DE2431779A1 - IMPROVED PROCEDURE FOR THE DETERMINATION OF GLUTAMATE AND GLUTAMINATE TRANSAMINASES - Google Patents
IMPROVED PROCEDURE FOR THE DETERMINATION OF GLUTAMATE AND GLUTAMINATE TRANSAMINASESInfo
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Dipl.-Ing. HLWeickmann, Dipl-Phys. Dr. K. Fincke H/WE/MY Dipl.-Ing. RA.Weickmann, D1PL.-CHEM. B. HuberDipl.-Ing. HLWeickmann, Dipl-Phys. Dr. K. Fincke H / WE / MY Dipl.-Ing. RA Weickmann, D1PL.-CHEM. B. Huber
S MÜNCHEN 86, DEN Case 16,752-F POSTFACH 860820 S MUNICH 86, DEN Case 16,752-F POSTFACH 860820
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THE DOW CHEMICAL COMPANY, Midland, Michigan /USA 2030 Abbott Road THE DOW CHEMICAL COMPANY, Midland, Michigan / USA 2030 Abbott Road
Verbessertes Verfahren für die Bestimmung von Glutamat- und GlutaminattransaminasenImproved procedure for the determination of glutamate and glutaminate transaminases
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Glutamat- und Glutaminat (glutamic)-transaminasen.The invention relates to a method for determining Glutamate and glutaminate (glutamic) transaminases.
Die kolorimetrischen Bestimmungen von Glutaminattransaminasen in biologischen Flüssigkeiten erfolgen nach verschiedenen Verfahren in vielen Laboratorien. Der Wert solcher Bestimmungen als Diagnosehilfe bei Myokardinfarkt und Nekrose von Leberzellen ist gut anerkannt; Reitman und Frankel, Am.J.Clin. Pathol., 28, 56 (1957). Die Enzyme, die von hauptsächlicher Bedeutung sind, sind Glutaminat-oxalessigsäure-transaminase (GOT), welche die UmsetzungThe colorimetric determinations of glutaminate transaminases in biological fluids are carried out according to various methods in many laboratories. The value of such determinations as a diagnostic aid in myocardial infarction and necrosis of liver cells is well recognized; Reitman and Frankel, Am. J. Clin. Pathol., 28, 56 (1957). The enzymes by principal Are important are glutaminate-oxalacetic acid transaminase (GOT), which is the implementation
L-Aspartat + a-Oxoglutarat - Oxalacetat + L-GlutamatL-aspartate + a-oxoglutarate - oxaloacetate + L-glutamate
katalysiert und das Enzym Glutaminat-brenztraubensäuretransaminase (GPT), welche die Umsetzungcatalyzes and the enzyme glutaminate-pyruvic acid transaminase (GPT), which is the implementation
L-Alanin + a-Oxoglutarat Pyruvat + L-GlutamatL-alanine + α-oxoglutarate pyruvate + L-glutamate
katalysiert. Die Verfahren basieren auf enzymkatalysierten Transaminationen eines Substrats, welches a-Oxoglutarat und eine geeignete Aminosäure enthält, wobei Glutamat und eine andere Säure, Pyruvat im Falle von GPT und Oxalacetat im Falle von GOT, gebildet werden.catalyzed. The methods are based on enzyme-catalyzed transaminations of a substrate, which a-oxoglutarate and Contains a suitable amino acid, with glutamate and another acid, pyruvate in the case of GPT and oxaloacetate in the case from GOT.
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Einige kolorimetrie ehe Verfahren basieren auf Farbumsetzungen, wo.'die gebildete Säure mit einbezogen ist. Kürzlich wurde ein Verfahren beschrieben, bei dem das während der Transaminierungsstufe gebildete Glutamat dehydriert wird, wobei man das Enzym Glutamatdehydrogenäse (GlDH) in wäßrigem Ammoniumsulfat und das Co-Enzym oxydiertes Nicotinamid-Adenindinucleotid (NAD) verwendet, wobei <x-Oxoglutarat, Ammoniak und reduziertes Nicotinamid-Adenindinucleotid (NADH) gebildet werden,Some colorimetric methods are based on color conversions, where the acid formed is included. Recently, a method has been described in which this occurs during the transamination step formed glutamate is dehydrated, whereby the enzyme glutamate dehydrogenase (GlDH) in aqueous ammonium sulfate and the coenzyme uses oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), where <x -oxoglutarate, ammonia and reduced Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) are formed,
Glutamat + H2O + NAD £i23 »cVOxoglutarat + NH3 + NADHGlutamate + H 2 O + NAD £ i23 »cVOxoglutarate + NH 3 + NADH
Das gebildete NADH wird mit einem farblosen Tetrazoliumfarbstoffe , 2-p-Jodphenyl- 3-nitrophenyl- 5-phenyltetrazolium-chlorid (INT), mit Hilfe eines Elektronencarriers wie N-Methylphenazonium-methosulfat (HfS) umgesetzt,wobei ein gefärbter Farbstoff (INT-formazan) bei einer Umsetzung gebildet wird, die durch den Elektronencarrier katalysiert wird:The NADH formed is treated with a colorless tetrazolium dye, 2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl-5-phenyltetrazolium chloride (INT), with the help of an electron carrier such as N-methylphenazonium methosulfate (HfS) implemented, whereby a colored dye (INT-formazan) is formed in a reaction that is catalyzed by the electron carrier:
NADH + INT — ^ NAD + INT-formazanNADH + INT - ^ NAD + INT-formazan
Die Intensität der gebildeten Farbe wird dann bestimmt und ergibt ein Maß für die Transaminase-Aktivität; Lippi und Guidi, Clin. Chim. Acta, 28, 431 (1970).The intensity of the color formed is then determined and gives a measure of the transaminase activity; Lippi and Guidi, Clin. Chim. Acta, 28, 431 (1970).
Die Transaminasebestimmung wird üblicherweise an biologischen Flüssigkeiten wie einem Serum bei der Differentialdiagnose von Leber- und Herzkrankheiten durchgeführt. Ein vorbestimmtes Volumen der Probenflüssigkeit wird mit einem vorbestimmten Volumen der Substratzusammensetzung, gepuffert auf einen pH-Wert von ungefähr 7f4, die iX-Oxoglutarat und entweder Asparaginsäure (für GOT) oder Alanin (für GPT) enthält, vermischt. Eine Farbentwicklerlösung oder Lösungen, die GlDH, INT und NAD enthalten, wird verwendet. Das Substrat, die Probe und der Farbentwickler werden in einem Behälter wie einem Kolorimeter einer Farbentwicklerküvette oder einem Reagenzglas vermischt. Die Mischung wird inkubiert, typischerweise im Wasserbad oder durch Erwärmen in einem Block bei 37°C während einer vorbestimmten Zeit von ungefähr 45 bis 60 Minuten. Die Inkuba-The transaminase determination is usually carried out on biological fluids such as serum in the differential diagnosis of liver and heart diseases. A predetermined volume of the sample liquid is mixed with a predetermined volume of the substrate composition, buffered to a pH of about 7 f 4, which contains iX-oxoglutarate and either aspartic acid (for GOT) or alanine (for GPT). A color developing solution or solutions containing GlDH, INT and NAD is used. The substrate, sample and color developer are mixed in a container such as a colorimeter, color developing cell or test tube. The mixture is incubated, typically in a water bath or by heating in a block at 37 ° C for a predetermined time of about 45 to 60 minutes. The Incuba-
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tion wird durch Zugabe von Säure beendigt und die Intensität der entstehenden Farbe wird photometrisch in einem Spektrophotometer oder Kolorimeter bei Wellenlängen von 490 bis 550 nm bestimmt und mit einem Kontrollserum, einer Vergleichskurve o.a. verglichen.tion is terminated by the addition of acid and the intensity of the resulting color is measured photometrically in a spectrophotometer or colorimeter determined at wavelengths from 490 to 550 nm and with a control serum, a comparison curve o.a. compared.
Die Erfindung betrifft eine Verbesserung bei Glutamatbestimmungen durch Umsetzung von NADH mit Tetrazolium-Indikatoren und umfaßt verbesserte Glutaminattransaminasebestimmungen durch Kuppeln der Transaminierung durch Glutamatdehydrogenase und NAD mit der Farbreaktion von NADH mit Tetrazoliumsalz-Indikatoren. Die Erfindung betrifft eineReagens-Substrat-Zusammensetzung, enthaltend ein Transaminasesubstrat, NAD, Glutamatdehydrogenase und das Tetrazolium-Farbreagens in einer einzigen flüssigen Zusammensetzung. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird-die Substrat-Reagens-Zusammensetzung mit einer Probe, die auf ihre Transaminase-Aktivität oder auf Glutamat analysiert werden soll, vermischt und dann wird während relativ kurzer Zeiten inkubiert wie von ungefähr 5 oder weniger bis ungefähr 15 Minuten, bevor die Inkubierung mit Säure beendigt wird, und dann wird die Farbe bestimmt.The invention relates to an improvement in glutamate determinations through the implementation of NADH with tetrazolium indicators and includes improved glutaminate transaminase determinations by coupling the transamination by glutamate dehydrogenase and NAD with the color reaction of NADH with tetrazolium salt indicators. The invention relates to a reagent-substrate composition containing a transaminase substrate, NAD, glutamate dehydrogenase, and the tetrazolium color reagent in a single liquid composition. In the method of the present invention, the substrate-reagent composition with a sample for its transaminase activity or to be analyzed for glutamate, mixed and then incubated for relatively short times as if by about 5 or less to about 15 minutes before the acid incubation is terminated, and then the color will certainly.
Die Reagens-Substrat-Zusammensetzung und das erfindungsgemäße Verfahren ergeben verschiedene Vorteile bei der Bestimmung von Glutamat und Glutaminattransaminaseenzymen. Sie kann in großen Mengen hergestellt werden, mit dem Vorteil, daß die Mengen der Bestandteile leicht abgemessen werden können, die Standardisierung leicht erfolgt und daß es für die tatsächliche Bestimmung nicht erforderlich ist, Mischoperationen durchzuführen. Die Inkubationszeit, die für die Bestimmung der Transaminase nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erforderlich ist, ist wesentlich geringer als die Zeit, die bei den bekannten Verfahren erforderlich ist, d.h. die Bestimmung kann in einer 10minütigen Inkubationszeit, verglichen mit Zeiten von 45 Minuten, durchgeführt werden. Das er-The reagent-substrate composition and that of the invention Methods provide several advantages in the determination of glutamate and glutaminate transaminase enzymes. she can be produced in large quantities, with the advantage that the quantities of the ingredients can be easily measured out, the standardization is easily done and that it is for actual Determination is not required to perform mixing operations. The incubation time necessary for the determination the transaminase is required by the method according to the invention is significantly less than the time that is required in the known methods, i.e. the determination can be compared in an incubation period of 10 minutes with times of 45 minutes. The
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findungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Mittel sind hochspezifisch und ergehen die gewünschte lineare Beziehung von Farbe zu Enzymaktivität. Da bei der vorliegenden Erfindung die Transaminase-Aktivität durch das Glutamat, das während der Inkubation gebildet wird, bestimmt wird» ermöglicht die Erfindung die Verwendung von reinen, wäßrigen Standardlösungen aus Glutamat, und es ist nicht erforderlich, Kontrollsera mit einer bekannten Enzym-Aktivität zu verwenden.The method according to the invention and the agent according to the invention are highly specific and result in the desired linear relationship from color to enzyme activity. As in the present invention the transaminase activity through the glutamate produced during the incubation is formed, is determined »the invention enables the use of pure, aqueous standard solutions of glutamate, and it is not necessary to use control sera with a known enzyme activity to use.
Das Reagens-Substrat-Mittel umfaßt Transaminasesubstrat-Komponenten, d.h. Οί-Ketoglutarat und eine Substrataminosäure; Farbreaktionskomponenten, d.h. den Tetrazoliumfarbstoff, und einen Elektronencarrier wie das Enzym Diaphorase oder FMS, und Kupplungsreaktionskomponenten GlDH und NAD in wäßriger Lösung, gepuffert auf einen pH-¥ert, bei dem die Transaminierungsreaktion schnell ablaufen kann» Insbesondere umfaßt das Reagens-Substrat das Substrat, die Farbreaktions- und Kupplungsreaktionskomponenten in Mengen, die ausreichen, eine meßbare Farbe zu geben, die für die Transaminase-Aktivität bei der Inkubation mit einer Glutaminattransaminase meßbar ist. Das Reagens-Substrat-Mittel ist weiter dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen frei ist von Ammoniak oder Ammoniumionen.The reagent substrate means comprises transaminase substrate components, i.e., Οί-ketoglutarate and a substrate amino acid; Color reaction components, i.e. the tetrazolium dye, and an electron carrier such as the enzyme diaphorase or FMS, and coupling reaction components GlDH and NAD in aqueous Solution, buffered to a pH at which the transamination reaction can run rapidly »In particular, the reagent substrate includes the substrate, color reaction and coupling reaction components in amounts sufficient to give measurable color necessary for transaminase activity is measurable on incubation with a glutaminate transaminase. The reagent-substrate means is further characterized by that it is essentially free of ammonia or ammonium ions.
Das erfindungsgeaäße Mittel kann hergestellt werden, indem man die Bestandteile in irgendeiner geeigneten Reihenfolge und Art vermischt. Wie bei diagnostischen Reagensmitteln sollten Bestandteile hoher Reinheit mit Qualität verwendet werden. Das Mittel kann geringe Mengen an anderen Bestandteilen zusätzlich zu den oben erwähnten Bestandteilen enthalten. Beispielsweise kann man oberflächenaktive Mittel, chelatbildend« Mittel (wie ithylendiamin-tetraessigsäure oder EDTA) oder Enzymaktivatoren wie Adenosin-diphosphat (ADP) verwenden. Im allgemeinen ist eine geringe Menge eines oberflächenaktiven Mittels wie Folyoxyäthylen-(23)-laurylither «1s oberflächenaktives Mittel wünschenswert. Von unge-The agent according to the invention can be produced by the ingredients are mixed in any suitable order and manner. As with diagnostic reagents high purity components should be used with quality. The agent can contain small amounts of other ingredients in addition to the ingredients mentioned above. For example, one can use surface-active agents, chelating agents (such as ethylenediamine-tetraacetic acid or EDTA) or enzyme activators such as adenosine diphosphate (ADP). Generally a small amount is one Surfactants such as polyoxyethylene (23) laurylether «1s surfactant is desirable. From un-
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fähr 0,01 bis 0,05 Mol ADP/1 sind im allgemeinen ebenfalls wünschenswert. Die Identität der Substrataminosäure bestimmt die Spezifität der Zusammensetzung und das Verfahren für eine besondere Transaminase. Dementsprechend kann die Substrataminosäure so ausgewählt werden, daß die Bestimmung spezifisch ist für GPT in Anwesenheit von GOT (unter Verwendung von L-Alanin) oder man kann die gesamte GOT- und GPT-Aktivität gewünschtenfalls bestimmen (indem man sowohl L-Aspartat als auqh L-Alanin zusammen verwendet).about 0.01 to 0.05 moles ADP / 1 are also generally desirable. The identity of the substrate amino acid determines the specificity of the composition and the method for a special transaminase. Accordingly, the substrate amino acid can be selected to make the determination specific is for GPT in the presence of GOT (using L-alanine) or you can have all of GOT and GPT activity determine if desired (using both L-aspartate and L-alanine together).
Für eine GPT-Bestimmung kann das L-Alanin als L-Alanin oder als racemische Mischung von DL-Alan in verwendet werden. Im letzteren Fall ist das D-Alanin im wesentlichen bei der Bestimmung inert und dient nur als Verdünnungsmittel. Es wurde gefunden, daß bei GOT-Bestimmungen D-Aspartat die GOT-Transaminierungsreaktion inhibiert. Für GOT-Bestimmungen sollte L-Aspartat anstelle des optischen Isomeren, D-Aspartat, oder racemische Mischungen verwendet werden.For a GPT determination, the L-alanine can be used as L-alanine or can be used as a racemic mixture of DL-Alan in. in the in the latter case, the D-alanine is essentially inert in the determination and serves only as a diluent. It was found that in GOT determinations, D-aspartate suppressed the GOT transamination reaction inhibited. For GOT determinations, L-aspartate should be used in place of the optical isomer, D-aspartate, or racemic mixtures can be used.
Die Glutamatdehydrogenase wird üblicherweise als Suspension in Glycerin verwendet. Sowohl GlDH als auch die Diaphorase sollten im wesentlichen von Ammoniumsalzen frei sein, die üblicherweise in Enzympräparationen enthalten sind. The glutamate dehydrogenase is usually given as a suspension used in glycerin. Both GlDH and diaphorase should be essentially free of ammonium salts, which are usually contained in enzyme preparations.
Als Tetrazoliuefarbstoffbestandteil kann man irgendeinen Tetrazoliumsalz-Farbstoff verwenden, der bei einer Elektronenoarrier-katalysierten NADH-Reduktion ein gefärbtes Produkt ergibt und der nicht nachteilig mit den anderen Bestandteilen oder mit anderen^ Materialien, die während der Transaminierungsreaktion vorhanden sind, reagiert. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ergeben INT, TNBT (Tetranitro-blautetrazolium), NBT (Nitro-blautetrazolium), NT (Neotetrazolium) und BT (Blautetrazolium) alle meßbare Verfärbungen. Jedoch ergibt INT eine unerwartete, intensivere Färbung als andere Tetrazoliumsalz-Farbstoff e und es ist ebenfalls in der Testmischung löslicher als die meisten Tetrazoliumsalze. DementsprechendAs the tetrazole dye component, there can be any Use tetrazolium salt dye that is catalyzed by an electron barrier NADH reduction results in a colored product and which does not adversely affect the other ingredients or with other ^ materials used during the transamination reaction are present, responds. In the method according to the invention, INT, TNBT (tetranitro-blue tetrazolium), NBT (nitro-blue tetrazolium), NT (neotetrazolium) and BT (Blue tetrazolium) all measurable discoloration. However, results INT has an unexpected, more intense color than other tetrazolium salt dyes and it is also in the test mixture more soluble than most tetrazolium salts. Accordingly
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ist INT der bevorzugte Tetrazoliumfarbstoff.INT is the preferred tetrazolium dye.
Das Reagens-Substrat-Mittel sollte im wesentlichen von Ammoniak wie Ammoniumionen frei sein. Es wurde gefunden, daß die Anwesenheit geringer Mengen von Ammoniumsalzen,wie sie entweder als Verunreinigungen oder als Suspensionsmittel oder Träger für einen oder mehrere Bestandteile vorhanden sein können oder wiß sie in einigen Puffersystemen vorhanden sein können, den gesamten Verlauf der Bestimmung stark inhibieren kann. Die Bestandteile sollten so ausgewählt und verwendet werden, daß man eine Ammoniumionenkonzentration von unter ungefähr 0,001 Mol/l in der fertigen Mischung erhält (d.h. von Null oder unterhalb der Grenze der Bestimmung von ungefähr 0,005 Mol/l). Die Ammoniumionenkonzentration liegt bevorzugt unter 0,001 Mol/l. Ammoniumionen aus dem Serum beeinflussen die Bestimmung nicht nachteilig weder bei normalen Serummengen oder bei Mengen, die dem 10- oder 20fachen des üblichen entsprechen.The reagent-substrate means should be essentially free of ammonia such as ammonium ions. It was found that the presence of small amounts of ammonium salts, like them present either as impurities or as suspending agents or carriers for one or more ingredients can be or can be present in some buffer systems, strongly inhibit the entire course of the determination can. The ingredients should be selected and used so as to achieve an ammonium ion concentration below about 0.001 mol / l in the final mixture (i.e. zero or below the limit of determination of about 0.005 mol / l). The ammonium ion concentration is preferably below 0.001 mol / l. Ammonium ions from the Serum will not adversely affect the determination either at normal serum levels or at levels close to 10 or 20 times the usual.
Die Reagens-Substrat-Mittel können die folgenden Bestandteile in den folgenden Verhältnissen enthalten:The reagent-substrate means may contain the following ingredients in the following proportions:
SubstratSubstrate
cX-Ketoglutarat 0,0005 bis 0,0012 MolcX-ketoglutarate 0.0005 to 0.0012 moles
Substrataminosäure 0,01 bis 0,5 Mol FarbreagensSubstrate Amino Acid 0.01 to 0.5 moles of color reagent
Tetrazoliumfarbstoff 0,0005 bis 0,005 Mol Elektronencarrier, Diaphorase (oder ein Äquivalent,d.h. PMS 0,0001 bis 0,0002 Mol) 100 bis 3200 Internationale Einheiten (I.E.)Tetrazolium dye 0.0005 to 0.005 moles electron carrier, diaphorase (or equivalent, i.e. PMS 0.0001 to 0.0002 mol) 100 to 3200 international units (I.U.)
KupplungsreagentienCoupling reagents
GlDH 2000 bis 4000 I.E.
NAD 0,001 bis 0,01 Mol
oberflächenaktives Mittel 1 bis 10g wäßriger Phosphatpuffer (pH 7,2 bis 8,5; Molarität 0,01
bis 1) q.s. auf 11.GlDH 2000 to 4000 IU
NAD 0.001 to 0.01 mole
surfactant 1 to 10g aqueous phosphate buffer (pH 7.2 to 8.5; molarity 0.01 to 1) qs to 11.
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Ein bevorzugtes Mittel enthält die folgenden Bestandteile:A preferred agent contains the following ingredients:
(X-Ketoglutarat 0,0005 bis 0,0075 Mol(X-ketoglutarate 0.0005 to 0.0075 moles
Substrataminosäure 0,01 bis 0,5 MolSubstrate amino acid 0.01 to 0.5 mole
INT 0,0005 bis 0,005 MolINT 0.0005 to 0.005 moles
Diaphorase 250 bis 2000 I.E..Diaphorase 250 to 2000 I.U ..
GlDH 2000 bis 40 000 I.E.GlDH 2000 to 40 000 I.U.
NAD 0,002 bis 0,004 MolNAD 0.002 to 0.004 moles
oberflächenaktives Mittel ungefähr 5 gsurfactant about 5 g
wäßriger Phosphatpuffer (pH q.s. auf 11
Molarität 0,01 bis 0,10), 8,0
bis 8,2aqueous phosphate buffer (pH qs to 11 molarity 0.01 to 0.10), 8.0
to 8.2
Bei einer bestimmten Anwendung für die Bestimmung einer bestimmten Glutaminattransaminase wie GOT oder GPT wird die bevorzugte Menge an Substrataminosäure abhängig von der verwendeten Aminosäure variieren. Für GPT-Bestimmungen verwendet man als Aminosäure L-Alanin und diese ist bevorzugt in Mengen von ungefähr 0,02 bis 0,4 Mol/l, bezogen auf das Reagens-Substrat-Mittel, vorhanden. Für GOT-Bestimmungen -verwendet man als Sübstratamin L-Aspart at, und dieses ist bevorzugt in Konzentrationen von ungefähr 0,01 bis ungefähr 0,16 Mol/l vorhanden.For a specific application for the determination of a specific Glutaminate transaminase such as GOT or GPT will be the preferred amount of substrate amino acid depending on the one used Amino acid vary. L-alanine is used as the amino acid for GPT determinations and this is preferred in Amounts from about 0.02 to 0.4 moles / liter based on the reagent-substrate agent are present. For GOT regulations -Used as substratamine L-aspartate, and this is preferably present in concentrations of from about 0.01 to about 0.16 mol / l.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Substratkomponenten, die Farbreaktionskomponenten und die Kupplungsreaktionskomponenten mit einer geringen Menge einer Probe, die auf ihre Transaminase-Aktivität analysiert werden soll, vermischt. Die entstehende Mischung wird bei solchen pH- und Temperaturbedingungen, die der.enzymkatalysierten Transaminierung entsprechen,während einer vorbestimmten kurzen Zeitdauer inkubiert, danach wird die Stärke oder Tiefe der entstehenden Farbe bestimmt. Das Mischen erfolgt zweckdienlich, indem •an eine Probe wie Serum, Plasma, Gewebeextrakte, Enzympräparationen o.a. direkt mit der erfindungsgemäßen wäßrigen Zusammensetzung vermischt. Die relativen Mengen an Proben und Substrat-Reagens-Mittel können etwa,s variieren, abhängigIn the method according to the invention, the substrate components, the color reaction components and the coupling reaction components mixed with a small amount of a sample to be analyzed for transaminase activity. The resulting mixture is under such pH and temperature conditions that der.enzymkatalysierten transamination correspond for a predetermined short period of time incubated, then the strength or depth of the resulting color is determined. Mixing is conveniently done by • to a sample such as serum, plasma, tissue extracts, enzyme preparations or the like directly with the aqueous according to the invention Mixed composition. The relative amounts of sample and substrate-reagent agent can vary approximately, depending
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j von solchen Faktoren wie der bekannten oder erwarteten Konzentration des Enzyms in der Probe, der Konzentration der I Bestandteile in der Zusammensetzung usw. Bei einem geeigneten Verfahren werden ungefähr 0,02 bis ungefähr 0,5 Vol-Teile Probe/Vol-Teil Zusammensetzung verwendet.j on factors such as known or expected concentration of the enzyme in the sample, the concentration of the constituents in the composition, etc. If appropriate Procedures will be about 0.02 to about 0.5 parts by volume Sample / part by volume composition used.
Der Inkubations-pH kann im Bereich von 7,2 bis so hoch wie 9,0 liegen. Für die besten Ergebnisse sollte der pH-Wert im Bereich von 7,9 bis 8,3 liegen und er wird bevorzugt kontrolliert, indem man zu der Substrat-Reagens-Zusammensetzung einen Puffer zufügt. Die Inkubation sollte bei einer Temperatur von ungefähr 25 bis 40°C und bevorzugt bei ungefähr 370C durchgeführt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Mittel auf die Inkubationstemperatur vor der Zugabe der Probe vorerwärmt.The incubation pH can range from 7.2 to as high as 9.0. For best results, the pH should be in the range of 7.9 to 8.3 and is preferably controlled by adding a buffer to the substrate-reagent composition. The incubation should be carried out at a temperature of about 25 to 40 ° C and preferably at about 37 0 C. In a preferred embodiment, the agent is preheated to the incubation temperature before adding the sample.
Die Inkubationszeit vor der Bestimmung der Farbe ist für die erfolgreiche Durchführung der vorliegenden Erfindung wichtig. Die Inkubationszeit kann nach bekannten Verfahren unter Verwendung bekannter Vorrichtungen wie kontinuierlicher Strömungsanalysevorrichtungen oder Registrierspektrophotometer erfolgen. Die Inkubation kann leicht durch Zugabe von Säure beendigt werden, zweckdienlich indem man die Mischung mit wäßriger Chlorwasserstoffsäure verdünnt, um den pH-Wert auf 0,1 bis 4,5 zu erniedrigen, danach bleibt die Farbe während 30 Minuten oder länger stabil und während dieser Zeit kann die Absorption gemessen werden. Die vorbestimmte Inkubationszeit sollte ausreichen, damit eine meßbare Farbe gebildet wird und sie sollte weniger als ungefähr 15 Minuten betragen. Bei längeren Inkubationszeiten wie bei 20 oder 30 Minuten wird nicht nur der Vorteil einer schnellen Bestimmung beseitigt, sondern die Empfindlichkeit und Linearität der Bestimmung können ebenfalls nachteilig beeinflußt werden.The incubation time prior to color determination is important to the successful practice of the present invention. The incubation time can be determined by known methods using known devices such as continuous flow analyzers or recording spectrophotometer. Incubation can be easily done by adding acid conveniently by diluting the mixture with aqueous hydrochloric acid to bring it to pH 0.1 to 4.5, after which the color remains stable for 30 minutes or more and during this time can the absorption can be measured. The predetermined incubation time should be sufficient for a measurable color to be formed and it should be less than about 15 minutes. For longer incubation times such as 20 or 30 minutes not only does it eliminate the benefit of rapid determination, but also the sensitivity and linearity of the determination can also be adversely affected.
Bei einem bevorzugten Verfahren wird die Inkubation. bei pH 8,0 bis 8,2 während ungefähr 5 bis ungefähr 15 MinutenIn a preferred method, the incubation. at pH 8.0 to 8.2 for about 5 to about 15 minutes
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bei 35 bis 400C durchgeführt und durch Zugabe einer wäßrigen Chlorwasserstoffsäure beendigt. Die Stärke der Farbe, die gebildet wird, wird bestimmt, indem man in einem Kolorimeter oder Spektrophotometer die Absorption mit Licht mit einer Wellenlänge von ungefähr 450 bis 55Q nm mißt. Die Enzymaktivität wird durch Vergleich der Absorptionsmessungen, die man erhält, mit Kontrollsera, Standardlösungen, die bekannte Mengen an Glutamat enthalten, Standardkurven o.a. bestimmt.carried out at 35 to 40 0 C and terminated by adding an aqueous hydrochloric acid. The strength of the color that is formed is determined by measuring in a colorimeter or spectrophotometer the absorption of light having a wavelength of about 450 to 55 Ω nm. The enzyme activity is determined by comparing the absorption measurements that are obtained with control sera, standard solutions containing known amounts of glutamate, standard curves or the like.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.The following examples illustrate the invention without restricting it.
i
Beispiel 1 i
example 1
Ein Reagens-Substrat-Mittel, welches die folgenden Bestandteile in wäßriger, ammoniakfreier Lösung in den folgenden Mengen enthält, wird hergestellt: A reagent-substrate composition containing the following ingredients in aqueous, ammonia-free solution in the following amounts is prepared:
Mittel (Brij - 35)Medium (Brij - 35)
suspension)suspension)
(KH2PO. und NaOH) Phosphate buffer pH 8.1
(KH 2 PO. And NaOH)
1 ml des Mittels wird in eine Reihe von Ampullen gegeben und gut vermischt. Die Ampullen werden für die Bestimmung von GPT in einem Probenkontrollserum oder Verdünnungen des identischen Kontrollserums mit wäßriger 0,85#iger Salzlösung verwendet. Jede Ampulle wird in einem Erwärmungsblock bei 37°C während 5 Minuten vor Zugabe der Probe erwärmt.1 ml of the agent is placed in a series of ampoules and mixed well. The ampoules are used for the determination of GPT in a sample control serum or dilutions of the identical control serum with aqueous 0.85 # saline solution used. Each ampoule is heated in a heating block at 37 ° C for 5 minutes before adding the sample.
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100 /Ul der geeigneten Flüssigkeit (Kontrollserum oder Verdünnung davon) werden zu jeweils fünf Ampullen zugegeben und der Inhalt wird vermischt. 100/ul einer wäßrigen O,85?oigen Salzlösung wird mit dem Inhalt einer weiteren Ampulle vermischt und dienen als Blindprobe. Nach 10minütiger Inkubation bei einer Temperatur von ungefähr 37°C wird die Inkubation beendigt, indem man den Inhalt jeder Ampulle mit 2 ml wäßriger Chlorwasserstoffsäure (ungefähr 0,1n) verdünnt.100 / ul of the appropriate liquid (control serum or dilution of which) are added to every five ampoules and the contents are mixed. 100 / μl of an aqueous 0.85? Saline solution is mixed with the contents of another ampoule and serves as a blank sample. After 10 minutes of incubation at a temperature of about 37 ° C, the incubation is terminated by adding the contents of each ampoule with 2 ml of aqueous hydrochloric acid (approx. 0.1N) diluted.
Die Intensität der Farbe wird in jeder Ampulle dann bestimmt, indem man die Absorption bei 500 nm unter Verwendung eines photoelektrischen Kolorimeters bestimmt. (Das Instrument wird zuvor auf Null-Absorption unter Verwendung von destilliertem Wasser eingestellt.) Eine identische Reihe von Vergleichsserum und Serumverdünnungen wird ebenfalls analysiert, wobei man ein im Handel erhältliches ultraviolettes Enzymbestimmungsverfahren verwendet. Ein Vergleich der graphischen Darstellungen der Ergebnisse gegen Konzentrationen an Serum in den Proben zeigt eine ausgezeichnete Linearität und einen guten Einklang mit der kolorimetrischen Bestimmung entsprechend der ultravioletten Bestimmung.The intensity of the color in each ampoule is then determined by measuring the absorbance at 500 nm using a photoelectric colorimeter determined. (The instrument is previously distilled to zero absorption using Water adjusted.) An identical set of reference serum and serum dilutions is also analyzed, with a commercially available ultraviolet enzyme determination method is used. A comparison of the graphs the results against concentrations of serum in the samples show excellent linearity and a good agreement with the colorimetric determination corresponding to the ultraviolet determination.
Eine Reagens-Substrat-Zusammensetzung wird hergestellt, die 1,6 χ 10~4 Hol/l PMS, 8 χ 10~4 Mol/l INT, 21,4 χ 10~4 Mol/l NAD, 1000 χ 10~4 Mol/l L-Alanin, 10 χ 10"*4 Mol/l CX-Ketoglutarat, 0,2 χ 10~4 Mol/l EDTA und 2700 I.E./l GlDH in Phosphatpufferlösung enthält, die ebenfalls ein oberflächenaktives Mittel enthält und die 1 g Rinderserumalbumin/l enthält. Das Mittel wird entsprechend einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht, wobei man verschiedene bekannte Mengen an wäßriger Glutamat-Standardlösung verwendet, um die Linearität des Substrats und das Verfahren in Anwesenheit von zugefügtem Protein zu untersuchen. Eine graphische Darstellung der Absorptionswerte gegen die Konzentration an zugefügtem Glutamat (zehn Bestimmungen vonA reagent-substrate composition is prepared containing 1.6 χ 10 ~ 4 Hol / l PMS, 8 χ 10 ~ 4 mol / l INT, 21.4 χ 10 ~ 4 mol / l NAD 1000 χ 10 ~ 4 mol / l L-alanine, 10 χ 10 "* 4 mol / l CX-ketoglutarate, 0.2 χ 10 ~ 4 mol / l EDTA and 2,700 IU / L GLDH in phosphate buffer solution containing also containing a surfactant and 1 g Bovine Serum Albumin / L The agent is tested according to a similar procedure to that described in Example 1, using various known amounts of standard aqueous glutamate solution to test the linearity of the substrate and the process in the presence of added protein the absorption values versus the concentration of added glutamate (ten determinations of
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0,4 χ 10 bis 4 χ 10" Mol Glutamat in der Testmischung) zeigt eine ausgezeichnete Linearität.0.4 χ 10 to 4 χ 10 "moles of glutamate in the test mixture) shows excellent linearity.
Eine GOT-Reagens-Substrat-Zusammensetzung wird hergestellt, die die folgenden Bestandteile in den im folgenden angegebenen Konzentrationen enthält:A GOT reagent-substrate composition is prepared which contains the following components in the concentrations given below:
OUKetoglutarat 0,001 Mol/lOUKetoglutarate 0.001 mol / l
L-Asparaginsäure 0,020 Mol/lL-aspartic acid 0.020 mol / l
INT 0,0008 Mol/lINT 0.0008 mol / l
NAD 0,003 Mol/lNAD 0.003 mol / l
Diaphorase 500 I.E./lDiaphorase 500 I.U./l
GlDH 8000 I.E./l Phosphatpuffer(pH 8,1) 0,05 Mol/l GlDH 8000 IU / l phosphate buffer (pH 8.1) 0.05 mol / l
Eine GPT-Reagens-Substrat-Zusammensetzung, die die gleichen Bestandteile in den gleichen Konzentrationen enthält, wird hergestellt, mit der Ausnahme, daß die GPT-Zusammensetzung 0,05 Mol/l L-Alanin und keine Asparaginsäure enthält.A GPT reagent substrate composition is prepared containing the same ingredients in the same concentrations, except that the GPT composition contains 0.05 mol / L L-alanine and no aspartic acid.
Die Zusammensetzungen werden getrennt in verschiedene Ampullen gegeben, 1 ml/Ampulle. Sie werden bei Bestimmungen von GOT bzw. GPT verwendet. Bei jedem Verfahren werden die Zusammensetzungen in einem 37OC-Erwärmungsblock während 10 Minuten vorerwärmt, dann mit 0,1 ml einer Serumprobe, Kontrollserum, destilliertem Wasser als Blindprobe oder wäßriger Glutaminsäure-Standardlösung vermischt. Die Mischungen werden während 10 Minuten bei 37°C inkubiert, dann mit 2,0 ml 0,1n Chlorwasserstoff säure vermischt, um die enzymatischen Umsetzungen zu beendigen. Die entstehende Farbe wird in einem Kolorimeter mit Licht mit einer Wellenlänge von ungefähr 500 nm bestimmt.The compositions are placed separately in different ampoules, 1 ml / ampoule. They are used in terms of GOT and GPT. In each method, the compositions in a 37 O C heating block for 10 minutes to be preheated and then with 0.1 ml of a serum sample, control serum, distilled water as a blank or aqueous mixed glutamic acid standard solution. The mixtures are incubated for 10 minutes at 37 ° C., then mixed with 2.0 ml of 0.1N hydrochloric acid in order to terminate the enzymatic reactions. The resulting color is determined in a colorimeter with light with a wavelength of approximately 500 nm.
Eine Reagens-Substrat-Zusammensetzung,, die 0,05 Mol/l L-Aspartat, 0,0075 Mol/l CX-Ketoglutarat, 0,0028 Mol/l NAD, 0,002 Mol/l INT, 800 I.E. Diaphorase und 4000 I.E./l GlDH inA reagent-substrate composition, which is 0.05 mol / l L-aspartate, 0.0075 mol / l CX-ketoglutarate, 0.0028 mol / l NAD, 0.002 mol / l INT, 800 IU diaphorase and 4000 IU / l GlDH in
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0,05 Mol/l Phosphatpuffer (pH ungefähr 8,1), der 0,5$ eines .oberflächenaktiven Mittels (Brij-35) enthält, enthält, wird 'hergestellt. Die Zusammensetzung wird verwendet, um die GOT-Aktivität auf aliquoten Teilen von 42 menschlichen Serumproben zu bestimmen, wobei man im wesentlichen das gleiche Verfahren verwendet, wie es in den Beispielen 1 und 3 beschrieben ist. Die GOT-Aktivität einer aliquoten Menge der gleichen Serumproben wird ebenfalls nach dem Verfahren von Henry, Chiamori, Golub und Berkman, Am.J.Clin.Path. 34, 381 (1960) bestimmt. Eine statistische Analyse der Ergebnisse zeigt eine gute Korrelation zwischen den beiden Verfahren. 0.05 mol / l phosphate buffer (pH approximately 8.1), the 0.5 $ one . contains surfactant (Brij-35) 'manufactured. The composition is used to measure GOT activity on aliquots of 42 human serum samples using essentially the same procedure as described in Examples 1 and 3 is. The GOT activity of an aliquot of the same serum samples is also determined according to the procedure by Henry, Chiamori, Golub and Berkman, Am.J.Clin.Path. 34, 381 (1960) determined. A statistical analysis of the results shows a good correlation between the two methods.
Entsprechend einem ähnlichen Verfahren wird eine GPT-Zusammensetzung nach einem Verfahren, das ähnlich ist wie in Beispiel 3, für die Korrelation mit dem obigen Vergleichsverfahren untersucht, wobei man 34 Serumproben verwendet und eine ausgezeichnete Korrelation zwischen beiden Verfahren feststellt.According to a similar procedure, a GPT composition by a method similar to Example 3 for correlation with the above comparative method using 34 serum samples and an excellent correlation between the two methods notices.
Bei einer besonders wertvollen Ausführungsform wird die Reagens-Substrat-Zusammensetzung in Form getrennter Zusammensetzungen hergestellt und eine davon enthält die Substrataminosäure und die andere enthält das Farbreagens und die Kupplungsbestandteile. Das (X-Ketoglutarat kann in irgendeiner Zusammensetzung sein oder es kann getrennt zugegeben werden. Diese getrennte Reagenszusammensetzung, die das Farbreagens und die Kupplungsbestandteile in den oben angegebenen Verhältnissen enthält, kann direkt für quantitative Glutamatbestimmungen verwendet werden.In a particularly useful embodiment, the reagent-substrate composition is in the form of separate compositions and one of them contains the substrate amino acid and the other contains the color reagent and the Coupling components. The (X-ketoglutarate can be used in any Composition or it can be added separately. This separate reagent composition that the color reagent and the coupling components in the proportions given above can be used directly for quantitative Glutamate determinations are used.
Bei Bestimmungen der Enzymataktivität erfolgt die getrennte Verwendung der Komponenten zweckdienlich, um die biologischen Flüssigkeitsproben als einzelne Blindproben verwenden zu können. Bei einem solchen Verfahren werden das Farbreagens und die Kupplungsreagentien mit den Proben während The enzymatic activity is determined separately Using the components appropriate to use the biological fluid samples as individual blanks to be able to. In such a procedure, the color reagent and coupling reagents are with the samples during
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einer Zeit inkubiert, die ausreicht, daß die Absorption der entstehenden Mischung einen stabilen, konstanten Wert erreicht. Diese Zeit ist im allgemeinen kurz und beträgt 1 bis 3 Minuten. Während dieser Inkubation werden geringe Mengen an Glutamat oder Substrataminen, die in den Proben vorhanden sind, verbraucht, und der entstehende, stabile Absorptionswert kann als Blindwert oder als Grundlinie für den Vergleich verwendet werden. Die restlichen Bestandteile werden dann zugegeben, um die fertige Substrat-Reagens-Zusammensetzung zu bilden, und dann wird die Inkubation fortgesetzt, die Absorption bestimmt und mit der Blindprobe verglichen und die Enzymaktivität wird wie oben beschrieben bestimmt. Diese Ausführungsform wird in dem folgenden Beispiel näher erläutert.incubated for a time sufficient for the absorption of the resulting mixture reaches a stable, constant value. This time is generally short, from 1 to 3 minutes. During this incubation, small amounts of glutamate or substrate amines will be present in the samples are used up, and the resulting stable absorption value can be used as a blank value or as a baseline for the Can be used for comparison. The remaining ingredients are then added to make the finished substrate-reagent composition and then the incubation is continued, the absorbance determined and compared to the blank and the enzyme activity is determined as described above. This embodiment is illustrated in the following example explained.
Reagens-Substrat-Zusammensetzungen werden für die getrennten Bestimmungen von GOT und GPT hergestellt. Die Farbreagens-Kupplungsbestandteil-Zusammensetzung wird in konzentrierter Form hergestellt, so daß die Verdünnung von 2 ml davon mit 1 ml des geeigneten Substrats eine Endzusammensetzung von 0,006 Mol/l NAD, 0,0008 Mol/l INT, 0,00002 Mol/l Äthylendiamin-tetraessigsäure, 0,010 Mol/l ADP, 50 I.E./l Diaphorase und 8000 I.E./l GIdH in 0,1 MolAwäßrigem Phosphatpuffer, pH 8,0, ergibt. Die GOT- und GPT-Substratzusammensetzungen werden getrennt in konzentrierter Form hergestellt, um fertige Mischungen zu ergeben, die enthalten: 4 mMol C*-Ketoglutarat in pH 8, 0,1 Mol/l Phosphatpuffer und 0,060 Mol/l L-Asparaginsäure (im Falle des GOT-Substrats) oder 0,1 Mol/l D-L-Alanin (im Falle des GPT-Substrats).Reagent-substrate compositions are prepared for the separate determinations of GOT and GPT. The color reagent coupling ingredient composition is made in concentrated form, so that the dilution of 2 ml of it with 1 ml of the suitable substrate a final composition of 0.006 mol / l NAD, 0.0008 mol / l INT, 0.00002 mol / l ethylenediamine-tetraacetic acid, 0.010 mol / l ADP, 50 IU / l Diaphorase and 8000 IU / l GIdH in 0.1 mol A aqueous phosphate buffer, pH 8.0. The GOT and GPT substrate compositions are produced separately in concentrated form, to give ready-made mixtures containing: 4 mmol C * -ketoglutarate in pH 8, 0.1 mol / l phosphate buffer and 0.060 mol / l L-aspartic acid (in the case of the GOT substrate) or 0.1 mol / l D-L-alanine (in the case of the GPT substrate).
Die Zusammensetzungen werden verwendet, um sowohl GOT als auch GPT in 43 menschlichen Serumproben zu bestimmen, und die Ergebnisse werden mit den Ergebnissen verglichen, die man erhält, wenn man aliquote Teile der gleichen 43 Sera entsprechend dem Verfahren von Henry et al, das in Beispiel 4 be-The compositions are used to determine both GOT and GPT in 43 human serum samples, and the Results are compared to the results obtained by using aliquots of the same 43 sera accordingly the method of Henry et al, which is in Example 4
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! schrieben wurde, analysiert. .Bei den Bestimmungen werden 2 ml des Farbreagens-Kupplungsreagens-Konzentrats auf 37°C erwärmt und mit 100/ul der Serumproben vermischt. Die Mischung wird dann 2 Minuten bei 37°C inkubiert, dann wird die Absorption (bei ungefähr 500 nm) bestimmt und als Serumblindwert registriert. 1 ml des geeigneten GOT- oder GPT-Substrat-Konzentrats wird dann zugegeben und dann wird vermischt. Die entstehende fertige Mischung wird bei 37°C während 10 Minuten inkubiert.,Nach dieser lOminütigen Periode wird die Absorption gemessen und registriert, wobei die Zeit so kontrolliert wird, daß eine Beendigung der Inkubation durch Säure nicht erforderlich ist. Die · Enzymaktivität wird aus dem Absorptionsunterschied zwischen der inkubierten fertigen Mischung und der Blindprobe durch Vergleich der Absorptionsmessungen, die man mit GlutamatStandardlösung erhält, berechnet.! was written, analyzed. .At the determinations will be Heat 2 ml of the color reagent-coupling reagent concentrate to 37 ° C and mix with 100 µl of the serum samples. The mixture it is then incubated for 2 minutes at 37 ° C., then the absorption (at approximately 500 nm) is determined and recorded as the serum blank value. 1 ml of the appropriate GOT or GPT substrate concentrate is then added and then mixed. The resulting finished mixture is at 37 ° C for 10 minutes incubated., After this 10 minute period, the absorption measured and recorded, the time being controlled so that the incubation is terminated Acid is not required. The enzyme activity is determined from the difference in absorbance between that incubated Mixture and the blank sample by comparing the absorption measurements obtained with the glutamate standard solution, calculated.
Bei der Bestimmung von GOT korrelieren die Ergebnisse gut mit den Ergebnissen, die man bei dem Vergleichsverfahren erhält, mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,9932 und einer linearen korrelationsgraphischen Darstellung mit einer Neigung von 0,9547. Die Beziehung der Absorptionsergebnisse ergibt, daß die GOT-Aktivität linear bis ungefähr 300 I.E. GOT/ml Serum ist. Ausgezeichnete Korrelation erhält man bei der GPT-Bestimmung mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,9937 und einer graphischen Darstellung mit einer Neigung von 1,034. Die Ergebnisse, die man erhält, zeigen eine ausgezeichnete Linerarität bis ungefähr 200 I.E. GPT/ml Serum an.When determining GOT, the results correlate well with the results obtained with the comparison method, with a correlation coefficient of 0.9932 and a linear correlation graph with a slope of 0.9547. The relationship of the absorption results indicates that GOT activity is linear to about 300 IU GOT / ml Serum is. Excellent correlation is obtained in the GPT determination with a correlation coefficient of 0.9937 and a graph with a slope of 1.034. The results obtained show excellent Linearity up to approximately 200 IU GPT / ml serum.
Für den Fachmann ist es geläufig, daß das oben beschriebene Verfahren vielfach abgeändert werden kann, beispielsweise kann man zu dem Farbreagens-Kupplungsbestandteil-Konzentrat o^-Ketoglutarat zugeben oder man kann es getrennt zugeben oder man kann die Konzentration der Bestandteile in den Konzentraten ändern, während man die Verhältnisse der Bestandteile relativ zueinander beibehält.For the person skilled in the art, it is familiar that the above-described Process can be varied many times, for example one can o ^ -Ketoglutarate to the color reagent coupling ingredient concentrate or you can add it separately or you can adjust the concentration of the ingredients in the concentrates change while maintaining the proportions of the components relative to one another.
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Claims (10)
enthält.10. Composition according to claim 9 »characterized in that it additionally (λ-Ke toglutarate and a substrate amino acid such as L-alanine and / or L-aspartic acid
contains.
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