DE2143062A1 - Water-insoluble enzyme preparation and process for its production - Google Patents
Water-insoluble enzyme preparation and process for its productionInfo
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Description
"Wasserunlösliches Enzympräparat und Verfahren zu seiner Herstellung""Water-insoluble enzyme preparation and process for its production"
Priorität: 27. August 1970 Großbritannien Anmelde-Nr. 41262/70 k. August 1971 Großbritannien Anmelde-Nr. 36601/71Priority: August 27, 1970 Great Britain registration no. 41262/70 k. August 1971 Great Britain registration no. 36601/71
Die Erfindung betrifft wasserunlösliche Enzympräparate, welche mindestens eine Desacylase mit Spaltaktivität in Bezug auf die Amidbindung von Penicillinkörpern enthalten.The invention relates to water-insoluble enzyme preparations which contain at least one deacylase with cleavage activity in relation to the Contain amide bond of penicillin bodies.
Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, wasserunlösliche Enzympräparate zur Verfügung zu stellen, die aus dem betreffenden Reaktionsmedium zwecks Wiederverwendung isoliert werden können und die sich außerdem sehr gut dazu eignen, um das betreffende Enzym in dieser Form zu lagern oder zu transportieren. Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Enzyrnpräparate besteht überdies darin, daß die bei ihrer Verwendung; erhältliche 6-Amiiiopenicillansäure einen höheren Reinheitsgrad aufweist als wenn o.ine wasserlösliche Pr-ni oillin-Desacylase verwendet wird, da bei Anwendung dor erfindungsgomäßen Enzympräparate in dem Unisetzungsprodukt im allgemeinen keine Enzymspuren mehr vorge-Accordingly, it is an object of the present invention to provide water-insoluble enzyme preparations which can be isolated from the reaction medium in question for reuse and which are also very suitable for storing or transporting the enzyme in question in this form. An advantage of the enzyme preparations according to the invention is, moreover, that the when used; 6-Amiiiopenicillanäure available has a higher degree of purity than if a water-soluble Pr-ni oillin deacylase is used, since when using the inventive enzyme preparations in the conversion product generally no more traces of enzyme.
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funden werden können.can be found.
Außerdem können die erfindungsgemäßen Enzympräparate auch dafür verwendet werden, um Schutzgruppen aus N-Aeyl-DL-Aminosäuren enzymatisch abzutrennen und diese somit in reiner Form wiederzugewinnen. In addition, the enzyme preparations according to the invention can also be used for protecting groups from N-ayl-DL-amino acids to be separated enzymatically and thus recovered in pure form.
Die wasserunlöslichen Enzympräparate sind dadurch gekennzeichnet, daß sie aus mindestens einer Desacylase mit SpaltaktivitätThe water-insoluble enzyme preparations are characterized by that they consist of at least one deacylase with cleavage activity
bestehen, in Bezug auf die Amidbindung von Penieil3inkö-p vn/ wobei diese Desacylase mittels eines wasserlöslichen Dialdehyds an einen festen, wasserunlöslichen absorbierenden Stoff gebunden ist.exist, with regard to the amide bond of Penieil3inkö-p vn / whereby this deacylase is bound to a solid, water-insoluble absorbent by means of a water-soluble dialdehyde.
Vorzugsweise wird die betreffende Desacylase aus Bakterien gewonnen, beispielsweise aus Escherichia coil, falls das Enzympräparat für die Aufspaltung von Benzylpenicillin und zur Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure eingesetzt werden soll. Palis dagegen mittels des Präparates Phenoxymethylpenicillin gespalten werden soll, so wird die Desacylase zweckmäßig aus w PiIzarten und Actinomyceten gewonnen.The deacylase in question is preferably obtained from bacteria, for example from Escherichia coil, if the enzyme preparation is to be used for splitting benzylpenicillin and for obtaining 6-aminopenicillanic acid. Palis to undergo cleavage by means of the preparation phenoxymethylpenicillin, the deacylase is obtained from appropriate w PiIzarten and actinomycetes.
Bei dem wasserlöslichen Dialdehyd handelt es sich vorzugsweise um Glyoxal oder Glutaraldehyd.The water-soluble dialdehyde is preferably glyoxal or glutaraldehyde.
Als festen wasserunlöslichen, absorbierenden Stoff kann man an sich jedes wasserunlösliche absorbierende Material verwenden, doch werden feinverteilte polymere Stoffe bevorzugt, weil einAs a solid, water-insoluble, absorbent substance, one can use Any water-insoluble absorbent material can be used, but finely divided polymeric materials are preferred because a
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solches Enzympräparat eine größere Aktivität aufweist. Man muß das wasserunlösliche absorbierende Material derart auswählen, daß mindestens 25 g des fertigen Enzympräparates in Form einer Packung in einer Kolonne von 30,^8 cm χ 2,5^ cm mit einer.Wirksamkeit von mindestens 90 S? während eines Zeitraumes von mindestens 12 Stunden bei 37°C, 5 πΊ .1e Stunde einer 0,5piOzentigen (Gewicht/ Volumen) wässrigen Lösung von DL-Phenylacetamido-phydroxyphenylglycin (nachstehend abgekürzt als PAPG) in das D-P-Hydroxyphenylglycin überführen, Zusätzlich sollen mindestens 50 g der erfindungsgemäßen Enzympräparate mindestens 70 % des in 100 ml einer 1-prozentigen (Gewicht/ Volumen) wässrigen Lösung enthaltenen Kaliumsalzes von Benzylpenicillin bei einem pH-Wert von 7*8 in einem gerührten Tank nach 6 Stunden und bei einer Temperatur von 37 C in 6-Aminopenicillansäure überführen.such enzyme preparation has a greater activity. The water-insoluble absorbent material must be selected in such a way that at least 25 g of the finished enzyme preparation in the form of a pack in a column of 30.8 cm × 2.5 ^ cm with an effectiveness of at least 90 S? during a period of at least 12 hours at 37 ° C, 5 πΊ .1e hour of a 0.5piOzentigen (weight / volume) aqueous solution of DL-phenylacetamido-hydroxyphenylglycine (hereinafter abbreviated as PAPG) to the DP-hydroxyphenylglycine, in addition, at least 50 g of the enzyme preparations according to the invention at least 70 % of the potassium salt of benzylpenicillin contained in 100 ml of a 1 percent (weight / volume) aqueous solution at a pH of 7 * 8 in a stirred tank after 6 hours and at a temperature of 37 C. convert into 6-aminopenicillanic acid.
Gut geeignete wasserunlösliche, absorbierende, feste Stoffe sind Cellulosepulver und die zahlreichen bekannten Cellulosederivate, ferner Ionenaustauscherharze, Silikagel, kolloidale Kieselsäure und polymere Stoffe.Well-suited water-insoluble, absorbent, solid substances are cellulose powder and the numerous known cellulose derivatives, also ion exchange resins, silica gel, colloidal silica and polymeric substances.
Ein besonders gut geeigneter polymerer Stoff ist Nylon, vorzugsweise in feinverteilter Form. Ganz besonders zweckmäßig ist dabei Nylon vom Typ 6,6 mit einem niedrigen Molekulargewicht und einer Tei lehengröße derart, dnß das Pulver durch ein AST!1'-Feinsieb Nr.35 (500 Mikron-Sieb) hindurchgeht, wobei dieses Nylon einen hohen Gehalt an Amino-Endgruppen aufweisen sol}., beispielsviei.seA particularly suitable polymeric material is nylon, preferably in finely divided form. Particularly useful here is nylon of the 6.6 type with a low molecular weight and a part size such that the powder is passed through an AST! # 35 1 'fine sieve (500 micron sieve), this nylon being said to have a high content of amino end groups, for example see
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200 bis 500 Grammäquivalent solcher Gruppen ,je 10 Gramm. Man kann das Nylon auch teilweise hydrolysieren, beispielsweise200 to 500 gram equivalent of such groups, 10 grams each can also partially hydrolyze the nylon, for example
Anzahl der mittels verdünnter Mineralsäure, um die/für die Anlagerung des Enzyms unter Mitwirkung des Dialdehyds zur Verfügung stehenden freien Aminogruppen zu erhöhen.Number of means of diluted mineral acid in order to / for the deposition of the Enzyme to increase the available free amino groups with the help of the dialdehyde.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung dieser Enzympräparate, welches dadurch' gekennzeichnet ist, daß man die ψ einzelnen Komponenten in wässrigem Medium bei einem pH-Wert von vorzugsweise 5 bis 9 miteinander in Berührung bringt und den gebildeten Enzymkomplex anschließend abtrennt. Man kann.dabei das wasserabsorbierende Material zuerst mit der Desacylase oder zuerst mit dem Dialdehyd in Berührung bringen oder die Kontaktierung kann mit diesen beiden Komponenten gleichzeitig' stattfinden.The invention also relates to a process for the preparation of these enzyme preparations, which is characterized 'by bringing the ψ individual components in an aqueous medium at a pH of preferably 5 to 9 contact each other and the enzyme complex formed is then separated. The water-absorbing material can first be brought into contact with the deacylase or first with the dialdehyde, or contact can be made with these two components at the same time.
Wenn man den absorbierenden Stoff zuerst mlt~dem""T5nzym in wässriger Lösung in Berührung bringt, so ist zur Erzielung einer guten ^ Absorption eine Verweilzeit von etwa 12 bis 24 Stunden sehr zweckmäßig. Anschließend wird dann das beladene Absorbens üblicherweise etwa 1 bis 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 0 bis 50°C mit dem Dialdehyd in Berührung gebracht. Auch wenn das Absorbens zuerst mit dem Dialdehyd und dann mit dem Enzym behandelt wird oder wenn die Kontaktierung mit beiden Komponenten gleichzeitig erfolgt, sind Behandlungszeiten der angegebenen Zeitdauer sehr erwünscht. Anschließend kann das feste Enzympräparat mit Wasser gewaschen werden, um nichtgebundenes Protein und nichtumgesetzten Dialdehyd zu entfernen.If the absorbent is first mixed with the "" enzyme in water Brings solution into contact, a residence time of about 12 to 24 hours is very useful in order to achieve good absorption. Then the loaded absorbent is then usually for about 1 to 24 hours at a temperature of 0 to 50 ° C brought into contact with the dialdehyde. Even if the absorbent is treated first with the dialdehyde and then with the enzyme or if the contact is made with both components at the same time, treatment times are the specified duration very welcome. The solid enzyme preparation can then be washed with water to remove unbound protein and unreacted To remove dialdehyde.
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Wenn der wasserunlösliche absorbierende Stoff keine chemischen Gruppen aufweist, welche mit dem D'ialdehyd reagieren können, so werden die absorbierten Enzymmoleküle durch die Einwirkung des Dialdehyds untereinander vernetzt. Wenn dagegen das Absorbens reaktive Gruppen enthält, welche mit dem Dialdehyd reagieren können, so tritt neben einer kovalenten Vernetzung der Enzymmoleküle mit dem absorbierenden Stoff unter Mitwirkung des Dialdehyds auch noch eine Vernetzung der Enzymmoleküle untereinander auf.If the water-insoluble absorbent substance does not have any chemical groups which can react with the aldehyde, so the absorbed enzyme molecules are cross-linked by the action of the dialdehyde. If, on the other hand, the absorbent Contains reactive groups which can react with the dialdehyde, so occurs in addition to a covalent crosslinking of the enzyme molecules with the absorbent substance, with the help of the dialdehyde, there is also a crosslinking of the enzyme molecules with one another on.
Die nachstehenden Beispiele 1 und 2 erläutern die Herstellung einer Penicillindesacylase. Die übrigen Beispiele erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Enzympräparate. Examples 1 and 2 below illustrate the preparation of a penicillin deacylase. The remaining examples explain the Production of the water-insoluble enzyme preparations according to the invention.
Man stellt eine teilweise gereinigte Penicillindesacylase her, indem man von einem Stamm NC IB 87^3 von Eseherichia coli ausgeht,, welcher Penicillindesacylase erzeugt. Aus den Zellen dieses Bakteriums wird das Enz:/m in einem Homogenisator durch mechanische Mittel freigesetzt, dann zentrifugiert man, behandelt die überstehende Lösung bis zur 40prozentigen Sättigung mit Ammoniumsulfat, verwirft den Niederschlag, setzt weiter Ammoniumsulfat bis zur 75prozentigen Sättigung hinzu, filtriert den dann gebildeten Niederschlag ab, löst ihn in Wasser, dialysiert ""·A partially purified penicillin deacylase is prepared starting from a strain NC IB 87 ^ 3 of Eseherichia coli ,, which produces penicillin deacylase. Enz: / m is made from the cells of this bacterium in a homogenizer mechanical means released, then centrifuged, the supernatant solution treated until 40 percent saturation with Ammonium sulfate, discards the precipitate, continues to add ammonium sulfate to 75 percent saturation, then filters it precipitate formed, dissolve it in water, dialyzed "" ·
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gegen Wasser und unterwirft schließlich der Gefriertrockagainst water and finally subjects the freeze-dry
Beispiel 2Example 2
Eine teilweise gereinigte" Penicillindesaeylase wird aus einem Mutantenstamm von Escherichia coll. NC IB 8743" hergestellt, indem man das Enzym aus den Zellen des Bakteriums freisetzt, dann mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 4,5 einstellt und schließlich die Zellrückstände abfiltriert oder durch Zentrifugieren entfernt.A partially purified "penicillin saeylase" is made from a Mutant strain of Escherichia coll. NC IB 8743 "produced by the enzyme is released from the cells of the bacterium, then adjusted to pH 4.5 with acetic acid and finally the cell debris is filtered off or removed by centrifugation.
25 g einer im Handel erhältlichen Diäthylaminoäthylcellulose werden in 100 ml eines 0,1m Natriumboratpuffers bei einem pH-Wert von 8,0 suspendiert und dann setzt man 2,5 g einer teilweise gereinigten Penicillindesacylase hinzu. Man rührt diese Mischung 24 Stunden lang sanft bei Zimmertemperatur, setzt dann 5 % (Gewicht/Volumen) Glutaraldehyd hinzu und rührt noch eine weitere Stunde lang.25 g of a commercially available diethylaminoethyl cellulose are suspended in 100 ml of a 0.1 M sodium borate buffer at a pH of 8.0 and then 2.5 g of a partially purified penicillin deacylase are added. This mixture is gently stirred for 24 hours at room temperature, then 5 % (weight / volume) glutaraldehyde is added and stirring is continued for an additional hour.
Anschließend wird der Peststoff abfiltriert,mit einer kleinen Menge der Pufferlösung ausgewaschen und dann sorgfältig zunächst mit Im-Natriumchloridlösung, dann mit O, Im-Natriumhydroxidlösung und schließlich.mit einer Im-Ammoniümehloridpufferlösung bei einem pH-Wert von 8,6 ausgewaschen. Man läßt die Cellulose noch über Nacht mit der Pufferlösung in Berührung, entfernt sie dannThen the pest is filtered off with a small one Amount of buffer solution washed out and then carefully first with Im sodium chloride solution, then with O, Im sodium hydroxide solution and finally with an Im ammonium chloride buffer solution washed out to a pH of 8.6. The cellulose is left in contact with the buffer solution overnight and then removed
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daraus und wäscht sie abschließend mit lm-Natriumchloridlösung und destilliertem Wasser. Dieses wasserunlösliche Enzympräparat hat eine solche Aktivität, daß es mit lOOprozentiger Wirksamkeit 20 Stunden lang 5 ml/Stunde einer 0,5prozentigen (Gewicht/ Volumen) PAPG-Losung In das entsprechende D-p-Hydroxyphenylglyoin überführt.from it and finally washes it with 1m sodium chloride solution and distilled water. This water-insoluble enzyme preparation has such an activity that it is 100 percent effective for 20 hours at 5 ml / hour of a 0.5 percent (weight / Volume) PAPG solution into the corresponding D-p-hydroxyphenylglyoin convicted.
Die Arbeitsweise von Beispiel 3 wird unter Verwendung eines im Handel erhaltlichen Pulvers aus Cellülosefasern als Absorbens
wiederholt. Dieses Enzympräparat weist eine derartige Aktivität auf, daß es l8 Stunden lang mit lOOprozentiger Wirksamkeit 5ml/
Stunde einer O,fiprozentigen (Gewicht /Volumen) PAPG-Lösung
enzymatisch spaltet, wobei 10 g dieses Präparates 18 Stunden
lang mit lOOprozentiger Wirksamkeit 32 bis 3^ ml eines 5prozentigen
(Gewicht/Volumen) Substrates spalten.The procedure of Example 3 is followed using a commercially available cellulose fiber powder as the absorbent
repeated. This enzyme preparation has such an activity that it contains 5 ml / hour of 0.5 percent (weight / volume) PAPG solution for 18 hours with 100 percent effectiveness
enzymatically cleaves, with 10 g of this preparation 18 hours
Split 32 to 3 ml of a 5 percent (weight / volume) substrate for a long time with 100 percent effectiveness.
Die Arbeltsweise von Beispiel 3 wird unter Verwendung im Handel
erhältlicher Carboxymethylcellulose als absorbierender Stoff
wiederholt, wobei jedoch nur 2 g des Enzyms verwendet v/erden.
Dieses Enzympräparat hat eine Aktivität derart, daß es 19 Stunden lang mit lOOprozentiger Wirksamkeit 5 ml/Stunde einer 0,5ρΐΌ-zentigen
(Gewicht/ Volumen)PAPG-Lösung enzymatisch spaltet.The procedure of Example 3 is carried out using commercially available carboxymethyl cellulose as the absorbent material
repeated except that only 2 g of the enzyme are used.
This enzyme preparation has an activity such that it enzymatically cleaves 5 ml / hour of a 0.5 pΐΌ-cent (weight / volume) PAPG solution for 19 hours with 100 percent effectiveness.
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Beispiel 6Example 6
Die Arbeitsweise von Beispiel 3 wird unter Verwendung von 25 g im Handel erhältlicher Epichlorhydrin-Triäthanolamincellulöse als Absorbens wiederholt. Die Pufferlösung hat dabei aber einen pH-Wert von 8,75 · Dieses Enzympräparat hat eine Aktivität derart, daß es 19 Stunden lang mit lOOprozentiger Wirksamkeit 5 ml/Stunde einer O,5prozentigen (Gewicht/Volumen) PAPG-Lösung spaltet.The procedure of Example 3 is followed using 25 g commercially available epichlorohydrin-triethanolamine celluloses as an absorbent repeatedly. But the buffer solution has one pH value of 8.75 This enzyme preparation has an activity such as that it is 5 ml / hour for 19 hours with 100 percent effectiveness a 0.5 percent (weight / volume) PAPG solution.
Man läßt 5 g Diäthylaminoäthyl-Sephadex A5O 3 Tage lang in einer O,lm-Natriumboratpufferlösung bei einem pH-Wert von 8,0 quellen. Anschließend dekantiert man die überschüssige Pufferlösung ab und setzt 1 g Enzym hinzu. Man rührt 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur. Dann setzt man 5 % (Gewicht/ Volumen) Glutaraldehyd hinzu und rührt noch eine weitere Stunde lang. Schließlich wird das Enzympräparat gemäß der Arbeitsweise von Beispiel J> sorgfältig ausgewaschen. Dieses Enzympräparat hat eine Aktivität derart, daß es 20 Stunden lang mit 100 % Wirksamkeit 5 ml/Stunde einer 0,5prozentigen (Gewicht/ 'Volumen) PAPG-Lösung enzymatisch spaltet.5 g of diethylaminoethyl Sephadex A5O are allowed to swell for 3 days in an 0.1m sodium borate buffer solution at a pH of 8.0. The excess buffer solution is then decanted off and 1 g of enzyme is added. The mixture is stirred for 24 hours at room temperature. Then 5 % (weight / volume) glutaraldehyde is added and stirring is continued for a further hour. Finally, the enzyme preparation is carefully washed out according to the procedure of Example J>. This enzyme preparation has an activity such that it enzymatically cleaves 5 ml / hour of a 0.5 percent (weight / volume) PAPG solution for 20 hours with 100% effectiveness.
25 g des Ionenaustauscherharzes Amberlite IR-45 (OH) werden in 100 ml eines 0,lm-Phosphatpuffers bei pH 7>0 suspendiert. Dann setzt man 4 g teilweise gereinigte Penicillindesacylase25 g of the ion exchange resin Amberlite IR-45 (OH) become suspended in 100 ml of a 0.1 m phosphate buffer at pH 7> 0. Then 4 g of partially purified penicillin deacylase are used
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hinzu. Die weitere Behandlung mit Glutaraldehyd und das anschliessende sorgfältige Auswaschen erfolgt gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 3. Mit diesem Enzympräparat werden die folgenden Ergebnisse erzielt;added. The further treatment with glutaraldehyde and the following Careful washing is carried out according to the procedure of Example 3. With this enzyme preparation, the following Results achieved;
1) 25 g des Präparates weisen eine Aktivität derart auf,daß1) 25 g of the preparation have an activity such that
sie 500 Stunden lang mit lOOprozentiger Wirksamkeit 70 ml/Stunde einer 5prozentigen (Gewicht/Volumen) PAPG-Lösung enzymatisch spalten.it for 500 hours with 100 percent effectiveness 70 ml / hour a 5 percent (weight / volume) PAPG solution enzymatically columns.
2) 40 g dieses Enzympräparates werden dagegen zu einer Serie2) 40 g of this enzyme preparation, on the other hand, become a series
von drei enzymatischen Behandlungen einer 4prozentigen (Gewicht/ ' Volumen) Lösung von Kaliumbenzylpenicillin bei 37°C und einem. pH-V/ert von 7*8 verwendet, wobei 400 ml Lösung behandelt werden. Nach jeder enzymatischen Behandlung wird das Enzym abfiltriert. In allen drei Fällen wird das Benzylpenicillin innerhalb von 6 Stunden in 6-Aminopenicillansäure umgewandelt.of three enzymatic treatments of a 4 percent (weight / ' Volume) solution of potassium benzylpenicillin at 37 ° C and one. pH value of 7 * 8 used, with 400 ml of solution being treated. The enzyme is filtered off after each enzymatic treatment. In all three cases the benzylpenicillin is within Converted to 6-aminopenicillanic acid for 6 hours.
Man stellt gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 2 ein geklärtes Homogenat von E. coli her, welches durch Zusatz von l6,4 g pinatriumhydrogenphosphat und 1,1 g Natriumdihydrogenphosphat auf einen pH-Wert von 7 abgepuffert wird. Hierfür wird 1 Liter des Hornogenates verwendet. Dann suspendiert man darin 200 g des Ionenaustauncherharzes Amberlite 1R-45 (OH). Diese Suspen.sion wird 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt.According to the procedure of Example 2, a clarified E. coli homogenate is prepared which, by adding 16.4 g pinodium hydrogen phosphate and 1.1 g sodium dihydrogen phosphate is buffered to a pH of 7. 1 liter of the hornogenate is used for this. 200 g are then suspended in it the ion exchange resin Amberlite 1R-45 (OH). This suspension is stirred for 24 hours at room temperature.
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Anschließend setzt man 5 % (Gewicht / Volumen) Glutaraldehyd hinzu und läßt zwei Stunden stehen. Schließlich wird der Fest-. stoff abfiltriert, mit einer 5prozentigen Lösung (Gewicht/ Volumen) von Natriumbisulfit und anschließend mit einer 0,Im-Natriumbhloridlösung sowie mit Wasser gewaschen. Dieses Enzympräparat v/eist eine solche Aktivität auf, daß es 300 Stunden lang mit lOOprozentiger Wirksamkeit 8o bis 1OO ml/Stunde einer 5prozentigen (Gewicht/ Volumen) PAPG-Lösung spaltet, wobei nach Versuchsende praktisch immer noch kein Aktivitätsverlust festzustellen ist.Then 5 % (weight / volume) glutaraldehyde is added and the mixture is left to stand for two hours. Eventually the feast. The substance is filtered off, washed with a 5 percent solution (weight / volume) of sodium bisulfite and then with a 0, Im sodium chloride solution and with water. This enzyme preparation has such an activity that it cleaves 80 to 100 ml / hour of a 5% (weight / volume) PAPG solution for 300 hours with 100% effectiveness, with practically no loss of activity being observed at the end of the experiment.
Gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 2 wird ein geklärtes ZeIlhomogenat von E.coil hergestellt und der pH-Wert wird auf 5*0 eingestellt. Dann suspendiert man in dem Homogenat 200 g des Ionenaustauscherharzes Amberlite IR-45 (OH) und rührt 24 Stunden lang bei Raumtemperatur. Anschließend stellt man den pH-Wert auf 8,0 ein und setzt 1 % (Gewicht/ Volumen) Glutaraldehyd hinzu. Die weitere Aufarbeitung erfolgt gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 9· Dieses Enzympräparat weist eine derartige Aktivität auf, daß es 300 Stunden lang mit lOOprozentiger Wirksamkeit 35 ml/Stunde einer 5prozentigen fGewicht/ Volumen) PAPG-Lösung enzymatisch spaltet. Außerdem werden 20 g des Enzympräparates dazu verwendet, um in zwei aufeinanderfolgenden Versuchen 50 ml.einer 2prozentigen (Gewicht/ Volumen) Lösung vonAccording to the procedure of Example 2, a clarified cell homogenate from E.coil is produced and the pH is adjusted to 5 * 0. 200 g of the ion exchange resin Amberlite IR-45 (OH) are then suspended in the homogenate and the mixture is stirred for 24 hours at room temperature. The pH is then adjusted to 8.0 and 1 % (weight / volume) glutaraldehyde is added. The further work-up is carried out according to the procedure of Example 9. This enzyme preparation has such an activity that it enzymatically cleaves 35 ml / hour of a 5% weight / volume PAPG solution for 300 hours with 100% effectiveness. In addition, 20 g of the enzyme preparation are used to produce 50 ml of a 2 percent (weight / volume) solution of
-Kaliumsalz
Benzylpenicillin/bei einem pH-Wert von 7*8 und einer Temperatur-Potassium salt
Benzylpenicillin / at a pH of 7 * 8 and a temperature
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von 37°C enzymatisch zu spalten. In beiden Versuchen wird innerhalb von 3 Stunden eine ßOprozentige Umwandlung in 6-Aminopenicillansäure erzielt.enzymatically to cleave at 37 ° C. In both attempts, within A ßO percent conversion to 6-aminopenicillanic acid within 3 hours achieved.
Die Arbeitsweise von Beispiel 3 wird unter Verwendung von Silikagel als Absorbens und von J5 $ (Gewicht/ Volumen) Glutaraldehyd wiederholt. Dieses Enzympräparat weist eine solche Aktivität auf, daß es 20 Stunden .ang mit lOOprozcntiger Wirksamkeit 5 ml/Stunde einer 0,5prozentigen (Gewicht/ Volumen) PAPG-Lösung enzymatisch spaltet.The procedure of Example 3 is followed using silica gel as an absorbent and from J5 $ (weight / volume) glutaraldehyde repeated. This enzyme preparation has such an activity that it lasts 20 hours with 100% effectiveness 5 ml / hour of a 0.5 percent (weight / volume) PAPG solution enzymatically cleaves.
25 g eines handelsüblichen Aluminiumoxids (Gütegrad II) werden in 100 ml destilliertem Wasser suspendiert und dann setzt man 1,5 g Enzym hinzu. Der pH-Wert wird auf 5*0 eingestellt und dann rührt man 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur. Anschließend setzt man 2 % (Gewicht/ Volumen) Glutaraldehyd hinzu und stellt den pH-Wert auf 8,0 ein. Nach einer weiteren Stunde Rühren wird der Feststoff abfiltriert und gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 3 sorgfältig ausgewaschen. Dieses Enzympräparat weist eine Aktivität derart auf, daß es 15 Stunden lang mit lOOprozentiger Wirksamkeit 5 ml/Stunde einer 0,5prozentigen (Gewicht / Volumen) PAPG-Lösung enzymatisch spaltet. Außerdem werden 21 g dieses Präparates dazu verwendet, um nacheinander zwei enzymatisch©25 g of a commercially available aluminum oxide (grade II) are suspended in 100 ml of distilled water and then 1.5 g of enzyme are added. The pH is adjusted to 5 * 0 and then stirred for 24 hours at room temperature. Then 2 % (weight / volume) glutaraldehyde is added and the pH is adjusted to 8.0. After stirring for a further hour, the solid is filtered off and carefully washed out according to the procedure of Example 3. This enzyme preparation has an activity such that it enzymatically cleaves 5 ml / hour of a 0.5 percent (weight / volume) PAPG solution for 15 hours with 100 percent effectiveness. In addition, 21 g of this preparation are used to enzymatically ©
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Desacylierungen einer lprozentigen (Gewicht / Volumen) Lösung des Kaliumsalzes von Benzylpenicillin bei einem pH-Wert von "J, und einer Temperatur von J57°C in einem gerührten Reaktor von 400 ml Fassungsvermögen durchzuführen. Bei beiden Versuchen werden über 90 % des Benzylpenicillinsalzes in 6-Aminopenicillansäure umgewandelt.To carry out deacylation of a 1 percent (weight / volume) solution of the potassium salt of benzylpenicillin at a pH value of "J, and a temperature of J57 ° C. in a stirred reactor with a capacity of 400 ml. In both experiments, over 90 % of the benzylpenicillin salt in 6 -Converted aminopenicillanic acid.
10 g einer handelsüblichen kolloidalen Kieselsäure werden in ' 50 ml einer 0,Im-Phosphatpufferlösung mit einem pH von 7*0 suspendiert, welche außerdem 0,1 g/m einer teilweise gereinigten Penicillindesacylase enthält. Man schüttelt dann sanft 24 Stunden lang.10 g of a commercially available colloidal silica are in ' 50 ml of a 0.1 im phosphate buffer solution with a pH of 7 * 0 suspended, which also contains 0.1 g / m of a partially purified penicillin deacylase. Shake gently for 24 hours long.
AnschlJößend werden 5 % (Gewicht/Volumen) Glutaraldehyd hinzugesetzt und man schüttelt eine weitere Stunde. Schließlich wird ^ der Feststoff .abfiltriert und gemäß der Arbeitsweise von Beispiel J) sorgfältig ausgewaschen. Dieses Enzympräparat weist eine Aktivität derart auf, daß es 20 Stunden lang mit einer lOOprozentigen Wirksamkeit 5 ml/Stunde einer 0,5prozentigen PAPG-Lösung enzymatisch spaltet.Then 5 % (weight / volume) glutaraldehyde are added and the mixture is shaken for a further hour. Finally, the solid is filtered off and carefully washed out according to the procedure of Example J). This enzyme preparation has an activity such that it enzymatically cleaves 5 ml / hour of a 0.5% PAPG solution for 20 hours with a 100% effectiveness.
Zu 32 ml destilliertem Wasser werden 7,6 g Acrylamid, 0,4 g Ν,Ν'-Methylen-bisacrylamid, l8 mg Ammoniumpersulfat und 20 μΐ β,β-Dimethylaminopropionnitril zugesetzt. Diese Mischung wird7.6 g of acrylamide, 0.4 g of Ν, Ν'-methylene-bisacrylamide, 18 mg of ammonium persulfate and 20 μΐ of β, β-dimethylaminopropiononitrile are added to 32 ml of distilled water. This mixture will
.209810/1705 ..209810 / 1705.
- I5 - 2U3062- I 5 - 2U3062
sorgfältig entlüftet, und es bildet sich dann ein steifel Gel, welches durch ein 30-Maschien-Sieb gegeben wird.carefully deaerated, and a stiff gel then forms, which is passed through a 30-mesh sieve.
20 g dieses Polyacrylamidgels und 2 g einer teilweise gereinigten Penicillindesacylase werden in 50 ml eines 0,Im-Natriumboratpuffers mit einem pH-Wert von 8,0 eingetragen und dieses Gemisch wird 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur bewegt. Dann setzt man 5 % (Gewicht/Volumen) Glutaraldehyd hinzu und läßt eine weitere Stunde reagieren. Das Enzympräparat wird dann gemäß der Arbeitsweise von Beispiel J> sorgfältig ausgewaschen. Das fertige Präparat hat eine derartige Aktivität, daß es 20 Stunden lang mit lOOprozentiger Wirksamkeit 5 ml/Stunde einer 0,5prozentigen (Gewicht/'Volumen) PAPG-Lösung enzymatisch spaltet.20 g of this polyacrylamide gel and 2 g of a partially purified penicillin deacylase are introduced into 50 ml of a 0.1 lm sodium borate buffer with a pH of 8.0 and this mixture is agitated for 24 hours at room temperature. Then 5 % (weight / volume) glutaraldehyde is added and the mixture is left to react for a further hour. The enzyme preparation is then carefully washed out according to the procedure of Example J>. The finished preparation has such an activity that it enzymatically cleaves 5 ml / hour of a 0.5 percent (weight / volume) PAPG solution for 20 hours with 100 percent effectiveness.
Man verfährt gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 8 unter Verwendung des Ionenaustauscherharzes Amberlite IR-45 (OH), wobei jedoch der Glutaraldehyd·durch 5 % (Gewicht/ Volumen) Glyoxal ersetzt wird. Dieses Enzympräparat weist eine derartige Aktivität auf, daß es 20 Stunden lang mit lOOprozentiger Wirksamkeit 5 ml/Stunde einer 0,5prozentigen (Gewicht/ Volumen) PAPG--Lösung enzymatisch spaltet.The procedure of Example 8 is repeated using the ion exchange resin Amberlite IR-45 (OH), but the glutaraldehyde is replaced by 5 % (weight / volume) glyoxal. This enzyme preparation has such an activity that it enzymatically cleaves 5 ml / hour of a 0.5 percent (weight / volume) PAPG solution for 20 hours with 100 percent effectiveness.
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„14_ 2H3062 "14 _ 2H3062
Beispiel l6Example l6
10 g des Ionenaustauscherharzes Amberlite XAD 7 (ein makrovernetz tes Acrylsäureesterharz) werden in 100 ml eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 5,0 eingerührt, welcher Penicillindesacylase enthält. Man rührt 16 Stunden lang bei Zimmertemperatur. Dann wird der pH-Wert auf 8,0 angehoben, und man setzt 10 ml 50prozentige (Volumen/Volumen) Glutaraldehydlösung hinzu und rührt weitere 2 Stundenllang bei Zimmertemperatur. Der Peststoff wird dann abfiltriert und mit einer 5prozentigen (Gewicht/ Volumen) Lösung von Natriumbisulfit, anschließend mit O,5m-Phosphatpuffer vom pH 7,8 und zum Schluß mit Wasser gewaschen. Dieses Präparat wird dazu verwendet, um l60 ml einer 6prozentigen (Gewicht/ Volumen) Lösung des Kaliumsalzes von Benzylpenicillin enzymatisch zu spalten. In drei aufeinanderfolgenden Versuchen werden mittels des gleichen Enzympräparates über 80 % des Benzylpenicillins innerhalb von 4 bis 5 Stunden in 6-Aminopenicillansäure umgewandelt. -10 g of the ion exchange resin Amberlite XAD 7 (a macro network tes acrylic acid ester resin) are stirred into 100 ml of a phosphate buffer with a pH of 5.0, which contains penicillin deacylase. The mixture is stirred for 16 hours at room temperature. The pH is then raised to 8.0, and 10 ml of 50 percent (volume / volume) glutaraldehyde solution is added and the mixture is stirred for a further 2 hours at room temperature. The pesticide is then filtered off and washed with a 5 percent (weight / volume) solution of sodium bisulfite, then with 0.5m phosphate buffer of pH 7.8 and finally with water. This preparation is used to enzymatically break down 160 ml of a 6 percent (weight / volume) solution of the potassium salt of benzylpenicillin. In three successive experiments, over 80 % of the benzylpenicillin is converted into 6-aminopenicillanic acid within 4 to 5 hours using the same enzyme preparation. -
25 g handelsübliche Diäthylaminoäthylcellulose werden in 100 ml einer 0,Im-Phosphatpufferlösung mit einem pH von 5,0 suspendiert und dann setzt man 2,5 g Enzym hinzu. Diese Mischung wird 20 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt. Dann hebt man den pH-Wert auf 8,0 an und setzt 5 % (Gewicht/ Volumen) Glutaraldehyd hinzu und rührt noch 1 Stunde lang. Der Peststoff (Feuchtgewicht: 40 g) wird abfiltriert und dann gemäß der Arbeitsweise25 g of commercially available diethylaminoethyl cellulose are suspended in 100 ml of an 0.1 lm phosphate buffer solution with a pH of 5.0 and then 2.5 g of enzyme are added. This mixture is stirred for 20 hours at room temperature. The pH is then raised to 8.0 and 5 % (weight / volume) glutaraldehyde is added and the mixture is stirred for a further 1 hour. The pesticide (wet weight: 40 g) is filtered off and then according to the procedure
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-15- 2U3062-15- 2U3062
von Beispiel 9 sorgKltig ausgewaschen.from Example 9 carefully washed out.
20 g dieses Enzympräparates werden für die enzymatische Spaltung von 100 ml einer 2prozentigen (Gewicht/Volumen) Lösung des Kaliumsalzes von Benzylpenicillin verwendet, wobei man bei 37°C und einem pH-Wert von 7,8 arbeitet. Hierfür braucht man 2 Stunden. In fünf Folgeversuchen werden jeweils 95 % des Benzylpenieillinsalzes in 6-Aminopenicillansäure umgewandelt.20 g of this enzyme preparation are used for the enzymatic cleavage of 100 ml of a 2 percent (weight / volume) solution of the potassium salt of benzylpenicillin, working at 37 ° C. and a pH of 7.8. This takes 2 hours. In five subsequent experiments, 95 % of the benzylpenicillin salt is converted into 6-aminopenicillanic acid.
Bei s ρ i e 1 l8At s ρ i e 1 l8
25 g einer handelsüblichen Diäthylaminoäthylcellulose werden in 100 ml eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 8,0 suspendiert. Dann setzt man 5 % (Gewicht / Volumen) Glutaraldehyd hinzu und rührt weitere j30 Minuten. Schließlich setzt man 2,5 g der teilweise gereinigten Penicillindesacylase hinzu und rührt diese Mischung nochmals 2 Stunden lang. Dann filtriert man den festen Stoff ab und wäscht gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 9 sorgfältig aus.25 g of a commercially available diethylaminoethyl cellulose are suspended in 100 ml of a phosphate buffer with a pH of 8.0. Then 5 % (weight / volume) glutaraldehyde is added and the mixture is stirred for a further 30 minutes. Finally, 2.5 g of the partially purified penicillin deacylase are added and this mixture is stirred for a further 2 hours. The solid is then filtered off and carefully washed according to the procedure of Example 9.
20 g dieses Enzympräparates werden dazu verwendet, um 100 ml einer 2prozentigen (Gewicht/ Volumen) Lösung des Kaliumsalzes von Benzylpenicillin innerhalb von 2 Stunden bei einem pH-Wert von 7,8 und einer Temperatur von 37°C enzymatisch zu spalten. In zwei aufeinanderfolgenden Versuchen werden jeweils 95 % des Benzylpenieillinsalzes in 6-Aminopenicillansäure umgewandelt.20 g of this enzyme preparation are used to enzymatically cleave 100 ml of a 2 percent (weight / volume) solution of the potassium salt of benzylpenicillin within 2 hours at a pH of 7.8 and a temperature of 37.degree. In two successive experiments, 95 % of the benzylpenicillin salt is converted into 6-aminopenicillanic acid.
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Beispiel 19 Ex iel 19
Die Arbeitsweise von Beispiel 17 wird unter Verwendung einer im Handel erhältichen Aminoäthylcellulose als fester absorbierender Stoff wiederholt.The procedure of Example 17 is followed using a commercially available aminoethyl cellulose as a solid absorbent Fabric repeated.
20 g dieses Enzympräparates werden zur enzymatischen Spaltung von 100 ml einer lprozentigen (Gewicht/ Volumen) Lösung des Kaliumsalzes von Benzylpenicillin bei einem pH-Wert von 7*8 und einer Temperatur von 37°C verwendet, wobei die Behandlung 2 Stunden dauert. In zwei aufeinanderfolgenden Versuchen werden jeweils 95 % des Benzylpenicillinsalzes in '6-Aminopenicillan^ säure umgewandelt.20 g of this enzyme preparation are used for the enzymatic cleavage of 100 ml of a 1 percent (weight / volume) solution of the potassium salt of benzylpenicillin at a pH of 7 * 8 and a temperature of 37 ° C, the treatment lasting 2 hours. In two successive experiments, 95 % of the benzylpenicillin salt is converted into 6-aminopenicillanic acid.
2 g Nylon (Teilchengröße: 53 bis 75 Mikron; Gehalt an freien Aminogruppen: 472 Grammäquivalente je 10 Gramm) werden mit2 g nylon (particle size: 53 to 75 microns; content of free Amino groups: 472 gram equivalents per 10 grams) are with
wässrigen Lösung von 200 ml Enzymlösung und 2 ml eines 25prozentigen/Glutaraldehyd 16 Stunden lang bei 3°C gerührt. Die Enzymlösung wird hergestellt, indem man 240hig des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Enzyms in 200 ml einer 0,05m-Natriumphasphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7*5 einrührt. Nach 16 Stunden zentrifugiert man und gewinnt so das feste beladene Absorbens, welches gut mit Wasser ausgewaschen wird.aqueous solution of 200 ml of enzyme solution and 2 ml of a 25 percent / glutaraldehyde Stirred at 3 ° C for 16 hours. The enzyme solution is prepared by 240hig of the enzyme obtained according to Example 1 stirred into 200 ml of a 0.05m sodium phosphate buffer solution with a pH of 7 * 5. After 16 hours one centrifuges and thus wins the solid, loaded absorbent, which is washed out well with water.
Die Aktivität des festen Enzympräparates ist derart, daß 1? 950 JuMol Phenylacetamid je Stunde und je Gramm enzymatischThe activity of the solid enzyme preparation is such that 1? 950 JuMol phenylacetamide per hour and per gram enzymatically
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gespalten werden.be split.
Außerdem werden 4 g des Enzympräparates dazu verwendet, um 750 ml einer 15m-Lösung von Benzylpenicillin in O,O5m-Natriumphosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 8 und einer Temperatur von 37°C zu spalten. Schon nach 17 Minuten sind 70 % des Benzylpenicillins in 6-Aminopenicillansäure umgewandelt worden. Nach 25 Minuten beträgt der Umwandlüngsgrad 90 % und nach 33 Minuten 95 %. In addition, 4 g of the enzyme preparation are used to split 750 ml of a 15m solution of benzylpenicillin in 0.05m sodium phosphate buffer solution at a pH of 8 and a temperature of 37.degree. After just 17 minutes, 70 % of the benzylpenicillin has been converted into 6-aminopenicillanic acid. The degree of conversion is 90 % after 25 minutes and 95% after 33 minutes.
10 g Nylon (Teilchengröße:.53 bis 75 Mikron; Gehalt ar. freien Aminogruppen: 4-72 Grammäquivalent je 10 Gramm) werden 1 Stunde lang bei 3°C mit 50 ml einer 25prozentigen wässrigen Lösung von Glutaraldehyd verrührt. Anschließend wird der Peststoff abgetrennt und zwecks Entfernung von überschüssigem Glutaraldehyd mit. Wasser gewaschen. Dann setzt man 100 ml einer Enzymlösung hinzu und rührt weitere l6 Stunden bei 30C. Diese Enzymlösung ist erhalten worden, indem man 240 mg des nach Beispiel 1 hergestellten Enzympräparates in 100 ml einer O,05m-Natriumphosphatpufferlösung mit pH-Wert von 8,0 auflöst. Nach l6 Stunden wird der Peststoff abzentrifugiert und gut mit Waseer ausgewaschen. Die Aktivität des Enzympräparates ist derart, daß 1 260 ^u-MoI Phenylacetamid je Stunde und je Gramm enzymatisch zersetzt werden.10 g of nylon (particle size: .53 to 75 microns; content of free amino groups: 4-72 gram equivalents per 10 grams) are stirred for 1 hour at 3 ° C. with 50 ml of a 25 percent aqueous solution of glutaraldehyde. The pesticide is then separated off and used to remove excess glutaraldehyde. Water washed. Is then added 100 ml of an enzyme solution are added and stirring is continued for l6 hours at 3 0 C. This enzyme solution was obtained by mixing 240 mg of the prepared in Example 1 enzyme preparation in 100 ml of a O, 05m-sodium phosphate buffer solution with pH of 8, 0 resolves. After 16 hours the pest is centrifuged off and washed out well with water. The activity of the enzyme preparation is such that 1 260 ^ u-MoI phenylacetamide per hour and per gram are enzymatically decomposed.
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D2 | Grant after examination |