DE2402414A1 - METHOD FOR DETERMINING THE RELEASE OF PROTEIN-BUNDED BILIRUBIN - Google Patents
METHOD FOR DETERMINING THE RELEASE OF PROTEIN-BUNDED BILIRUBINInfo
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Description
Dr.lng, A.Yfind teAtmi Lederer 1 8, Jan. 1974Dr.lng, A.Yfind teAtmi Lederer 1 8, Jan. 1974
PATEN'ANWÄLTf i PATEN'ANWÄLTf i ..
RAN 4090/55RAN 4090/55
F. Hofl&nann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/SchweizF. Hofl & nann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel / Switzerland
Verfahren zur Bestimmung der Freisetzung von •proteingebundenem. BilirubinMethod for determining the release of protein-bound. Bilirubin
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit chemischer Mittel zur Freisetzung von Bilirubin und ein Verfahren zur Bestimmung des Verhältnisses von Bilirubin zu Protein in einer Plasmaprobe.The present invention relates to a method for determining the ability of chemical agents to be released of bilirubin and a method for determining the ratio of bilirubin to protein in a plasma sample.
Es ist bekannt, dass Bilirubin durch Plasmaproteine fest gebunden wird. Das Verhältnis von Bilirubin zu Protein ist von der Affinität zwischen dem Bilirubin und den Plasmaproteinen, der Anzahl an Bindungsgruppen in den Proteinmolekülen, der.Konzentration des Bilirubins und der Anwesenheit von Substanzen, welche die Bindung von Bilirubin an eine Bindungsgruppe des Proteins kompetitiv hemmen, abhängig. Weiter ist bekannt, dass verschiedene chemische Mittel, insbesonders Arzneimittel, Bilirubin aus Plasmaproteinen freisetzen, wobei das freie Bilirubin in den Blutstrom geht. Die Fähigkeit dieser chemischen Mittel zur Freisetzung von 409 830/103 5 It is known that bilirubin is tightly bound by plasma proteins. The ratio of bilirubin to protein depends on the affinity between the bilirubin and the plasma proteins, the number of binding groups in the protein molecules, the concentration of the bilirubin and the presence of substances which competitively inhibit the binding of bilirubin to a binding group of the protein . It is also known that various chemical agents, especially drugs, release bilirubin from plasma proteins, with the free bilirubin going into the bloodstream. The ability of these chemical agents in the release of 409 830/103 5
Hen/20.11.1973Hen / 11/20/1973
Bilirubin ist jedoch unterschiedlich.However, bilirubin is different.
Grössere Mengen an Bilirubin im Blutstrom verursachen eine Krankheit namens Hyperbilirubinemia, welche hauptsächlich bei Frühgeburten und bei zur normalen Zeit geborenen Kindernvorkommt. Die Freisetzung des Bilirubins kann eine Hirnkrankheit namens Kernicterus hervorrufen. Da Kinder oft mit Arzneimittel behandelt werden müssen, besteht ein Bedürfnis an einem schnellen Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit der einzelnen chemischen Mittel Bilirubin freizusetzen. Auf diese Weise kann das für die Behandlung geeignete Arzneimittel ausgewählt werden. Ferner ist es wünschenswert, bei jedem einzelnen Patient die zusätzliche Fähigkeit der Bindung von Bilirubin an die Plasmaproteinen untersuchen zu können, damit die Behandlung mit Arzneimitteln in besserer Sachkenntnis und ohne eine Freisetzung von gefährlichen Mengen an Bilirubin in den Blutstrom erfolgt.Excessive amounts of bilirubin in the bloodstream cause a disease called hyperbilirubinemia, which is mainly occurs in premature births and in children born at normal times. The release of bilirubin can be a Cause brain disease called kernicterus. Because children often need to be treated with drugs, there is a need for a rapid method of determining the Ability of each chemical agent to release bilirubin. That way, that can be used for treatment appropriate drugs are selected. It is also desirable for each individual patient to have the additional ability to study the binding of bilirubin to the plasma proteins, so that the treatment with drugs in better Expertise and without a release of dangerous amounts of bilirubin into the bloodstream.
Brfindungsgemäss werden Methoden entwickelt, welche den oben erwähnten Bedürfnissen Rechnung tragen.According to the invention, methods are developed which take account of the above-mentioned needs.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der relativen Fähigkeit chemischer Mittel zur Freisetzung von Bilirubin, welches an ein Protein gebunden ist. Dieses Verfahren ist gekennzeichnet durch:More specifically, the present invention relates to a method for determining the relative ability of chemicals Means for releasing bilirubin bound to a protein. This procedure is characterized by:
' (a) Messung des Absorptionsmaximums von Bilirubin, welches an ein Protein gebunden ist, und/oder von freiem Bilirubin in einer Plasmaprobe, die Bilirubin und Protein in einem bestimmten bekannten Mengenverhältnis enthält,'(a) Measurement of the absorption maximum of bilirubin, which is bound to a protein and / or from free bilirubin in a plasma sample that contains bilirubin and protein in contains a certain known quantity ratio,
(b) Zusatz verschiedener bekannter Mengen an jedem chemischen Mittel zu unter (a) beschriebenen Plasmaproben
aliquoter Grosse und Verdünnung,
409830/1035 (b) addition of various known amounts of each chemical agent to plasma samples described under (a) aliquot size and dilution,
409830/1035
(c) Messung der Abnahme des Absorptionsmaximums von Bilirubin, welches an das Protein gebunden ist und/oder der Zunahme des Absorptionsmaximums vom freien Bilirubin nach jedem dieser Zusätze,(c) Measurement of the decrease in the absorption maximum of bilirubin bound to the protein and / or the Increase in the absorption maximum of free bilirubin after each of these additions,
(d) Auftragen des Kehrwertes der im Schritt (c) gemessenen Zu- oder Abnahme des Absorptionsmaximums gegen den Kehrwert der molaren Konzentration für jedes chemische Mittel, oder Auftragen der in Schritt (c) gemessenen Zu- oder Abnahme des Absorptionsmaximums gegen die molare Konzentration für jedes chemische Mittel und(d) Plotting the reciprocal value of the increase or decrease in the absorption maximum measured in step (c) against the reciprocal value the molar concentration for each chemical agent, or plotting the increase or decrease in the measured in step (c) Absorption maximum versus molar concentration for each chemical agent and
(e) Vergleich der für jedes chemische Mittel erhaltenen Kurven.(e) Comparison of the curves obtained for each chemical agent.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Verhältnisses von Bilirubin zu Protein in einer Plasmaprobe, dadurch gekennzeichnet, dass manThe present invention also relates to a method for determining the ratio of bilirubin to protein in a plasma sample, characterized in that one
(a1) jeder Probe einer Reihe von Plasmaproben aliquoter Grosse und Verdünnungen und mit verschiedenen Verhältnissen von Bilirubin zu Protein, eine bestimmte Menge eines freisetzenden Mittels, welches die Bindung von Bilirubin an das Plasmaprotein kompetitiv hemmt, zusetzt;(a 1 ) adding a certain amount of a releasing agent which competitively inhibits the binding of bilirubin to plasma protein to each sample of a series of plasma samples aliquots in sizes and dilutions and having various ratios of bilirubin to protein;
(b1) die Abnahme des Absorptionsmaximums von Bilirubin, welches an das Protein gebunden ist und/oder die Zunahme des Absorptionsmaximums von freiem Bilirubin nach jedem dieser Zusätze misst;(b 1 ) measures the decrease in the absorption maximum of bilirubin bound to the protein and / or the increase in absorption maximum of free bilirubin after each of these additions;
(c1) zum Etablieren einer Vergleichskala, die in Schritt (W) gemessene Zu- oder Abnahme des Absorptionsmaximums gegen das Verhältnis von Bilirubin zu Protein für jedes zugefügte chemische Mittel aufträgt;(c 1 ) to establish a comparison scale plotting the increase or decrease in the absorption maximum measured in step (W) versus the ratio of bilirubin to protein for each chemical agent added;
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(d1) der zu untersuchenden Plasnaprobe gleicher Grosse und Verdünnung wie in Schritt (a1) die gleiche bestimmte Menge an freisetzendem Mittel wie in Schritt (ai) zugibt, und die entsprechende Abnahme des Absorptionsmaximums von Bilirubin, welches an das Protein gebunden ist und/oder die Zunahme des Absorptionsmaxiiaums von freiem Bilirubin, misst; und(d 1 ) the plasma sample to be examined of the same size and dilution as in step (a 1 ) adds the same specific amount of releasing agent as in step (ai), and the corresponding decrease in the absorption maximum of bilirubin which is bound to the protein and / or the increase in the absorption maximum of free bilirubin; and
(eO das Verhältnis von Bilirubin zu Protein in der zu untersuchenden Probe durch Vergleich der in Schritt (d1) gemessenen Zu- oder Abnahme des Absorptionsmaximums mit der in Schritt (c1) etablierten Vergleiehsskala, bestimmt.(eO the ratio of bilirubin to protein in the sample to be examined is determined by comparing the increase or decrease in the absorption maximum measured in step (d 1 ) with the comparison scale established in step (c 1).
Die erfindungsgemässen Verfahren basieren auf der Feststellung, dass Bilirubin, welches an ein Protein gebunden ist, ein Absorptionsspektrum mit einem Maximum zwischen 455-460 nm aufweist, während für freies Bilirubin das Maximum zwischen 420-440 nm liegt. Diese Verschiebung der Wellenlänge des Absorptionsmaximums wird durch die Freisetzung von Bilirubin, welches an das Plasmaprotein gebunden ist, verursacht.The inventive method are based on the finding that bilirubin, which is bound to a protein has an absorption spectrum with a maximum between 455-460 nm, while for free bilirubin the maximum lies between 420-440 nm. This shift in the wavelength of the absorption maximum is caused by the release of bilirubin, which is bound to the plasma protein.
Obwohl in der vorliegenden Besehreibung für das Bilirubin, welches an ein Protein gebunden ist, und für das freie Bilirubin jeweils ausschliesslich ein Absorptionsmaximum zwischen 455-460 nm und ein Absorptionsmaximum zwischen 420-440 nm aufgeführt wird, ist zu bemerken, dass diese Werte der Zimmertemperatur und einem pH-Wert von 7 bis 8, in der Regel 7,45, entsprechen und durch Aenderungen der Temperatur und/oder des pH-Wertes in einem bestimmten Ausmass variieren können.Although in the present description for the bilirubin, which is bound to a protein, and for the free bilirubin only an absorption maximum between 455-460 nm and an absorption maximum between 420-440 nm is listed, it should be noted that these values correspond to the room temperature and a pH of 7 to 8, usually 7.45, and by changes in temperature and / or temperature pH value can vary to a certain extent.
Erfindungsgemäss können auch kleine Aenderungen in der Freisetzung von Bilirubin, welches an ein Protein gebunden ist, durch differentielle Spektrometrie nit grosser Genauigkeit gemessen werden.According to the invention, small changes in the release of bilirubin, which is bound to a protein, can also be made can be measured with great accuracy by differential spectrometry.
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Es -wird angenommen, dass ein Molekül' Plasmaprotein (Albumin) höchstens zwei Bindungsgruppen für Bilirubin besitzt. Aus diesem CJrund werden die Bindungsgrappen gesättigt, wenn das Verhältnis von Bilirubin zu Albumin sich 2.0 nähert. In der Folge ergibt der Zusatz eines freisetzenden Kittels, welches die Bindung von Bilirubin rsit den Albumin kompetitiv hemmt, im Falle wo das Verhältnis von Bilirubin zu Albumin hoch ist, eine grössere Freisetzung als im Falle, wo dieses Verhältnis niedrig ist. Die Anzahl der freien Bindungsgruppen, welche das Protein besitzt - meistens als Verhältnis von Bilirubin zu Protein ausgedrückt — wird oft in der Fachsprache als zusätzliche Bindungsfähigkext bezeichnet. Die Höhe der Freisetzung, welche durch ein bestimmtes freisetzendes Mittel, z.B. ein Arzneimittel, verursacht wird, hängt sowohl von der Freisetzungsfähigkeit des einzelnen Mittels, als auch von der zusätzlichen Bindungsfähigkext des Plasmaproteins eines bestimmten Patienten ab.It - is believed to be a molecule 'plasma protein (Albumin) has at most two binding groups for bilirubin. For this reason the binding groups are saturated, when the ratio of bilirubin to albumin is 2.0 approaching. Subsequently, the addition of a releasing gasket results in the binding of bilirubin with the albumin competitively inhibits, in the case where the ratio of bilirubin to albumin is high, a greater release than in the case where this ratio is low. The number of free Binding groups that the protein possesses - mostly as Expressed ratio of bilirubin to protein - is often referred to in technical jargon as additional binding text. The amount of release caused by a particular releasing agent Agent, e.g. a drug, is caused depends both on the releasability of the individual By means of, as well as from the additional binding capacity of the plasma protein of a certain patient.
Um die relative Fähigkeit eines bestimmten chemischen Mittels zur Freisetzung von Bilirubin zu bestimmen, wird erfindungsgemäss wie folgt verfahren; Zu Plasmaproben mit einem bekannten Gehalt an Protein (Albumin) werden verschiedene bekannte Mengen an Bilirubin zugegeben. Anschliessend wird die Absorption der erhaltenen Proben, welche Bilirubin und Albumin in einem bekannten molaren Verhältnis enthalten, gemessen. Das Bilirubin, welches an das Protein gebunden ist, wird durch ein Absorptionsmaximum zwischen 455-460 nm festgestellt, während das freie Bilirubin durch ein Absorptionsmaximum zwischen 420-440 nm angezeigt wird. Diesen Proben werden bekannte Mengen an verschiedenen chemischen Mitteln, wie z.B. Arzneimittel zugegeben und die Absorption wird erneut gemessen. Die Abnahme des Absorptionsmaximuns in dem Bereich von 455—460 nm oder die Zunahme des Absorptionsaaxinuns in dem Bereich von 420-440 nm ist direkt von dem freigesetzen Bilirubin 409830/1035To the relative ability of a given chemical To determine means for the release of bilirubin, the procedure according to the invention is as follows; To plasma samples with Various known amounts of bilirubin are added to a known content of protein (albumin). Then the Absorbance of the obtained samples, which contain bilirubin and albumin in a known molar ratio, was measured. The bilirubin, which is bound to the protein, is determined by an absorption maximum between 455-460 nm, while the free bilirubin is indicated by an absorption maximum between 420-440 nm. These samples are known Amounts of various chemical agents, such as drugs, are added and the absorption is renewed measured. The decrease in the absorption maximum in the area of 455-460 nm, or the increase in the absorption axis in that Range of 420-440 nm is directly related to the released bilirubin 409830/1035
abhängig. Bie absolute Abnahme des Absorptionsmaxiimims (ΔΑ) bei 455-460 im oder die absolute Zunahme des Absorptionsmaximums bei 420-440 nm kann gegen die molare Konzentration für jedes chemische Mittel aufgetragen werden, wobei eine Gerade erhalten wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird jedoch der Kehrwert der Zu- oder Abnahme des Absorptionsmaximums gegen den Kehrwert der molaren Konzentration für jedes chemische Kittel aufgetragen. Im letzteren Fall entsprechen die Geraden mit dem kleinsten Neigungswinkel den Mitteln, welche eine hohe Freisetzungsfähigkeit besitzen und umgekehrt.addicted. When the absolute decrease in the absorption maximum (ΔΑ) at 455-460 im or the absolute increase in the absorption maximum at 420-440 nm can be plotted against the molar concentration for each chemical agent, obtaining a straight line will. In a preferred embodiment, however, the reciprocal of the increase or decrease in the absorption maximum is counteracted plotted the reciprocal of the molar concentration for each chemical coat. In the latter case, the straight lines correspond with the smallest angle of inclination means that a high Have releasability and vice versa.
Durch Terwendung von differentieller Spektrometrie können genauere Ergebnisse erhalten werden. In diesem Fall wird ein Spektrometer mit Doppelstrahlung verwendet, die Absorption der ursprünglichen Probe vor Zugabe eines freisetzenden Kittels mit derjenigen der Probe nach Zugabe dieses Mittels verglichen und der Unterschied der Absorptionsmaxima in den erwähnten Absorptionsbereichen direkt gemessen. Im Vergleich zu der erst geschilderten Methode können Aenderungen der Absorptionsnaxima, welche durch Zugabe von viel kleineren Mengen an freisetzendem Kittel, z.B. 100 bis 1000 Mal weniger verursacht werden, mit grosser Genauigkeit gemessen werden.Using differential spectrometry you can more accurate results can be obtained. In this case a spectrometer with double radiation is used, the absorption the original sample before adding a releasing agent with that of the sample after adding this agent compared and the difference in absorption maxima in the mentioned absorption ranges measured directly. In comparison to the method just described, changes in the Absorption maxima, which by adding much smaller Quantities of released gown, e.g. 100 to 1000 times less, can be measured with great accuracy.
Einer der Vorteile des erfindungsgemässen Verfahrens Ist, dass die durch ein freisetzendes Mittel verursachte Freisetzung des Bilirubins bei Plasmaproben mit einem Verhältnis von Bilirubin zu Protein - sowohl über als auch unterhalb 1.0 mit Genauigkeit gemessen werden kann. In bekannten Methoden, z.B. die Methode der Filtration mit Sephadex G25 [J.Am.Chem. Soc. 71, 1230 (1949)], konnte die Freisetzung des Bilirubins nur bei Verhältnissen von Bilirubin zu Protein unterhalb 1.0 gemessen werden. Desentsprechend hat die erfindungsgemässe Methode den Vorteil, dass sie ohne Rücksicht auf das Verhältnis von Bilirubin zu Protein direkt zur Untersuchung 409830/1035One of the advantages of the method according to the invention is that the release of bilirubin caused by a releasing agent can be measured with accuracy in plasma samples with a ratio of bilirubin to protein - both above and below 1.0. In known methods, for example the method of filtration with Sephadex G25 [J.Am.Chem. Soc. 71, 1230 (1949)], the release of bilirubin could only be measured at ratios of bilirubin to protein below 1.0. Accordingly, the method according to the invention has the advantage that it can be used directly for the analysis 409830/1035, regardless of the ratio of bilirubin to protein
des Plasmas eines Patienten verwendet werden kann. Bas in der erfindungsgemässen Methode angewendete Prinzip kann zur schnellen Bestimmung der zusätzlichen Bindungsfähigkeit des Plasmas .Verwendung finden. In dieser Bestimmung benutzt man eine Reihe von Plasmaproben mit bekannten Verhältnissen von Bilirubin zu Protein und ein freisetzendes Mittel, welches die Bindung von Bilirubin mit dem entsprechenden Protein koapetitiv hemmt. Als freisetzendes Mittel eignet sich besonders ITatriumsalicylat. Auf diese Weise kann eine Skala etabliert werden, die Aenderungen der Absorptionsmaxima, welche durch die Zusätze von bestimmten Mengen von als Standard verwendeten freisetzendes Mitteln verursacht werden, gegen das Verhältnis von Bilirubin zu Protein (zusätzliche Bindungsfähigkeit) widergibt. Anschliessend können die gemessenen Aenderungen der Absorptionsmaxima, welche durch den Zusatz des als Standard verwendeten freisetzenden Mittels in irgendeiner Plasmaprobe verursacht werden, mit der oben erwähnten Skala verglichen und das Verhältnis von Bilirubin zu Protein (zusätzliche Bindungsfähigkeit) direkt durch Interpolation bestimmt werden. Der Vorteil einer derartigen Methode zur Bestimmung der zusätzlichen Bindungsfähigkeit eines Plasmas liegt darin, dass sie eine direkte Messung der zusätzlichen Bindungsfähigkeit ermöglicht und nicht die mit den bekannten indirekten Methoden verbundenen Fehler und Komplikationen aufweist.of a patient's plasma can be used. Bas in the principle applied according to the invention can be used for rapid Determination of the additional binding capacity of the plasma. Find use. A series is used in this determination of plasma samples with known ratios of bilirubin to protein and a releasing agent that prevents binding of bilirubin with the corresponding protein coapetitively inhibits. Sodium salicylate is particularly suitable as a releasing agent. In this way a scale can be established that shows the changes in the absorption maxima caused by the additives caused by certain amounts of releasing agent used as a standard versus the ratio of Bilirubin to protein (additional binding ability) reflects. Then the measured changes in the absorption maxima, caused by the addition of the release agent used as the standard in any plasma sample are compared with the above mentioned scale and the ratio of bilirubin to protein (additional binding capacity) can be determined directly by interpolation. The advantage of such a method for determining the additional The ability of a plasma to bind lies in the fact that it enables a direct measurement of the additional ability to bind and does not have the errors and complications associated with the known indirect methods.
Die nachstehenden Beispiele mit Zeichnungen dienen zur Veranschaulichung der Erfindung.The following examples with drawings serve to illustrate the invention.
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Bestimmung der Fähigkeit von Arzneimittel zur Freisetzung von Bilirubin, welches an menschliches Albumin gebunden istDetermination of drug release ability of bilirubin bound to human albumin
Die Albuminkonzentration menschlicher Plasmaproben wird durch Elektrophorese bestimmt. Anderseits stellt man eine Lösung von 2 mg/ml Bilirubin in O,IN Natriumhydroxyd her. Diese Lösung wird den Plasmaproben in Mengen, welche molare Verhältnisse von Bilirubin zu Albumin von 0,25, 0.5, 1.0 und 1.5 ergeben, zugesetzt und die erhaltenen Mischungen werden mit 0,15M Phosphatpuffer von pH-Wert 7,45 auf 1:100 verdünnt. Drei Mililiter Proben jeder Mischung werden in Kessküvetten (Probe und Standard) gebracht und in einem selbstregistrierenden Aminco-Chance-Zweistrahl-Spektralphotoiaeter wirdThe albumin concentration in human plasma samples is determined by electrophoresis. On the other hand, you provide a solution of 2 mg / ml bilirubin in O, IN sodium hydroxide. These Solution is added to the plasma samples in amounts which have molar ratios of bilirubin to albumin of 0.25, 0.5, 1.0 and 1.5 result, added and the resulting mixtures are diluted with 0.15M phosphate buffer from pH 7.45 to 1: 100. Three milliliter samples of each mixture are placed in vat cuvettes (sample and standard) and placed in a self-registering one Aminco Chance Dual Beam Spectrophotometer
—8
eine Grundlinie etabliert. 9x10 Mol freisetzendes Mittel-8th
established a baseline. 9x10 moles of releasing agent
in 10 Mikroliter wird der Küvette, welche die Probe enthM.lt zugesetzt, wobei schliesslich die Konzentration an frei-in 10 microlitres is added to the cuvette containing the sample, the concentration of free
—5
setzendem Mittel 3-10 Mol beträgt. Der Referenzküvette
wird ein gleiches Volumen Wasser zugegeben. Each gründlicher Mischung wird die Absorption der Proben bei einer Wellenlänge
zwischen 350 nm und 540 nm gemessen und die Aenderung
der Absorption in Bezug auf die Grundlinie registriert. Das Verfahren wird mit Natriumsaliclat, Natriumbenzoat
und dem Diäthanolaminsalz von SuIfisoxazol als freisetzendes
Mittel durchgeführt. Für jeden Zusatz an Arzneimittel wird die absolute Abnahme des Absorptionsmaximums (AA) bei
455-460 nm gemessen und der Kehrwert νοηΔΑ gegen den Kehrwert
der molaren Konzentration des Arzneimittels aufgetragen.-5
setting agent is 3-10 moles. An equal volume of water is added to the reference cuvette. With each thorough mixture, the absorption of the samples is measured at a wavelength between 350 nm and 540 nm and the change in absorption with respect to the baseline is recorded. The procedure is carried out with sodium saliclate, sodium benzoate and the diethanolamine salt of sulfisoxazole as the releasing agent. For each drug addition, the absolute decrease in the absorption maximum (AA) is measured at 455-460 nm and the reciprocal value νοηΔΑ is plotted against the reciprocal value of the molar concentration of the drug.
Die in Zeichnung 1 aufgeführten Absorptionskurven veranschaulichen die Freisetzung von Bilirubin, welches an menschliches Plasmaprotein gebunden ist, durch Natriumsalicylat bei Verhältnissen von Bilirubin zu Albumin von 1,0 und 2.0.The absorption curves shown in Figure 1 illustrate the release of bilirubin bound to human plasma protein by sodium salicylate with bilirubin to albumin ratios of 1.0 and 2.0.
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Die direkte Messung der durch Zugabe von Arzneimittel verursachten Absorptionsänderungen wird wie folgt durchgeführt.The direct measurement of the changes in absorbance caused by the addition of drugs is carried out as follows.
Eine Bilirubin-Albumin- Piasinaprobe mit einem Verhältnis von Bilirubin zu Albumin von 1,0 wird mit 0,15M Phosphatpuffer vom pH-Wert 7*45 auf 1:50'verdünnt. VerschiedeneA bilirubin-albumin piasin sample with a ratio from bilirubin to albumin of 1.0 is diluted with 0.15M phosphate buffer from pH 7 * 45 to 1:50. Different
-8 -6
molare Mengen 9,0x10 bis 5x10 an freisetzendem Mittel
werden jeweils in aliquoten Volumen zu 3,0 ml der verdünnten
Probe zugegeben. Die erhaltenen Mischungen werden in Messküvetten gebracht und für jede dieser Mischungen wird die
Aenderung der Absorption registriert. Die Absorptionsänderungen, welche durch die Freisetzung von Bilirubin das an menschliches
Plasmaprotein gebunden ist, mittels Hatriumsalicylat bei . Verhältnissen von Bilirubin zu Albumin von 1,0 und 2,0, verursacht
werden, sind in Zeichnung 2 dargestellt.-8 -6
molar amounts of 9.0 × 10 to 5 × 10 of releasing agent are added in aliquots to 3.0 ml of the diluted sample. The mixtures obtained are placed in measuring cuvettes and the change in absorption is recorded for each of these mixtures. The changes in absorption caused by the release of bilirubin bound to human plasma protein via sodium salicylate. Bilirubin to albumin ratios of 1.0 and 2.0 are shown in Figure 2.
In Zeichnung 3 werden die Fähigkeiten von Hatriumsaiicylat, Matriumbenzoat und des Diäthanolaminsalzes von Sulfisoxazol zur Freisetzung von Bilirubin, welches an ein menschliches Plasmaprotein gebunden ist, verglichen. Die entsprechenden Messungen erfolgten durch differentielle Spektrophotometrie bei einem Verhältnis von Bilirubin zu Albumin von 1,0.In drawing 3 the abilities of sodium aicylate, Sodium benzoate and the diethanolamine salt of sulfisoxazole for Release of bilirubin bound to human plasma protein compared. The corresponding Measurements were made by differential spectrophotometry with a bilirubin to albumin ratio of 1.0.
Bestimmung der Freisetzung von Bilirubin durch Arzneimittel bei in der Klinik üblichen Plasmaspiegeln Determination of the release of bilirubin by drugs at the plasma levels customary in clinics
Plasmaproben, welche Bilirubin und Albumin in Verhältnissen von 0.25, 0.5, 1.0 und 1.5 enthalten, werden mit 0,15M Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,45 auf 1:20, 1:30, 1:50, 1:60, 1:80, 1:90 und l;100 verdünnt. Die Messung der Freisetzung von Bilirubin erfolgt in Analogie zu Beispiel 1. Die Menge an Arzneimittel (SuIfisoxazol oder Sulfadimethoxin), 409830/1035 Plasma samples containing bilirubin and albumin in ratios of 0.25, 0.5, 1.0 and 1.5 are mixed with 0.15M phosphate buffer from pH 7.45 to 1:20, 1:30, 1:50, 1:60, 1: 80, 1:90 and 1; 100 diluted. The measurement of the release of bilirubin takes place in analogy to Example 1. The amount of drug (sulfisoxazole or sulfadimethoxin), 409830/1035
welche jeder Plasmaverdünnung zugegeben wird, entspricht dem, mit einer therapeutischen Menge dieses Arzneimittels erreichten, in der Klinik üblichen, Plasmaspiegel. Wie durch die Zeichnungen 4 und 5 veranschaulicht, wird der Kehrwert der durch die Zugabe von Arzneimittel erfolgten Aenderung des Absorptionsmaximums gegen die Verdünnung des Plasmas aufgetragen.which is added to each plasma dilution corresponds to reached clinical plasma levels with a therapeutic amount of this drug. How through Figures 4 and 5 illustrate the reciprocal of the change made by the addition of drug the absorption maximum plotted against the dilution of the plasma.
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| NL7400294A (en) | 1974-07-22 |
| FR2214888A1 (en) | 1974-08-19 |
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