retrogradation") at the temperature used and becomes semi-solid. The semi-solid material is difficult to handle and markedly reduces the activity of the enzyme, which results in a reduction in the yield of the end product. For this reason, the concentration of the starting material achievable in this process is about 5% by weight at most, so that the processes according to the prior art have a low efficiency or a low efficiency when they are carried out industrially.

Im Hinblick auf die Überwindung dieser Schwierigkeiten des Standes der Technik wurden bislang Verfahren vorgeschlagen, bei denen die Konzentration des Ausgangsmaterials durch Verwendung eines Stärkehydrolysats erhöht wird, welches durch Hydrolyse von Stärke mit einem Enzym oder einer Säure auf ein D.E. (Dextrose-Äquivalent) von 15 oder nicht mehr als 20 erhalten wird, um Cyclodextrine mit guter industrieller Wirksamkeit zu erhalten.With a view to overcoming these difficulties of the prior art, methods have heretofore been proposed in which the concentration of the starting material is increased by using a starch hydrolyzate which is obtained by Hydrolysis of starch with an enzyme or an acid on a D.E. (Dextrose equivalent) of 15 or no more than 20 is obtained to obtain cyclodextrins with good industrial effectiveness.

Ein solcher Vorschlag - japanische Patentpublikation 2380/71 lehrt, daß eine Stärke zuerst mit a-Amylase oder einerSäure auf ein D.E. von nicht mehr als 15 partiell hydrolysiert wird und eine wäßrige Lösung des erhaltenen Stärkehydrolysats mit einem D.E. von nicht meht als 15 mit einer Stärkekonzentration von mindestens 8 % mit Cyclodextrin-transglycosylase in Gegenwart eines Cyclodextrin-Komplexierungsmittels (oder Ausfällungsmittels) umgesetzt wird. Auch die US-PS 3 425 910 (die der GB-PS 1 185 207, der CA-PS 857 304 und der FR-PS 1 541 576 entspricht) lehrt, daß" eine wäßrigeOne such proposal - Japanese Patent Publication 2380/71 teaches that a starch is first partially hydrolyzed with α-amylase or an acid to a DE of not more than 15 and an aqueous solution of the obtained starch hydrolyzate with a DE of not more than 15 with a starch concentration of at least 8% is reacted with cyclodextrin transglycosylase in the presence of a cyclodextrin complexing agent (or precipitating agent). US Pat. No. 3,425,910 (which corresponds to GB-PS 1 185 207, CA-PS 857 304 and FR-PS 1 541 576) also teaches that "an aqueous

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Lösung eines Stärkehydrolysats mit einem D.E. von nicht mehr als 20 in einem ähnlichen Verfahren verwendet wird.Solution of a starch hydrolyzate with a D.E. of no more than 20 is used in a similar procedure.

Es wurde nunmehr bei der Untersuchung der enzymatischen Herstellung von Cyclodextrinen unter Verwendung einer wäßrigen Lösung eines Stärkehydrolysats gefunden, daß, selbst wenn wäßrige Lösungen von Hydrolysaten derselben Stärke mit demselben Dextrose-Äquivalent, die jedoch von verschiedenen Ansätzen erhalten wurden, in derselben Stärkehydrolysatkonzentration verwendet werden, die Ausbeuten der durch die enzymatische Reaktion unter denselben Bedingungen erhaltenen Cyclodextrine in unvorhersehbarer Weise variieren und die Ausbeutereproduzierbarkeit schlecht ist. Dies ist ein sehr schwerwiegender Nachteil für die industrielle Durchführung dieser Verfahren. Es wurde auch gefunden, daß, wenn die Konzentration des Stärkehydrolysats bei den vorstehenden experimentellen Verfahren erhöht wird, im Versuch die Verfahren für den industriellen Betrieb vorteilhaft zu gestalten, die Cyclodextrinausbeuten manchmal niedriger werden.It has now been used in the investigation of the enzymatic production of cyclodextrins using an aqueous Solution of a starch hydrolyzate found that, even if aqueous solutions of hydrolyzates with the same starch the same dextrose equivalent but obtained from different batches in the same starch hydrolyzate concentration are used the yields of those obtained by the enzymatic reaction under the same conditions Cyclodextrins vary in unpredictable ways and yield reproducibility is poor. This is a very serious disadvantage for the industrial implementation of these processes. It was also found that if the concentration of the starch hydrolyzate is increased in the above experimental procedures, in the trial the procedures to make it advantageous for industrial operation, the cyclodextrin yields are sometimes lower.

Dieses Ergebnis, welches im Hinblick auf die Ausrüstung bzw. die Geräte und die zu behandelnde Menge für ein industrielles Verfahren sehr nachteilig ist, folgt auch aus den Ergebnissen der Beispiele der vorstehenden japanischen Patentpublikation 2380/71. Z.B. wird im Versuch V dieser Patentschrift ein Stärkehydrolysat mit einem D.E. von 5 (welcher Wert in dieser Patentschrift als bevorzugt angesehen wird),erhalten durch Hydrolyse von Kartoffelstärke mit im Handel erhältlicher verflüssigender Amylase (Kleistase, ein Handelsname für ein Produkt der Daiwa Kasei Kabushiki Kaisha, Japan, 10 000 Einheiten),in einer Konzentration von 11 Gewichts-% verwendet und 4 Tage bei 3 7°C unter Verwendung von Trichloräthylen als Cyclodextrin-Komplexierungsmittel umgesetzt. Cyclodextrine werden in einer Ausbeute von 58 % erhalten. Wenn andererseits die vorstehende Reaktion wiederholt wird mit dem Unterschied, daß die Konzentration des Stärkehydrolysats auf 35 Gewichts-% erhöht wird,This result, which in terms of equipment or devices and the amount to be treated for an industrial Method is very disadvantageous also follows from the results of the examples of the above Japanese Patent publication 2380/71. For example, in Experiment V of that patent, a starch hydrolyzate with a D.E. of 5 (which value is considered preferred in this patent obtained by hydrolysis of potato starch with commercially available liquefying amylase (Kleistase, a trade name for a product of Daiwa Kasei Kabushiki Kaisha, Japan, 10,000 units), at a concentration of 11% by weight used and 4 days at 37 ° C using trichlorethylene as a cyclodextrin complexing agent implemented. Cyclodextrins are obtained in a yield of 58%. On the other hand, if the above reaction is repeated with the difference that the concentration of the starch hydrolyzate is increased to 35% by weight,

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nimmt die Ausbeute an Cyclodextrinen auf 35 Gewichts-% ab. Darüber hinaus lehrt Beispiel II der US-PS 3 425 910, daß, wenn ein Stärkehydrolysat mit einem D.E. von 2,0 (innerhalb des Bereiches von 0,5 bis etwa 6, was gemäß dieser Patentschrift bevorzugt ist) in einer höheren Konzentration verwendet wird, die Ausbeute an Cyclodextrinen zunimmt, jedoch beträgt die Ausbeute nur 52 % nach der Umsetzung einer wäßrigen Lösung des Stärkehydrolysats in einer Konzentration vo η 34 g/l00 ml bei 50°C während so lange wie 7 Tagen unter Verwendung von Toluol als Cyclodextrin-Komplexierungsmitte],. the yield of cyclodextrins decreases to 35% by weight. In addition, Example II of U.S. Patent 3,425,910 teaches that when a starch hydrolyzate having a DE of 2.0 (within the range of 0.5 to about 6, which is preferred according to that patent) is used at a higher concentration , the yield of cyclodextrins increases, but the yield is only 52 % after the reaction of an aqueous solution of the starch hydrolyzate in a concentration of 34 g / 100 ml at 50 ° C for as long as 7 days using toluene as the cyclodextrin complexing agent ] ,.

Es ist ferner zu bemerken, daß in diesen Verfahren gemäß dem Stand der Technik, wenn höhere Konzentrationen an Stärkehydrolysat verwendet werden, um das Verfahren industriell vorteilhaft durchzuführen, größere D.E.-Werte niedrigere Ausbeuten an Cyclodextrinen bewirken. Dies bedeutet, daß, um das Stärkehydrolysat in einer höheren Konzentration zu verwenden, das D.E. des Stärkehydrolysats niedriger sein muß. Demzufolge kann das leicht Schwierigkeiten bei der Verfahrensführung bzw. im Betrieb herbeiführen. Experiment V der vorstehend genannten japanischen Patentschrift zeigt die mit variierenden D.E.-Werten bei einer hohen Konzentration von 30 Gewichts-% erhaltenen Ergebnisse. Diese Ergebnisse demonstrieren, daß der Betrieb schwierig ist, wenn das D.E. beträgt; daß, wenn das D.E. 10 ist, die Ausbeute an Cyclodextrinen 45 % beträgt, und daß, wenn das D.E. auf 18 erhöht wird, die Ausbeute auf 30 % abnimmt.It should also be noted that in these prior art processes, when higher concentrations of starch hydrolyzate can be used to carry out the process industrially advantageously, larger D.E. values lower ones Cause yields of cyclodextrins. This means that to get the starch hydrolyzate in a higher concentration use the D.E. of the starch hydrolyzate must be lower. As a result, this can easily lead to difficulties in carrying out the process or in operation. Experiment V of the above Japanese patent cited above shows those with varying D.E. values at a high concentration of 30% by weight results obtained. These results demonstrate that it is difficult to operate when the D.E. amounts to; that if the D.E. 10, the yield of cyclodextrins is 45% and that when the D.E. increased to 18 the yield decreases to 30%.

Beispiel III der vorstehenden US-PS gibt die Ergebnisse von Experimenten wieder, die durchgeführt wurden unter Verwendung eines Stärkehydrolysats in einer Konzentration von 34 g/lOO ml der Reaktionslösung und unter Variierung des D.E. des Hydrolysats von 0,4 bis 25,5. Diese Ergebnisse zeigen, daß, wenn die Reaktion unter Verwendung von Toluol als Cyclodextrin-Komplexierungsmittel bei 50 C während 4 bzw.7 Tagen durchgeführt wird, die Ausbeute an Cyclodextrinen mit größeren D.E.-Werten in beiden Fällen größer wird, und die Ab-Example III of the foregoing US patent gives the results of experiments carried out using a starch hydrolyzate at a concentration of 34 g / 100 ml of the reaction solution and varying the DE of the hydrolyzate from 0.4 to 25.5. These results show that if the reaction is carried out using toluene as the cyclodextrin complexing agent at 50 C for 4 and 7 days, respectively, the yield of cyclodextrins with larger DE values increases in both cases, and the ab-

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nähme der Ausbeuten ist drastisch. Z.B. ist die Ausbeute an Cyclodextrinen aus einem Stärkehydrolysat mit einem D.E. von 1,0 und einer Konzentration von 34 g/lOO ml der Reaktionslösung 45 % nach 4-tägiger Reaktion und 51 % nach 7-tägiger Reaktion. Wenn jedoch das D.E. des Hydrolysats 12,0 bei derselben Konzentration beträgt, nimmt die Ausbeute drastisch auf 17 % nach 4-tägiger Reaktionszeit und auf 22 % nach 7-tägiger Reaktionszeit ab.the yields are drastic. For example, the yield of cyclodextrins from a starch hydrolyzate with a DE of 1.0 and a concentration of 34 g / 100 ml of the reaction solution is 45 % after a 4-day reaction and 51% after a 7-day reaction. However, when the DE of the hydrolyzate is 12.0 at the same concentration, the yield drops drastically to 17 % after 4 days of reaction time and to 22% after 7 days of reaction time.

Wie bereits erwähnt, ist die erreichbare Stärkekonzentration höchstens 5 %, wenn Stärke direkt als Ausgangsmaterial verwendet wird, und wenn die Konzentration erhöht wird, ergeben sich Schwierigkeiten beim Betrieb des Verfahrens und unzufriedenstellende Ausbeuten. Es ist leicht verständlich, daß auch im Falle von Stärkehydrolysaten dieselben Schwierigkeiten auftreten würden, wenn deren D.E.-Werte niedrig sind und denjenigen der Stärke nahekommen. Wenn z.B. ein Stärkehydrolysat mit einem D.E. von etwa 10 verwendet wird, kann es in gelöstem Zustand in einer Konzentration von mehr als 45 g/lOO ml gehalten werden. Wenn jedoch das D.E. etwa beträgt, ist die erreichbare Konzentration höchstens 20 g/ 100 ml, und es ist schwierig, Lösungen mit einer höheren Konzentration zu bilden. V7enn darüber hinaus das Substrat ein niedriges D.E. aufweist,entsteht während der Reaktion ein unlösliches klebriges Material aus einem feinen unlöslichen Material und bewirkt eine drastische Verringerung der Filtrierbarkeit der Reaktionslösung. Diese verringerte FiI-trierbarkeit kann selbst durch Erwärmen der Reaktionslösung nicht verbessert v/erden und beeinflußt daher nachteilig die Reinigungsverfahrensweise der Cyclodextrine.As already mentioned, the achievable starch concentration is a maximum of 5% if starch is used directly as the starting material and when the concentration is increased, difficulties arise in the operation of the process and unsatisfactory yields. It is easy to understand that the same difficulties also exist in the case of starch hydrolysates would occur when their D.E. values are low and approach that of starch. For example, if a Starch hydrolyzate with a D.E. of about 10 is used, it can be dissolved in a concentration of more can be kept as 45 g / 100 ml. However, if the D.E. approximately the achievable concentration is at most 20 g / 100 ml, and it is difficult to find solutions with a higher Form concentration. Furthermore, if the substrate has a low D.E. has arises during the reaction an insoluble sticky material made of a fine insoluble material and causes a drastic reduction in the Filterability of the reaction solution. This reduced filterability cannot be improved even by heating the reaction solution and therefore adversely affects the purification procedure of the cyclodextrins.

Es wurden nunmehr Untersuchungen durchgeführt, um die verschiedenen Nachteile und Schwierigkeiten zu überwinden, die bei der Verwendung von Stärkehydrolysaten angetroffen werden, wie schlechte Reproduzierbarkeit der Ausbeuten, Verringerung der Ausbeuten auf Grund der Verwendung von Stärkehydrolysaten hoher Konzentration, -die notwendigen langen Reaktionszeiten und die erhebliche Verringerung der AusbeutenStudies have now been carried out to identify the various To overcome disadvantages and difficulties encountered with the use of starch hydrolysates, such as poor reproducibility of the yields, reduction in yields due to the use of starch hydrolysates high concentration, the necessary long reaction times and the considerable reduction in yields

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durch die Verwendung von Starkehydrolysaten mit einem großen D.E.-Wert.by using starch hydrolysates with a large D.E. value.

Es wurde nunmehr gefunden, daß eine bedeutsame kritische Beschränkung hinsichtlich der gesamten Mengen von Maltose und Glucose in dem Stärkehydrolysat besteht, was bislang vollständig vernachlässigt wurde, und daß, wenn die Gesamtmenge von Maltose und Glucose in einem Stärkehydrolysat mit einem D.E. von nicht mehr als 20 etwa 5 Gewichts-%, bezogen auf das Gewicht des Stärkehydrolysats, überschreitet, eine wesentliche Verringerung der Ausbeute an Cyclodextrinen eintritt, wie in den nachstehenden Vergleichsbeispielen veranschaulicht wird. Es wurde somit gefunden, daß die schlechte Reproduzierbarkeit von Ausbeuten dadurch verbessert werden kann, daß man Stärkehydrolysate mit einem D.E. von nicht mehr als 20 verwendet, welche das Erfordernis hinsichtlich der Gesamtmenge von Maltose und Glucose darin erfüllen.It has now been found that there is a significant critical limit on the total amounts of maltose and glucose is in the starch hydrolyzate, which has hitherto been completely neglected, and that if the total amount of maltose and glucose in a starch hydrolyzate with a D.E. of not more than 20 about 5% by weight, based on the weight of the starch hydrolyzate exceeds a substantial decrease in the yield of cyclodextrins occurs, as illustrated in the comparative examples below. It was thus found that the poor reproducibility of yields can be improved by starch hydrolyzates with a D.E. of not more than 20 is used, which meets the requirement for the total amount of maltose and glucose meet in it.

Es wurde ferner ermittelt, daß eine spezielle Korrelation zwischen der Konzentration des Stärkehydrolysats und der Menge von Cyclodextrin-trän sglyco sy läse besteht, und durch Durchführung der Reaktion unter Bedingungen, die die folgende GleichungIt was also found that a specific correlation between the concentration of the starch hydrolyzate and the Amount of cyclodextrin watering sglyco sy läse consists, and through Carry out the reaction under conditions that the following equation

'CR = 194A/S'CR = 194A / S

erfüllen, worinmeet what

S die Konzentration (in g/l00 ml der Reaktionslösung) eines Stärkehydrolysats zu Beginn der Reaktion ist und eine positive Zahl von 10 bis 50 darstellt undS is the concentration (in g / 100 ml of the reaction solution) of a starch hydrolyzate at the start of the reaction and represents a positive number from 10 to 50 and

CR die Zahl ist, die die Einheit bzw. Einheiten von Cyclodextrin- transglycosylase pro g Stärkehydrolysat angibt,CR is the number representing the unit or units of cyclodextrin indicates transglycosylase per g of starch hydrolyzate,

kann der Nachteil der Erzielung schlechter Ausbeuten und der Benötigung langer Reaktionszeiten als Folge der Verwendung von Starkehydrolysaten hoher Konzentration elimi-can have the disadvantage of obtaining poor yields and the need for long reaction times as a result of the use of starch hydrolysates of high concentration elimi-

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niert werden, und die Verringerung der Ausbeuten auf Grund der Verwendung von Starkehydrolysaten mit einem größeren D.E.Wert und einer höheren Konoentration in wäßriger Lösung kann vermieden werden, wie in den nachstehenden Vergleichsbeispielen gezeigt wird. Keines der Beispiele der vorstehenden japanischen und amerikanischen Patentschriften erfüllt die vorstehende Gleichung, und in diesen Beispielen ist CR viel kleiner als 194/y/s. The reduction in yields due to the use of starch hydrolyzates having a larger DE value and a higher concentration in aqueous solution can be avoided, as will be shown in the following comparative examples. None of the examples of the above Japanese and American patents satisfy the above equation, and in these examples, CR is much smaller than 194 / y / s.

Es wurde auch gefunden, daß, wenn in den vorstehenden Verfahren des Standes der Technik Stärkehydrolysate mit einem D.E.-Wert und einer höheren Konzentration verwendet werden, die Ausbeute an Cyclodextrinen erheblich verringert wird, jedoch, wenn die vorstehende Korrelation erfüllt ist, ein solcher Nachteil nicht wesentlich auftritt, selbst wenn Stärkehydrolysate hoher Konzentration verwendet werden.It has also been found that when in the above prior art processes, starch hydrolysates with a D.E. value and a higher concentration can be used, the yield of cyclodextrins is significantly reduced, but when the above correlation is satisfied, a such disadvantage does not occur significantly even when high concentration starch hydrolysates are used.

Es wurde somit bestätigt, daß,-wenn die Gesamtmenge von Maltose und Glucose in dem Stärkehydrolysat und die durch die vorstehende Gleichung ausgedrückten Bedingungen in den Bereichen der vorliegenden Erfindung liegen, alle Nachteile, die durch die Verwendung von Starkehydrolysaten bewirkt werden, überwunden werden können und Cyclodextrine in ausgezeichneter Weise in industriellem Maßstab hergestellt werden können.It was thus confirmed that when the total amount of maltose and glucose in the starch hydrolyzate and the conditions expressed by the above equation in the ranges of the present invention are all the disadvantages caused by the use of starch hydrolysates can be overcome and cyclodextrins are excellently produced on an industrial scale can.

Es ist demzufolge Ziel der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrinen zu schaffen, durch Umsetzung einer wäßrigen Lösung eines Stärkehydrolysate mit einem D.E. von nicht mehr als 20 mit Cyclodextrin-transglycosylase in Gegenwart eines Cyclodextrin-Komplexierungsmittels, ohne die Nachteile der Verfahren gemäß dem Stand der Technik.It is therefore an object of the invention to provide an improved process for the preparation of cyclodextrins, by reacting an aqueous solution of a starch hydrolyzate with a D.E. of not more than 20 with cyclodextrin transglycosylase in the presence of a cyclodextrin complexing agent without the disadvantages of the processes according to the state of the art.

Andere Ziele und Vorteile der Erfindung gehen aus der nachstehenden Beschreibung hervor.Other objects and advantages of the invention will be apparent from the following Description.

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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Reaktion zur Herstellung von Cyclodextrinen unter derartigen Bedingungen durchgeführt, daßAccording to the process of the present invention, the reaction to produce cyclodextrins is carried out under such conditions performed that

(i) die Gesamtmenge von Maltose und Glucose, die bei der Initiierung der Reaktion enthalten ist, nicht mehr als etwa 5 Gewichts-%, bezogen auf das Gewicht des Stärkehydrolysats, beträgt und(i) the total amount of maltose and glucose contained in the initiation of the reaction is not more than about 5% by weight, based on the weight of the starch hydrolyzate, and

(ii) die Menge an Cyclodextrin-transglycosylase in der Reaktionslösung die folgende Gleichung(ii) the amount of cyclodextrin transglycosylase in the reaction solution the following equation

erfüllt, worinmet what

S die Konzentration (in g/lOO ml der Reaktionslösung) des Stärkehydrolysats bei Initiierung der Reaktion ist und eine positive Zahl von 10 bis 50 darstellt undS is the concentration (in g / lOO ml of the reaction solution) of the starch hydrolyzate at initiation of the reaction and represents a positive number from 10 to 50 and

CR die Anzahl ist, die die Einheit bzw. Einheiten von Cyclodextrin-transglycosylase pro g Stärkehydrolysat angibt bzw. wiedergibt.CR is the number representing the unit or units of cyclodextrin transglycosylase per g of starch hydrolyzate indicates or reproduces.

Das erfindungsgemäß verwendete Stärkehydrolysat wird nach bekannten Verfahrensweisen hergestellt, z.B. durch Erwärmen von Stärke in Gegenwart einer Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, oder durch Hydrolyse derselben mit einer oc-Amylase, wie Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger. Die Zusammensetzung des Scchari<3s in der gebildeten Stärke variiert je nach der Hydrolysemethode und den Hydrolysebedingungen.The starch hydrolyzate used in the present invention is prepared according to known procedures, for example by heating of starch in the presence of an acid, such as hydrochloric acid, or by hydrolysis of the same with an α-amylase, such as Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Aspergillus oryzae or Aspergillus niger. The composition des Scchari <3s in the starch formed varies depending on the hydrolysis method and the hydrolysis conditions.

Es wurde gefunden, daß, wenn Cyclodextrin-transglycosylase auf verschiedene Stärkehydrolysate mit einem D.E. von 5 bis 20, hergestellt nach verschiedenen Methoden, einwirken gelassen wird, die Ausbeute an Cyclodextrinen je nach der Menge von Glucose und Maltose in den Stärkehydrolysaten innerhalb eines großen Bereiches variiert, selbst wenn dieIt has been found that when cyclodextrin transglycosylase is responsive to various starch hydrolysates having a D.E. from 5 to 20, prepared by different methods, is allowed to act, the yield of cyclodextrins depending on the Amount of glucose and maltose in the starch hydrolyzates varies within a wide range, even if the

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Stärkehydrolysat-Substrate denselben D.E.-Wert aufweisen. Es wurde z.B. ermittelt, daß, wenn die Gesamtmenge von Glucose und Kaitose in dem Stärkehydrolysat nicht mehr als 5 Gewichts-% beträgt, Cyclodextrine in einer Ausbeute von 30 bis 70 %, bezogen auf das Gewicht des Ausgangsmaterials, erhalten werden können, daß jedoch, wenn die Gesamtmenge 5 Gewichts-% überschreitet, die Ausbeute abrupt abnimmt, und wenn die Gesamtmenge etwa 20 Gewichts-% beträgt, die Ausbeute an Cyclodextrinen so wenig wie 15 % beträgt. Ein solches Phänomen wurde beobachtet, selbst wenn Maltose und/ oder Glucose einem Stärkehydrolysat zugegeben werden, welches im wesentlichen keine Maltose und Glucose enthält, bevor es in der Reaktion eingesetzt wird, und es wurde daher sichergestellt, daß eine enge Beziehung zwischen der Gesamtmenge von Glucose und Maltose im Stärkehydrolysat und der Ausbeute an Cyclodextrinen besteht. Die Reduktion der Ausbeute an Cyclodextrinen, die durch die Gegenwart von Glucose und/oder Maltose bewirkt wird, ist vermutlich der Tatsache zuzuschreiben, daß Transglycosylierungsreaktionen außer der Cyclisierung durch die Gegenwart von Glucose und/oder Maltose katalysiert bzw. aktiviert bzw. gefördert werden.Starch hydrolyzate substrates have the same D.E. For example, it has been found that when the total amount of glucose and kaitose in the starch hydrolyzate is not more than 5% by weight, cyclodextrins in a yield of 30 to 70%, based on the weight of the starting material, can be obtained, however, if the total amount exceeds 5% by weight, the yield decreases abruptly, and when the total is about 20% by weight, the yield of cyclodextrins is as little as 15%. A such a phenomenon has been observed even when maltose and / or glucose are added to a starch hydrolyzate, which contains essentially no maltose and glucose before it is used in the reaction, and therefore it has been ensured that there is a close relationship between the total amount of glucose and maltose in the starch hydrolyzate and the yield of cyclodextrins consists. The reduction in the yield of cyclodextrins caused by the presence of Glucose and / or maltose is probably due to the fact that transglycosylation reactions apart from the cyclization, catalyzed or activated or promoted by the presence of glucose and / or maltose will.

Ein Verfahren ist bereits bekannt, welches die Durchführung der vorstehenden Reaktion in Gegenwart eines Cyclodextrin-Komplexierungsmittels, wie Trichloräthylen oder 1-Decanol, welches eine Einschlußverbindung mit einer extrem niedrigen Löslichkeit in dem Reaktionssystem durch Reaktion mit Cyclodextrin bildet, umfaßt, in dem Versuch zu erreichen, daß eine Cyclodextrinbxldungsreaktion überwiegend abläuft. Es wurde jedoch überraschenderweise gefunden, daß der Effekt der Gesamtmenge von Maltose und Glucose im Stärkehydrolysat auch in Gegenwart eines solchen Cyclodextrin-Komplexierungsmittels eintritt.A method is already known which enables the above reaction to be carried out in the presence of a cyclodextrin complexing agent, such as trichlorethylene or 1-decanol, which is an inclusion compound with an extremely low Forms solubility in the reaction system by reacting with cyclodextrin, in an attempt to achieve that a cyclodextrin formation reaction predominantly takes place. However, it was surprisingly found that the effect the total amount of maltose and glucose in the starch hydrolyzate even in the presence of such a cyclodextrin complexing agent entry.

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Im erfindungsgemäßen Verfahren wird daher die Reaktion einer wäßrigen Lösung eines Stärkehydrolysats mit einem D.E. von nicht mehr als 20, vorzugsweise 15 bis 7, mit Cyclodextrintransglycosylase in Gegenwart eines Cyclodextrin-Komplexierungsmittels nach Einstellung der Gesamtmenge von Maltose und Glucose in dem Stärkehydrolysat auf nicht mehr als etwa 5 Gewichts-%, bezogen auf das Gewicht des Stärkehydrolysats, durchgeführt.In the process according to the invention, therefore, the reaction of an aqueous solution of a starch hydrolyzate with a D.E. from no more than 20, preferably 15 to 7, with cyclodextrin transglycosylase in the presence of a cyclodextrin complexing agent after adjusting the total amount of maltose and glucose in the starch hydrolyzate to not more than about 5% by weight, based on the weight of the starch hydrolyzate.

Im allgemeinen beeinflußt bei enzymatischen Reaktionen die Konzentration eines Enzyms nicht den endgültigen Gleichgewichtswert der Reaktion, und es wurde davon ausgegangen, daß eine Reaktion zur Bildung von Cyclodextrinen unter Verwendung von Cyclodextrin-transglycosylase dieses anerkannte Gesetz, in Gegenwart eines Reaktionsbeschleunigers, wie Trichlorethylen oder 1-Decanol, befolgen würde. Es wurde jedoch als Folge ausgedehnter Untersuchungen gefunden, daß Cyclodextrin-transglycosylase überhaupt nicht diesem Gesetz folgt. Die Anmelderin hat Stärkehydrolysate mit einem D.E. von 5 bis 20,hergestellt nach verschiedenen Methoden, mit Cyclodextrin-transglycosylase in Gegenwart eines Cyclodextrin-Komplexierungsmittels mit verschiedenen Konzentrationen an Stärkehydrolysaten (Substrat) und Cyclodextrin-transglycosylase umgesetzt und die Menge der gebildeten Cyclodextrine untersucht. Es wurde dabei gefunden, daß der schlußendliche Gleichgewichtswert der Reaktion eine bestimmte Korrelation mit der Menge des Enzyms pro Volumeneinheit der Reaktionslösung und der Menge des Enzyms pro Gewichtseinheit des Substrats aufweist. Es konnte jedoch keine geradlinige Proportionalrelation beobachtet werden.In general, in enzymatic reactions, the concentration of an enzyme does not affect the final equilibrium value of the reaction, and it was believed that a reaction using the formation of cyclodextrins of cyclodextrin transglycosylase this accepted law, in the presence of a reaction accelerator such as trichlorethylene or 1-decanol. However, as a result of extensive research, it has been found that cyclodextrin transglycosylase does not follow this law at all. Applicant has starch hydrolysates with a D.E. of 5 up to 20, produced by various methods with cyclodextrin transglycosylase in the presence of a cyclodextrin complexing agent at various concentrations Starch hydrolysates (substrate) and cyclodextrin transglycosylase are converted and the amount of cyclodextrins formed is investigated. The final equilibrium value of the reaction was found to have a certain correlation with the amount of the enzyme per unit volume of the reaction solution and the amount of the enzyme per unit weight of the substrate having. However, no straight-line proportional relation could be observed.

Als die Reaktion bei 45°C während 90 Stunden in Gegenwart von Trichloräthylen unter Verwendung eines Stärkehydrolysats mit einem D.E. von 10,2 und enthaltend Glucose und Maltose in einer Gesamtmenge von 2,1 Gewichts-% in einer Substratkonzentration von 40 g/100 ml durchgeführt wurde, wurde die maximal während dieser Zeit erreichte Ausbeute durch Variierung der Menge des zugegeben Enzyms untersucht.As the reaction at 45 ° C for 90 hours in the presence of trichlorethylene using a starch hydrolyzate with a D.E. of 10.2 and containing glucose and maltose in a total amount of 2.1% by weight in a substrate concentration of 40 g / 100 ml was carried out, the maximum yield achieved during this time was determined by variation investigated the amount of enzyme added.

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- Ii -- Ii -

Die Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt,The results are given in Table I,

Table I.

Enzym-Menge
(Einheiten pro
10 ml der Reak
tionslösung )Enzyme amount
(Units per
10 ml of the reac
solution) Enzym-Menge
(Einheiten pro
g Substrat)Enzyme amount
(Units per
g substrate) Ausbeute an
Cyclodextrinen
(%, bezogen auf
das Substrat)Yield to
Cyclodextrins
(%, based on
the substrate) 60
180
36060
180
360 15
45
9015th
45
90 23,7
53,1
56,223.7
53.1
56.2

Selbst wenn die Reaktionszeit verlängert wurde, konnte die Ausbeute nicht weiter erhöht werden.Even if the reaction time was lengthened, the yield could not be increased any further.

Weitere ausführliche Untersuchungen, bezogen auf die vorstehende Tatsache, führten zur Feststellung, daß,um Cyclodextrine in guter Reinheit und hohen Ausbeuten stabil bzw. gleichmäßig und innerhalb kurzer Zeiten durch Umsetzung eines Stärkehydrolysats mit einem hohen D.E. in einer hohen Konzentration er erhalten, die Menge des Enzyms bei Initiierung der Reaktion die Gleichung (1) erfüllen muß. Es wurde festgestellt, daß, wenn CR weniger als 194/^/s beträgt, die Ausbeute an Cyclodextrinen drastisch abnimmt und die Reaktion sehr unstabil bzv/. ungleichmäßig wird und daß, selbst wenn verschiedene Reaktionsbedingungen konstant gehalten werden, die Ausbeute innerhalb eines breiten Bereiches variiert und die Reproduzierbarkeit der Ausbeuten schlecht ist.Further detailed investigations, based on the above fact, led to the finding that, to cyclodextrins stable or uniform in good purity and high yields and within short times by reaction of a starch hydrolyzate with a high D.E. in a high concentration he received the amount of the enzyme at Initiation of the reaction must satisfy equation (1). It was found that when CR is less than 194 / ^ / s is, the yield of cyclodextrins decreases drastically and the reaction is very unstable or /. becomes uneven and that even if various reaction conditions are kept constant, the yield is within one varies in a wide range and the reproducibility of the yields is poor.

Aus diesem Grunde wird die Reaktion im erfindungsgemäßen Verfahren unter solchen Bedingungen durchgeführt, die der Gleichung (1) genügen.For this reason, the reaction in the process according to the invention is carried out under such conditions as the Equation (1) suffice.

509885/ 1184509885/1184

Stärkehydrolysate, die Maltose und Glucose in einer Gesamtmenge von nicht mehr als etwa 5 Gewichts-% enthalten, können dadurch hergestellt werden, daß man die Hydrolysebedingungen bei den bekannten, vorstehend erwähnten Hydrolyse-Methoden wählt bzw. steuert. Sie können auch dadurch hergestellt werden, daß man das Hydrolysat mit Glucoseoxydase behandelt oder daß man eine Hefe, wie Saccharomyces cerevisiae, in dem Hydrolysat züchtet, um dadurch im vorhinein Glucose und Maltose zu assimilieren.Starch hydrolysates containing maltose and glucose in a total amount of no more than about 5% by weight can be prepared by the hydrolysis conditions in the known, aforementioned hydrolysis methods chooses or controls. They can also be prepared by treating the hydrolyzate with glucose oxidase treated or that a yeast such as Saccharomyces cerevisiae, cultivated in the hydrolyzate to thereby in advance Assimilate glucose and maltose.

Im erfindungsgema'ßen Verfahren kann die Konzentration des Stärkehydrolysats in der wäßrigen Lösung jegliche sein, bei der das Stärkehydrolysat in Wasser gelöst werden kann, und für den kommerziellen Betrieb ist die Konzentration so hoch wie möglich. Z.B. beträgt die bevorzugte Konzentration mindestens etwa 30 g/lOO ml der Reaktionslösung.In the process according to the invention, the concentration of the Starch hydrolyzate in the aqueous solution be any in which the starch hydrolyzate can be dissolved in water, and for commercial operation the concentration is as high as possible. For example, the preferred concentration is at least about 30 g / 100 ml of the reaction solution.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Cyclodextrin-Komplexierungsmittel ist jegliches Komplexierungsmittel, das dazu befähigt ist, bei der Reaktion mit dem gebildeten Cyclodextrin einen ausfällbaren Komplex oder eine ausfällbare Einschlußverbindung zu bilden. Typische Beispiele für solche Cyclodextrin-Komplexierungsmittel umfassen Trichlorethylen, Tetrachloräthan, Toluol, Cyclohexan, Brombenzol, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform, Benzol, Kohlenstoffdisulfid, p-Xylol, Äthylbenzol, p-Cumol, Cyclohexanol, 1-Heptanol, Hexan, 1-Decanol und 1-Nonanol. Das Komplexierungsmittel kann in geeigeter Weise, je nach der gewünschten Art von Cyclodextrinen, ausgewählt werden. Beispielsweise kann die Verwendung von 1-Decanol oder 1-Nonanol überwiegend a-Cyclodextrin ergeben. Wenn Hexan, Trichlorethylen oder Toluol verwendet wird, wird überwiegend ß-Cyclodextrin gebildet. Wenn Tetrachloräthan oder 1-Heptanol verwendet wird, werden a-Cyclodextrin und ß-Cyclodextrin gleichzeitig gebildet.The cyclodextrin complexing agent used in the process of the invention is any complexing agent capable of reacting with the formed Cyclodextrin to form a precipitable complex or inclusion compound. Typical examples of such cyclodextrin complexing agents include trichlorethylene, Tetrachloroethane, toluene, cyclohexane, bromobenzene, carbon tetrachloride, chloroform, benzene, carbon disulfide, p-xylene, ethylbenzene, p-cumene, cyclohexanol, 1-heptanol, Hexane, 1-decanol and 1-nonanol. The complexing agent can be appropriately selected depending on the desired kind of cyclodextrins. For example the use of 1-decanol or 1-nonanol can result in predominantly α-cyclodextrin. If hexane, trichlorethylene or toluene is used, ß-cyclodextrin is predominantly formed. When using tetrachloroethane or 1-heptanol a-cyclodextrin and ß-cyclodextrin are formed simultaneously.

509885/ 118509885/118

Der p„-Wert der Reaktionslösung und die Reaktionstemperatur können in geeigneter Weise, je nach dem optimalen p_H-Bereich und der optimalen Reaktionstemperatur, für die Cyclodextrintransglycosylase gewählt werden. Z.B. beträgt im Falle von Bacillus macerans der optimale p„-Wert etwa 5 bis 7 und die optimale Reaktionstemperatur etwa 40 bis 5O°C. Die Reaktionszeit, die im erfindungsgemäßen Verfahren ausreicht, beträgt etwa 24 bis 60 Stunden. Die Reaktion kann auch während mehr als 60 Stunden durchgeführt werden, jedoch ist kein Vorteil der Erhöhung der Ausbeute an Cyclodextrinen zu erwarten. Der p "value of the reaction solution and the reaction temperature can be appropriately depending on the optimum p _H range and the optimum reaction temperature can be chosen for the cyclodextrin transglycosylase. For example, in the case of Bacillus macerans, the optimal p n value is about 5 to 7 and the optimal reaction temperature is about 40 to 50 ° C. The reaction time, which is sufficient in the process according to the invention, is about 24 to 60 hours. The reaction can also be carried out for more than 60 hours, but no benefit in increasing the yield of cyclodextrins is to be expected.

Die erfindungsgemäß verwendete Cyclodextrin-transglycosylase kann z.B. wie folgt erhalten werden.The cyclodextrin transglycosylase used according to the invention can be obtained, for example, as follows.

Ein Kulturmedium, enthaltend 3 % Weizenkleie und 0,5 % CaI-ciumcarbonat, mit oder ohne geeignete Mengen an organischen oder anorganischen Stickstoffquellen, wie Fleichextrakt, Maiswasser oder Ammoniumsulfat, oder einer Kohlenstoffquelle, wie Stärke, wird sterilisiert. Bacillus macerans Wird in das Kulturmedium inokuliert bzw. eingeimpft und 2 bis 4 Tage bei 37 C aerob gezüchtet. Das unlösliche Material wird dann durch Zentrifugieren entfernt, und die überstehende Flüssigkeit kann in der Reaktion als rohe Enzymlösung direkt oder nach dem Konzentrieren derselben unter vermindertem Druck verwendet werden. Ferner kann vor der Verwendung der überstehenden Flüssigkeit ein Fällungsmittel, wie Isopropanol, der überstehenden Flüssigkeit zugegeben werden, um das Enzym auszufällen und zu sammeln.A culture medium containing 3% wheat bran and 0.5% calcium carbonate, with or without suitable amounts of organic or inorganic nitrogen sources, such as meat extract, Corn water or ammonium sulfate, or a carbon source, like starch, is sterilized. Bacillus macerans is inoculated or inoculated into the culture medium and Grown aerobically for 2 to 4 days at 37C. The insoluble material is then removed by centrifugation, and the Supernatant liquid can be used in the reaction as a crude enzyme solution directly or after concentrating the same under reduced pressure can be used. Furthermore, a precipitant, such as isopropanol, can be added to the supernatant liquid before the supernatant liquid is used to precipitate and collect the enzyme.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne sie jedoch einzuschränken.The following examples illustrate the invention without, however, limiting it.

In der vorliegenden Beschreibung wurden die Glucose-, Maltose- und α- und ß-Cyclodextrin-Mengen nach dem folgenden Verfahren bestimmt:In the present specification, the amounts of glucose, maltose, and α- and β-cyclodextrin have become as follows Procedure determines:

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Glucoseglucose

Bestimmt nach der Tauber-Kleiner-Methode.Determined by the Tauber-Kleiner method.

MaltoseMaltose

Bestimmt nach einer kohlenstoffchromatographischen Methode.Determined by a carbon chromatographic method.

α- und ß-Cyclodextrineα- and ß-cyclodextrins

Bestimmt nach einer enzymatischen Methode [Kobayashi et al., Proceedings of the Sumposium on Amylase, Japan, Band 8, Seite 29 (1973)].Determined by an enzymatic method [Kobayashi et al., Proceedings of the Sumposium on Amylase, Japan, Volume 8, Page 29 (1973)].

Es v/urde eine dünnschichtchromatographische Analyse^unter Verwendung einer dünnen Schicht aus mikrokristalliner Cellulose, durchgeführt, und die Probe wurde mit Butanol/Äthanol/ Wasser (4/3/5) entwickelt, wonach eine Jodlösung gesprüht wurde, um Cyclodextrine zu ermitteln.A thin-layer chromatographic analysis was carried out below Using a thin layer of microcrystalline cellulose, and the sample was washed with butanol / ethanol / Water (4/3/5) was developed, after which an iodine solution was sprayed to detect cyclodextrins.

Die Einheit der Cyclodextrin-transglycosylase wurde nach der folgenden Methode gemäß der Tilden-Hudson-Methode [J.Bacteriol., 43, 527 (1942)] bestimmt.The unit of cyclodextrin transglycosylase was determined by the following method according to the Tilden-Hudson method [J. Bacteriol., 43 , 527 (1942)].

1,0 ml einer Lösung eines Enzyms in destilliertem Wasser wird zu einer Mischung aus 1,5 ml einer 4%-igen wäßrigen Lösung von löslicher Stärke und 0,5 ml eines O,lm-Acetatpuffers (p„-Wert 5,5) zugegeben, und die Mischung wird 30 Minuten bei 45°C gehalten. (Selbst wenn die Temperatur auf 40 C verändert wurde, trat kaum eine Veränderung der Enzym— stärke ein.) Anschließend wurden 100 μΐ der vorstehenden Reaktionslösung zu 40 jiil einer 0, ln-Jodlösung gefügt. 1 Mikroliter (ul) der erhaltenen Mischung wird auf eine Glasplatte getropft, bei 20 bis 25 C bei einer relativen Feuchtigkeit von 50 bis 6O % getrocknet und mikroskopisch untersucht. Die minimale Menge des Enzyms, in dem ein nadeiförmiger Kristall bei dieser mikroskopischen Untersuchung beobachtet wird, wird als eine Einheit definiert.1.0 ml of a solution of an enzyme in distilled water becomes a mixture of 1.5 ml of a 4% aqueous solution of soluble starch and 0.5 ml of an 0.1 m acetate buffer (p "value 5.5) added, and the mixture is kept at 45 ° C for 30 minutes. (Even when the temperature was changed to 40 C, there was hardly any change in the enzyme strength.) Then, 100 μl of the above reaction solution was added to 40 μl of a 0.1n-iodine solution. 1 microliter (μl) of the mixture obtained is dropped onto a glass plate, dried at 20 to 25 ° C. with a relative humidity of 50 to 60% and examined microscopically. The minimum amount of the enzyme in which a needle-shaped crystal is observed upon this microscopic examination is defined as one unit.

509885/ 1 184509885/1 184

Example 1 and comparison example 1

Aspergillus niger wurde in einem flüssigen Medium, enthaltend Kartoffelstärke als Haupt-Kohlenstoffquelle, gezüchtet. Die Zellen wurden durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde als Enzymlösung verwendet. Die Enzymlösung wurde mit Kartoffelstärke zur Reaktion gebracht, um eine Stärkehydrolysatlösung zu bilden. Die Lösung wurde gekocht, um das Enzym zu entaktivieren, und dann sprühgetrocknet, um ein Stärkehydrolysatpulver (I) mit einem D.E. von 15,0, enthaltend 1,9 Gewichts-% Glucose und 6,1 Gewichts-% Maltose,zu erhalten. Andererseits wurde aus Kartoffelstärke Dextrin (II) mit einem D.E. von 12,0 und enthaltend 2,3 Gewichts-% Maltose (Glucose war nicht nachweisbar), unter Verwendung einer verflüssigenden Amylase von Bacillus subtilis hergestellt.Aspergillus niger was contained in a liquid medium Potato starch as the main carbon source, grown. The cells were removed by filtration and the filtrate was used as an enzyme solution. The enzyme solution was with Potato starch reacted to form a starch hydrolyzate solution to build. The solution was boiled to inactivate the enzyme and then spray dried to give a Starch hydrolyzate powder (I) with a D.E. of 15.0 containing 1.9% by weight glucose and 6.1% by weight maltose obtain. On the other hand, potato starch turned into dextrin (II) with a D.E. of 12.0 and containing 2.3% by weight of maltose (glucose was undetectable), using a Liquefying amylase produced by Bacillus subtilis.

100 g (I) oder (II) wurden zu 190 ml einer rohen Enzymlösung (40 Einheiten/ml) von Bacillus macerans, hergestellt nach dem vorstehenden Verfahre, in ein Kulturmedium enthaltend Weizenkleie, um eine Lösung mit einer Substratkonzentration von 40 g/l00 ml herzustellen, zugegeben. 20 ml Trichloräthylen oder 1-Decanol wurden als Cyclodextrin-Komplexierungsmittel der Lösung zugegeben, und die Mischung wurde unter Rühren 48 Stunden bei 45°C umgesetzt, wobei der p_H-Wert der Lösung bei 6,1 gehalten wurde. Nach der Reaktion wurden Trichloräthylen oder 1-Decanol durch Destillation entfernt, und Cyclodextrine wurden quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt.100 g of (I) or (II) was added to 190 ml of a crude enzyme solution (40 units / ml) of Bacillus macerans prepared by the above method in a culture medium containing wheat bran to make a solution having a substrate concentration of 40 g / 100 ml to produce, added. 20 ml of trichlorethylene, or 1-decanol was added as a cyclodextrin complexing of the solution, and the mixture was reacted for 48 hours at 45 ° C with stirring while the _pH value was maintained the solution at 6.1. After the reaction, trichlorethylene or 1-decanol was removed by distillation and cyclodextrins were quantified. The results are shown in Table II.

509885/1184509885/1184

Table II

An
satzAt
sentence Subs "^¹*⁰ "^Subs "^ ¹ * ⁰ " ^ D. B.D. B. CRCR 31
3131
31 Cyclodextrin-Komplexi erdungsmittelCyclodextrin complexing agent Ausbeute
an ß-CDyield
on ß-CD l~Decanoll ~ decanol Ausbeute
an ß-cryield
at ß-cr Bei
spiel
1
Vgl*·
B.lat
game
1
See*·
Bl TypType 15,0
12,015.0
12.0 76
7676
76 Tri chloro äthylenTri chloro ethylene 33,5
51,233.5
51.2 Ausbeute
an α-CDyield
on α-CD 2,2
3,12.2
3.1 I
III.
II Ausbeute
an α-CDyield
on α-CD 24,0
35_t8 24.0
35 _t 8 Spur
Spurtrack
track

*OC-CD = a-Cyclodextrin . j* OC-CD = α-cyclodextrin. j

**ß-CD = ß-Cyclodextrin j** ß-CD = ß-cyclodextrin j

I Die Ausbeute der Cyclodextrine wird in %, ;I The yield of the cyclodextrins is in%;

bezogen auf das Gewicht des Substrats, ausgedrückt.,'based on the weight of the substrate, expressed., '

Nach der Reaktion wurde die durch Verwendung von Trichlorethylen als Cyclodextrin-Komplexierungsmittel erhaltene Reaktionsmischung behandelt, um Trichlorethylen durch Dampfdestillsation zu entfernen, und zur Bildung von Kristallen gekühlt. Die Kristalle wurden aus Wasser umkristallisiert, um ß-Cyclodextrinpulver zu erhalten. Das so erhaltene ß-Cyclodextrinpulver wog im Fall des Substrats (I) 26,5 g und 42,8 g im Falle des Substrats (II). Die Reinheit dieser Pulver war fast lOO %, wie sich dünnschichtchromatographisch und durch enzymatische Untersuchungen zeigte.After the reaction, the reaction mixture obtained by using trichlorethylene as a cyclodextrin complexing agent was used treated to remove trichlorethylene by steam distillation and to form crystals chilled. The crystals were recrystallized from water to obtain β-cyclodextrin powder. The thus obtained β-cyclodextrin powder weighed 26.5 g in the case of the substrate (I) and 42.8 g in the case of the substrate (II). The purity of these powders was almost 100% as shown by thin layer chromatography and showed by enzymatic studies.

Wenn 1-Decanol als Cyclodextrin-Komplexierungsmittel verwendet wurde, wurde ein Cyclohexanüberschuß der Reaktionsmischung nach Entfernung von 1-Decanol zugegeben. Die Mischung wurde zentrifugiert. Der Niederschlag wurde isoliert und in Wasser suspendiert. Cyclohexan wurde durch Dampfdestillation entfernt, und anschließend wurde Wasser zur Trockne verdampft, wobei ein rohes Pulver erhalten wurde. Das rohe Pulver wurde zweimal aus Wasser umkristallisiert. Das erhaltene a-Cyclodextrinpulver wog 18,6 gWhen 1-decanol is used as a cyclodextrin complexing agent an excess of cyclohexane was added to the reaction mixture after 1-decanol was removed. The mixture was centrifuged. The precipitate was isolated and suspended in water. Cyclohexane was through Steam distillation was removed, and then water was evaporated to dryness to give a crude powder became. The crude powder was recrystallized twice from water. The obtained α-cyclodextrin powder weighed 18.6 g

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im Falle des Substrats (I) und 28,2 g im Falle des Substrats (II).in the case of the substrate (I) and 28.2 g in the case of the substrate (II).

Examples 2 to 4 and comparative examples 2 to 4

Eine Wassersuspension von Kartoffelstärke wurde unter Verwendung einer verflüssigenden a-Amylase von Bacillus subtilis partiell hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde sprühgetrocknet und mit 90 % Äthanol gewaschen, um ein Dextrin mit einem D.E. von 9,5 zu erhalten, das frei von Glucose und Maltose war. Vorbestimmte Mengen von Glucose und Maltose wurden dem erhaltenen Dextrin zugegeben. 19 ml des rohen Enzymlösung (40 Einheiten/ml), hergestellt in Beispiel 1, wurden zu 10 g der erhaltenen Mischung (Substrat) zugegeben, um eine Lösung mit einer Konzentration von 40 g/l00 ml zu bilden. Anschließend wurden 2 ml Trichlorathylen oder 1-Decanol der Lösung zugegeben, und die Mischung wurde 50 Stunden bei 45 C umgesetzt, wobei der p_H-Wert der Mischung bei 6,3 gehalten wurde. Trichlorathylen oder 1-Decanol wurden dann durch Destillation entfernt, und die erhaltene Reaktionsmischung wurde zur Bestimmung der Cyclodextrin-Ausbeute analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt. A water suspension of potato starch was partially hydrolyzed using a liquefying α-amylase from Bacillus subtilis. The hydrolyzate was spray dried and washed with 90% ethanol to obtain a dextrin with a DE of 9.5 which was free of glucose and maltose. Predetermined amounts of glucose and maltose were added to the obtained dextrin. 19 ml of the crude enzyme solution (40 units / ml) prepared in Example 1 was added to 10 g of the obtained mixture (substrate) to form a solution having a concentration of 40 g / 100 ml. Then, 2 ml of trichlorethylene, or 1-decanol the solution was added, and the mixture was reacted for 50 hours at 45 C, the _pH value was kept the mixture at 6.3. Trichlorethylene or 1-decanol was then removed by distillation and the resulting reaction mixture was analyzed to determine the yield of cyclodextrin. The results obtained are shown in Table III.

509885/ 1 184509885/1 184

Table III

cncn

(JO(JO coco QOQO cncn

ODOD

An-
s-atzAt-
sentence Menge der zuge
gebenen Gluco
se oder Malto
se (Gew.-%,be
zogen auf das
Ge s am t s accharid!Amount of trains
given Gluco
se or malto
se (% by weight, be
moved to that
Ge s am ts accharid! MaltoseMaltose D.E. .D.E. . CRCR 194/yS194 / yS Ausbeute an
ß-CD bei Ver
wendung von
Trichlorethy
len als Cy-
clodextrin-
Komplexie-
rungsmittel
(Gew.-%, be
zogen auf
das SubstratYield to
ß-CD for Ver
application of
Trichlorethylene
len as cy-
clodextrin
Complex
funds
(% By weight, be
pulled up
the substrate Ausbeute an
α-CD bei
Verwendung
von 1-Deca-
nol als Cy-
clodextrin-
Komplexie-
rungsmittel
(Gew.-%,be
zogen auf d.
Substrat)Yield to
α-CD at
use
from 1-deca-
nol as cy-
clodextrin
Complex
funds
(% By weight, be
moved on d.
Substrate) Bei
spiel 2
Bsp. 3
Bsp. 4at
game 2
Ex. 3
Ex. 4 Glucoseglucose 0
0
30
0
3 9,5
11,3
11,69.5
11.3
11.6 76
Il
Il 76
Il
Il 31
Il
ti 31
Il
ti 58,8
55,3
52,758.8
55.3
52.7 38,3
36,1
36,038.3
36.1
36.0 Vergl;
I Bei-
: spiel 2
VgI.-
Bsp. 3
VgI.-
Bsp. 4Comp;
I at-
: game 2
VgI.-
Ex. 3
VgI.-
Ex. 4 0
2
10
2
1 3
1
53
1
5 13,4
14,4
16,113.4
14.4
16.1 IlIl
KK
titi IlIl
IlIl
titi 42,1
37,5
30,042.1
37.5
30.0 25,1
23,4
19,725.1
23.4
19.7 3
5
53
5
5

ODOD

Example 5 and comparative example 5

100 ml einer Kultur von Saccharomyces cerevisiae, die während 12 Stunden in einem Kulturmedium, das Glucose als Hauptkomponente enthielt, gezüchtet wurde, wurden zu einer Lösung von 400 g des in Beispiel 1 verwendeten Stärkehydrolysats (I) in 6 6o ml Wasser gefügt, und der p„-Wert der Lösung wurde auf 5,5 mit Essigsäure eingestellt. Die Lösung wurde dann 30 Stunden inkubiert, um Glucose und Maltose, die darin enthalten waren, zu assimilieren. Die Trennung durch Zentrifugieren ergab eine klare Dextrinlösung mit einem D.E. von 10,6, enthaltend 0,2 Gewichts-% Glucose und 1,0 Gewichts-% Maltose.100 ml of a culture of Saccharomyces cerevisiae obtained during 12 hours cultured in a culture medium containing glucose as a main component became one A solution of 400 g of the starch hydrolyzate (I) used in Example 1 in 6 6o ml of water is added, and the p "value of the solution is added was adjusted to 5.5 with acetic acid. The solution was then incubated for 30 hours to add glucose and maltose, which were contained therein to assimilate. Separation by centrifugation gave a clear dextrin solution a D.E. of 10.6, containing 0.2% by weight glucose and 1.0% by weight maltose.

2 g eines rohen Pulvers von Cyclodextrin-transglycosylase (8000 Einheiten/g), erhalten durch Lyophilisation eines Filtrats einer Kultur von Bacillus macerans, wurden zu 500 ml der vorstehend hergestellten Dextrinlösung gefügt. Nach Einstellung des p„-Wertes der Lösung auf 6,1 wurden 50 ml 1-Decanol oder Trichlorethylen zugegeben. Die CR-Zahl der Mischung betrug 80, und 194/j/s betrug 31. Die Mischung wurde 48 Stunden bei 45 C umgesetzt. Bei der Verwendung von 1-Decanol als Cyclodextrin-Komplexierungsmittel wurde a-Cyclodextrin in einer Ausbeute von 36,0 %, bezogen auf das Dextrin, gebildet. Wenn andererseits Trichloräthylen als Cyclodextrin-Komplexierungsmittel verwendet wurde, wurde ß-Cyclodextrin in einer Ausbeute von 53,1 %, bezogen auf das Dextrin, erhalten.2 g of a raw powder of cyclodextrin transglycosylase (8000 units / g) obtained by lyophilization of a The filtrate from a culture of Bacillus macerans was added to 500 ml of the above-prepared dextrin solution. After the p n value of the solution had been adjusted to 6.1, 50 ml of 1-decanol or trichlorethylene were added. The CR number the blend was 80 and 194 / j / s was 31. The blend was reacted at 45 ° C. for 48 hours. When using 1-decanol as a cyclodextrin complexing agent, α-cyclodextrin in a yield of 36.0%, based on the dextrin. On the other hand, if trichlorethylene as Cyclodextrin complexing agent was used, based on ß-cyclodextrin in a yield of 53.1% the dextrin.

Zum Vergleich wurden 200 g des Stärkehydrolysats (I) (DE 15,0; CR 80; 194//S 31) in 380 ml Wasser gelöst, und dieselbe Reaktion wie vorstehend wurde durchgeführt. Bei der Verwendung von 1-Decanol wurde a-Cyclodextrin in einer Ausbeute von 22,3 % und bei der Verwendung von Trichloräthylen ß-Cyclodextrin in einer Ausbeute von 32,3 % gebildet.For comparison, 200 g of the starch hydrolyzate (I) (DE 15.0; CR 80; 194 // S 31) were dissolved in 380 ml of water, and the same Reaction as above was carried out. When using 1-decanol, α-cyclodextrin was found in one yield of 22.3% and when using trichlorethylene ß-cyclodextrin is formed in a yield of 32.3%.

509885/ 1 1 84509885/1 1 84

Examples 6 to 11 and Comparative Examples 6 to 8

0,1 g einer verflüssigenden oc-Amylase (10 000 Einheiten) von Bacillus subtilis wurden einer 30%-igen wäßrigen Stärke-Suspension, enthaltend 1 kg Kartoffelstärke, zugegeben, und die Mischung wurde auf etwa 80 C erhitzt. Die Mischung wurde 10 Minuten in einem Autoklaven auf 120 C gehalten. Das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde durch ein Sprühtrocknungsverfahren in Pulverform überführt. Das Pulver wurde mit Äthanol gewaschen, um ein Dextrinpulver mit einem D.E. von 9,7, enthaltend 2,0 % Maltose (Glucose war nicht nachweisbar) zu erhalten.0.1 g of a liquefying oc-amylase (10,000 units) of Bacillus subtilis were a 30% aqueous starch suspension, containing 1 kg of potato starch, was added and the mixture was heated to about 80.degree. The mixture was kept at 120 ° C. in an autoclave for 10 minutes. The insoluble material was removed by filtration, and the filtrate was dried by a spray drying method converted into powder form. The powder was washed with ethanol to obtain a dextrin powder having a D.E. of 9.7 containing 2.0% maltose (glucose was not detectable) was obtained.

Das vorstehende Dextrin wurde in einer vorbestimmten Konzentration zu rohen Enzymlösungen von Bacillus macerans mit verschiedenen Enzym-Einheiten, hergestellt nach der vorstehenden Methode,unter Verwendung von Weizenkleie enthaltendem Kulturmedium, gefügt. Der p_H~Wert einer jeden Mischung wurde auf 6,5 eingestellt, und es wurde 4 8 Stunden bei 45°C in Gegenwart von Trichloräthylen umgesetzt. Nach der Reaktion wurde das Trichloräthylen auf einem Wasserbad entfernt, und das erhaltene Cyclodextrin wurde quantitativ bestimmt. Die nach Entfernung des Trichloräthylens verbliebene Lösung wurde konzentriert und gekühlt. Die erhaltenen Kristalle wurden aus Wasser umkristallisiert, um ein ß-Cyclodextrinpulver zu erhalten.The above dextrin in a predetermined concentration was added to crude enzyme solutions of Bacillus macerans having various enzyme units prepared by the above method using a culture medium containing wheat bran. The p _H ~ value of each mixture was adjusted to 6.5 and it was reacted for 4 8 hours at 45 ° C in the presence of trichlorethylene. After the reaction, trichlorethylene was removed on a water bath and the resulting cyclodextrin was quantified. The solution remaining after removal of the trichlorethylene was concentrated and cooled. The obtained crystals were recrystallized from water to obtain β-cyclodextrin powder.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV aufgeführt.The results obtained are shown in Table IV.

509885/1184509885/1184

Table IV

CD OO 00CD OO 00

Ansatzapproach D. E.D. E. Einheit d.
rohen En
zymlösung
(Einhei
ten/ml )Unit d.
raw en
enzyme solution
(Unit
ten / ml) S
(s/
100
ml.)S.
(s /
100
ml.) CFt
(Ein
heiten
pro g
Sub
strat)CFt
(A
units
per g
Sub
strat) 194
>ß 194
> ß Cyclo-
dextrin-
Ausbeute
(Gew.-%,
bezogen
auf das
Substrat)Cyclo-
dextrin
yield
(% By weight,
based
on the
Substrate) Ausbeute
an ß-Cy-
clodextrin-
pulver
(Gew.-%,
bezogen
auf das
Substrat)yield
at ß-Cy-
clodextrin
powder
(% By weight,
based
on the
Substrate) Vergl.-
Beisp. 6Comp.-
Example 6 9,79.7 1515th 4545 2424 2929 28,428.4 2626th Beisp. 6Example 6 titi 3030th 4545 4949 2929 53,953.9 5050 Bei sp. 7At sp. 7th ItIt 8080 4545 130130 2929 60,160.1 5555 Vergl.-
Beisp. 7Comp.-
Example 7 ItIt 1010 3030th 2727 3535 35,535.5 . 31. 31 Beisp. 8Example 8 ttdd 1515th 3030th 4141 3535 60,860.8 5555 Beisp. 9Example 9 ItIt 8080 3030th 219219 3535 61,261.2 5656 Vergl,-
Beisp. 8Compare -
Example 8 ttdd 55 1010 4747 6161 27,327.3 2323 Beisp.10Example 10 1515th 1010 141141 6161 57,457.4 5151 Beisp.11Example 11 ItIt 3030th 1010 282282 6161 60 _r 760 _r 7 5555

INJ CDINJ CD

Die nach Entfernung von Trichlorethylen verbliebene Reaktionslösung wurde dünnschichtchromatographisch analysiert. Es wurde ein gelber Flecken von ß-Cyclodextrin beobachtet, jedoch ein violetter Fleck von oc-Cyclodextrin war nur in Spuren.The reaction solution remaining after removal of trichlorethylene was analyzed by thin layer chromatography. It was a yellow spot of β-cyclodextrin was observed, but a purple spot of α-cyclodextrin was only in traces.

Bei Verlängerung der Reaktionszeit auf 72 Stunden wurden im wesentlichen dieselben Ergebnisse wie in der vorstehenden Tabelle erhalten, und es wurde gefunden, daß die Reaktion bereits nach 48 Stunden ein Gleichgewicht erreicht hatte.When the reaction time was increased to 72 hours, the results were essentially the same as those in the above table and it was found that the reaction had reached equilibrium as early as 48 hours.

Examples 12-17 and Comparative Examples 9-11

Ein Dextrinpulver mit einem D.E. von 10,5, enthaltend 0,4 % Glucose und 2,1 % Maltose wurde aus Süßkartoffelstärke in im wesentlichen derselben Weise wie in Beispiel 6 erhalten.A dextrin powder having a DE of 10.5 containing 0.4 % glucose and 2.1% maltose was obtained from sweet potato starch in substantially the same manner as in Example 6.

Das erhaltene Dextrin wurde in einer vorbestimmten Konzentration in derselben rohen Enzymlösung, die in Beispiel 6 verwendet wurde, gelöst. Der p„-Wert der Lösung wurde auf 6,3 eingestellt, und anschließend wurde die Lösung 50 Stunden bei 45°C in Gegenwart von 1-Decanol zur Reaktion gebracht. Nach der Reaktion wurde 1-Decanol durch Destillation entfernt, und Cyclodextrin wurde quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle V aufgeführt.The obtained dextrin was added to a predetermined concentration in the same crude enzyme solution used in Example 6 was used, solved. The p "value of the solution was adjusted to 6.3, and then the solution was 50 hours reacted at 45 ° C in the presence of 1-decanol. After the reaction, 1-decanol was removed by distillation and cyclodextrin was quantified. The results are listed in Table V.

509885/118509885/118

Table V

Ansatzapproach D. E.D. E. Einheit
d.rohen
Enzymlö-
sung
(Einhei
ten/ml )unit
threaten
Enzyme solution
sung
(Unit
ten / ml) S
(g/100
ml)S.
(g / 100
ml) CR
(Einhei
ten/g
Substrat)CR
(Unit
ten / g
Substrate) 194194 Ausbeute
an Cyclo-
dextrin-
pulver
(Gew.-%·,
bezogen
auf das
Substrat)yield
on cyclo-
dextrin
powder
(% By weight,
based
on the
Substrate) Vergl,-
Beisp. 9
Beisp.12
Beisp.13Compare -
Example 9
Example 12
Example 13 10,5
It
Il10.5
It
Il 15
30
8015th
30th
80 45
45
4545
45
45 24
49
13024
49
130 29
29
2929
29
29 24,2
35,8
37,224.2
35.8
37.2 Vergl.-
Beisp.lO
Beisp.14
Beisp.15Comp.-
Example 10
Example 14
Example 15 t;
π
Ilt;
π
Il 10
15
8010
15th
80 30
30
3030th
30th
30th 27
41
21927
41
219 35
35
3535
35
35 23,3
36,0
33,123.3
36.0
33.1 Vergl,-
Beisp.ll
Beisp.16
Beisp.l7Compare -
Example ll
Example 16
Example l7 10,5
ti
K10.5
ti
K 5
15
305
15th
30th 10
10
1010
10
10 47
141
28247
141
282 61 .
61
6161.
61
61 . 22,2
37,7
38,7. 22.2
37.7
38.7

509885/1 184509885/1 184

Bei der dünnschichtchromatographischen Analyse wurde ein violetter Flecken von a-Cyclodextrin in allen Ansätzen beobachtet, jedoch wurde der für ß-Cyclodextrin charakteristische gelbe Flecken nur in Spuren gefunden.In the thin-layer chromatographic analysis, a purple spots of a-cyclodextrin observed in all approaches, however, the yellow spot characteristic of β-cyclodextrin was only found in traces.

Examples 18 and 19 and Comparative Example 12

Dieselbe Reaktion wie in Beispiel 12 wurde durchgeführt, wobei jedoch das Dextrinpulver mit einem D.E. von 10,5, hergestellt in Beispiel 12, verwendet wurde und Tetrachloräthan als Cyclodextrin-Komplexierungsmittel verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI aufgeführt.The same reaction as in Example 12 was carried out, however, the dextrin powder having a D.E. of 10.5 prepared in Example 12 was used and tetrachloroethane was used as a cyclodextrin complexing agent. The results are shown in Table VI.

Table VI

An
satzAt
sentence D. 33.D. 33. Einheit
der rohen
Enzymlö
sung (Ein
heiten/ml )unit
the raw
Enzyme solution
sung (a
units / ml) S
(g/100
ml.)S.
(g / 100
ml.) CR
(Einhei
ten/g
Sub
stratCR
(Unit
ten / g
Sub
strat 194
JB 194
JB Ausbeute
an α-CD
(Gew.-%,
bezogen
auf das
Substrat)yield
on α-CD
(% By weight,
based
on the
Substrate) Ausbeute
an ß-CD
(Gew.-%,
bezogen
auf das
Substrat)yield
on ß-CD
(% By weight,
based
on the
Substrate) VgI.-
B-- 12
B. .18
B. 19VgI.-
B-- 12
B. 18
B. 19 10,5
10,5
10,510.5
10.5
10.5 10
30
8010
30th
80 4040
4040
4040 19
57
152 19th
57
152 3131
3131
3131 17,617.6
29_r 329 _r 3
20,420.4 10,910.9
24,924.9
37,937.9

Example 20

40 kg eines pulverigen Dextrins mit einem D.E. von 10,3, enthaltend 0,3 % Glucose und 2,1 % Maltose, erhalten durch Behandlung von Süßkartoffelstärke mit verflüssigender a-Amylase, wurden in 76 1 einer rohen Enzymlösung von Bacillus macerans mit einer Enzymstärke von 80 Einheiten/ml gelöst. Nach Einstellung des p_H~Wertes der Lösung auf 6,5 wurden 8 1 Trichlorethylen zu der Lösung gefügt. Die Mischung wurde bei 45°C während 45 Stunden gerührt (CR 152, 194/j/s 31)40 kg of a powdery dextrin with a DE of 10.3, containing 0.3% glucose and 2.1% maltose, obtained by treating sweet potato starch with liquefying α-amylase, were in 76 l of a crude enzyme solution of Bacillus macerans with an enzyme starch of 80 units / ml. After adjustment of the p _H ~ of the solution to 6.5 8 1 trichlorethylene were added to the solution. The mixture was stirred at 45 ° C for 45 hours (CR 152, 194 / j / s 31)

509885/1184509885/1184

_ pc __ pc _

Andererseits wurden 89 1 der vorstehenden rohen Enzymlösung mit einer Enzymstärke von 80 Einheiten/ml zu 18 kg eines Stärkehydrolysats mit einem D.E. von 2,4, enthaltend im wesentlichen keine Glucose und Maltose, gefügt. Nach Einstellung des p„-Wertes der Lösung auf 6,5 wurden 8 1 Trichlorethylen zugegeben. Die Mischui
gerührt (CR 340, 194/^/S 46).On the other hand, 89 liters of the above crude enzyme solution having an enzyme strength of 80 units / ml was added to 18 kg of a starch hydrolyzate having a DE of 2.4 containing substantially no glucose and maltose. After the p n value of the solution had been adjusted to 6.5, 8 l of trichlorethylene were added. The mishui
stirred (CR 340, 194 / ^ / S 46).

äthylen zugegeben. Die Mischung wurde 45 Stunden bei 45 Cethylene added. The mixture was left at 45 ° C for 45 hours

Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung zur Entfernung von Trichloräthylen durch Dampfdestillation erhitzt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung auf 90 bis 95°C gehalten und durch Diatomeenerde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Im Falle des Cyclodextrins mit einem D.E. von 10,3 als Substrat konnte ein klares Filtrat leicht erhalten werden. Das Filtrat wurde auf 5°C gekühlt, und die ausgefällten Kristalle wurden durch Filtration gesammelt und aus Wasser umkristallisiert, wobei 19,8 kg reines ß-Cyclodextrin als kristallines Pulver (Ausbeute 49,5 %, bezogen auf das Gewicht des Substrats) erhalten wurden.After the reaction, the reaction mixture was heated to remove trichlorethylene by steam distillation. The reaction mixture was then held at 90 to 95 ° C and passed through diatomaceous earth using a filter press filtered. In the case of the cyclodextrin with a D.E. of 10.3 as a substrate, a clear filtrate could easily be obtained can be obtained. The filtrate was cooled to 5 ° C and the precipitated crystals were collected by filtration and recrystallized from water, 19.8 kg of pure β-cyclodextrin as a crystalline powder (yield 49.5%, based on based on the weight of the substrate).

Wenn andererseits das Stärkehydrolysat mit einem D.E. von 2,4 verwendet wurde, wurde die Reaktionsmischung auf die Hälfte ihres ursprünglichen Volumens nach Entfernung von Trichloräthylen durch Dampfdestillation konzentriert und unmittelbar danach auf 5 C zur Bildung von Kristallen gekühlt. Die Kristalle wurden in Wasser gelöst und auf einer Filterpresse filtriert. Das Filtrat wurde in derselben Weise wie vorstehend behandelt, wobei 8,8 kg reines ß-Cyclodextrin als kristallines Pulver (Ausbeute 48,9 %, bezogen auf das Gewicht des Substrats) erhalten wurden.On the other hand, when the starch hydrolyzate has a D.E. of 2.4 was used, the reaction mixture was based on the Concentrated and half of its original volume after removal of trichlorethylene by steam distillation Immediately thereafter cooled to 5 C to form crystals. The crystals were dissolved in water and placed on a Filter press filtered. The filtrate was treated in the same manner as above, taking 8.8 kg of pure β-cyclodextrin as crystalline powder (yield 48.9% based on the weight of the substrate).

Example 21 and comparative example 13

Ein Kulturmedium, enthaltend 1,2 % Stärke, 1,0 % Maiswasser, 0,6 % Ammoniumsulfat und 0,3 % Calciumcarbonat, wurde sterilisiert. In das Medium wurde Bacillus macerans eingeimpft» und aerob bei 3 7°C während 1 bis 3 Tagen gezüchtet, um rohe Enzymlösungen mit verschiedenen Enzym-Einheiten zu bilden.A culture medium containing 1.2% starch, 1.0% corn water, 0.6% ammonium sulfate and 0.3% calcium carbonate was sterilized. Bacillus macerans was inoculated into the medium and cultured aerobically at 37 ° C. for 1 to 3 days to obtain crude Form enzyme solutions with different enzyme units.

509885/1184509885/1184

30 g eines Stärkehydrolysate mit einem D.E. von 9,7, enthaltend 2,0 % Maltose (Glucose war nicht nachweisbar), wurden in 82 ml einer jeden der Enzymlösungen gelöst. Nach Einstellung des p_H-Wertes einer jeden der Lösungen auf 6,5 v/urden 10 ml Trichloräthylen zugegeben, und die Mischung wurde 48 Stunden bei 45°C gerührt.30 g of a starch hydrolyzate with a DE of 9.7 containing 2.0% maltose (glucose was undetectable) was dissolved in 82 ml of each of the enzyme solutions. After adjusting the p _H -value of each of the solutions to 6.5 v / ere 10 ml of trichlorethylene are added, and the mixture was stirred for 48 hours at 45 ° C.

Nach der Reaktion wurde Cyclodextrin quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII aufgeführt. Die dünnschichtchromatographische Analyse ergab, daß das Produkt fast ausschließlich ß-Cyclodextrin war.After the reaction, cyclodextrin was quantified. The results are shown in Table VII. The thin layer chromatographic Analysis showed that the product was almost exclusively β-cyclodextrin.

Table VII

Ansatzapproach D. E.D. E. Stärke der
rohen En-
zymlösung
(Einheiten/
ml)Strength of
raw end
enzyme solution
(Units/
ml) CR
!Einheiten/
g Substrat)CR
!Units/
g substrate) 194
/S194
/ S Ausbeute an
Cyclodex
trin (Gew.-%,
bezogen auf
das Substrat)Yield to
Cyclodex
trin (% by weight,
based on
the substrate) Vergl.-
Beisp.13
Beisp.21
Beisp.22Comp.-
Example 13
Example 21
Example 22 9,79.7
9,79.7
9,79.7 10
15
30 10
15th
30th 27
41
8227
41
82 3535
3535
3535 31,2
58,9
62,031.2
58.9
62.0

509885/1184509885/1184

Claims

Patent to saying

Process for the preparation of cyclodextrins, thereby characterized in that an aqueous solution of a starch hydrolyzate with a D.E. of not more than 20 with Cyclodextrin transglycosylase converts, the reaction being carried out under such conditions that

(i) the total amount of maltose and glucose contained in the starch hydrolyzate upon initiation of the reaction is no more than about 5% by weight based on the weight of the starch hydrolyzate and

(ii) the amount of cyclodextrin transglycosylase in the reaction solution satisfies the following equation:

CR = 194A/3CR = 194A / 3

wherein

S is the concentration in g per 100 ml of the reaction solution of the starch hydrolyzate at initiation the reaction and represents a positive number from 10 to 50 and

CR is the number representing the units of cyclodextrin transglycosylase indicates or reproduces per g of starch hydrolyzate.

509885/118509885/118