DE2336885A1

DE2336885A1 - Counting of microparticles in liquid - is by spreading of liquid over surface and counting by microscope

Info

Publication number: DE2336885A1
Application number: DE19732336885
Authority: DE
Inventors: Max Spinell
Original assignee: NK Verwaltungs AG
Current assignee: NK Verwaltungs AG
Priority date: 1973-07-19
Filing date: 1973-07-19
Publication date: 1975-02-06

Abstract

The liquid is spread over a surface and the micro-particles visible in the field of vision of a microscope are counted. The liquid is applied with a test sprayer onto a conveyor surface moving at a constant speed. The skin of liquid produced on the conveyor surface is carried along past the field of vision of the microscope objective, by means of which the micro-particles are counted by automatic metering equipment. The technique of fluorescent is applied in the counting operation.

Description

Verfahren und Apparat zum Zählen von Mikropartikeln in einer FlüssigkeitMethod and apparatus for counting microparticles in a liquid

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Zählen von in einer Flüssigkeit enthaltenen Mikropartikeln durch Ausbreiten der Flüssigkeit auf einer Fläche und Auszählen der im Gesichtsfeld eines Mikroskops sichtbaren Mikropartikeln, sowie einen Apparat zur Durchführung des Verfahrens.The invention relates to a method for counting microparticles contained in a liquid by spreading it out the liquid on a surface and counting the microparticles visible in the field of view of a microscope, as well as one Apparatus for carrying out the process.

In einer solchen Flüssigkeit werden die zu zählenden Mikroparitkel, beispielsweise Bakterien, Gewebezellen u.a.m. derart mit einem Farbstoff eingefärbt, daß sich die Partikel wegen der angenommenen Farbe oder für den Fall der Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffes wegen der von ihnen ausgesandten Fluoreszens von der Umgebung unterscheiden lassen.In such a liquid the microparticles to be counted, For example, bacteria, tissue cells, etc. are colored with a dye in such a way that the particles differ because of the assumed color or, in the case of the use of a fluorescent dye, because of those emitted by them Let fluorescence be distinguished from the surroundings.

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Bei dem bekannten Verif-hr-en wira fine geeignete Menge eines derart hergestellten Präparates» beispielsweise 10 mm^, entnommen. Diese Flüssigkeitsmenge wird in einer gleichmässigen Schicht zwischen einem Objektglas und einem Deckglas verteilt. Gewöhnlich v/erden Flüssigkeitsschichtstärken der Grössenordnung 10 bis 20 /U benutzt, und die Probe deckt somit ein Areal von 500 bis 1000 mmr. Das Präparat wird mittels des Mikroskoptisches stufenweise under das Objektiv bewegt, und in einer gewissenIn the known Verif-hr-en we fine a suitable amount of a preparation produced in this way »for example 10 mm ^, taken. This amount of liquid is distributed in an even layer between an object glass and a cover glass. Liquid layer thicknesses are usually of the order of magnitude 10 to 20 / U are used, and the sample thus covers an area of 500 to 1000 mmr. The specimen is gradually moved under the objective by means of the microscope table, and in a certain amount

Anzahl von Gesichtsfeldern, beispielsweise 20 bis 25 Feldern, wird die Anzahl von Mikropartikeln gezählt. Da jedes Gesichtsfeld etwa 0,5mm2 deckt, werden höchstens 2 bis 3% der ganzen entnommenen Flüssigkeitsmenge von 10 mm^ gezählt.Number of fields of view, for example 20 to 25 fields, the number of microparticles is counted. Since each field of view covers about 0.5mm2, a maximum of 2 to 3% of the total amount of liquid withdrawn of 10 mm ^ is counted.

Da die Partikelverteilung in den meisten Fällen sehr unzulänglich ist, so ist die Methode mit einem hohen relativen Fehler behaftet; man rechnet mit einem relativen Fehler von 20/5. Es liegt weiterhin auf der Hand, dass ein solches manuelles Zählen die die Analyse durchführende Person sehr in Anspruch nimmt. Eine Analyse der somit bekannten Art dauert etwa 5 Minuten und muss daher als recht zeitaufwendig bezeichnet werden.Since the particle distribution is very inadequate in most cases, the method has a high relative error afflicted; a relative error of 20/5 is calculated. It it is furthermore obvious that such a manual counting takes up a lot of the person performing the analysis. An analysis of the type thus known takes about 5 minutes and must therefore be described as quite time-consuming.

Zweck der Erfindung ist, ein Verfahren zum Zählen von Mikropartikeln in einer Flüssigkeit durch Mikroskopieren eines Flüssigkeitspräparates zu schaffen, das schneller und genauer ist.The purpose of the invention is to provide a method for counting microparticles in a liquid by microscopy to create a liquid preparation that is faster and more accurate.

Dieser Zv/eck wird dadurch erzielt, dass das flüssigkeitsförmige Präparat mittels einer Messpritze auf eine mit konstanter Geschwindigkeit bewegte Förderbahn aufgebracht und die dadurch auf der Förderbahn erzeugte Flüssigkeitshaut am Gesichtsfeld eines Objektivs vorbeigeführt wird, welches mit einem Apparat zum automatischen Zählen der Mikropartikel in Verbirdung steht« Durch dieses Verfahren erreicht man ein automatisches Zählen, wobei sich beispielsv/eise die ganze Probe von 10 mm^ in 30 bis 60 Sekunden zählen lässt. Man kann also in weniger als einem Fünftel der früher für die Analyse aufgewendeten Zeit die Mikropartikel in der ganzen entnommenen Flüssigkeitsmenge von beispielsv/eise 10 mra.3 zählen, d.h. Zählen einer fünfzigmsl so grossen Menge wie früher. Dadurch erzielt man einen relativen Fehler von 3 bis 5% gegenüber früher 20?$.This target is achieved by applying the liquid preparation by means of a measuring syringe to a conveyor track moving at constant speed and by guiding the skin of the liquid created on the conveyor track past the field of view of an objective which is connected to an apparatus for automatically counting the microparticles “This method enables automatic counting, whereby, for example, the entire sample of 10 mm ^ can be counted in 30 to 60 seconds. So in less than a fifth of the time previously spent on the analysis, the microparticles can be counted in the entire amount of liquid withdrawn, for example 10 mra.3, ie counting an amount as large as fifty milliseconds as before. This achieves a relative error of 3 to 5% compared to the previous $ 20.

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Beim Zählen findet Fluoreszen '.technik Anwendung. Es hat sich in Zusammenhang mit dem automatischen Zählen als besonders bequem erwiesen, einen Fluoreszenzfarbstoff als den dem Farbstoff zuzusetzenden Farbstoff zu wählen, so dass für das Zählen der Partikel ein Apparat mit einer Lichtquelle verwendbar ist, der solche Filter aufweist, dass die Partikel mit Licht einer Wellenlänge beleuchtet werden, die unter der Wellenlänge des von Fluoreszenzfarbstoff ausgesandten Lichtes liegt,'wobei dieses ausgesandte Licht durch Filter einen automatisierten Zähler zugeführt wird.Fluorescence technology is used for counting. It has particularly convenient in connection with automatic counting, a fluorescent dye than that of the dye to choose the dye to be added so that an apparatus with a light source can be used for counting the particles, the filter has such that the particles are illuminated with light of a wavelength below the wavelength of the from fluorescent dye emitted light is, 'this emitted light through filters an automated counter is fed.

Ein zur Durchführung des erdindungsgemässen Verfahrens gut geeigneter Apparat besteht darin, dass "er ein Förderorgan, welches eine geschlossene, an sich zurückkehrende Förderbahn bildet, und weiterhin, gesehen in Reihenfolge in der Forderrichtung des For— derorgans und im Bereich der von diesem gebildeten Bahn, ein Aufbringungsorgan für das flüssigkeitsförmige Präparat, ein Registrierorgan, beispielsweise das Objektiv eines Mikroskops, sowie ein Reinigungsaggregat enthält. In diesem Apparat wird die Förderbahn die ganze Zeit hindurch mit der konstanten Geschwindigkeit bewegt, während ihr neue, zu analysierende Proben zugeführt und auf die schon analysierten Proben von der Förderbahn vor deren Wiederverwendung wirksam entfernt werden.One that is well suited for carrying out the method according to the invention Apparatus consists in the fact that "it is a conveying element, which forms a closed conveying path that returns to itself, and furthermore, seen in order in the direction of the for- derorgan and in the area of the path formed by this, an application organ for the liquid preparation, a registration organ, for example the lens of a microscope and a cleaning unit. In this apparatus the The conveyor track moves at the constant speed all the time, while it is supplied with new samples to be analyzed and the samples already analyzed are effectively removed from the conveyor track prior to their reuse.

Eine bevorzugte Ausführungsform des Förderorgans besteht darin, dans dieses eine Scheibe ist, deren zylindrische Oberfläche die Förderbahn bildet.A preferred embodiment of the conveyor organ is dans this is a disc, the cylindrical surface of which forms the conveyor track.

Die Erfindung wird nachstehend anhand der Zeichnung.näher erläutert, die diagrammässig einen zur Durchführung des erfindungcgemässen Verfahrens geeigneten Apparat zeigt.The invention is explained in more detail below with reference to the drawing, the diagrammatic one for carrying out the invention Process suitable apparatus shows.

Das fltissigkeitsförnige Präparat,das die Mikropartikel enthält, wird mittels eines rechts in der Zeichnung gezeigten Verdünnungsaggregats hergestellt, das aus zwei Ausmesspritzen 1 und 2 besteht. Die Spritze 1 dient zum Ausmessen der gewünschten Probemenge aus einem Probebehälter 3» indem die Probemenge durch eine Pipette h aus dem Behälter 3 hochgesaugt und an eine Mischkammer 5 abgegeben wird. Die in einem Behälter 6 enthaltene Verdünnungslösun.T, wird mit der Spritze 2 ausgemessen und nach UmstellungThe liquid-like preparation containing the microparticles is produced by means of a dilution unit shown on the right in the drawing, which consists of two measuring syringes 1 and 2. The syringe 1 is used to measure the desired amount of sample from a sample container 3 »in that the sample amount is sucked up from the container 3 by a pipette h and delivered to a mixing chamber 5. The dilution solution contained in a container 6 is measured with the syringe 2 and after conversion

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eines die Spritzen 1 un.i 2 verbindenden Ventils 7 an die Mischkammer 5 abgegeben, wo sie mit der Probemenge vermischt wird. Dem so hergestellten Präparat wird ein Fliaoreszenzfarbstoff zugeführt, der auf irgendeiner Stufe des Verdünnungsvorganges oder gegebenenfalls erst in der eigentlichen Mischkammer an die Zellen gebunden wird.a valve 7 connecting the syringes 1 and 2 is delivered to the mixing chamber 5, where it is mixed with the sample amount. A fluorescent dye is added to the preparation produced in this way, which is bound to the cells at some stage of the dilution process or, if necessary, only in the actual mixing chamber.

Aus der Mischkammer 5 v/ird das Präparat über ein Ventil 8 in eine Messpritze 9 gesaugt, deren Kolben nach Schliessen des Ventils 8 das flüssigkeitsförmige Präparat über den Rand einer rotierenden Glasscheibe 10 hinauspresst. Die Dosiergeschwindigkeit der Messpritze 9 und die Rotationsgesohwindigkeit der Glasscheibe 10 sind so abgestimmt, dass eine geeignete dünne Flüssigkeitshaut am Umfang der Glasscheibe ausgelegt wird. Die Flüssigkeitshaut ist vorzugsweise 10 bis 20 /U dick und hat eine Breite von 1,5 nun.The preparation is sucked from the mixing chamber 5 via a valve 8 into a measuring syringe 9, the piston of which is after the valve is closed 8 the liquid preparation over the edge of a rotating glass pane 10 presses out. The dosing speed the measuring syringe 9 and the rotational speed of the Glass panes 10 are designed so that a suitable thin liquid skin is laid out on the periphery of the glass pane. the Fluid skin is preferably 10 to 20 / U thick and has a Width of 1.5 now.

Diese Flüssigkeitshaut wird während der weiteren Rotation der Glasscheibe am Gesichtsfeld eines Objektivs 11 vorbeigeführt, durch welches Licht von einer Lichtquelle 12 die Flüssigkeitshaut trifft. Das Licht von der Lichtquelle 12 passiert auf den Wege zum Objektiv" 11 ein Exzitationsfilter 13, das lediglich Lichtdurchtritt in Wellenlängenbereich 4000 bis 5000 Ar.g:-:trörn gestattet, und einen dlchroitisehen Spiegel 14, der das Licht in diesem Wellenlängenbereich reflektiert. Das Licht geht somit durch das Objektiv 11 und trifft die Flüssigkeitshaut auf der Glasscheibe 10, wodtireh der an die Mikropartikel gebundene FluoreszenzfarbEtoff von einfallenden Licht exzitiert v/ird und dadurch Licht, Emissionslicht,abgibt, das eine niedrigere Energie entsprechend dem Wellenlängenbereich von 5300 Ängström und mehr hat.This skin of liquid is moved past the field of view of an objective 11 during the further rotation of the glass pane, by which light from a light source 12 hits the skin of the liquid. The light from the light source 12 passes to the Ways to the lens "11 an excitation filter 13, which is only Light transmission in wavelength range 4000 to 5000 Ar.g: -: trörn permitted, and a dichroic mirror 14 that shines the light reflected in this wavelength range. The light thus passes through the lens 11 and hits the skin of the liquid the glass pane 10, where the bound to the microparticles Fluorescent color substance is excised from incident light and thereby emits light, emission light, which has a lower energy corresponding to the wavelength range of 5300 angstroms and has more.

Das Emipsionslicht geht durch das Objektiv 11 in der entgegengesetzten Richtung des Exzitationnlichtes und trifft den dichroitischen Spiegel 14. Das Emissionslicht geht wegen seiner höherer) V.^TellenlP.n~e direkt durch den 3pj e.:;el 14 ohne Reflektier* hindurch und weiter durch ein sekundäres Gperrfiltersystern 15 und ein Okular 16. Das Enissionslicht ist dadurch für elektrooptische Detektion zugänglich.The Emipsionslicht passes through the objective lens 11 in the opposite direction of the Exzitationnlichtes and strikes the dichroic mirror 14. The light emission is due to its higher) V. ^T ~ e ellenlP.n directly by the 3PJ e.:;el 14 without passing Reflektier * and further through a secondary notch filter system 15 and an eyepiece 16. The emission light is thereby accessible for electro-optical detection.

Nachdem die Flüssi-keitshaut auf der Glasscheibe das Gesichts-After the fluid skin on the pane of glass has

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feld des Objektives 11 pansiesthat, wird sie mittels eines Reinigungsaggregates entfernt, das aus zwei Düsen 17 und 18, aus denen Reinigungsflüssigkeit auf den unteren Rand der Glasscheibe gespritzt wird, sowie aus einer rotierenden Bürste 19 besteht, die an dem Rand der Glasscheibe zwischen den Düsen 17 und 18 anliegt. Gesehen in der durch einen Pfeil gezeigten Rotationsrichtung der Glasscheibe ist nach der Düse 18 eine Saugtasse 20 angeordnet, die mittels eines Saug.organs 21 zum Entfernen der Reinigungsflüssigkeit auf der Scheibe dient, und diese wird dadurch getrocknet und ist zum Empfang der nächsten Probe bereit.field of the lens 11 pansiesthat, it is determined by means of a Cleaning unit removed, consisting of two nozzles 17 and 18, from which cleaning liquid is applied to the lower edge of the glass pane is sprayed, and consists of a rotating brush 19, which is on the edge of the glass between the nozzles 17 and 18 are present. Seen in the direction of rotation of the glass pane shown by an arrow, after the nozzle 18 there is a Arranged suction cup 20, which is used by means of a suction organ 21 to remove the cleaning liquid on the window, and this is then dried and is ready to receive the next one Sample ready.

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Claims

Iy method of counting contained in a liquid Microparticles by spreading the liquid over a surface and counting the number in the field of view of a microscope visible microparticles, characterized in that the liquid by means of a measuring syringe on a applied at a constant speed moving conveying surface and the resulting liquid skin on the conveying surface is guided past the field of view of the microscope objective, through which an apparatus for the automatic counting of_ Microparticles this counts.

2. The method according to claim 1, characterized in that that fluorescence technology is used in counting.

3. Apparatus for carrying out the method according to claim 1 or 2 in connection with an apparatus for automatic counting of microparticles, characterized in that it has a conveyor element (10), which is a closed, to itself returning conveyor track forms, and further, seen in the conveying direction of the conveyor element, in the area of this formed web, an application member (9) for the liquid the objective (11) of a microscope and a cleaning unit (17,18,19).

4. Apparatus according to claim 3, characterized in that that the conveyor member (10) is a disc, the cylindrical surface of which forms the conveyor track.

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