DE2043189A1

DE2043189A1 - Urine catecholamine determination - for rapid detection of pathologically high levels

Info

Publication number: DE2043189A1
Application number: DE19702043189
Authority: DE
Inventors: Der Anmelder Ist
Original assignee: GREEFF K; STROBACH H
Current assignee: GREEFF K; STROBACH H
Priority date: 1970-09-01
Filing date: 1970-09-01
Publication date: 1972-03-09
Also published as: DE2043189C3; DE2043189B2

Abstract

Pathologically high urine levels of the catecholamines (nor) adrenaline and dopamine are rapidly detected by boiling up a small sample with a non-oxidising acid other than H3PO4 basifying with a buffer soln. of disodium -EDTA, alkali hydroxide and bromothymol blue, opt. filtering, slowly filtering through Al2O3 impregnated paper, rinsing the filter with a small amt. of water, applying to the alumina-paper a reagent soln. of potassium ferricyanide, ammonium acetate and copper sulphate, filtering off excess reagent after a definite reaction time, and comparting the resulting colour with that produced by reference sample.

Description

Prof. Dr. med. Kurt Greeff, 4 Düsseldorf, Brinkmannstr. 25 und Dipl.-Chem. Hans Strobach, 4 DUsseldorf, Copernicusstr. 75 Schnelltest zum Nachweis einer pathologischen Katecholaminmenge im Harn aminmenge im Harn Die Erfindung betrifft einen Schnelltest zum Nachweis einer pathologisch erhöhten Ausscheidung von Adrenalin, Noradrenalin bzw. Dopamin im Harn.Prof. Dr. med. Kurt Greeff, 4 Düsseldorf, Brinkmannstr. 25 and Dipl.-Chem. Hans Strobach, 4 DUsseldorf, Copernicusstr. 75 rapid test for the detection of a pathological Amine of catecholamines in urine Amine of urine The invention relates to a rapid test for the detection of a pathologically increased excretion of adrenaline, noradrenaline or dopamine in the urine.

Es ist bekannt, daß krankhafte Veränderungen im Organismus die Ausscheidung der Katecholamine Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin beeinflussen. So bewirken beispielsweise Tumore, die sich am sympathischen Nervensystem ansiedeln, wie Neuroblastome und Phaeochromozytome eine erhöhte Ausscheidung von Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin im Harn.It is known that pathological changes in the organism cause excretion the catecholamines affect adrenaline, noradrenaline and dopamine. So effect for example, tumors that settle on the sympathetic nervous system, such as neuroblastomas and pheochromocytomas an increased excretion of adrenaline, and noradrenaline Dopamine in the urine.

Die quantitative Bestimmung der Katecholamine ist sehr zeitraubend und erfordert sowohl einen hohen personellen als auch apparativen Aufwand. Die-Katecholamine werden heute allgemein nach dem Verfahren von Euler bestimmS, Danach wird eine Harnprobe von etwa 25 ml auf einen pg-Wert von etwa 8,5 eingestellt und auf eine Aluminiumoxydsäule aufgegeben. Die Katecholamine werden mit Essigsäure eluiert, das Eluat mit Ammoniak auf einen pH-Wert von 5 bis 6 eingestellt, mit Kaliumferricyanid oxydiert, das Oxydationsprodukt mit Alkali und Ascorbinsäure in stabile Lutine umgewandelt und deren Fluoreszenz als Maß für die Konzentration der Katecholamine bestimmt.The quantitative determination of the catecholamines is very time consuming and requires a high level of expenditure in terms of both personnel and equipment. Die-Catecholamines are generally determined today according to the Euler method, after which a urine sample is taken adjusted from about 25 ml to a pg value of about 8.5 and on an aluminum oxide column given up. The catecholamines are eluted with acetic acid, the eluate with ammonia adjusted to a pH value of 5 to 6, oxidized with potassium ferricyanide, the oxidation product converted into stable lutins with alkali and ascorbic acid and their fluorescence intended as a measure of the concentration of catecholamines.

Angesichts der Langwierigkeit und Umständlichkeit der quantitativen Bestimmung wäre es er;<nscht, zunächst vorab in einem Schnelltest festzustellen, ob der Katecholaminspiegel im Harn krankhaft erhöht ist oder nicht. Es brauchten dann nur diejenigen Proben einer genaueren Untersuchung, d.h. einer quantitativen Bestimmung unterworfen werden, in denen dieser Schnelltest positiv verlaufen war. Hierdurch würde eine erhebliche Arbeitsersparnis erreicht, weil nicht wie bisher alle Harnproben der quantitativen Bestimmung unterworfen werden müßten, sondern durch den Schnelltest gleich diejenigen ausgeschieden würden, die keinen erhöhten Katecholaminspiegel anzeigen.Given the tedium and awkwardness of the quantitative Determination would be it; it would be desirable to first determine in advance in a whether the catecholamine level in the urine is abnormally high or not. Needed it then only those samples of a more precise investigation, i.e. a quantitative one Determination in which this rapid test was positive. This would result in considerable labor savings, because not as before all urine samples would have to be subjected to quantitative determination, but the rapid test would immediately eliminate those who did not increase Show catecholamine levels.

Von besonderer Bedeutung ist eine solche Schnellbestimmungsmethode, weil in der modernen Medizin immer mehr Laborbefunde zur exakten Ermittlung der Krankheitsursache herangezogen werden. Eine brauchbare Schnellbestimmungsmethode würde es sehr erleichtern, die Werte fUr den Katecholaminspiegel im Harn generell in die Laboruntersuchungen mit einzubeziehen.Such a rapid determination method is of particular importance, because in modern medicine more and more laboratory results for the exact determination of the Cause of disease to be used. A useful quick determination method would make it much easier to determine the values for the catecholamine level in the urine in general to be included in the laboratory tests.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer brauchbaren Schnellbestimmungsmethode, die eine Aussage darüber erlaubt, ob der Katecholaminspiegel über dem normalen Spiegel eines gesunden Patienten liegt und damit krankhaft verändert ist oder nicht. Die erfindungsgemäße Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man die Brenzkatechinamine Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin bei schwach alkalischer Reaktion des Harns an Aluminiumoxyd-imprägniertem Papier adsorbiert, das Papier mit einer wäßrigen Lösung von Kaliumferricyanid, Kupfersulfat und Ammoniumacetat in Wasser behandelt und die Katecholamine durch die Verfärbung des Papiers nachweist.The object of the present invention is to provide a useful one Rapid determination method that allows a statement to be made about whether the level of catecholamines is present is above the normal level of a healthy patient and is therefore abnormally changed is or not. The object of the invention is achieved by using the catecholamines Adrenaline, noradrenaline and dopamine in case of a weakly alkaline reaction of the urine Aluminum oxide-impregnated paper is adsorbed, the paper with an aqueous solution treated by potassium ferricyanide, copper sulfate and ammonium acetate in water and the Detects catecholamines through the discoloration of the paper.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin im Harn, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine geringe Harnmenge mit einer nicht oxydierenden anorganischen Säure außer Phosphorsäure aufkocht, mit einer alkalischen Pufferlösung aus dem Dinatriumsalz von Athylendiamlntetraessigsäure, Alkalihydroxyd und Bromthymolblau alkalisiert, gegebenenfalls filtriert, dann langsam durch ein Filter aus mit Aluminiumoxyd imprägniertem Papier filtriert, mit einer geringen Wassermenge nachspült, auf das Aluminiumoxydpapier eine wäßrige Reagenzlösung aus Kaliumferricyanid, Ammoniumacetat und Kupfersulfat aufbringt und eine definierte Zeit einwirken läßt, überschüssiges Reagenz absaugt und die entstandene Verfärbung mit einer in gleicher Weise erhaltenen Färbung einer Harnprobe bekannten Katecholamingehalts vergleicht.The invention relates to a method for determining adrenaline, Norepinephrine and dopamine in the urine, which is characterized by having a low level Boiling the amount of urine with a non-oxidizing inorganic acid other than phosphoric acid, with an alkaline buffer solution made from the disodium salt of ethylenediamine tetraacetic acid, Alkali hydroxide and bromothymol blue alkalized, if necessary filtered, then slowly filtered through a filter made of paper impregnated with aluminum oxide, rinsed with a small amount of water, an aqueous one on the aluminum oxide paper Reagent solution of potassium ferricyanide, ammonium acetate and copper sulfate applies and Allow to act for a defined time, suction off excess reagent and remove the resulting reagent Discoloration with a coloration of a urine sample obtained in the same way is known Catecholamine content compares.

Wie bei der quantitativen fluorophotometrischen Bestimmung wird der Nachweis in einem Teil des gut durlchmischten 24-Stunden-Harns durchgeführt. Für den Versuchszweck ist eine Menge von etwa 1 % des 24-Stunden-Harns, was etwa 1 bis 20 ml entspricht, am besten geeignet. Die Menge des während 24 Stunden ausgeschiedenen Harns beträgt etwa 100 bis 500 ml beim Säugling und etwa 500 bis 2000 ml und darüber beim Erwachsenen. In das Sammelgefäß werden 20 bis 50 ml 10 zeiger Schwefelsäure oder eine andere nicht oxydierende anorganische Säure, wie Salzsäure gegeben, um eine Autoxydation der Brenzkatechinamine in alkalischem Milieu während des Sammelns zu verhindern. Phosphorsäure ist ungeeignet, da sie den Test stören wUrde. Der auf eine pH-Wert von zweckmäßig nicht unter 2 angesäuerte Harn wird nach einer Lagerung von mindestens einem und höchsten 5 Tagen mit verdünnter Säure aufgekocht. FUr 1 % des 24-Stunden-Harns genügt Aufkochen der Harnprobe mit 3 ml 2 %iger Schwefelsäure über dem Bunsenbrenner in einem großen Reagenzglas.As with quantitative fluorophotometric determination, the Detection carried out in part of the well-mixed 24-hour urine. For the purpose of the experiment is an amount of about 1% of the 24-hour urine, which is about 1 to 20 ml is the most suitable. The amount excreted during 24 hours Urine is about 100 to 500 ml in the infant and about 500 to 2000 ml and above in the adult. 20 to 50 ml of 10 point sulfuric acid are placed in the collecting vessel or another non-oxidizing inorganic acid such as hydrochloric acid an auto-oxidation of the catecholamines in an alkaline environment during the collection to prevent. Phosphoric acid is unsuitable as it would interfere with the test. The on a pH value of appropriately not below 2 acidified urine becomes after storage Boiled with diluted acid for at least one and at most 5 days. For 1 % of the 24-hour urine is sufficient to boil the urine sample with 3 ml of 2% sulfuric acid above the Bunsen burner in a large test tube.

Nach dem Abkühlen wird die Harnprobe tropfenweise mit einer alkalischen Pufferlösung versetzt, bis die Farbe von Rot über Gelb nach Grün umschlägt. Die Pufferlösung enthält Thymolblau als Indikator, eine Base, vorzugsweise verdünnte Natronlauge, zum Alkalisieren der Probe, sowie das Dinatriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure (Titriplex III).After cooling, the urine sample is dropped with an alkaline Buffer solution is added until the color changes from red to yellow to green. the Buffer solution contains thymol blue as an indicator, a base, preferably diluted Sodium hydroxide to alkalize the sample, as well as the disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid (Titriplex III).

Nach Farbumschlag nach GrUn werden noch etwa 1 bis 3 Tropfen Pufferlösung bis zum Umschlag nach Blau zugesetzt. Eine geeignete Pufferlösung hat folgende Zusammensetzung: 50 mg Thymolblau 8 g Titriplex III 100 ml 10 %ige Natronlauge.After the color changes to green, about 1 to 3 drops are left Buffer solution added until it turned blue. A suitable buffer solution has the following composition: 50 mg thymol blue 8 g Titriplex III 100 ml 10% sodium hydroxide solution.

Anstelle von Natronlauge sind auch andere Alkalihydroxyde wie KOH geeignet.Instead of caustic soda, other alkali hydroxides such as KOH are also used suitable.

Zweckmäßig wird die alkalisierte Probe dann filtriert, vorteilhaft durch ein dichtes Filter. Der Filtrationsschritt ist nicht unbedingt erforderlich, verringert jedoch die Gefahr der Verstopfung des Aluminiumoxyd-Reagenzpapiers und führt zu einer gleichmäßigeren Farbentwicklung auf dem Reagenzpapier.The alkalized sample is then expediently filtered, advantageously through a tight filter. The filtration step is not absolutely necessary, however, reduces the risk of clogging of the alumina reagent paper and leads to a more even color development on the reagent paper.

Anschließend wird die Probe langsam durch ein Filter aus mit Aluminiumoxyd imprägniertem Papier gegeben. Die Filtrationsgeschwindigkeit ist dabei wesentlich. Ein zu rasches Durchlaufen muß vermieden werden. Als geeignet haben sich Filtrationsgeschwindigkeiten von etwa 10 bis 12 Tropfen/Ninute erwiesen. Bei den eingesetzten Harnmengen liegt die Filtrationsdauer zwischen etwa 4 bis 25 Minuten und beträgt im Normalfall beim Durchsaugen des Harns mit der Wasserstrahlpumpe etwa 12 bis 13 Minuten. Das Filtrieren der Probe erfolgt in üblicher Weise durch geeignete Filtriervorrichtungen,wie Büchner-Trichtern oder anderen mit Bohrungen versehenen Filterplatten, auf die ein Vorratszylinder aufgesetzt ist. Zur Bestimmung der Filtrationsgeschwindigkeit enthält die Filtriervorrichtung an ihrem unteren Ende einen Tropfenzähler.The sample is then slowly passed through a filter made of aluminum oxide given impregnated paper. The rate of filtration is essential. Too fast a run through must be avoided. Filtration speeds have proven to be suitable from about 10 to 12 drops / minute. The amount of urine used is the filtration time between about 4 to 25 minutes and is normally at Sucking through the urine with the water jet pump for about 12 to 13 minutes. The filtering the sample is carried out in the usual way through suitable filtering devices such as Büchner funnels or other filter plates provided with holes on which a storage cylinder is put on. To determine the filtration rate, the filter device contains a dropper at its lower end.

Für die Zwecke der Erfindung als besonders geeignet hat sich eine Filtrierapparatur aus Plexiglas erwiesen. Das Oberteil besteht aus einem 200 mm langen Rohr von 11,5 mm lichter Weite und einem Außendurchmesser von 20 mm. Auf etwa 1 cm Länge ist die Bohrung auf 16 mm erweitert. Das Unterteil der Apparatur besteht aus einem 40 mm langen ausgebohrten Plexiglasrohr, das unten durch einen Stutzen mit Schlaucholive, oben durch eine Siebplatte von 11,5 mm Durchmesser verschlossen ist, Um die Siebplatte herum ist das Rohr auf etwa 10 mm Länge auf einen Außendurchmesser von 16 mm abgedreht. Das Filter aus Aluminiumoxyd-Imprägniertem Papier wird auf die Siebplatte aufgelegt und dann das Oberteil der Apparatur aufgesteckt, wodurch das Filter fest in die Paßflächen von Ober- und Unterteil eingeklemmt wird. Die Probe läuft häufig auch ohne Betätigung der Wasserstrahlpumpe durch, in der Regel wird jedoch von vornherein mit Wasserstrahlvakuum gearbeitet Das als Filter verwendete Aluminiumoxyd-imprägnierte Reagenzpapier wird hergestellt durch Imprägnieren üblichen Chromatographiepapiers mit einer phosphorsauren wäßrigen Lösung eines Aluminiumsalzes einer anorganischen oder organischen Säure, Fällen von Aluminiumhydroxyd und Trocknen des Papiers. Zur Imprägnierung sind Salze wie A12(S04)3, Als13 und andere wasserlösliche Salze geeignet. Bevorzugt wird Aluminiumsulfat verwendet.For the purposes of the invention, a has been found to be particularly suitable Filtration apparatus made of plexiglass proved. The upper part consists of a 200 mm long tube with a clear width of 11.5 mm and an outer diameter of 20 mm. on about 1 cm in length, the bore is expanded to 16 mm. The lower part of the apparatus consists of a 40 mm long drilled out Plexiglas tube, which is connected at the bottom by a Connection piece with hose olive, closed at the top by a sieve plate with a diameter of 11.5 mm is, Around the sieve plate, the tube is about 10 mm long to an outside diameter turned off by 16 mm. The filter made of aluminum oxide impregnated paper is on placed the sieve plate and then attached the upper part of the apparatus, whereby the filter is firmly clamped in the mating surfaces of the upper and lower part. the The sample often runs through without actuating the water jet pump, as a rule however, a water jet vacuum is used from the outset that is used as a filter Alumina-impregnated test paper is manufactured by the usual impregnation Chromatography paper with a phosphoric acid aqueous solution of an aluminum salt an inorganic or organic acid, precipitation of aluminum hydroxide and drying of the paper. For impregnation, salts such as A12 (S04) 3, Als13 and others are water-soluble Suitable for salts. Aluminum sulfate is preferably used.

Die Fällung von Aluminiumhydroxyd bzw. Aluminiumoxydhydroxyd erfolgt vorzugsweise durch Einbringen des imprägnierten Papiers in eine Ammoniakatmosphäre. Es ist jedoch auch möglich, die Fällung durch Eintauchen in verdünnte Ammoniaklösung vorzunehmen, Jedoch sind Haltbarkeit und Aktivität des Papiers nicht ganz so gut wie bei der Einwirkung von gasförmigem Ammoniak. Das Papier kann auch mit einer Lösung von Natriumaluminat imprägniert und das Aluminiumoxyd durch Eintauchen in eine hochprozentige Ammoniumchloridlösung gefällt werden.The precipitation of aluminum hydroxide or aluminum oxide hydroxide takes place preferably by placing the impregnated paper in an ammonia atmosphere. However, it is also possible to carry out the precipitation by immersion in dilute ammonia solution However, the durability and activity of the paper are not quite as good as with the action of gaseous ammonia. The paper can also come with a Solution of sodium aluminate impregnated and the aluminum oxide by immersion in a high percentage ammonium chloride solution can be precipitated.

Die Einwirkung von gasförmigem Ammoniak erfolgt am besten auf das noch feuchte Papier. Die Einwirkungsdauer beträgt vorteilhaft etwa 60 bis 70 Stunden jedoch beeinträchtigen geringere oder höhere Einwirkungsdauer die Aktivität nicht wesentlich. Die Trocknung des Papiers wird zunächst zweckmäßig bei Raumtemperatur vorgenommen und dann im Exsikkator über chemischem Trocknungsmittel fortgesetzt. Sie ist nach 2 bis 3 tägiger Lagerung im Exsikkator über Phosphorpentoxyd, Ätzkali und.Calciumoxyd beendet. Das fertig getrocknete Papier ist in einem gut verschlossenen Gefäß über Blaugel praktisch unbegrenzt haltbar. Frisch hergestelltes Papier wird zweckmäßig mindestens 2 bis 3 Wochen gelagert, da seine Filtrationseigenschaften zunächst schlecht sind und auch die Farbentwicklung unregelmäßig ist.Gaseous ammonia exposure is best done on the still damp paper. The duration of action is advantageously about 60 to 70 hours however, shorter or longer exposure times do not affect the activity essential. The drying of the paper is initially expedient at room temperature made and then in the desiccator over chemical desiccant continued. After 2 to 3 days of storage in the desiccator it is over phosphorus pentoxide, Caustic potash and calcium oxide finished. The finished dried paper is good in one closed vessel can be kept practically indefinitely over blue gel. Freshly made Paper is expediently stored for at least 2 to 3 weeks because of its filtration properties are initially bad and the color development is also irregular.

Nachdem die Harnprobe durch das Aluminiumoxydpapier gelaufen ist, wird zur Entfernung von Resten scharf abgesaugt und anschließend wird mit einer kleinen Wassermenge von beispielsweise-0,5 bis 3 ml gewaschen. Nach dem langsamen DurchlauRen des Waschwasser wird der Rest scharf abgesaugt.After the urine sample has passed through the aluminum oxide paper, is sharply suctioned to remove residues and then with a small amount of water, for example, -0.5 to 3 ml. After the slow one When the washing water runs through, the rest is sucked off sharply.

Nach Abstellen der Wasserstrahlpumpe wird auf das Aluminiumoxydpapier eine geringe Menge einer wäßrigen Reagenzlösung aufgetropft, die etwa äquimolare Mengen Kupfersulfat und Kaliumferricyanid sowie Ammoniumacetat enthält. Eine geeignete Lösung kann beispielsweise folgendermaßen hergestellt werden: 103,2 mg Kupfersulfat werden in 36 ml 50 %iger wäßriger Ammoniumacetatlösung gelöst. Diese Lösung wird mit Wasser auf 50 ml aufgefüllt.After turning off the water jet pump, the aluminum oxide paper is applied a small amount of an aqueous reagent solution that is approximately equimolar Contains amounts of copper sulfate and potassium ferricyanide and ammonium acetate. A suitable one For example, solution can be prepared as follows: 103.2 mg of copper sulfate are dissolved in 36 ml of 50% aqueous ammonium acetate solution. This solution will made up to 50 ml with water.

Getrennt werden log6,8 mg Kaliumferricyanid in 50 ml Wasser gelöst, und beide Lösungen vereinigt.Separately, log6.8 mg of potassium ferricyanide are dissolved in 50 ml of water, and combined both solutions.

Die Reagenzlösung ist lichtempfindlich und wird daher zweckmäßig in einer schwarz lackierten Schliffiasche aufbewahrt.The reagent solution is light sensitive and is therefore useful in kept in a black lacquered cut glass.

Die Menge der Reagenzlösung wird so gewählt, daß das Filter gerade bedeckt ist. Nach 1 bis 4, vorzugsweise 2 bis 3 Minuten Einwirkungsdauer der Reagenzlösung auf das Aluminiumoxydpapier wird scharf abgesaugt und mit wenig Wasser, beispielsweise 10 Tropfen, nachgespült. Danach wird das Reagenzpapier entnommen und im noch feuchten Zustand mit der Vergleichsfarbe verglichen. Auf das Nachspülen kann verzichtet werden, jedoch muß dann sofort mit der Vergleichs färbung verglichen werden, da eine Nachdunklung erfolgt.The amount of reagent solution is chosen so that the filter straight is covered. After 1 to 4, preferably 2 to 3 minutes of exposure to the reagent solution on the aluminum oxide paper is sucked sharply and with a little water, for example 10 drops, rinsed. Then the reagent paper is removed and placed in the still moist Condition compared with the comparison color. There is no need to rinse will, However, the color must then be compared immediately with the comparison, as there is a darkening he follows.

Die Herstellung einer geeigneten Standardfärbung, dia nach Fixierung dann photografisch reproduziert werden kann, wie das bei Reagenzpapieren der Fall ist, erfolgt mit Harnproben bekannten Katecholamingehalts, wobei die Färbung, die von einem gerade noch zulässigen Katechinaminspiegel hervorgerufen wird, als Grenzfärbung herangezogen wird, B e i s p i e 1 10 ml eines mit 10 zeiger Schwefelsäure schwach angesauerten und 1 Tag gelagerten 24-Stunden-Harns werden mit 3 ml 2 zeiger Schwefelsäure versetzt und in einem großen Reagenzglas kurz aufgekocht. Nach dem-AbkUhlen wird die Harnprobe tropfenweise mit einer Pufferlösung aus 50 mg Thymolblau, 8 g Titriplex und 100 ml 10 zeiger Natronlauge versetzt, bis die Farbe von Rot über Gelb nach Grün umschlägt. Dann werden weitere 1 bis 3 Tropfen bis zum Umschlag nach Blau zugegeben. Die gepufferte Probe wird durch ein Blaubandfilter von Schleicher-Schüll Nr. 589 filtriert und anschließend in der auf Seiten 4 und 5 beschriebenen Filtrierapparatur durch ein Filter aus Aluminiumoxyd-imprägniertem Papier mit einer Geschwindigkeit von etwa 10 bis 12 Tropfen/Minute unter Anwendung von Wasserstrahlvakuum filtriert. Das zur Filtration verwendete Aluminiumoxyd papier ist auf folgende Weise hergestellt worden: 50 g A12(S04)5 ' 18 H2° wurden unter Zusatz von 2,25 ml 85 %I ger Orthophosphorsäure in wenig Wasser gelöst. Nach Auflösung des Salzes wird mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt und gegebenenfalls filtriert. Mit dieser Lö-sung werden Streifen aus Chromatographiepapier Schleicher-Schüll Nr. 2043a oder b Mgl. imprägniert, indem das Papier vier Mal durch eine flache mit der Imprägnierlösung gefüllte Schale gezogen wird. Anschließend läßt man einige Sekunden über eine Ecke des Papiers abtropfen.The production of a suitable standard coloration, dia after fixation can then be reproduced photographically, as is the case with reagent papers is carried out with urine samples known catecholamine content, the staining, the caused by a just acceptable level of catechinamine, as border color is used, for example 1 10 ml of a weak sulfuric acid with 10 pointer Acidified 24-hour urine stored for 1 day is mixed with 3 ml of 2-point sulfuric acid added and briefly boiled in a large test tube. After cooling down the urine sample drop by drop with a buffer solution of 50 mg thymol blue, 8 g Titriplex and 100 ml of 10 pointer sodium hydroxide solution are added until the color changes from red to yellow Green turns. Then another 1 to 3 drops are added until it turns blue. The buffered sample is filtered through a Schleicher-Schull No. 589 blue band filter filtered and then in the filter apparatus described on pages 4 and 5 through a filter made of alumina-impregnated paper at one speed filtered from about 10 to 12 drops / minute using a water jet vacuum. The aluminum oxide paper used for filtration is made in the following way been: 50 g of A12 (S04) 5 '18 H2 ° with the addition of 2.25 ml of 85% I ger orthophosphoric acid dissolved in a little water. After the salt has dissolved, it is made up to 100 ml with water and optionally filtered. This solution is used to make strips of chromatography paper Schleicher-Schüll No. 2043a or b Possibly impregnated by pulling the paper through four times a flat bowl filled with the impregnation solution is drawn. Afterward allowed to drain over a corner of the paper for a few seconds.

Danach wird das Papier so aufgehängt, daß überschüssige Lösung über eine Ecke abtropfen kann. Nach 2 bis 3 minütigem Abtropfen wird das Papier in noch feuchtem Zustand in eine frisch mit konzentriertem Ammoniak beschickte Zelle eingebracht, wobeidas Papier nicht eintauchen darf. In dieser Ammoniakatmosphäre wird etwa 60 bis 70 Stunden belassen; danach wird das Papier zunächst 2 Stunden bei Raumtemperatur und schließlich 2 bis 3 Tage über Phosphorpentoxyd, Ätzkali und Calciumoxyd im Exsikkator getrocknet und anschließend noch 3 Wochen gelagert. Nachdem der Harn durchgelaufen ist, wird mit 10 Tropfen Wasser nachgespült und an der Wasserstrahlpumpe scharf abgesaugt. Danach wird die Wasserstrahlpumpe abgestellt und auf das Aluminiumoxydpapierfilter werden 5 Tropfen einer Reagenzlösung aufgebracht, die durch Vereinigung der beiden folgenden Lösung erhalten wurde: Lösung 1: 103,2 mg Kupfersulfat werden in 36 ml 50 %igem wäßrigem Ammoniumacetat gelöst und die Lösung wird mit Wasser auf 50 ml aufgefüllt.After that, the paper is hung up so that excess solution is over one corner can drain. After 2 to 3 minutes of draining will loaded the paper into a freshly filled with concentrated ammonia while it was still moist Cell inserted, whereby the paper must not be immersed. In this ammonia atmosphere is left for about 60 to 70 hours; after that the paper is initially 2 hours at room temperature and finally 2 to 3 days over phosphorus pentoxide, caustic potash and Calcium oxide dried in a desiccator and then stored for another 3 weeks. After this If the urine has run through, it is rinsed with 10 drops of water and attached to the water jet pump sharply sucked. The water jet pump is then switched off and placed on the aluminum oxide paper filter 5 drops of a reagent solution are applied by combining the two The following solution was obtained: Solution 1: 103.2 mg of copper sulfate are in 36 ml Dissolved 50% aqueous ammonium acetate and the solution is made up to 50 ml with water filled up.

Lösung 2: 136,8 mg Kaliumferricyanid werden in 50 ml Wasser gelöst.Solution 2: 136.8 mg of potassium ferricyanide are dissolved in 50 ml of water.

Die Reagenzlösung läßt man 3 Minuten auf das Aluminiumoxydpapierfilter einwirken, saugt dann scharf ab und spült mit 10 Tropfen Wasser nach. Das noch feuchte Reagenzpapier zeigt eine Braunfärbung, die einen Katecholamingehalt im Harn von etwa 1000/ug/24 Std., also einen höheren als den Normalwert zeigt.The reagent solution is left on the aluminum oxide paper filter for 3 minutes take effect, then sucks up sharply and rinses off with 10 drops of water. That still damp Reagent paper shows a brown color, which indicates a catecholamine content in the urine of about 1000 / ug / 24h, which is higher than normal.

Die Reagenzlösung wird entweder vor jedem Versuch frisch aus den beiden getrennten Lösungen hergestellt oder in Lösungen werden nach dem Vereinigen im Dunkeln etwa 1 Woche im Kühlschrank aufbewahrt. Während dieser Zeit wird das in Ferricyanidlösungen enthaltene Ferrocyanid als Kupferferrocyanid ausgefällt. Nach Abzentrifugieren (10 Minuten bei 4000 U/Min.) ist die überstehende Lösung längere Zeit haltbar. Eine Berührung mit organischen oxydablen Substanzen (z.B. Gummikappe an Tropfflaschen) muß ebenso vermieden werden wie die Einwirkung von Licht.The reagent solution is either fresh from the two before each experiment Separate solutions are prepared or in solutions after combining in the dark Stored in the refrigerator for about 1 week. During this time this is in ferricyanide solutions contained ferrocyanide precipitated as copper ferrocyanide. After centrifugation (10 Minutes at 4000 rpm), the supernatant solution can be kept for a longer period of time. One Contact with organic oxidizable substances (e.g. rubber cap on dropper bottles) must be avoided as well as exposure to light.

Herstellung der Standardfärbung: In einerHarnprobe eines Patienten mit einwandfrei festgestelltem Phaeochromozytom (bzw. Neunblastom) werden nach dem bekannten Verfahren von Euler Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin quantitativ bestimmt. Proben dieses Harns mit einem Gehalt von 3, 4, 5 bzw. 6/Ug Gesamtkatecholamine werden in der beschriebenen Weise dem Schnelltest unterworfen und die dabei erhaltenen vier Farbschattierungen fotografisch fixiert.Preparation of the standard stain: In a urine sample from a patient with a perfectly determined pheochromocytoma (or nine-blastoma) are after known methods of Euler epinephrine, norepinephrine and dopamine quantified. Samples of this urine with a content of 3, 4, 5 or 6 / Ug total catecholamines are made subjected to the rapid test in the manner described and the resulting four shades of color fixed photographically.

Anschließend werden dem Schnelltest mindestens etwa 200 Harnproben von gesunden medikamentös nicht vorbehandelten Versuchspersonen unterworfen, bei denen die 24-Stunden-Ausscheidung an Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin höchstens 500/ug beträgt (quantitative Untersuchung) und die erhaltenen Farben mit den vier Vergleichs farben verglichen. Als Standardfarbe wird diejenige herangezogen, die sich in mindestens 95 % der Fälle als dunkler oder gleich intensiv erweist wie die zum Vergleich untersuchten Kontrollen.Then the rapid test is at least about 200 urine samples by healthy test persons not previously treated with medication those the 24-hour excretion of adrenaline, noradrenaline and dopamine at most 500 / ug is (quantitative study) and the colors obtained with the four Comparative colors compared. The standard color used is that which turns out to be darker or equally intense than that in at least 95% of the cases controls examined for comparison.

Claims

1.) Procedure for the determination of adrenaline, oradrenaline and dopamine in the urine, characterized in that one does not have a small amount of urine with one oxidizing acid other than phosphoric acid boils with an alkaline buffer solution from the disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid, an alkali hydroxide and The existing bromothymol blue buffer solution is made alkaline, if necessary filtered, then slowly filtered through a filter made of paper impregnated with aluminum oxide, with a small amount of water rinsed, on the aluminum oxide paper an aqueous Reagent solution of potassium ferricyanide, ammonium acetate and copper sulfate applies and Allow to act for a defined time, suction off excess reagent and remove the resulting reagent Coloring with the color of a urine sample of known catecholamine content determined in the same way compares.

2.) The method according to claim 1, characterized in that for the determination of about 1 ffi of the 24-hour urine, preferably 1 to 20 ml, begins.

3.) The method according to claim 1, characterized in that the Boil urine with dilute sulfuric acid or hydrochloric acid.

4.) The method according to claim 1, characterized in that the Urine is made alkaline with a buffer solution containing sodium hydroxide solution as the base.

5.) The method according to claim 1, characterized in that the alkalized and optionally filtered urine through a filter made of aluminum oxide paper sucks that by impregnating the paper with a solution of Aluminum sulfate in the presence of phosphoric acid, action of ammonia vapor on the still moist Paper and drying has been obtained.

6.) The method according to claim 5, characterized in that one is a Aluminum oxide paper is used, which is produced by exposure to ammonia vapor for 60 to 70 times on the wet paper.

7.) The method according to claim 1, characterized in that the Filtration of the urine through the aluminum oxide paper filter at a filtration rate from about 8 to 14, preferably about 10 to 12 drops / minute, optionally using a water jet vacuum.

8.) The method according to claim 1, characterized in that the Reagent solution of potassium ferricyanide, ammonium acetate and copper sulfate in an amount on the aluminum oxide paper filter so that it is just covered and leave it on for about 1 to 3 minutes.

9.) Aluminum oxide impregnated paper for carrying out the process according to claims 1 to 8, characterized by one of a phosphoric acid solution Aluminum salt with a base and drying obtained precipitate of aluminum oxide.

10.) Paper according to claim 9, characterized by a with gaseous Ammonia precipitated aluminum oxide.