DE2417230A1

DE2417230A1 - Enzymatic assay of metabolic substrates - by measuring reaction velocity when it has stabilised at low enzyme concn.

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Publication number: DE2417230A1
Application number: DE2417230A
Authority: DE
Inventors: Lebrecht Von Dr Klitzing
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1974-04-09
Filing date: 1974-04-09
Publication date: 1975-11-06

Abstract

Enzymatic determination fo substrate, esp. metabolite concns., comprises starting the reaction by adding the enzyme then measuring teh reaction velocity (dE/dt), which is characteristic of the instantaneous substrate concn., only after the perturbation caused by introducing the enzyme has decayed and only during the period of time when the velocity at low enzyme concn. is practically constant e.g. 15-30 sec. Partic. for analysing blood glucose but also for blood alcohol, lactic acid or pyruvic acid. Analysis kis very rapid and method can be used where two enzymes are needed for reaction e.g. hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase in glucose assay.

Description

"Verfahren und Anordnung zur enzymatisehen Bestimmung der Konzentration von Substraten, insbesondere Stoffweehselmetaboliten Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatisoben Bestimmung der Konzentration von Substraten, insbesondere von Stoffwechselmetaboliten, wie z.B. Blutglucose, und eine Anordnung zur Durobfübrung des Verfahrens."Method and arrangement for the enzymatic determination of the concentration of substrates, in particular metabolic metabolites. The invention relates to a Method for the enzymatic determination of the concentration of substrates, in particular of metabolic metabolites, such as blood glucose, and an arrangement for the delivery of Durob of the procedure.

Die bisher bekannten derartigen Verfahren sind bei ihrer Anwendung relativ zeitaufwendig, da in allen Fällen die Endpunktbestimmung einer enymatischen Reaktion durohgeführt werden muß (vgl. z.B. DE-OS 1 598 183). Eine sohnelle quantitative Bestimmung von Stoffweobselmetaboliten, z.B.The previously known such methods are in their application relatively time-consuming, since in all cases the endpoint determination is an enymatic The reaction has to be carried out continuously (cf. e.g. DE-OS 1 598 183). Such a quantitative one Determination of fabric metabolites, e.g.

Blutglucose oder auch Blutalkohol, ist in der klinisohen Diagnostik jedoch sehr oft von entscheidender Bedeutung.Blood glucose or blood alcohol is used in clinical diagnostics however, very often crucial.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sowie eine Anordnung zur DuroFfUhrung des Verfahrens zu schaffen, das die enzymatische Bestimmung der Eonzentration von Substraten in sehr einfacher und insbesondere sehr schneller Weise ermöglioht. Die Erfindung geht dabei von der atsaohe aus, daß nach MICHAELIS und MENGEN (vgl.The invention is therefore based on the object of a method and to create an arrangement for the implementation of the process, which the enzymatic Determination of the concentration of substrates in a very simple and in particular very faster way possible. The invention is based on the atsaohe that after MICHAELIS and MENGEN (cf.

Bioobem. Ztsohr. 1913, Heft 49, Seite 333 ff) bei enzymatischen Reaktionen ein Zusammenhang besteht zwischen Substratkonzentration und Reaktionsgeschwindigkeit, derart, daß bei Jeweils konstanter Enzymmenge die Reaktionsgesobwindigkeit mit steigender Substratkonzentration zunächst schnell, dann langsamer bis zu einem Maximalwert zunimmt (Fig. 1). Dabei ist in dem aufsteigenden Ast dieser Funktion (bis zum Punkt "a") der Zusammenhang zwisoben Reaktionsgeschwindigkeit und Substratkonzentrat on annähernd linear. Diese Reaktion 1. Ordnung gilt bis etwa zu der Substratkonzentration KM (Michaelis-Konstante), bei der die halbmaximale Reaktionsgeschwindigkeit ( vmax ) geinessen wird. Selbstverständlich gilt dies nur für den angegebenen Konzentrationsbereich, ebenso auch nur dann, wenn die ueiteren die Reaktionsgeschwindigkeit beeinflussenden Parameter konstant gehalten werden (emperatur, pIIll.a.).Bioobem. Ztsohr. 1913, issue 49, page 333 ff) in enzymatic reactions there is a connection between substrate concentration and reaction rate, in such a way that with a constant amount of enzyme in each case, the rate of reaction increases with increasing Substrate concentration initially fast, then more slowly up to a maximum value increases (Fig. 1). This function is in the ascending branch (up to the point "a") the connection between the above Reaction rate and substrate concentrate on approximately linear. This first order reaction applies up to about the substrate concentration KM (Michaelis constant), at which half the maximum reaction speed (vmax ) is eaten. Of course, this only applies to the specified concentration range, also only if the others influence the reaction rate Parameters are kept constant (temperature, pIIll.a.).

Unter Ausnutzung dieser Datsaohe besteht die erfindungsgemäße Lösung der gestellten Aufgabe darin, daß bei einer mit dem Einmischen eines Enzyms, z.B. Hexokinase und Gllzoose-6-Phosphat-Dehydrogenase, in einem Reaktionsansatz heginnende Enzymreaktion die die jeweilige Substratkonzentration kennzeichnende Reaktionsgeschwindigkeit (dE/dt) dieser Lnzyr reaktion gemessen wird, jedoch erst nach Abklingen der beip Einmischen des Enzyms entstehenden Störung, danach aber nur innerhalb eines Zeitbereiches, in dem die Reaktionsgeschwindigkeit bei niedrigen Enzymaktivitäten praktisch konstant bleibt, z.B. 15 ... 30 sec. Dabei ist es jedoch erforderlich, daß, um die Auswertung der Messung zur Bestimmung der Substrat-Konzentration zu ermöglichen, zuvor unter Verwendung bekannter verschiedener Substratkonzentrationen in Eichkurven festgelegt ist, welche Geschwindigkeitswerte bestimmten Substratkonzentrationen entsprechen.The solution according to the invention is made using this data the task set is that in a process involving the incorporation of an enzyme, e.g. Hexokinase and Gllzoose-6-Phosphat-Dehydrogenase, beginning in one reaction Enzyme reaction the reaction rate characterizing the respective substrate concentration (dE / dt) of this Lnzyr reaction is measured, but only after the beip Mixing in the enzyme resulting disturbance, but then only within a time range, in which the reaction rate is practically constant at low enzyme activities remains, e.g. 15 ... 30 sec. It is necessary, however, that in order to evaluate the to enable the measurement to determine the substrate concentration, previously under Use of known different substrate concentrations determined in calibration curves is which speed values correspond to certain substrate concentrations.

Es ist allerdings auch möglich, ohne Zuhilfenahme von Eichkurven die Substratkonzentration zu bestimmen. Zu diesem Zweok werden von dem zu bestiumenden Substrat zwei Reaktion ansätze gemacht. Der zweite Ansatz unterscheidet sich vom ersten dadurch, daß zusätzlich noch eine definierte Menge des entsprechenden Substrats hinzugegeben ist. Diese insgesamt erhöhte Substratkonzentration im zweiten Ansatz ergibt eine erhöhte Reaktionsgeschwindigkeit. Die Differenz der beiden Reaktionsgeschwindigkeiten aus dem ersten und zweiten Ansatz entspricht also der Differenz der Substratkonzentrationen. Die Berechnung kann e-lltweder zeichnerisch erfolgen oder mit Hilfe eines Rechners, wobei dann die zu bestimmende Konzentration im Ansatz 1 ist dF/dt (1) c = dF/dt (2) - dF/dt (1) a (c = Konzentration Ansatzl;dF/dt (1), (2) = Reaktionsgeschwindigkeiten in den Ansätzen 1 und 2; a = Konzentrationsdifferenz in den beiden Ansätzen).However, it is also possible without the aid of calibration curves Determine substrate concentration. For this purpose are to be determined by the Substrate made two reaction approaches. The second approach is different from the first in that, in addition, a defined amount of the corresponding substrate is added. This overall increased substrate concentration in the second approach results in an increased reaction rate. The difference between the two reaction rates from the first and second So approach corresponds to the difference the substrate concentrations. The calculation can either be done graphically or with the help of a computer, then the concentration to be determined in the approach 1 is dF / dt (1) c = dF / dt (2) - dF / dt (1) a (c = concentration batch; dF / dt (1), (2) = reaction rates in runs 1 and 2; a = concentration difference in both approaches).

Innerhalb des für jedes Enzym charakteristischen Eonzentrationsbereichs K (kleiner als KM) ist es dann möglich, aus einer zu einem bestimmten Zeitpunkt tx gemessenen Reaktionsgeschwindigkeit vx die zum Zeitpunkt to vorliegende Substratkonzentration zu ermitteln.Within the concentration range characteristic of each enzyme K (smaller than KM) it is then possible from one at a certain point in time tx measured reaction rate vx the substrate concentration present at time to to investigate.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens muß allerdings berücksichtigt werden, daß der erwähnte funktionelle Zusammenhang zwischen der zum Reaktionsbeginn vorhandenen Substratkonzentration und der gemessenen Reaktionsgeschwindigkeit nur solange gilt, wie die während der Reaktion verbrauchte Substratmenge, bezogen auf die Gesamtmenge, vernachlässigbar gering ist. Es muß also nicht nur mit sehr geringen Enzymaktivitäten gearbe-itet werden, sondern auch möglichst bald nach Reaktionsbeginn die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt werden. Das aber sind Maßnahmen, die eine Anwendung der bisher allgemein üblichen Methode nicht zulassen, die darin besteht, die Konzentrationsänderung pro Zeiteinheit eines photometrisch oder auch fluorimetrisch kontinuierlich meßbaren Reaktionsparameters, wie z.B. reduziertes Nicotinamid-adenin-dinueleotid (NADH) festzustellen und daraus die Reaktionsgeschwindigkeit zu berechnen. Bei den jetzt in Betracht gezogenen geringen Substratkonzentrationen wären dann aber die zu messenden Extinktionsänderungen innerhalb kurzer Zeiträume derart gering, daß diese Meßmethode schon vom Prinzip her mit einem großen Fehler behaftet wäre.When carrying out the method according to the invention, however, must be taken into account that the mentioned functional relationship between the The substrate concentration present at the beginning of the reaction and the measured reaction rate only applies as long as the amount of substrate consumed during the reaction, based on on the total amount, is negligibly small. So it doesn't just have to be a lot low enzyme activities, but also as soon as possible after the start of the reaction the rate of reaction can be determined. But these are measures that are one thing Do not allow the use of the previously generally accepted method, which consists of the change in concentration per unit time of a photometric or fluorimetric continuously measurable reaction parameters, such as reduced nicotinamide adenine dinueleotide (NADH) to be determined and the reaction rate to be calculated from this. Both However, the low substrate concentrations now being considered would then be the changes in extinction to be measured within short periods of time are so small that this measuring method would already be afflicted with a great error in principle.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ferner zu beachten, daß mit dem Einmischen des Enzyms das Meßsignal flir etwa 5-8 Sekunden gestört wird, so daß der erste Meßwert frühestens nach 15 Sekunden abgelesen-werden sollte. Bei kontinuierlicher Registrierung (REG) ist der günstigste Meßzeitpunkt unmittelbar zu ersehen; bei digitaler Meßwerterfassung über einen Drucker (DR) darf mit der Messung erst dann begonnen werden, wenn sich das Signal dE/dt nicht mehr verändert. Bei den geringen Enzymaktivitäten ist die Differenz der Reaktionsgeschwindigkeiten nach z.B. 15 bis 25 Sekunden vernaohlässigbar gering; der Zeitpunkt der Meßwerterfassung darf also in diesem Bereich durchaus etwas variieren. Bezüglich der Enzymaktivität ist zu beachten, daß die Enzymaktivität einerseits so gering sein muss, daß die Reaktionsgeschwindigkeit während des Messzeitraums nahezu konstant bleibt. Je niedriger die Enzymaktivität, desto besser wird nämlioh diese Forderung erfüllt. Andererseits darf die Enzymaktivität nicht zu gering sein, da bei zu niedriger Enzymaktivität die Reaktionsgeschwindigkeit nicht mehr meßbar wird.When carrying out the method according to the invention is also to Note that when the enzyme is mixed in, the measurement signal lasts for about 5-8 seconds is disturbed, so that the first measured value can be read after 15 seconds at the earliest should. In the case of continuous registration (REG), this is the best time to measure to be seen immediately; in the case of digital data acquisition via a printer (DR) the measurement can only be started when the signal dE / dt is no longer present changes. In the case of the low enzyme activities, the difference in the reaction rates is negligibly small after e.g. 15 to 25 seconds; the time at which the measured value was recorded may therefore vary somewhat in this area. Regarding the enzyme activity it should be noted that the enzyme activity on the one hand must be so low that the Reaction speed remains almost constant during the measurement period. The lower the enzyme activity, the better this requirement is met. on the other hand the enzyme activity must not be too low, since the enzyme activity is too low the speed of the reaction can no longer be measured.

FUr die Durchfthrung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das mit der ablaufenden Reaktion sich ändernde Meßsignal (z.B.For carrying out the method according to the invention, this is done with measuring signal (e.g.

die NADH-Extinktion oder Fluoressenz) über ein RC-Glied und nachgesohaltetem Operationsverstärker fortlaufend differenziert, Weitere Ausgestaltungen und Vorteile der Erfindung werden im Zusammenhang mit den gezeigten Ausführungsbeispielen erörtert.the NADH extinction or fluoro essence) via an RC element and subsequent Operational amplifiers continuously differentiated, further features and advantages of the invention are discussed in connection with the exemplary embodiments shown.

Es zeigen: Fig. 1: Zusammenhang zwischen Substratkonzentration und Reaktion geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen Fig. 2a.' Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Fig.2b: Sohaltbild der -Differnzierstufe mit Dämpfungsglied Fig. 3: Registrierung der Differentialfunktion dE/dt Die Spannungsangaben auf der Ordinaten entspreohen den Meßwerten dE/dt Fig. 4: Zusammenhang zwischen der Gluoosekonzentration zum Zeitpunkt to (= Reaktionsbeginn) und der enzymatischen Reaktionsgeschwindigkeit dE/dt bei Glucosekonzentrationen zwischen 2 . 10-6 und 16 . 10'6 M mit M = Mol/LiterJ Fig. 5: Wie Fig. 4, jedoch bei Glucosekonzentrationen bis 80 . 10'6 M Die erfindungsgemäße Anordnung nach Fig. 2a zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht zunächst aus' einem Photometer oder Fluorimeter (PH), dem wahlweise ein log/lin-Wandler nachgeordnet ist, da in den meisten Fällen die Ausgangsspannungen von Photometern bzw. Fluorimetern sich logarithmisch zur Meßgröße verändern.They show: FIG. 1: Relationship between substrate concentration and Reaction rate of enzymatic reactions Fig. 2a. ' Arrangement for implementation of the method according to the invention Fig.2b: Sohaltbild the -Differzierstufe with attenuator Fig. 3: Registration of the differential function dE / dt The voltage information on the Ordinates correspond to the measured values dE / dt Fig. 4: Relationship between the glucose concentration at time to (= start of reaction) and the enzymatic Reaction rate dE / dt at glucose concentrations between 2. 10-6 and 16. 10'6 M with M = mol / liter J Fig. 5: As Fig. 4, but with glucose concentrations up to 80. 10'6 M The arrangement according to the invention according to FIG. 2a for carrying out the The method according to the invention initially consists of 'a photometer or fluorimeter (PH), which can optionally be followed by a log / lin converter, as in most cases the output voltages of photometers or fluorimeters are logarithmic to Change the measured variable.

Dieses linearisierte Signal wird dann (Fig. 2b) zunächst auf ein Dämpfungsglied gegeben (RC-Glied aus 2.7 kOhm und 100 µF, entsprechend einer Zeitkonstanten von ca. 0,3 seo), um hochfrequente Störungen dem nachfolgenden Differenzierglied fernzuhalten. Das nachgeschaltete Differenzierglied besteht hier ebenfalls aus einem RC-Glied, wobei über einen Widerstand R = 10 ... 60 kOhm der Bipolar-Kondensator C = 5 µF/70 V (10F/35 V + 10 µF/35 V, hintereinandergeschaltet) aufgeladen wird. Der Ladestrom ergibt über den Widerstand R einen Spannungsabfall, der dem Operationsverstärker zugeführt wird. Solange die Kapazität des Kondensators C nicht ausgenutzt wird (was hier damit erreicht wird, daß man etwa eine Größenordnung unterhalb der angegebenen Nennspannung bleibt), ist zwischen der Ladung Q und der Potentialdifferenz zweier Kondensatorplatten ein linearer Zusammenhang. (Im Nennspannungsbereich könnte es nämlioh schon zu Eigenentladungen des Kondensators kommen, die sich hier unangenehm bemerkbar maohen wUrden.) Die Linearität dieser Anordnung ist mit simulierten "inzymreaktionen" aus einem Funktionsgenerator überprüft worden. Hier wurde dessen Ausgangsspannung gleichförmig als Funktion der Zeit verändert; die Spannungsänderung pro Zeit ( = du/dt) ist dann konstant.This linearized signal is then (Fig. 2b) first to an attenuator given (RC element from 2.7 kOhm and 100 µF, corresponding to a time constant of 0.3 seo) to keep high-frequency interference away from the following differentiator. The downstream differentiating element here also consists of an RC element, where the bipolar capacitor C = 5 µF / 70 via a resistor R = 10 ... 60 kOhm V (10F / 35 V + 10 µF / 35 V, connected in series) is charged. The charging current results in a voltage drop across the resistor R, which the operational amplifier is fed. As long as the capacitance of the capacitor C is not used (which what is achieved here is that one is about an order of magnitude below the specified Nominal voltage remains), is between the charge Q and the potential difference of two Capacitor plates a linear relationship. (In the nominal voltage range it could Namlioh already come to self-discharges of the capacitor, which are uncomfortable here noticeably mauhen.) The linearity of this arrangement is with simulated "inzyme reactions" has been checked from a function generator. Here is its output voltage changed uniformly as a function of time; the voltage change per time (= du / dt) is then constant.

Die angegebene Sohaltung eignet sich daher als Differenzierstufe. Das Differentialsignal dE/dt kann dann entweder digitalisiert und im Drucker DR ausgedruckt oder in REG registriert werden.The specified position is therefore suitable as a differentiation level. The differential signal dE / dt can then either be digitized and stored in the printer DR printed out or registered in REG.

Der auf diese Weise zu definierten Zeitpunkten nach Reaktionsbeginn ermittelte Differentialquotient dE/dt entspricht der zum Zeitpunkt to (= Reaktionsbeginn) bestehenden Substratkonzentration.In this way at defined times after the start of the reaction The determined differential quotient dE / dt corresponds to that at time to (= start of reaction) existing substrate concentration.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist nur dann durchführbar, wenn die Reaktionsgesohwindigkeit e i n e 5 Enzyms gemessen wird. Bei der Bestimmung von z,B. Milchsäure genügt auch ein Enzym, da Milchsäure + NAD Brenztraubensäure + NADH.The method according to the invention can only be carried out if the reaction rate of an enzyme is measured. When determining e.g. Lactic acid also suffices as an enzyme, since lactic acid + NAD Pyruvic acid + NADH.

Das Verfahren ist aber auch in denjenigen Fällen anwendbar, bei denen, wie z.B. bei der Glucosebestimmung z w e i Enzyme eingesetzt werden mttssen.However, the procedure can also be used in those cases in which e.g. two enzymes have to be used for the determination of glucose.

Es wird daher als AusftShrungsbeispiel das erfindungsgemäße Verfahren an einer Gluoosebestlmmung mit den Enzymen Hexokinase (HK) und GluGose-6-Phosphat-Debydrogenase (G-6-PDH) dargestellt. Gerade diese Substratbestimmung, bei der die einzelnen Reaktionsgeschwindigkeiten von zwei an der Reaktion beteiligten Enzymen die Gesamtreaktionsgeschwindigkeit ergeben, zeigt, daß es möglich ist, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch derartige Bestimmungen durchzuführen. Um die aus den beiden Reaktionsgeschwindigkeiten zwangsläufig resultierenden Überlagerungen zu vermeiden, wird die absolute Aktivität der G-6-PDH im Enzymgemisoh etwa 25 x so hoch wie die der HK gewählt. Bei einem KM der G-6-PDH für deren Substrat G-6-P von oa. 5 . 10-5 M gegenüber 10 . 10-5 M der HK flir Gluoose ist somit erst einmal sichergestellt, daß die Reaktion über die HK gesohwindigkeitsbestimmend ist und vor allem keine störende Endprodukthemmung an der 11K erfolgt.The method according to the invention is therefore used as an exemplary embodiment in a gluose determination with the enzymes hexokinase (HK) and GluGose-6-phosphate debydrogenase (G-6-PDH). Precisely this substrate determination, in which the individual reaction rates of two enzymes involved in the reaction, the overall reaction rate shows that it is possible to use the method according to the invention as well To carry out determinations. Inevitably from the two reaction speeds To avoid resulting overlaps, the absolute activity of G-6-PDH becomes in the enzyme mixture about 25 times as high as that of the HK. With a KM the G-6-PDH for their substrate G-6-P from oa. 5. 10-5 sts against 10. 10-5 M of HK for Gluoose it is thus first ensured that the reaction is speed-determining via the HK and, above all, there is no disruptive end product inhibition on the 11K.

Die beiden Cosubstrate ATP und NADP sind jeweils- im tberschuß vorhanden. Das über die HI( gebildete G-6-P wird sofort unter Bildung von NADPH oxydiert, so daß die Zunå-hme des fluorimetrisch oder photometrisch gemessenen NADPH pro Zeiteinheit die tatsächliche Reaktionsgeschwindig-Zeit an der HK widerspiegelt.The two cosubstrates ATP and NADP are each present in excess. The G-6-P formed via the HI (is immediately oxidized with the formation of NADPH, see above that the increase of the fluorimetrically or photometrically measured NADPH per unit of time reflects the actual reaction rate time at the HD.

Reaktionsablauf Glucose + ATP G-6-P + ADP G-6-P + NADP 6-P-Glusonolacton + NADPH ATP: Adenosintriphosphat; ADP: Adenosindiphosphat; NADP/NADPH: Nicotinamidadenin-dinukleotid-Phosphat, oxydiertlreduziert; G-6-P: Glusose-6-Phosphat) Kontinuierlich registrieren läßt sich hier die NADPH-Fluoreszenz. (Gegenüber der photometrischen Bestimmung von NADPH ist die fluorimetrische Bestimmung etwa zwei Größenordnungen empfindlicher und daher für diese Fragestellung besonders geeignet). Die Anregung erfolgt bei 366 nm, die Emissionsaufnahme über ein Kantenfilter > 400 nm. Der Differentialquotient wird - wie schon erläutert - über einen Operationsverstärker gebildet und analog registriert.Glucose + ATP reaction sequence G-6-P + ADP G-6-P + NADP 6-P-glusonolactone + NADPH ATP: adenosine triphosphate; ADP: adenosine diphosphate; NADP / NADPH: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, oxidized / reduced; G-6-P: Glusose-6-Phosphate) The NADPH fluorescence can be continuously registered here. (Compared to the photometric determination of NADPH, the fluorimetric determination is about two orders of magnitude more sensitive and therefore particularly suitable for this question). The excitation takes place at 366 nm, the emission pick-up via an edge filter> 400 nm. The differential quotient is - as already explained - generated via an operational amplifier and registered analogously.

Reagenzien: I Puffer (20 mM Triäthanolamin, 20 mM KOl, 10 mM MgC12; pH 8.2) II ATP (80 mg/ml) III NADP (20 mg/ml) IV Glucose p.a. (MERCK), 10 mM V Enzymgemisch: 0.01 ml HK (140 U/ml; Boehringer) + 0.1 ml G-6-PDH (350 U/ml; Boehringer) + 0.4 ml bidestilliertes Wasser 0,01 ml des Enzymgemisches (V) ergeben folgende Aktivitäten: HK: 0.028 U; G-6-PDH: 0.7 U; jeweils bei 250C und Substratsättigung. Hierbei ist die Einheit 1 U diejenige Aktivität, die in einer Minute bei 2500 und Substratsättigung .-6 Mol des Substrats umsetzt.Reagents: I buffer (20 mM triethanolamine, 20 mM KOl, 10 mM MgCl2; pH 8.2) II ATP (80 mg / ml) III NADP (20 mg / ml) IV glucose p.a. (MERCK), 10 mM V enzyme mixture: 0.01 ml HK (140 U / ml; Boehringer) + 0.1 ml G-6-PDH (350 U / ml; Boehringer) + 0.4 ml of double-distilled water 0.01 ml of the enzyme mixture (V) results in the following activities: HK: 0.028 U; G-6-PDH: 0.7 U; each at 250C and substrate saturation. Here is the unit 1 U is the activity that occurs in one minute at 2500 and substrate saturation .-6 moles of the substrate converts.

Reaktionsansatz: Vor Versuchsbeginn werden zusammengegeben: 100 ml (I), 1 ml (II), 1 ml (III) und auf 25 °C temperiert.Reaction mixture: Before the start of the experiment, combine: 100 ml (I), 1 ml (II), 1 ml (III) and heated to 25 ° C.

2.5 ml dieser Lösung werden in eine 1 cm-Küvette gegeben und in den ebenfalls temperierten Küvettenhalter des Meßgerätes (PH) eingesetzt. Dann werden 0.01 ... 0.05 ml der zu untersuchenden Probe (hier: Lösung IV) eingemischt und die Reaktion zum Zeitpunkt to mit 0.01 mol Enzymgemisch gestartet.2.5 ml of this solution are placed in a 1 cm cuvette and poured into the also temperature-controlled cuvette holder of the measuring device (PH) used. Then will 0.01 ... 0.05 ml of the sample to be examined (here: solution IV) is mixed in and the Reaction started at time to with 0.01 mol of enzyme mixture.

In der Fig. 3 ist die Registrierung des Differentialquotienten wiedergegeben, und zwar z.B. bei Clucoseendkonzentrationen in der Küvette von 4 10 M (molar) <1 M entspricht 1 Mol/ 1000 ml; 10 -7 Mol/2.5 ml sind demnach 4 10 5 M).In Fig. 3 the registration of the differential quotient is shown, For example, with final clucose concentrations in the cuvette of 4 10 M (molar) <1 M corresponds to 1 mol / 1000 ml; 10 -7 mol / 2.5 ml are therefore 4 10 5 M).

Die Reaktion beginnt nicht unmittelbar bei to, sondern setzt einige Sekunden später ein. Es kommt hier nämlich zu molekularen Reaktionen, die vor der eigentlichen Umsatzreaktion ablaufen (Relaxationszeiten enzymatischer Reaktionen).The reaction does not start immediately with to, but continues some Seconds later. Molecular reactions occur here that precede the actual turnover reaction take place (relaxation times of enzymatic reactions).

Durchaus mögliche, von außen kommende elektrische Störungen, die i n den Zeitpunkt der Messung fallen, können bei der kontinuierliohen Messung (Registrierung) erkannt und eliminiert werden. Störungen, die außerhalb des Meßzeitpunktes liegen, haben bei dieser Methode keinen Einfluß auf das Meßergebnis.Quite possible electrical disturbances coming from outside that i n fall at the time of the measurement, with continuous measurement (registration) recognized and eliminated. Disturbances that lie outside of the measurement time, have no influence on the measurement result with this method.

In den Fig. 4 und Fig. 5 ist in Eichkurven der Zusammenhang zwischen der Glucosekonzentration zum Zeitpunkt t0 und der Reaktionsgesohwindigkeit dE/dt dargestellt. Die Linearität dieser Eichkurven ist bis zu einer Glucosekonzentration von 8 . 10 -5 M ermittelt worden (bei einem KM für HK/Glueose von 10 . 1O5M). Allerdings sind bei der Ermittlung der Werte für die beiden Geraden unterschiedliche Enzymmengen benutzt worden, da in dem Bereich der niedrigen Substratkonzentrationen (Fig. 4) bei geringen Enzymmengen die Reaktionsgeschwindigkeit schwer meßbar wird. Die beiden Geraden dürfen also nicht unmittelbar miteinander verglichen werden.In FIGS. 4 and 5, the relationship between the glucose concentration at time t0 and the reaction rate dE / dt shown. The linearity of these calibration curves is up to a glucose concentration from 8. 10 -5 M have been determined (with a KM for HK / Glueose of 10. 10 5M). However are different amounts of enzyme when determining the values for the two straight lines has been used because in the range of low substrate concentrations (Fig. 4) with small amounts of enzyme, the reaction rate is difficult to measure. The two Straight lines must therefore not be compared directly with one another.

Unter Benutzung dieser Eichkurven oder der erwähnten Doppelbestimmungen mit einer zusätzlichen definierten Substratmenge kann aufgrund des durch das erfindungsgemäße Verfahren jeweils ermittelten Spannungswertes sofort die entsprechende Glucosekonzentration angegeben werden.Using these calibration curves or the duplicate determinations mentioned with an additional defined amount of substrate can due to the inventive Method determined voltage value immediately the corresponding glucose concentration can be specified.

Ebenso kann verfahren werden bei der ermittlung der Konsentrationen von z.B. Blutalkohol, Milchsäure, Brenztraubensäure.The same procedure can be used to determine the consentrations e.g. blood alcohol, lactic acid, pyruvic acid.

Claims

t method for the enzymatic determination of the concentration of substrates, in particular metabolic metabolites, e.g.

of blood glucose, characterized in that at one with the mixing an enzyme e.g. hexokinase + glucose-6-phosphate dehydrogenase in one reaction mixture beginning enzyme reaction which characterizes the respective substrate concentration Reaction rate (dE / dt) of this enzyme reaction is measured, but only after the disturbance resulting from the mixing in of the enzyme has subsided, but afterwards only within a time range in which the reaction rate at low Enzyme activities remain practically constant, e.g. B.

15 ... 30 sec.

2. The method according to claim 1, characterized in that before measuring the rate of enzyme reaction using known various Substrate concentrations in calibration curves are used to determine which speed values correspond to certain substrate concentrations.

3. The method according to claim 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t that two reactions were made from the substrate to be determined are, then the second reaction batch but still a defined amount of to determining substrate and in both cases the reaction rate what is measured is the concentration (C) of the substrate to be determined the formula C = dF / dt (i) dF / dt (2) - dF / dt (1) results, where dF / dt (1) or (2) are the reaction rates in batches 1 and 2 and a is the concentration difference is in the two approaches.

4. Arrangement for carrying out the method according to claim 1, characterized in that for converting one of a photometer or fluorimeter incoming measurement signal in a differential function an RC element with an operational amplifier is provided, an analog / digital converter for digitizing the differential quotient is downstream.

5. Arrangement according to claim 4, d a d u r c h ge k e n n z e i c h n e t that the capacitor of the differentiating element is designed so that the on The nominal voltage given to him is about an order of magnitude higher than the voltage of the incoming Measuring signal lies.

L e r s e i t e