DE2218783C3 - Process for the production of an alkaline amylase - Google Patents
Process for the production of an alkaline amylaseInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung einer alkalischen Amylase, welche ein Aktivitätsmaximum bei pH 4,5, bei pH 7 sowie bei pH 9 besitzt und welche aufgrund der Molekulargewichtsbestimmung durch Gelfiltration ein Molekulargewicht von etwa 40000 hat.The invention relates to a method for generating an alkaline amylase which has a maximum activity at pH 4.5, at pH 7 and at pH 9 and which is based on the molecular weight determination has a molecular weight of about 40,000 by gel filtration.
Amylasen sind stärkeabbauende Enzyme, die vorzugsweise im sauren oder neutralen Bereich aktiv sind (siehe »Advances in Applied Microbiology« I, S. 293 [1965]). Für die Erzeugung dieser Enzyme sind verschiedene Verfahren bekannt.Amylases are starch-degrading enzymes that are preferably active in the acidic or neutral range (see "Advances in Applied Microbiology" I, p. 293 [1965]). There are various ways of producing these enzymes Procedure known.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Erzeugung einer neuartigen alkalischen Amylase unter Verwendung eines neuartigen Mikroorganismus zu schaffen.The object of the present invention is to provide a method for producing a novel alkaline Amylase using a novel microorganism.
Die Erfindung besteht in einem Verfahren zur Erzeugung einer alkalischen Amylase, welche ein Aktivitätsmaximum bei pH 4,5, bei pH 7 sowie bei pH 9 besitzt und welche aufgrund der Molekulargewichtsbestimmung durch Gelfiltration ein Molekulargewicht von etwa 40000 hat, daß ein Kulturmedium, das ein Carbonat, eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und ein anorganisches Material enthält, mit dem Stamm Bacillus ATCC 21 783 geimpft und dann nach Einstellung auf einen pH-Wert von 7 bis 11 bei einer Temperatur von etwa 30 bis 37 ( so lange aerob bebrütet wird, bis das Kulturmedium eine beträchtliche Aktivität an der alkalischen Amylase besitzt, worauf die in dem Kulturmedium erzeugte alkalische Amylase von dem Kulturmedium mit für die Gewinnung von Enzymen üblichen physikalisch-chemischen Verfuhren abgetrennt wird. Der Bacillus ATCC 21783 ist aus einer Bodenprobe isoliert worden, die aus dem Bezirk Ilirosawa in Wako (Präl'ektur Sailama, Japan) stammt.The invention consists in a method for producing an alkaline amylase which has a maximum activity at pH 4.5, at pH 7 and at pH 9 and which is based on the molecular weight determination has a molecular weight of about 40,000 by gel filtration, that a culture medium containing a carbonate, containing a carbon source, a nitrogen source, and an inorganic material with the stem Bacillus ATCC 21 783 inoculated and then after adjusting to pH 7-11 at a temperature from about 30 to 37 (is incubated aerobically until the culture medium shows considerable activity of the alkaline amylase, whereupon the alkaline amylase produced in the culture medium of the Separated culture medium with the usual physical-chemical procedures for the recovery of enzymes will. The Bacillus ATCC 21783 was isolated from a soil sample obtained from the Ilirosawa district in Wako (Sailama Prefecture, Japan).
Der als Bacillus ATCC 21783 bezeichnete Mikroorganismus ist am 23. Mär/ l')72 ohne Einschränkung des Zugangs bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12*01 Parklawn Drive, Rockville, Maryland .1OXSi, USA, hinterlegt worden.The microorganism designated as Bacillus ATCC 21783 is on Mar 23/1 ') 72 with unrestricted access from the American Type Culture Collection (ATCC), 12 * 01 Parklawn Drive, Rockville, Maryland. 1 OXSi, USA.
Die mikrobiologischen Eigenschaften wurden nach dem Verfahren getestet, die von Nathan R. Smith, R.E. Gordon und F.E. Clark unter dem Titel »Aerobic Sporeforming Bacteria« (United States Department of Agriculture, November 1952) und die in »Bergeys Manual of Determinative Bacteriology« (1957) beschrieben sind.The microbiological properties were tested according to the method described by Nathan R. Smith, RE. Gordon and F.E. Clark under the title "Aerobic Sporeforming Bacteria" (United States Department of Agriculture, November 1952) and those in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (1957).
Die Eigenschaften dieses Mikroorganismus sowie der neuartigen alkalischen Amylase werden nachstehend erläutert.The properties of this microorganism as well as the novel alkaline amylase are shown below explained.
Die Figur zeigt ein Kurvenbild zur Darstellung der optimalen pH-Werte der alkalischen Amylase gemäß der Erfindung.The figure shows a graph showing the optimal pH values of the alkaline amylase according to the invention.
Nachstehend werden in durchlaufender Numerierung zunächst die Nährmedien angegeben, welche in den Versuchen zu den Tabellen 1 und 2 verwendet wurden. Die Zusammensetzung wird je in Gramm pro Liter Wasser angegeben:The nutrient media that are used in the experiments for Tables 1 and 2 were used. The composition is in grams per each Liters of water indicated:
(1) Nährbouillor.(1) Nutrient broth.
Natriumcarbonat ReptonSodium carbonate repton
RindfleischexlraktBeef extract
(2) Nährbouillon mit Agar-Agar(2) Nutrient broth with agar-agar
Natriumcarbonat PeptonSodium carbonate peptone
Rindfleischextrakt Agar-AgarBeef extract agar-agar
(3) Bouillon mit
Traubenzucker(3) bouillon with
glucose
10 (oder nicht zugesetzt) 5 310 (or not added) 5 3
10 (oder nicht zugesetzt)10 (or not added)
3 153 15
Natriumcarbonat 10 (oder nicht zugesetzt)Sodium carbonate 10 (or not added)
Pepton 5Peptone 5
Rindfleischextrakt 3Beef extract 3
Traubenzucker 10Glucose 10
(4) Bouillon mit
Traubenzucker und Agar-Agar(4) bouillon with
Glucose and agar agar
Natriumcarbonat 10 (oder nicht zugesetzt)Sodium carbonate 10 (or not added)
Pepton 5Peptone 5
Rindfleischextrakt 3Beef extract 3
Traubenzucker 10Glucose 10
Agar-Agar 15Agar-agar 15
(5) Gelatine-Medium(5) gelatin medium
Natriumcarbonat K) (oder nicht zugesetzt)Sodium carbonate K) (or not added)
Pepton 5Peptone 5
Rindlleischextrakt 3Beef extract 3
Gelatine 5Gelatin 5
(6) Pepton-Wasser-Mcdium (6) Peptone-Water-Mcdium
Natriumcarbonat 10 (oder nicht zugesetzt)Sodium carbonate 10 (or not added)
Pepton 5Peptone 5
(7) Kartoffel-Medium(7) potato medium
Natriumcarbonat 10 (oder nicht zugesetzt)Sodium carbonate 10 (or not added)
Kartoffelextrakt 50Potato extract 50
Agar-Agar 15Agar-agar 15
(8) Voges-Proskaucr-I est(8) Voges-Proskaucr-I est
Natriumcarbonat IOSodium carbonate IO
Pepton 7Peptone 7
l'rauben/uckcr 5l'raub / uckcr 5
NaCI 5NaCl 5
(9) Nitrat-Reduktion(9) Nitrate Reduction
Natriumcarbonat 10Sodium carbonate 10
Pepton 5Peptone 5
Rindfleischextrakt 3Beef extract 3
KNO3 1KNO 3 1
(10) Katalase-Reaktion(10) Catalase reaction
Natriumcarbonat 10Sodium carbonate 10
Pepton 5Peptone 5
Hefeextrakt 5Yeast extract 5
Stärke 20Strength 20
K2HPO4 1K 2 HPO 4 1
Agar-Agar 15Agar-agar 15
MgSO4- 7 H2O 0,2MgSO 4 - 7 H 2 O 0.2
Ml) Hydrolyse von
KaseinMl) hydrolysis of
casein
Natriumcarbonat 10Sodium carbonate 10
Hefeextrakt 5Yeast extract 5
Traubenzucker IODextrose IO
Kasein 5Casein 5
K2HPO4 1K 2 HPO 4 1
Agar-Agar 15Agar-agar 15
MgSO4-7 H.,O 0,2MgSO 4 -7 H., O 0.2
(12) Stärkehydrolyse(12) starch hydrolysis
Natriumcarbonat 10Sodium carbonate 10
Pepton 5Peptone 5
Hefeexlrakt 5Yeast extract 5
Stärke 20Strength 20
K2HPO4 1K 2 HPO 4 1
Agar-Agar 15Agar-agar 15
MgSO4-7 H,OMgSO 4 -7 H, O
(13) Verwertung von
Ci trat(13) recovery of
Ci stepped
Natriumcarbonat 10Sodium carbonate 10
Natriumchlorid 1Sodium chloride 1
MgSO4-7 H3O 0,2MgSO 4 -7 H 3 O 0.2
(NH4),HPO4 1(NH 4 ), HPO 4 1
KH2PO4 0,5KH 2 PO 4 0.5
Ci trat 2Ci stepped 2
Agar-Agar 15Agar-agar 15
(14) Verwertung von
Ammoniumsalz(14) recovery of
Ammonium salt
Natriumcarbonat 10Sodium carbonate 10
Pepton 5Peptone 5
Rindfleischextrakt 3Beef extract 3
NaCI 70NaCl 70
(16) Traubenzucker-Nitrat-Medium (16) Dextrose nitrate medium
Natriumcarbonat 10Sodium carbonate 10
Pepton 10Peptone 10
Rindfleischextrakt 3Beef extract 3
Hefeextrakt 2Yeast extract 2
Traubenzucker 10Glucose 10
K2HPO4 5K 2 HPO 4 5
(18) Traubenzucker-Asparagin-Medium (18) Glucose-Asparagine Medium
Das Wachstum des Bacillus ATCC 21 783 auf verschiedenen Niihrmedien ist aus der Tabelle 1 ersichtlich. The growth of the Bacillus ATCC 21 783 on various Nutrient media can be seen from Table 1.
/iis.il/ um N.ι ( I I/iis.il/ um N.ι (I I
In der Tabelle I sind in der Spalte 1 die verwendeten Nährmedien und in den Spalten 2 und 3 das Wachstum hei einem pH-Wert von 7 bzw. 10,2 angegeben.In Table I, column 1 shows the used Culture media and in columns 2 and 3 the growth indicated at a pH value of 7 and 10.2, respectively.
Der Mikroorganismus hat Abmessungen von 0,5 bis 0,6 x 2,0 bis 3,0 μηι. Das Sporangium ist deutlich gequollen, und die im Endteil der Zelle gebildete Spore ist oval und hat Abmessungen von 0,9 bis 1,Ox 1,2 bis 1,5 μΠΊ.The microorganism has dimensions from 0.5 to 0.6 x 2.0 to 3.0 μm. The sporangium is clearly swollen, and the spore formed in the end part of the cell is oval and has dimensions of 0.9 to 1, Ox 1.2 to 1.5 μΠΊ.
Der Mikroorganismus hat pcrlrichösc (ieiUcln, wie aus seiner elektronenmikroskopischen Aufnahme hervorgeht. Dergenannte Bacillus-Stamm hat eine positive Gramfärbbarkeit und negative Antiacidität. Er wächst auf dem nachstehend beschriebenen Nährmedium (lösliche Stärke, Hefeextrakt, Pepton, K2HPO4, MgSO4 · 7H2O und 1 % Na2CO3, eingestellt auf einen pH-Wert von 10,2) sehr gut in Form von freibeweglichen Kolonien. Dieser Bacillus-Stamm zeichnet sich dadurch aus, daß er in einem alkalischen Nährmedium mit einem pH-Wert von 7,5 bis 11, vorzugsweise etwa 10, gut wächst, besser als in einem neutralen Nährmedium. The microorganism has pcrlrichösc (ieiUcln, as can be seen from its electron micrograph. The named Bacillus strain has a positive Gram stainability and negative antacidity. It grows on the nutrient medium described below (soluble starch, yeast extract, peptone, K 2 HPO 4 , MgSO 4 · 7H 2 O and 1% Na 2 CO 3 , adjusted to a pH value of 10.2) very well in the form of freely moving colonies.This Bacillus strain is characterized by the fact that it grows in an alkaline nutrient medium with a pH value of 7.5 to 11, preferably about 10, grows well, better than in a neutral nutrient medium.
Die folgenden physiologischen Eigenschaften wurden festgestellt:The following physiological properties were noted:
(1) Optimale Wachstumsbedingungen:(1) Optimal growing conditions:
pH-Wert
TemperaturPH value
temperature
etwa 10about 10
37 bis 40 c- aerob37 to 40 c- aerobic
(2) Bedingungen, unter denen der
Mikroorganismus wachsen kann:(2) Conditions under which the
Microorganism can grow:
pH-Wert
TemperaturPH value
temperature
7,5 bis 117.5 to 11
bis zu 45 C - aerobup to 45 C - aerobic
Mit Hilfe des 1% Na2CO3 enthaltenden Nährmediums wurden folgende Versuche durchgeführt und die folgenden Ergebnisse erhalten:With the aid of the nutrient medium containing 1% Na 2 CO 3 , the following experiments were carried out and the following results were obtained:
In einem Nährmedium der folgenden Zusammen setzungIn a nutrient medium of the following combination settlement
Natriumcarbonat 10*)Sodium carbonate 10 *)
(NlI4J2HPO4 1(NlI 4 J 2 HPO 4 1
KCI 0,2KCI 0.2
MgSo4 0,2MgSo 4 0.2
Hefeextrakt 0,2Yeast extract 0.2
SacL'harid (Glucose. Saccharose u. dgl.) 5SacL'harid (glucose, sucrose, etc.) 5
*) Angaben in Gramm pro Liier Wasser*) Figures in grams per Liier of water
werden die Saccharide Traubenzucker, Fruchtzucker. Xylose, Holzzucker, Rohrzucker, Malzzucker, Milchzucker und Pektinzucker verwertet. Dagegen werden Galaktose, Mutterkornzucker und Inulin nur wenig verwertet. Es wird Säure erzeugt. Als Sticksloffquelle werden Hefeextrakt, Pepton, Maisquellflüssigkeit und dergleichen verwendet.the saccharides are dextrose, fructose. Xylose, wood sugar, cane sugar, malt sugar, milk sugar and pectin sugar. On the other hand, galactose, ergot sugar and inulin are very little recovered. Acid is generated. Yeast extract, peptone, corn steep liquor and like used.
Der Bacillus ATCC 21783 wurde dann einer vergleichenden Untersuchung gemäß dem Klassifizierungsverfahren unterworfen, das in der genannten Veröffentlichung »Aerobic Spore-forming Bacteria« und in »Bergeys Manual of Determinative Bacteriology« (1957) (auf S. 613 TO beschrieben ist. Diese Untersuchung ergab, daß der genannte Mikroorganismus in einigen Punkten den bekannten Mikroorganismen der Gattung Bacillus ähnelte, in bestimmten Eigenschaften sich jedoch vollkommen von ihnen unterschied, und daß es in der bekannten Gattung keine Arten gab, die in den genannten Eigenschaften mit dem vorliegenden Mikroorganismus übereinstimmen. Dies führte zu dem Schluß, daß es sich um einen neuen Stamm der Gattung Bacillus handelte. Da es sich bei dem bekannten Mikroorganismus um ein aerobes, sporenbildendes Bakterium handelt, gehört er natürlich zur Gattung Bacillus. Der Mikroorganismus zeichnet sich insbesondere dadurch aus, daß er in einem alkalischen Medium besonders gut wächst, wobei der optimale pH-Wert etwa bei 10 liegt.The Bacillus ATCC 21783 then became a comparative Subjected to examination according to the classification procedure outlined in said publication "Aerobic Spore-forming Bacteria" and in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (1957) (described on p. 613 TO. This investigation showed that the said microorganism in some respects to the known microorganisms of the Genus Bacillus was similar, but completely different from them in certain properties, and that there were no species in the known genus that had the properties mentioned with the present Microorganism match. This led to the conclusion that this is a new strain of the genus Bacillus acted. Since the known microorganism is an aerobic, spore-forming Bacterium, it belongs of course to the genus Bacillus. The microorganism stands out in particular characterized in that it grows particularly well in an alkaline medium, with the optimum pH is around 10.
Mit dem Bacillus-Stamm ATCC 21783 wurden bekannte Bakterienarten verglichen, beispielsweise der Bacillus flrmus. Dieser ist hei der Vogcs-Proskaucr-Reaktion negativ und hat in einem traubenzuckerhaltigen Nährmedium einen optimalen pH-Wert von 6,2. Dagegen ist der Bacillus-Stamm ATCC 21 783 bei der Voges-Proskauer-Reaktion positiv und zeigt ein Wachstum in einem traubenzuckerhaltigen Nährmedium bei einem pH-Wert von 7,5 bis 11, wobei der optimale pH-Wert bei etwa 10 liegt.With the Bacillus strain ATCC 21783 were known Comparing types of bacteria, for example Bacillus flrmus. This is called the Vogcs-Proskaucr reaction negative and has an optimal pH value of in a nutrient medium containing dextrose 6.2. In contrast, the Bacillus strain ATCC 21 783 is positive in the Voges-Proskauer reaction and shows a Growth in a nutrient medium containing dextrose at a pH of 7.5 to 11, with the optimal pH is around 10.
Während das Wachstum von Bacillus firrnus durch Traubenzucker gehemmt wird, ist dies bei dem Bacillus-Stamm ATCC 21 783 nicht der Fall.While the growth of Bacillus firnus is inhibited by glucose, so is the Bacillus strain ATCC 21 783 not the case.
In diesen Punkten unterscheidet sich der Bacillus-Siamm ATCC 21 783 deutlich von dem Bacillus lirrnus.The Bacillus Siamm differs in these points ATCC 21 783 clearly from the Bacillus lirrnus.
Man kann auch den Bacillus subtilis zum Vergleich mit dem Bacillus-Stamm ATCC 21 783 heranziehen. Bei dem Bacillus siibiilis ist jedoch nur eine kleine Differenz zwischen der Hauptachse des Myceliums und der Nebenachse der Spore vorhanden (Hauptachse des Myceliums: 0,7 bis 0,8 ^m, Nebenachse der Spore: 0,6 bis 0,9 μτη). Dagegen beträgt bei dem Bacillus-Stamm ATCC 21 783 die Hauptachse des Myceliums 0,5 bis 0,6 μΐη und die Achse der Spore 0,9 bis 1,0 μίτι.The Bacillus subtilis can also be used for comparison with the Bacillus strain ATCC 21 783. In Bacillus siibiilis, however, there is only a small difference between the major axis of the mycelium and the minor axis of the spore (major axis of the mycelium: 0.7 to 0.8 ^ m, minor axis of the spore: 0.6 to 0.9 μm). In contrast, in the case of the Bacillus strain ATCC 21 783, the main axis of the mycelium is 0.5 to 0.6 μm and the axis of the spore is 0.9 to 1.0 μm.
Hinsichtlich der physiologischen Eigenschaften beträgt der optimale pH-Wert des Nährmediums für den Bacillus subtilis etwa 5,5, während der Bacillus-StammWith regard to the physiological properties, the optimal pH value of the nutrient medium for the Bacillus subtilis about 5.5, while the Bacillus strain
ATCC 21 783 ein gutes Wachstum in einem auf einen pH-Wert von 7,5 bis 11 eingestellten Nährmedium zeigt, wobei der optimale pH-Wert etwa 10 beträgt. In diesen Punkten unterscheidet sich der Bacillus-Stamm ATCC 21783 deutlich von dem Bacillus subtilis. ATCC 21 783 good growth in a nutrient medium adjusted to a pH of 7.5 to 11 shows, the optimum pH being around 10. The Bacillus strain differs in these points ATCC 21783 clearly distinguished from the Bacillus subtilis.
Zusammenfassend sei festgestellt, daß der Bacillus-Stamm ATCC 21 783 ein Mikroorganismus ist, der als aerobes, sporenbildendes Bakterium zur Gattung Bacillus gehört, und der angesichts seiner mikrobiologischen Eigenschaften, insbesondere der Tatsache, daß der für sein Wachstum optimale pH-Wert bei etwa 10 liegt, als ein neuer Stamm dieser Gattung angesehen werden kann. Dieser Stamm wird mit Bacillus ATCC 21783 bezeichnet.In summary, it should be noted that the Bacillus strain ATCC 21 783 is a microorganism that is an aerobic, spore-forming bacterium belonging to the genus Bacillus heard, and given its microbiological properties, in particular the fact that the for its growth optimal pH is around 10, be considered as a new strain of this genus can. This strain is named Bacillus ATCC 21783.
In der praktischen Durchführung der Erfindung kann die Vergärung nach folgendem Verfahren durchgeführt werden.In the practice of the invention, fermentation can be carried out by the following procedure will.
Das Verfahren ist gekennzeichnet durch den Zusatz eines Carbonats zu dem Kulturmedium. In diesem Medium werden Stärke, lösliche Stärke und dergleichen als Kohlenstoffquelle, Hefeextrakt, Pepton, Maisquellflüssigkeit und dergleichen als Stickstoffquelle und verschiedene Carbonate, z. B. Kaliumcarbonat, Natriumcarbonat und Natriumbicarbonat, als anorganische Salze verwendet. Diese Salze werden der Lösung zwecks Herstellung eines Kulturmediums zugesetzt, das auf einen pH-Wert von etwa 10,5 eingestellt ist.The method is characterized by the addition of a carbonate to the culture medium. In this Medium are starch, soluble starch and the like as a carbon source, yeast extract, peptone, corn steep liquor and the like as a nitrogen source and various carbonates, e.g. B. potassium carbonate, Sodium carbonate and sodium bicarbonate, used as inorganic salts. These salts become the solution added to prepare a culture medium adjusted to a pH of about 10.5.
Das auf diese Weise hergestellte Medium wird mit dem Bacillus ATCC 21783 geimpft, der d?nn unter Schütteln bei einer Temperatur von etwa 30 bis 37 C gezüchtet wird. Die Aktivität des erzeugten Enzyms erreicht ein Maximum im allgemeinen nach einer Züchtung von etwa 24 bis 64 Stunden.The medium prepared in this way is inoculated with the Bacillus ATCC 21783, the thin under Shaking at a temperature of about 30 to 37 C is grown. The activity of the enzyme produced generally reaches a maximum after about 24 to 64 hours of cultivation.
Da der Zeitraum bis zum Erreichen der maximalen Enzymaktivität bei einer gegebenen Temperatur und bei einem aus denselben Bestandteilen bestehenden Kulturmedium von den Belüftungs- und Rührbedingungen abhängt, wird die Züchtungsdauer zweckmäßig in jedem Einzelfall durch Messung der Enzymaktivität bestimmt.Since the time to reach maximum enzyme activity at a given temperature and in the case of a culture medium consisting of the same components, on the aeration and stirring conditions depends, the cultivation time is expedient in each individual case by measuring the enzyme activity definitely.
Der zweite wichtige Kennwert für die Züchtung ist der pH-Wert des Mediums. Zu Beginn muß mit Carbonaten oder Bicarbonaten ein pH-Wert von 7 bis 11 eingestellt werden. Bei Verwendung eines zuckerhaltigei Kulturmediums liegt der optimale pll-Wert /wischet S und 11.The second important parameter for breeding is the pH of the medium. At the beginning you have to use carbonates or bicarbonates set a pH of 7 to 11 will. When using a sugar-containing culture medium, the optimal pII value / wipe is S and 11.
Zum Gewinn des Enzyms aus der Kullurbouilloi s kann man die üblichen physikalisch-chemischen Vcr fahren verwenden. Beispielsweise kann man die Kultur bouillon abkühlen und ihr gegebenenfalls zur Neu tralisierung Essigsaure zusetzen. Zum quantitativer Ausfällen der alkalischen Amylasc wird der Kultur·On winning the enzyme from the Kullurbouilloi s possible to use drive the usual physicochemical Vcr. For example, you can cool the culture broth and, if necessary, add acetic acid to neutralize it. For the quantitative precipitation of the alkaline Amylasc the culture
ι» bouillon dann Äthylalkohol zugeselzt. Der Niederschlag wird abgetrennt, gründlich mit Äthylalkoho gewaschen und getrocknet. Das auf diese Weise vor der Kultur des genannten Mikroorganismus gcwon nene Enzym, die alkalische Amylasc, erweist sich al·ι »bouillon then selted with ethyl alcohol. The precipitation is separated off, washed thoroughly with ethyl alcohol and dried. That way before The enzyme obtained from the culture of the said microorganism, the alkaline amylase, proves to be
is eine alkalische Amylasc, deren optimale pH-Worte bc Aui'rcchtcrhaltung ihrer Aktivität bei pil 4,5, pH 7 und pH 9 liegen.is an alkaline amylasc whose optimal pH words are bc Their activity is maintained at pH 4.5, pH 7 and pH 9.
Die Züchtung muß in einem alkalischen Medium mit einer hohen Carbonatkonzcntration erfolgen. Dem Medium, das eine Kohlcnstoffquellc und eine Stickstoffquellc enthält, wie dies für das Wachstum des Mikroorganismus erforderlich ist, werden verschiedene Carbonate zugesetzt. Beispielsweise muß man einem Medium, das Traubenzucker, K2HPO4, Hefeextrakt,The cultivation must be carried out in an alkaline medium with a high concentration of carbonate. Various carbonates are added to the medium containing a source of carbon and a source of nitrogen as required for the growth of the microorganism. For example, a medium that contains glucose, K 2 HPO 4 , yeast extract,
2s Peplon und MgSO4 · 7 H2O enthält, Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat zusetzen. Zweckmäßig beträgt die Konzentration des zugesetzten Carbonats in dem Medium 0,5 bis 5 %.2s contains peplon and MgSO 4 · 7 H 2 O, add sodium carbonate or sodium bicarbonate. The concentration of the added carbonate in the medium is expediently 0.5 to 5%.
Zur vorteilhaften Erzeugung der erwünschten alka-For the advantageous generation of the desired alkali
3<> tischen Amylasc ist der Zusatz eines Carbonats zu dem genannten Medium äußerst wichtig. Dies geht aus den in der Tabelle 3 niedergelegten Versuchsergebnissen hervor.3 <> table Amylasc, the addition of a carbonate to the medium mentioned is extremely important. This goes from the test results set out in Table 3.
Das Wachstum des Mikroorganismus Bacilius-Stamm ATCC 21783 wurde geprüft, indem die Kulturbouillon nach 18 Stunden in eine Küvette mit einem Strahlengang von 1 cm Länge gegeben und ihr Absorptionsvermögen bei 660i^m gemessen wurde. Ferner wurde die Aktivität der Amylase unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 angegeben, aus der hervorgeht, daß das Vorhandensein eines Carbonats in dem Medium eine wichtige Voraussetzung für die Erzeugung der alkalischen Amylase ist.The growth of the microorganism Bacilius strain ATCC 21783 was checked by adding the culture broth after 18 hours placed in a cuvette with a beam path of 1 cm length and its absorption capacity was measured at 660i ^ m. Further the activity of amylase was measured under the conditions described below. The results are given in Table 3, from which it can be seen that the presence of a carbonate in the medium is an important prerequisite for the generation of alkaline amylase.
Zugesetztes SalzAdded salt
Anfangs-pH-WertInitial pH
Wachstumgrowth
Amylase-Aktivilät
(E/ml)Amylase activity
(U / ml)
pH·pH
pH 9pH 9
(1) Ohne Salzzusatz (Bouillon enthält nur
lösliche Stärke, K2HPO4, Hefeextrakt,
Pepton und MgSO4 ■ 7 H2O)(1) No added salt (bouillon only contains
soluble starch, K 2 HPO 4 , yeast extract,
Peptone and MgSO 4 ■ 7 H 2 O)
Der näehstwichlige Faktor für die Züchtung ist der pH-Wert. Aus den Hrgehnissen der nachstehend beschriebenen Versuche geht hervor, dnß /ur Herstellung der alkalischen Amylase der pH-Wert während der Züchtung im Bereich von 7 bis 11 liegen muliThe next important factor in breeding is that PH value. From the results of the experiments described below, it can be seen that the product was manufactured of alkaline amylase the pH value during cultivation is in the range from 7 to 11 muli
Der Hinfluß des pH-Wertes auf die Hr/eugung der alkalischen Aniylase wurde untersucht, indem mit HCI oder NaOII der pll-Wert des genannten Kulturmediums verändert wurde, das I % Natriumcarbonat enthielt, (!email der Tabelle 4 wurde dabei erkannt, daß die besten Hrgebnisse bei einem pll-Wert von 7 bis II, insbesondere von X bis 11, in Anwesenheit von Trauben/ucker, erhalten wurden. Die Tabelle 4 hißt ferner eine Veränderung der Amylaseaktivitäl erkennen.The inflow of the pH on the hearing of the alkaline analase was investigated by using HCI or NaOII, the pI value of the culture medium mentioned was changed, the I% sodium carbonate contained, (! email of table 4 was recognized, that the best hearing results at a pI value of 7 to II, in particular from X to 11, in the presence of grapes / sugar. Table 4 also shows a change in amylase activity recognize.
Tabelle 4
MediumTable 4
medium
Amylaseakliviläl (li/nil)Amylase akliviläl (li / nil)
pll-Wert:pll value:
7 X 9 IO7 X 9 IO
200200
100100
11(10 2X00 3000 8(X) 100 100 100 10011 (10 2X00 3000 8 (X) 100 100 100 100
enthält 1 %
Na/.'O,contains 1%
Na /. 'O,
enthält nicht
1 % Na1CO1 does not contain
1% Na 1 CO 1
Danach wurde der HinlluU des pll-Wertcs auf die Urzeugung der alkalischen Amylase durch die Veränderung des pl!-Wertes des Kulturmediums mit NaIICO1 oder Na1CO1 untersucht. Das Hrgebnis geht aus der Tabelle 5 hervor.Thereafter, the limit of the pI value for the spontaneous generation of alkaline amylase was examined by changing the pI value of the culture medium with NaIICO 1 or Na 1 CO 1 . The results are shown in Table 5.
Zugesetztes SaI/Added SaI /
Anfänglicher
pll-WertBeginner
pll value
lind-pll-Wert Wachstumlind-pll-value growth
Amylase-Aktivitäl U-VmI)Amylase activity U-VmI)
Ohne Salzzusatz (Medium besteht aus 2%
löslicher Stärke, 0,1 % KjIIIO4, 0,5 % I IeIeextrakt,
0,5 % l'epton, 0,02 % MgSO, ■ 7 H1O)Without added salt (medium consists of 2%
soluble starch, 0.1% KiIIIO 4 , 0.5% egg extract, 0.5% l'epton, 0.02% MgSO, ■ 7 H 1 O)
NaIICO5(U1K,
N.illCO, 1,0%
NaIICO1 2,0%
Na1CO, 0,5 %
Na1CO, 1,0%NaIICO 5 (U 1 K,
N.illCO, 1.0%
NaIICO 1 2.0%
Na 1 CO, 0.5%
Na 1 CO, 1.0%
Unter den vorstehend angegebenen Kulttirbedingungen wird das Medium mit dem vorher in demselben Nährmedium vorbebrütetcn Bacillus ATCC 21783 geimpft und dieser dann in einer Schülielkultur unter geeigneten Bedingungen, z. B. bei 30 bis 37 ( , 24 bis 64 Stunden lang gezüchtet. Wenn die Züchtung beendet ist, werden die Zellen abgetrennt und die Bouillon wird mit Fssigsüurc oder einer ähnlichen Säure neutralisiert oder auch nicht neutralisiert. Dann wird zum Ausfüllen der erzeugten alkalischen Aniylase ein Lösungsmittel, beispielsweise Äthylalkohol oder Aceton, zugesetzt. Der Niederschlag wird dann entwässert und getrocknet, wobei man die gewünschte .Substanz erhält.Under the cultivation conditions given above becomes the medium with that before in the same Pre-incubated culture medium inoculated with Bacillus ATCC 21783 and this then in a Schüliel culture under suitable conditions, e.g. B. at 30 to 37 (, 24 to Grown for 64 hours. When the cultivation is finished, the cells are separated and the Broth is made with liquor or something similar Acid neutralized or not neutralized. Then, to fill in the generated alkaline anylase a solvent such as ethyl alcohol or acetone is added. The precipitate is then drained and dried to obtain the desired substance.
Die auf diese Weise erhaltene alkalisehe Aniylase hat eine Aktivität von etwa 2000 bis 3000 H/ml und einen optimalen pH-Wert von etwa 9 im alkalischen Bereich.The alkaline anylase obtained in this way has an activity of about 2000 to 3000 H / ml and an optimal pH of about 9 in the alkaline range.
Das crfindungsgcmäU erhaltene lin/ym, die neuartige alkalische Annlase. hat folgende physikalischchemische Higensehaftcn:The lin / ym received, the novel alkaline annealing. has the following physicochemical Notes:
(I) Molekulargewicht(I) molecular weight
Bei Bestimmung mit Hilfe von Gelfiltration: etwa 40 000.When determined with the aid of gel filtration: about 40,000.
(2) Optimaler pll-Werlbereieh und Bereich
der stabilen pl !-Werte(2) Optimal pll advertising area and area
of the stable pl! values
Der pH-Wert wurde mit Acetat auf 4 bis 5, mit Tris-Maleat-Pufferlösung auf 5 bis 8,5, mit Glycin-Natriumhydroxid auf 9 bis 1 i und mit Carbonat auf II bis 12 eingestellt. Ferner wurde das verwendete Fnzym mit Hilfe von Gelfiltration entsalzt. Figur 1 zeigt in einem Kurvenbild die optimalen pH-Werte der alkalischen Amylase, wobei die Aktivität bei demThe pH was adjusted to 4 to 5 with acetate, to 5 to 8.5 with Tris-Maleate buffer solution, and to 8.5 with glycine sodium hydroxide adjusted to 9 to 1 i and with carbonate to II to 12. This was also used Fnzym desalinated with the help of gel filtration. FIG. 1 shows the optimal pH values in a graph of alkaline amylase, the activity in which
pll-Wert 9 mit I i>(> "·'.■ angegeben ist. .Aus Figur I geht hervor, dai.i optimale pH-Werte hei pH 4,5, pH 7 und pH 9 liegen.pll value 9 with I i> (> "· '. ■ is specified.. From FIG shows that there are optimal pH values at pH 4.5, pH 7 and pH 9.
0,01 ml des erlindungsgemäl.ien Lnzyms wurden zusammen mit 0,1 ml einer Pufferlösung mit einem gegebenen pH-Wert und 1,0 Mikromol CaCI1 als Stabilisator 30 Minuten lang auf 60 (' erhitzt. Zu dem genannten Gemisch wurde dann 0,2 ml einer Pufferlösung mit dem pll-Wert 9,0 zugesetzt, worauf die Kestaktiviläl bestimmt wurde. Das l'rgebnis ist in der Tabelle 6 angegeben.0.01 ml of the enzyme according to the invention were heated to 60 ('for 30 minutes together with 0.1 ml of a buffer solution with a given pH value and 1.0 micromol CaCl 1 as a stabilizer. 2 ml of a buffer solution with a pI value of 9.0 were added, whereupon the Kestaktiviläl was determined. The result is given in Table 6.
labelIe 6label 6
''S'' S.
-"> i - "> i
Na1CO1 Na 2 CO, / N a II CO,
Na 1 CO 1
120
12th
7
86th
7th
8th
I10
I.
IO70
IO
(3) Untersuchung der Hnzymaktivität(3) Study of enzyme activity
0,01 ml der genannten alkalisehen Amylase wurden so verdünnt, daß das Absorptionsvermögen bei 700 nm auf H) bis 20% herabgesetzt wurde. Die verdünnte Amylase wurde zu 0,1 ml einer 0,2%igen Kartoffelstärkclösung und zu 0,2 ml einer 0,2mo!aren Glycin-NaCI-NaOl!-Pufferlösung mit dem pH-Wert 9,0 (oder zu 0,2ml einer O.lm.ilaren Acetat-Pufferlösuni» mit0.01 ml of said alkaline amylase was diluted so that the absorbance at 700 nm on H) was reduced to 20%. The diluted amylase became 0.1 ml of a 0.2% potato starch solution and to 0.2 ml of a 0.2 molar glycine-NaCl-NaOl! buffer solution with a pH value of 9.0 (or 0.2 ml of an O.lm.ilar acetate buffer solution with
dem pH-Wert 4,0) zugesetzt und 10 Minuten lung hei 40 C bebrütet. Nach der Reaktion wurde dem Gemisch 0,5 ml 0,5molare Essigsäure zugesetzt. Dann wurden 3 ml einer 0,005%igen Jodlösung zugesetzt und das Absorptionsvermögen der Probe bei 700 nni gemessen. Zur Korrektur der abgelesenen Werte wurde der Wert für eine Blindprobe subtrahiert, in der die Enzymlösung vor dem Zusatz der Stärkelösung mit (),5molarcr Essigsäure gemischt worden war.the pH 4.0) added and 10 minutes ling hot 40 C incubated. After the reaction, 0.5 ml of 0.5 molar acetic acid was added to the mixture. then 3 ml of a 0.005% iodine solution were added and the absorbance of the sample at 700 nni measured. To correct the readings, the value for a blank sample was subtracted, in which the enzyme solution had been mixed with (), 5 molar acetic acid before the addition of the starch solution.
Definition der EnzymaklivitätDefinition of enzyme aclivity
I-ine Aktivitälseinheit des Enzyms wird dellniert als jene Menge des Enzyms, welche das Absorptionsvermögen bei 700 nm unter den vorstehend beschriebenen Normbedingungen um 10% herabsetzt.One unit of activity of the enzyme is elongated than that amount of the enzyme which has the absorbance at 700 nm below those described above Standard conditions reduced by 10%.
(4) Verwendungstemperaturbercich(4) Usage temperature range
Die Hnzymaklivität wurde nach dem üblichen Verfahren bei dem pll-Wert 8 und bei verschiedenen Femperaluren gemessen. Die Messung erfolgte mit einer Lösung, die kein Ca'' als Stabilisator enthielt.The enzyme activity was determined according to the usual procedure Measured at the pll value of 8 and at different temperatures. The measurement was carried out with a solution that did not contain Ca '' as a stabilizer.
Man erhielt auf diese Weise die in der Tabelle 7 angegebenen Restaktivitäten.The residual activities indicated in Table 7 were obtained in this way.
(5) Aktivierung und Stabilisierung(5) activation and stabilization
Zur Untersuchung der Aktivierung des Enzyms wurde Ca' ' zugesetzt. Dabei wurde die Aktivierung nicht beobachtet, sondern es wurde eine Erhöhung der Hitzebeständigkeit erkannt, wenn bei dem pll-Werl H C;i' ' zugesetzt wurde.To investigate the activation of the enzyme, Ca ″ was added. This was the activation not observed, but an increase in the heat resistance was recognized when the pll-Werl H C; i "was added.
Dies ist in der Tabelle 8 angegeben. Alle Proben wurden hei der angegebenen Temperatur 30 Minuten lang bebrütet.This is shown in Table 8. All samples were at the specified temperature for 30 minutes long incubated.
lcniperatiirlcniperatiir
50
55
60
65
70
75
8050
55
60
65
70
75
80
(6) Reinigungsverfahren(6) cleaning method
Die Kulturbouillon, die durch die Züchtung des Bacillus ATCC 21783 erhalten worden war, wurde durch Zusatz von 5molarer CaCK-Lösung auf den pll-Wcrt7 eingestellt, wobei sich Niederschläge bildeten, die abzentrifugiert wurden.The culture broth obtained by culturing Bacillus ATCC 21783 became by adding 5 molar CaCK solution to the pII-Wcrt7 set, whereby precipitates formed, which were centrifuged off.
Zu dem FiItrat wurde 1A Volumen Aceton zugesetzt, worauf sich wieder Niederschläge bildeten.To the FiItrat 1 A volume of acetone was added, followed by re-formed precipitates.
Diese wurden abgetrennt und in Wasser gelöst.These were separated and dissolved in water.
Die Lösung wurde über Nacht der Dialyse unterworfen und danach mit Polyathylenglykol konzentriert. Nach der Gelfiltrations-Chromatographie wurden aktive Fraktionen abgetrennt, die auf einer DÄDÄ-Cellulose-Kolonnc absorbiert wurden. Diese wurde mit einer Lösung, welche lmillimolar an CaCI1 und lOmillimolaran Fris-hydro.xymethylaminomethan-HCI war und den pH-Wert 8,5 besaß üquilibriert. Danach wurde das Enzym mit CaCl:-Lösung eluicrt, welche eine Konzentration von 5 -50 Millimol/I, tzewöhnlich 40 Millimol/1, hatte.The solution was dialysed overnight and then concentrated with polyethylene glycol. After gel filtration chromatography, active fractions were separated off and absorbed on a DÄDÄ cellulose column. This was equilibrated with a solution which was 1 millimolar in CaCl 1 and 10 millimolar in Fris-hydro.xymethylaminomethane-HCl and had a pH of 8.5. The enzyme was then eluted with CaCl : solution, which had a concentration of 5-50 millimoles / l, usually 40 millimoles / l.
Die aktive Fraktion wurde somit abgetrennt und zur Gewinnung des Endproduktes durch Gclfiltralions-Chromatographie gereinigt.The active fraction was thus separated and used for the recovery of the end product by gel filtration chromatography cleaned.
Aus Kurven, welche die Beziehung zwischen dem pH-Wert und der Enzymaktivität vor und nach der Reinigung zeigen, geht kein Unterschied hervor.From curves showing the relationship between pH and enzyme activity before and after Showing purification, there is no difference.
(7) Einheitlichkeit des Hn/yms(7) Uniformity of the Hn / yms
Aus den nachstehend angegebenen Ergebnissen geht hervor, daß das erfindungsgemäß erhaltene Enzym einheitlich ist.From the results shown below, it can be seen that the enzyme obtained in the present invention is uniform.
1. Die .Sedimentationskonstante bei der Analyse mit der Ultrazentrifuge be'rug etwa 4 S.1. The sedimentation constant in the analysis with the ultracentrifuge was about 4 S.
2. Die Gelfillrations-Chromatographie ergab mir eine einzige Aktivitätsspitze.2. Gel filtration chromatography gave me a single peak of activity.
3. Die Diskelektrophoretische Analyse bei dem pll-Wert 8.3 bestätigte, daß das Enzym monndisper>> war.3. The disk electrophoretic analysis at the pll value 8.3 confirmed that the enzyme monndisper >> was.
4. Das Verhältnis /wischen den Fn/ymakiKitälen bei den pH-Werten zwischen 4 iinii '.· wurde auch dann nicht verändert, wenn die Enzwnaktivität durch Erhitzung teilweise verlorenging.4. The ratio / between the Fn / ymaki channels at pH values between 4 iinii '. · became not changed even if the enzwn activity was partially lost by heating.
In der Tabelle1) sind die physikaliich-chemischen Eigenschaften des Enzyms mit denen von bekannten Annlasen verglichen, beispielsweise . er -.accharili-/ierendeii und verflüssigenden Am ν lasen, die aus einer Kultur des Mikroorganismus Bacillus suhiilis gewonnen wurden (siehe »Advances in Applied Microbiology«, 7. s. 243 |1%5|).In Table 1 ) the physico-chemical properties of the enzyme are compared with those of known annases, for example. er -.accharili- / ierendeii and liquefying am ν read from a culture of the microorganism Bacillus suhiilis (see "Advances in Applied Microbiology", 7. p. 243 | 1% 5 |).
Das" erfindungsgemäße Enzym ist dadurch gekennzeichnet, daß es drei optimale pH-Werte. \on pH 4.5. pH 7 und pH 9. d. h. eine Aktivität in einem breiten Bereich, besitzt.The "enzyme according to the invention is characterized in that that there are three optimal pH levels. \ on pH 4.5. pH 7 and pH 9. d. H. an activity in a broad Area, owns.
Diese Ergebnisse führen zu dem Schluß, daß das erfindungsgemäße Enzym eine neuartige verflüsM-uende Amylasc ist.These results lead to the conclusion that the enzyme according to the invention is a novel liquefying agent Amylasc is.
\us einer Kultur des Bacillus suhtilis
gewonnene Amylascn ErfinilungsgcmaM
erhaltene AAmylascn invention gene obtained from a culture of Bacillus suhtilis
received A
Art
HitzebeständigkeitArt
Heat resistance
verflüssigend
65-80 (liquefying
65-80 (
saccharifizierend
55-70 Csaccharifying
55-70 C
verflüssigendliquefying
hl)-In ( hl) -In (
Fortset/uni!Continued / uni!
Aus einer Kultur des liucillus sublilis gewonnene AmvtosenFrom a culture of the liucillus sublilis won amvtoses
lirfindungsgemüli
erhaltene Amylusclirfindungsgemüli
preserved amylusc
Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß aus dem Vergleich der physikalisch-chemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Enzyms, der alkalischen Amylase, mit denen der bekannten Amylase deutlich hervorgeht, daß es sich um eine neuartige Amylase handelt, die sich von bekannten Amylasen unterscheidet.In summary it can be stated that from the comparison of the physicochemical properties of the enzyme according to the invention, alkaline amylase, with those of the known amylase clearly shows that it is a novel amylase, which is different from known amylases differs.
Solche Amylasen sind in den deutschen Offenlcgungsschriftcn 20 44 513 und 2044 984 beschrieben. Zum Nachweis der Neuartigkeil des erfindungsgemiißen Bucillus-Slamm ATCC 21 /83 wurde dessen Aktivität mit derjenigen der in der entgegengehaltenen DT-OS 2044 513 genannten BacillenSuch amylases are described in the German Offenlegungsschrift 20 44 513 and 2044 984 described. To demonstrate the novel wedge of the invention Bucillus slam ATCC 21/83 became its Activity with that of the bacilli mentioned in the cited DT-OS 2044 513
ATCC 21592 (A-40)
ATCC 21591 (A-59)
ATCC 21596 (27-1)
ATCC 21593 (124-1)
ATCC 21595 (135)
ATCC 21594 (169)ATCC 21592 (A-40)
ATCC 21591 (A-59)
ATCC 21596 (27-1)
ATCC 21593 (124-1)
ATCC 21595 (135)
ATCC 21594 (169)
und derjenigen der in der IDT-OS 20 44 984 genannten Bacillenand those mentioned in IDT-OS 20 44 984 Bacilli
FERM P-374 Bacillus subtilis AJ-3250FERM P-374 Bacillus subtilis AJ-3250
FERM P-375 AJ-3252FERM P-375 AJ-3252
FERM P-376 Bacillus sp. AJ-3255FERM P-376 Bacillus sp. AJ-3255
FERM P-660 AJ-3298FERM P-660 AJ-3298
FERM P-661 AJ-3299FERM P-661 AJ-3299
verglichen.compared.
Es zeigen sich für den erfindungsgemäßen Stamm ATCC 21783 und die bekannten, oben aufgeführten Stämme Optima bei den folgenden pH-Werten: siehe vergleichende Zusammenstellung.It shows for the strain ATCC 21783 according to the invention and the known ones listed above Strains Optima at the following pH values: see comparative list.
Vergleichende ZusammenstellungComparative compilation
5-105-10
4,5, 7,0, 9,0
+ )4.5, 7.0, 9.0
+ )
15%15%
is Als einziger Bacillus besitzt der erfindungsgemäß Bacillus ATCC 21783 drei Aktivitätsmaxima un< somit eine Aktivitätsbreite von fast pH 3 bis fast pH 12 Zum Nachweis des technischen Fortschritts wir(is The only Bacillus that has the invention Bacillus ATCC 21783 three activity maxima and thus an activity range from almost pH 3 to almost pH 12 To prove the technical progress we (
ferner die Stabilität des erfindungsgemäß hergestellte!also the stability of the inventively produced!
Enzyms mit der der Enzymenach den DT-OS 2044 5 K und 2044 984 verglichen.Enzyme with that of the enzymes according to DT-OS 2044 5 K and 2044,984.
Hinsichtlich eier Wärmestabilität weist das erfin dungsgemäß hergestellte Enzym eine Aktivität von 100% bei 65 ( und pH 4 und pH 9 auf, aus dei DT-OS 2044 513 bekannte Enzyme besitzen dageger in Gegenwart \un Ca1+ bei 55 ( eine Restaktivitä von nur 50%.With regard eggs thermal stability, the enzyme OF INVENTION manure produced according to an activity of 100% at 65 (and pH 4 and pH 9, known from dei DT-OS 2 044 513 enzymes have dageger in the presence \ un Ca 1+ at 55 (a Restaktivitä of only 50%.
Die aus der DT-OS 20 44 984 bekannten Enzyme sind bei einem pH 5,5 bis 9, bzw. bei einem pH 7.0The enzymes known from DT-OS 20 44 984 are at a pH 5.5 to 9, or at a pH 7.0
ίο bis 10,0, bzw. bei einem pH 8,0 bis 10,0 und be einem pH 6.0 bis 11,0 stabil. Hier bietet sich dem Fachmann die Chance, wenn bei pH 4 gearbeitet werden muß, sofort auf das Enzym des erfindungsgemäßen Verfahrens zurückgreifen zu können.ίο up to 10.0, or at a pH 8.0 to 10.0 and be stable at pH 6.0 to 11.0. Here the skilled person has the chance when working at pH 4 must be able to immediately fall back on the enzyme of the method according to the invention.
Bei der Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten Enzyms als Zusatz zu Detergentien wird es in Pulverform direkt in das Detergens eingeführt, das beispielsweise aus Natriumdodecylbenzolsulfonat (DBS) bestehen kann. Dieses Präparat unterliegt keinen Begrenzungen z.B. hinsichtlich des pH-Wertes der fertigen Dclcrgens-Lösung oder des Mischungsverhältnisses der Detergcns-Bestandteile und der Zusatzstoffe. Beispielsweise erzielt man durch den Zusatz von 0,01 bis 1,0 Gewichtsprozent des erfindungsgemäß hergestellten Enzyms eine gute Wirkung, d. h. eine gute Amylolyscwirkung.When the enzyme prepared according to the invention is used as an additive to detergents, it becomes in powder form introduced directly into the detergent, for example from sodium dodecylbenzenesulfonate (DBS) can exist. This preparation is not subject to any restrictions, e.g. with regard to the pH value of the finished dye solution or the mixing ratio the detergent ingredients and additives. For example, the addition from 0.01 to 1.0 percent by weight of the enzyme prepared according to the invention has a good effect, d. H. one good amylolysis effect.
Das erfindungsgemäß hergestellte Enzym wurde während eines bestimmten Zeitraums in Anwesenheit eines Detergens bei 40 C bebrütet. Danach wurde die Restaktivität des Enzyms gemessen.The enzyme produced according to the invention was in the presence for a certain period of time a detergent is incubated at 40 C. The residual activity of the enzyme was then measured.
Wie ersichtlich besitzt als einziger
Bacillus ATCC 21783 drei Optima.As can be seen, is the only one who owns
Bacillus ATCC 21783 three optima.
Bacillus der VersuchsmethodeBacillus the experimental method
Im Zeitpunkt der Berührung mit dem erfindungsgemäßen Enzym hatte das Detergens eine Konzentration von 0,1 %. Als Detergens wurde Natriumdodecylbenzolsulfonat (DBS) verwendet. Im Zeitpunkt der Reaktion wurde mit Hilfe einer Glycin-NaCI-NaOH-Pufferlösung ein pH-Wert von 10,5 eingestelltAt the time of contact with the invention Enzyme, the detergent had a concentration of 0.1%. Sodium dodecylbenzenesulfonate was used as a detergent (DBS) used. At the time of the reaction, a glycine-NaCl-NaOH buffer solution was used adjusted to a pH of 10.5
ReaktionslösungReaction solution
Detergens 0,5% 2 mlDetergent 0.5% 2 ml
Glycin-NaCl-NaOH-Puffcrlösung 3 ml
Frfindungsgemäß hergestelltesGlycine-NaCl-NaOH buffer solution 3 ml
In accordance with the invention
Enzym (20IX) E/ml) 1 mlEnzyme (20IX) U / ml) 1 ml
Wasser-Zusatz 4 mlWater addition 4 ml
Ergebnisseresults
Restaktivität des erfindungsgemäß hergestellten
EnzymsResidual activity of the produced according to the invention
Enzyme
Reaktionstemperatur: 4CCReaction temperature: 4CC
Name des Mikroorganismus Name of the microorganism
Restaktivität (%)Residual activity (%)
0 Min 30 Min. 60 Min.0 min 30 min 60 min.
Bacillus ATCC 21783 100Bacillus ATCC 21783 100
110110
9898
Nachstehend werden Ausfuhrungsbeispiele der Erfindung beschrieben:Exemplary embodiments of the invention are described below:
Lösliche Stärke
K2HPO4
Hefeextrakt
Pepton
MgSO4 ■ 7 H2OSoluble starch
K 2 HPO 4
Yeast extract
Peptone
MgSO 4 · 7 H 2 O
20 g20 g
IgIg
5g
10g5g
10g
0,2 g0.2 g
Der vorstehend angegebene Ansatz wurde in 900 ml Wasser gelöst und die Lösung 15 Minuten lang bei 115°C sterilisiert. Eine Lösung von 10% Na2CO3 in 100 ml Wasser wurde 15 Minuten lang bei 115°C sterilisiert. Durch Mischen dieser beiden Lösungen wurde ein Kulturmedium erhalten, von dem 250 ml in einen abgesetzten Schüttelkolben mit einem Fassungsvermögen von 11 eingebracht wurden. Das in dem Kolben befindliche Kulturmedium wurde mit dem Bacillus ATCC 21783 geimpft, der in demselben Medium über Nacht vorbebrütet worden war. Dann wurde der pH-Wert des Mediums auf etwa 10 eingestellt und das Medium 48 Stunden lang bei 37 0C geschüttelt. Die Zellen wurden mit Hilfe einer Zentrifuge von dem Kulturmedium abgetrennt Bei dem pH-Wert 9 enthielt 1 ml des Kulturfiltrats 2500 Einheiten alkalische Amylase.The mixture given above was dissolved in 900 ml of water and the solution was sterilized at 115 ° C. for 15 minutes. A solution of 10% Na 2 CO 3 in 100 ml of water was sterilized at 115 ° C. for 15 minutes. By mixing these two solutions, a culture medium was obtained, 250 ml of which was placed in a shake-off flask with a capacity of 11 liters. The culture medium in the flask was inoculated with the Bacillus ATCC 21783, which had been pre-incubated in the same medium overnight. The pH of the medium was then adjusted to about 10 and the medium was shaken at 37 ° C. for 48 hours. The cells were separated from the culture medium with the aid of a centrifuge. At pH 9, 1 ml of the culture filtrate contained 2500 units of alkaline amylase.
Nach gründlichem Abkühlen der Kulturbouillon wurden ihr 3 Volumen Aceton zugesetzt, wodurch das Enzym quantitativ ausgefällt wurde. Der Niederschlag wurde gründlich mit Aceton gewaschen und luftgetrocknet. Aus 11 der Kulturbouillon wurden etwa 11g eines bräunlichen Pulvers gewonnen.After the culture broth had cooled down thoroughly, 3 volumes of acetone were added to it, whereby the enzyme was precipitated quantitatively. The precipitate was washed thoroughly with acetone and air dried. About 11 g of a brownish powder were obtained from 11 of the culture broth.
Die auf diese Weise erhaltene Probe hatte einen optimalen pH-Wert von etwa 9,0 und erwies sich als alkalische Amylase (spezifische Aktivität: 200 000 E/g).The sample thus obtained had an optimal pH of about 9.0 and was found to be alkaline amylase (specific activity: 200,000 U / g).
Beispiel 2
Zusammensetzung des Kulturmediums:Example 2
Composition of the culture medium:
5555
Der vorstehend angegebene Ansatz wurde in 900 ml Wasser gelöst, mit NaOH auf einen pH-Wert von 6 bis 6,5 eingestellt und 15 Minuten lang bei 115°C sterilisiert. Eine Lösung von 10 % Na2CO3 in 100 ml Wasser wurde 15 Minuten lang bei 115X sterilisiert. Durch Mischen dieser beiden Lösungen wurde ein Kulturmedium erhalten, von dem 100 ml in einen abge-The mixture given above was dissolved in 900 ml of water, adjusted to a pH of 6 to 6.5 with NaOH and sterilized at 115 ° C. for 15 minutes. A solution of 10% Na 2 CO 3 in 100 ml of water was sterilized at 115X for 15 minutes. By mixing these two solutions, a culture medium was obtained, 100 ml of which was poured into a
setzten Schüttelkolben mit einem Fassungsvermögen von 11 eingebracht wurden. Das in dem Kolben befindliche Kulturmedium wurde mit dem Bacillus ATCC 21783 geimpft, der in demselben Medium über Nacht vorbebrütet worden war. Dann wurde das Medium 72 Stunden lang bei 37°C geschüttelt Die Zellen wurden mi» Hilfe einer Zentrifuge von dem Kulturmedium abgetrennt. Bei dem pH-Wert 9 enthielt 1 ml des Kulturfiltrats 3800 Einheiten alkalische Amylase.Put shake flasks with a capacity of 11 were introduced. The one in the piston Culture medium was inoculated with the Bacillus ATCC 21783, which was found in the same medium above Had been pre-incubated the night before. The medium was then shaken at 37 ° C for 72 hours Cells were separated from the culture medium with the aid of a centrifuge. Contained at pH 9 1 ml of the culture filtrate 3800 units of alkaline amylase.
Nach dem gründlichen Abkühlen der Kulturbouillon wurden ihr 3 Volumen Aceton zugesetzt, wodurch das Enzym quantitativ ausgefällt wurde. Der Niederschlag wurde gründlich mit Aceton gewaschen und luftgetrocknet Aus 11 der Kulturbouillon wurden etwa 12 g eines bräunlichen Pulvers gewonnen.After the culture broth had cooled down thoroughly, 3 volumes of acetone were added to it, whereby the Enzyme was precipitated quantitatively. The precipitate was washed thoroughly with acetone and air dried About 12 g of a brownish powder were obtained from 11 of the culture broth.
Die auf diese Weise erhaltene Probe hatte einen optimalen pH-Wert von etwa 9,0 und erwies sich als alkalische Amylase (spezifische Aktivität: 350 000 E/g).The sample thus obtained had an optimum pH of about 9.0 and was found to be as alkaline amylase (specific activity: 350,000 U / g).
Zusammensetzung des Mediums:
Ansatz 1Composition of the medium:
Approach 1
4545
Der Ansatz A wurde in 900 ml Wasser gelöst und 15 Minuten lang bei 115°C sterilisiert. Eine Lösung von 1 % NaHCO3 in 100 ml Wasser wurde 15 Minuten lang bei 115 0C sterilisiert. Durch Mischen dieser beiden Lösungen wurde ein Kulturmedium erhalten, von dem 250 ml in einen abgesetzten Schüttelkolben mit einem Fassungsvermögen von 11 eingebracht wurden. Das in dem Kolben befindliche Kulturmedium wurde mit dem Bacillus ATCC 21783 geimpft, der in demselben Medium über Nacht vorbebrütet worden war. Dann wurde das Medium auf einen pH-Wert von etwa 10 eingestellt und 72 Stunden lang bei 37X geschüttelt. Die Zellen wurden mit Hilfe einer Zentrifuge von dem Kulturmedium abgetrennt. Bei dem pH-Wert 9 enthielt ImI des Kulturfiltrats 3500 Einheiten alkalische Amylase.Approach A was dissolved in 900 ml of water and sterilized at 115 ° C. for 15 minutes. A solution of 1% NaHCO 3 in 100 ml water was sterilized for 15 minutes at 115 0 C. By mixing these two solutions, a culture medium was obtained, 250 ml of which was placed in a shake-off flask with a capacity of 11 liters. The culture medium in the flask was inoculated with the Bacillus ATCC 21783, which had been pre-incubated in the same medium overnight. The medium was then adjusted to pH about 10 and shaken at 37X for 72 hours. The cells were separated from the culture medium using a centrifuge. At pH 9, ImI of the culture filtrate contained 3500 units of alkaline amylase.
Nach gründlichem Abkühlen der Kulturbouillon wurden ihr 3 Volumen Aceton zugesetzt, wodurch das Enzym quantitativ ausgefällt wurde. Der Niederschlag wurde gründlich mit Aceton gewaschen und luftgetrocknet. Aus 11 der Kulturbouillon wurden etwa 10,5 g eines bräunlichen Pulvers gewonnen.After the culture broth had cooled down thoroughly, 3 volumes of acetone were added to it, whereby the enzyme was precipitated quantitatively. The precipitate was washed thoroughly with acetone and air dried. About 10.5 g of a brownish powder were obtained from 11 of the culture broth.
Die auf diese Weise erhaltene Probe hatte einen optimalen pH-Wert von etwa 9,0 und erwies sich als alkalische Amylase (spezifische Aktivität: 320 000 E/g).The sample thus obtained had an optimal pH of about 9.0 and was found to be alkaline amylase (specific activity: 320,000 U / g).
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen1 sheet of drawings
Claims (1)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| JP2507971 | 1971-04-19 |
Publications (3)
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|---|---|
| DE2218783A1 DE2218783A1 (en) | 1972-11-02 |
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| DE2218783C3 true DE2218783C3 (en) | 1978-02-02 |
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