DE2024251A1 - Method for isolating a fibrinolytic enzyme - Google Patents
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Description
ARZNEIWinav/ERX DRSSDEH - .ARZNEIWinav / ERX DRSSDEH -.
Verfahren zur Isolierung eines fibrinolytischen EnzymsMethod for isolating a fibrinolytic enzyme
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung eines fibrinolytischen Enzyms in hochgereinigter form.The invention relates to a method for isolating a fibrinolytic enzyme in a highly purified form.
Neben der Anwendung von Streptokinase, beruhend auf einer Aktivierung körpereigenen Plasminogen^ zu Plasmin, werden in zunehmendem MaBe Versuche unternommen, die thrombolytische Therapie durch eine Applikation fibrinolytisch wirkender proteolytischer Enzyme zu bereichern· Bereits ge- | ringe Mengen einer derartigen Protease vermögen arterielle und venöse Thromben vollständig aufzulösen. Eine therapeutisch verwertbare Protease muß in hochgereinigter Form vorliegen und unter physiologischen Bedingungen ohne toxische Nebenwirkungen fibrinolytisch aktiv sein·In addition to the use of streptokinase, based on a Activation of the body's own plasminogen ^ to plasmin, attempts are increasingly being made to reduce the thrombolytic Enrich therapy with the application of fibrinolytic proteolytic enzymes · Already done | Small amounts of such a protease are able to completely dissolve arterial and venous thrombi. One therapeutic Usable protease must be in a highly purified form and without toxic under physiological conditions Side effects be fibrinolytically active
Es ist bekannt, daß gewisse Schimmelpilze Gemische proteolytischer Enzyme bilden, die auch fibrinolytisch aktive Proteasen enthalten«It is known that certain molds are more proteolytic in mixtures Form enzymes that are also fibrinolytically active proteases contain"
Es ist bereits bekannt, daß man aus Aspergillus ory zae eine fIbrinolytisch wirksame Protease mit der Bezeichnung Asper- * gillin 0 isolieren kann· ^"Proc.Soceip.Biol., N, Y., 99. 504 (195827It is already known that a fibrinolytically active protease with the designation Aspergillus ory zae can be isolated from Aspergillus ory zae with the designation Asper- * gillin 0 · ^ "Proc.Soceip.Biol., N, Y., 99. 504 (195827
Durch direkte Ausfällung aus Kulturfiltraten mit organischen Lösungsmitteln oder durch Ausfällen mit organischen Lösungsmitteln nach Vorreinigung über Kunstharzaustausoher IBA 400 wurde die Protease angereichert· Anschließend werden die erhaltenen Niederschläge resuependiert, filtriert, und Ballaststoffe durch Zugabe von Kupfer-, Zink- bzw« OadmiuMJiulfat-Löeung ausgefällt· Nach Dialysleren wird der wirkstoffhaltig· Überstand lyophilieiert. ^Lancet g± 443 (195927 The protease was enriched by direct precipitation from culture filtrates with organic solvents or by precipitation with organic solvents after pre-cleaning via synthetic resin exchange IBA 400. The precipitates obtained are then resuspended, filtered, and dietary fiber is precipitated by adding copper, zinc or Oadmium sulfate solution · After dialysis, the active ingredient-containing supernatant is lyophilized. ^ Lancet g ± 443 (195927
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Von A.P. THJAKT u. F.G.NORSTROli ^fU.SaP. 3 256 152? wird eine fibrinolytisch aktive Protease aus Aspergillus Aspergillus flavus oder Absidla coerulea dadurch gewonnen,, daß Kulturfiltrat bei O 0C entweder mit dem doppelten Volumen auf -20 0G gekühlten Äthanols versetzt und das ausgefällte aktive Material abgesaugt oder das Kulturfiltrat mit lianni nietung versetzt und der wirkstoff haltige Miederschlag nach 48 Stunden Standzeit bei 4-4 0O durch Rühren mit Aceton behandelt wird ο wobei d@r aeetosaislöslieh© Wirkstoff zurückbleibt. Anschließend wird der im Vakiam getrocknet® Wirkstoff in Wasser suspendiert, der unlösliche Anteil abzentrifugiert, die wirkstoffhaltige Lösuag gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert*BY AP THJAKT & FGNORSTROli ^ fU.SaP. 3 256 152? a fibrinolytically active protease from Aspergillus Aspergillus flavus or Absidla coerulea is obtained by adding twice the volume of ethanol cooled to -20 0 G to the culture filtrate at O 0 C and sucking off the precipitated active material or riveting the culture filtrate with lianni Active precipitate is treated with acetone after 48 hours standing at 4-4 0 O by stirring ο with the active ingredient remaining. Then the active ingredient dried in the Vakiam® is suspended in water, the insoluble fraction is centrifuged off, the solution containing the active ingredient is dialyzed against water and lyophilized *
Weiterhin ist im caaadisehen Patent 671 648 ein Verfahren zur Herstellung hoohaktiver fibrinolytis.cher Agentien aus Aspergillus oryzae beschrieben, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß Hohpräparat® na@h Auflösen in Wasser und nach Einstellen auf pH 3»5 - 5j?5 mittels Salzsäur© der Chromatographie über quervernetzt as Bösbran Sepfoadex G-50 unter- "■ worfen und anschließend nach, Entwicklung mit salzsaurem Wasser die wirkstoffhaltigen Fraktionen lyophilisiert werden·Furthermore, in Caaadi patent 671,648 there is a method for the production of high-active fibrinolytic agents Aspergillus oryzae described, which is characterized is that Hohpräparat® after dissolving in water and after adjusting to pH 3 »5 - 5j? 5 by means of hydrochloric acid © chromatography via cross-linked as Bösbran Sepfoadex G-50 under- "■ thrown and then after, development with hydrochloric water the active ingredient-containing fractions are lyophilized
B.A.EUDHJASOHOV /~(Ber.d.Akad.d9Wiss.der UdSSH 153« 4, 939 (1963^7 fand außer in Aspergillus oryzae-Stämiaen auch in Aspergillus awamori einen fibrinolytisoti aktiven Stoff, den er nach dem oben beschriebenen Verfahren von STEFANINI ^■proc.Soo.exp.Biöl·, Ν·ϊ·, ^L· 50^ (1958i7isolierte.BAEUDHJASOHOV /~(Ber.d.Akad.d 9 Wiss. Der USSH 153 «4, 939 (1963 ^ 7 found not only in Aspergillus oryzae strains, but also in Aspergillus awamori a fibrinolytisoti-active substance, which he obtained according to the above-described method by STEFANINI ^ ■ proc.Soo.exp.Biöl ·, Ν · ϊ ·, ^ L · 5 0 ^ (1958i7isolierte.
Von A.A#IMSCHENETZKI u. Mitarbt« ^"*Ber.d»Akad.d«Wiss· der UdSSR 163. 3, 737 (1965^7 wird ein Verfahren zur Gewinnung einer fibrinolytisch aktiven Protease aus. Aspergillus terricola angegeben« Die Gewinnung erfolgt dadurch, daS zur Ausfällung des Wirkstoffes EulturfIltrat mit AmmoniumsulfatBy AA # IMSCHENETZKI & Mitarbt «^" * Ber.d »Akad.d« Wiss · der USSR 163. 3, 737 (1965 ^ 7 a method for obtaining a fibrinolytically active protease from. Aspergillus terricola is stated «The production takes place in that, for the precipitation of the active ingredient, culture filtrate with ammonium sulphate
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oder Aceton versetzt wird* Nach Abzentrifugieren wird der Niederschlag in Wasser gelöst, unlösliche Anteile werden abfiltriert, und das Filtrat wird über eine Sephadex G-25-Saule filtriert, um Ammoniumsulfat und Pigmente abzutrennen. Das aktive Eluat wird lyophilisiert. or acetone is added * After centrifugation, the Precipitate is dissolved in water, insolubles are filtered off, and the filtrate is passed over a Sephadex G-25 column filtered to separate ammonium sulfate and pigments. The active eluate is lyophilized.
Im US Patent 3 281 331 ist ein Verfahren zur Gewinnung fibrinolytisch aktiver Proteasen beschrieben, worin die Wirkstoffe aus der Lösung eines Rohenzymgemiscb.es von Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus oder Absidia coerulea bei pH 5,5 an CM-Cellulose oder CM-Sephadex adsorbiert, mit Puffer vom pH 7fO eluiert und anschließend nach der Dialyse lyophilisfert oder mit Tannin ausgefällt werden bzw· bei pH 6,0 an ~2 US Pat. No. 3,281,331 describes a process for obtaining fibrinolytically active proteases, in which the active ingredients are adsorbed from the solution of a crude enzyme mixture of Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus or Absidia coerulea at pH 5.5 on CM cellulose or CM Sephadex, eluted with buffer of pH 70 and then lyophilized after dialysis or precipitated with tannin or at pH 6.0 to ~ 2
DEAE-Gellulose adsorbiert und durch stufenweise Erhöhung der Salzkonzentration mit Puffer eluiert werden·DEAE cellulose is adsorbed and, by gradually increasing the Salt concentration to be eluted with buffer
Alle bekannten Verfahren beziehen sich auf die* Isolierung fibrinolytisch aktiver Protease aus Aspergillus oryzae, Aspergillus terricola, Aspergillus Flavus, Aspergillus awamori oder Absidia tfoerulea·All known methods relate to the * isolation fibrinolytically active protease from Aspergillus oryzae, Aspergillus terricola, Aspergillus flavus, Aspergillus awamori or Absidia tfoerulea
Die beschriebenen Aufarbeitungsverfahren sind - auf Grund der unterschiedlichen Molekularstruktur und der daraus resultierenden spezifischen physikochemischen Eigenschaften der Proteasen - nur für die Isolierung fibrinolytisch aktiver Enzyme aus den jeweils angegebenen Schimmelpilzen anwendbar.The work-up procedures described are - due to the different molecular structure and the resulting specific physicochemical properties of proteases - only for the isolation of fibrinolytically active Enzymes from the specified molds can be used.
Einige Aufarbeitungsverfahren führen außerdem zu nur teilgereinigten Proteasepräparate, wodurch ihre therapeutischen Einsatzmöglichkeiten begrenzt sind·Some work-up methods also lead to only partially purified protease preparations, which makes them therapeutic Possible uses are limited
Zweck der Erfindung war die Entwicklung eines Verfahrens zur rationellen Isolierung einer unter physiologischen Bedingun-genThe purpose of the invention was to develop a method for rational isolation of an under physiological conditions
fibrinolytisch optimal wirksamen, hochgereinigten Protease aus Auspergillus ochraceus, die ohne toxische Nebenwirkungen in der Therapie äußerlich oder parenteral appliziert werden kann· ■fibrinolytically optimally effective, highly purified protease from Auspergillus ochraceus, which is applied externally or parenterally in therapy without any toxic side effects can be · ■
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, aus rohen Enzymgemischen von Aspergillus ochraceus eine hochgereinigte fibrinolytisch wirksame Protease zu isolieren· Vor allem war es erforderlich, ein Verfahren aufzustellen, mit Hilfe dessen die Abtrennung fibrinolytisch inaktiver Proteasen, Ballasteiweiße und störender Farbstoffe auf rationelle Weise gelingt·The invention is based on the object, from crude enzyme mixtures from Aspergillus ochraceus a highly purified fibrinolytically to isolate effective protease with the help of which the separation of fibrinolytically inactive proteases, ballast proteins and interfering dyes in a rational way Wise succeed
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß eine fibrinolytisch wirksame und ohne toxische Nebenwirkungen therapeutisch anwendbare Protease hergestellt werden kann, wenn ein aus Aspergillus ochraceus-Kulturen isoliertes rohes Enzymgemisch mit wäßriger Pufferlösung extrahiert, der wirkstoffhaltige Extrakt über die Anionenaustausch^ DEAE-Sephadex oder DEAE-Cellulose filtriert und anschließend aus dem wirkstoffhaltigen Eiltrat der Wirkstoff mit mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln ausgefällt wird· Nach Trocknen im Vakuum ist der abgetrennte wirkstoffhaltige Niederschlag in Wasser aufzulösen und der Gelchromatographie an quervernetzten Dextrangelen Sephadex G-75 oder Sephadex G-1OÖ zu unterwerfen» Die proteas ehalt igen Fraktionen werden gefriergetrocknet, und damit erhält man die hochgereinigte fibrinolytisch wirksame Protease«According to the invention it was found that a fibrinolytic Effective and therapeutically applicable protease without toxic side effects can be produced if a protease is obtained from Aspergillus ochraceus cultures isolated crude enzyme mixture extracted with aqueous buffer solution, the active ingredient-containing Extract via the anion exchange ^ DEAE-Sephadex or DEAE-Cellulose filtered and then from the active ingredient-containing Eiltrat the active ingredient with water-miscible organic Solvents are precipitated · After drying in vacuo, the separated active ingredient-containing precipitate is in water to be dissolved and subjected to gel chromatography on cross-linked dextran gels Sephadex G-75 or Sephadex G-10Ö » The fractions containing proteas are freeze-dried, and this gives the highly purified fibrinolytically effective protease «
Die Extraktion des rohen Enzymgemisches erfolgt in der Weise, daß dieses Rohpräparat - mit einer proteolytischen Aktivität von ca. 1 CE/mg - mit 0,05 - 0,1 M Tris-HOl-Puffer pH 6,5 - 7»5 oder 0,05 - 0,1 M Ammoniumacetat-Puffer vom pH 6,5 - 7i5» bei Baumtemperatur mehrmals ausgerührt wird, um den Wirkstoff vollständig in Lösung zu bringen· Durch Zentrifugieren bei I5OOO g wird eine klare, dunkelgefärbte wirkstoffhaltige Lösung erhalten und der unlösliche inaktive Anteil abgetrennt«The extraction of the crude enzyme mixture takes place in the manner that this raw preparation - with a proteolytic activity of approx. 1 CE / mg - with 0.05-0.1 M Tris-HOl buffer pH 6.5 - 7 »5 or 0.05 - 0.1 M ammonium acetate buffer from pH 6.5 - 7i5 »is stirred several times at tree temperature, in order to bring the active substance completely into solution · By centrifuging at 1500 g a clear, dark colored drug-containing solution obtained and the insoluble inactive Share separated "
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Dieser wirkstoffhaltige Exbrakt wird, vorzugsweise bei 0 4 0O, über die mit dem Anionenaust aus eher EEAE-Sephadex Λ-50 oder dem Anionenaustauscher DEAE-Gellulose, Kapazität 0,5 - 0,9 mVal/g» beschickte Säule, die mit dem Extraktionspuffer äquilibrierfe worden ist, filtriert« Anschließend wird der Ionenaustauscher mit dem zur Extraktion verwendeten Puffer nachgewaschen·This drug-containing Exbrakt, preferably at 0 4 0 O through which the Anionenaust from rather EEAE-Sephadex Λ-50 or the anion exchanger DEAE-Gellulose, capacity from 0.5 to 0.9 meq / g "packed column, with the Extraction buffer has been equilibrated, filtered «The ion exchanger is then washed with the buffer used for the extraction.
Durch die angegebene Anionenaustauscher-BehAndlung werden aus dem wirkstoffbaltigen Extrakt sowohl Ballasteiweißstoffe und zur fibrinolytischen Therapie ungeeignete Proteasen als auch der größte Teil der Farbstoffe entfernt, wohingegen die fibrinolytisch aktive Protease nicht adsorbiert wird· |The specified anion exchanger treatment will result in the extract, which contains active ingredients, contains both dietary fiber and fibrinolytic therapy removes unsuitable proteases as well as most of the dyes, whereas the fibrinolytic active protease is not adsorbed · |
Aus der auf diese Weise erhaltenen Wirkstofflösung wird der Wirkstoff durch Versetzen mit der dreifachen Menge auf -20 0G vorgekühlten, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, vorzugsweise mit Atihanoi, ausgefällt und im Vakuum getrocknet· From the active ingredient solution obtained in this way, the active ingredient is precipitated by adding three times the amount of pre-cooled, water-miscible organic solvent to -20 0 G, preferably with Atihanoi, and dried in vacuo.
Die in möglichst wenig Wasser wieder aufgelöste wirkstoffhaltige Substanz wird in der Weise der Gelchromatographie unterworfen, daß die Lösung - vorzugsweise bei 0 bis +4 0O - auf eine mit Sephadex 6-76- oder Sephadex GMOO-GeI beschickte Säule gegeben wird· Anschließend wird mit Wasser λ eluiert. Xn den bei der Elution erhaltenen Fraktionen wird die proteolytische Aktivität getestet. Die aktiven Fraktionen werden gefriergetrocknet und ergeben ein weißes Trockenpulver einer reinen fibrinolytisoh wirksamen Protease alt einer proteolytischen Aktivität von ca, 15 CE/mg,The active ingredient-containing substance dissolved in as little water as possible is subjected to gel chromatography in such a way that the solution - preferably at 0 to +4 0 O - is placed on a column loaded with Sephadex 6-76 or Sephadex GMOO-Gel eluted with water λ. The proteolytic activity is tested in the fractions obtained during the elution. The active fractions are freeze-dried and result in a white dry powder of a pure fibrinolytic protease with a proteolytic activity of approx. 15 CE / mg,
Durch da» erfindungsgemäße Verfahren ist es möglich, aus rohen Enzymgemiaohen, erhalten aus Aepergillus oohraoeua, eine unter philologischen Bedingungen aktive hoohgerelnigte f 1-brinolytiech wirkeam· Froteas· mit einfachen technischen Hilfimitteln su iiolitrtn·The process according to the invention makes it possible, from raw enzyme mixtures obtained from Aepergillus oohraoeua , to obtain a high-quality brinolytic effect that is active under philological conditions.
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Die fibrinolytisoh aktive Protease führt bei äußerlicher oder parenteraler Applikation unter therapeutischen Bedingungen zu keinerlei toxischen Nebenwirkungen·The fibrinolytisoh active protease results in external or parenteral application under therapeutic conditions with no toxic side effects
Die proteolytische Aktivität, ausgedrückt in oaseinolytischen Einheiten (035), wurde nach einem modifizierten Verfahren einer von KfJNITZ ^"j.Gen.Physiol. JQ (1W) 2917 angegebenen Testmethode bei pH 8,0 bestimmt·The proteolytic activity, expressed in oaseinolytic units (035), was determined by a modified method of a test method given by KfJNITZ ^ "j.Gen.Physiol. JQ (1W) 2917 at pH 8.0.
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Ausführungs-Beispiel© tExecution example © t
50 g eines aus Aspergillus ochraceus-Kulturen isolierten rohen Enzymgemisch.es mit e iner proteolytischen Gesamtaktivität von 1t4-0E/mg weiten 4mal mit Je 200 ml 0,05 M Tris-HOl-Puffer vom pt 7 »2 unter 15-minütigem mechanischem Bohren extrahiert. Das Extraktionsgemisch wird bei 15000 g klarzentrifugiert. Die klaren, dunkelbraun gefärbten wirkstoffhaltigen Lösungen werden vereinigt und ergeben ein Volumen von 750 ml.50 g of a crude enzyme mixture isolated from Aspergillus ochraceus cultures with a total proteolytic activity of 1 t 4-0U / mg expand 4 times with 200 ml each of 0.05 M Tris-HOl buffer of pt 7 »2 for 15 minutes mechanical drilling extracted. The extraction mixture is centrifuged until clear at 15,000 g. The clear, dark brown solutions containing the active substance are combined and give a volume of 750 ml.
Die gesamte Lösung wird bei 0 bis 4 0O über eine mit dem Ani- " onenaustauscher DEAE-Sephadex A-50 beschickte Säule (Durchmesser 10 cm, Füllhöhe 18 cm) filtriert. Anschließend wird mit 0,05 M Tris-HOl-Puffer, pH 7,2, nachgewaschen·The entire solution is A-50 packed column (diameter 10 cm, filling level 18 cm) at 0 to 4 0 O a "anion exchanger with the anilines DEAE-Sephadex filtered. Subsequently, with 0.05 M Tris-HOl buffer, pH 7.2, rewashed
Zur Herstellung des Austauscherbettes werden 50 g DEAE-Sephadex A-50 mit 0,05 M Tris-HOl-Puffer pH 7>2 äquilibriert·50 g DEAE-Sephadex are used to produce the exchanger bed A-50 equilibrated with 0.05 M Tris-HOl buffer pH 7> 2
Aus dem nur noch schwach gefärbten wirkstoffhaltigen Filtrat (ca. 3500 ml) wird der Wirkstoff mit dem 3fachen Volumen auf -20 0O gekühlten Äthanols ausgefällt. Zur vollständigen Ausflockung des Wirkstoffes läßt man die Fällung über Nacht bei -20 0O stehen. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren ab- f getrennt, mit Äthanol und Aceton nachgewaschen und im Vakuum getrocknet·The active ingredient is precipitated from the filtrate (approx. 3500 ml), which is now only slightly colored, with the active ingredient-containing filtrate in 3 times the volume of ethanol cooled to -20 0 O. For complete flocculation of the drug is allowed to stand, the precipitation overnight at -20 0 O. The precipitate is separated off by centrifugation, washed with ethanol and acetone and dried in vacuo.
Es werden 4,43 g eines an fibrinolytisch wirksamer Protease angereicherten Produktes mit 11,6 CE/mg erhalten.There are 4.43 g of a fibrinolytically active protease enriched product with 11.6 CE / mg.
1,5 g dieses Produktes werden mit 8 ml dest. Wasser versetzt, gerührt und vom unlöslichen Rückstand durch Zentrifugieren bei 5000 g befreit.1.5 g of this product are distilled with 8 ml. Water added, stirred and removed from the insoluble residue by centrifugation exempted at 5000 g.
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Der klare, bräunliche wirkstoffhaltige Extrakt wird bei O bis 4 0C über eine mit in Wasser gequollenem Sephadex G 75-Gel beschickte Säule (Durchmesser 2,5 cm, Füllhöhe 95 cm) filtriert und mit dest. Wasser eluiert· Das von der Säule kommende Eluat wird dabei in 20 ml-Frakt ionen aiii gefangen. The clear, brownish active ingredient-containing extract is filtered at 0 to 4 ° C. through a column (diameter 2.5 cm, filling height 95 cm) charged with Sephadex G 75 gel swollen in water and washed with distilled water. Water eluted · The eluate coming from the column is captured in 20 ml fractions aiii.
Nach einem inaktivem Vorlauf von 220 ml findet sich, der Wirkstoff in den Fraktionen 12 bis 18, Farbstoffe und Eiweiße mit geringerem Molekulargewicht verbleiben auf der Säule·After an inactive forerun of 220 ml, the Active ingredient in fractions 12 to 18, dyes and proteins with a lower molecular weight remain on the Pillar·
Die Wirkstofflösung (140 ml) wird der Gefriertrocknung unterworfen und ergibt 616 mg eines weißen, leicht löslichen Trockenpulvers mit einer spezifischen proteolytischen Aktivität von 15ι7 GE pro mg.The active ingredient solution (140 ml) is subjected to freeze-drying and gives 616 mg of a white, easily soluble dry powder with a specific proteolytic activity of 15ι7 GE per mg.
20 g eines aus Aspergillus ochraceus isolierten rohen Enzymgemisches mit einer proteolytischen Gesamtaktivität von 1,0 OE/mg werden gemäß Vorschrift im 'Beispiel 1 extrahiert.20 g of a crude enzyme mixture isolated from Aspergillus ochraceus with a total proteolytic activity of 1.0 OE / mg are extracted according to the instructions in Example 1.
Die erhaltene klare, dunkelgefärbte wirkstoffhaltige Lösung (290 ml) wird über eine mit dem AnIonenaustauscher DEAE-Cellulose beschickte Säule (Durchmesser 4,5 ov, Füllhöhe 15 cm), die mit 0,05 M Tris-HOl-Puffer pH 7,2 äquilibriert worden ist, filtriert. Anschließend wird mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer pH 7»2 nachgewaschen·The clear, dark-colored solution containing the active ingredient obtained (290 ml) is over a DEAE cellulose with the anion exchanger loaded column (diameter 4.5 ov, filling height 15 cm), which equilibrates with 0.05 M Tris-HCl buffer pH 7.2 has been filtered. Then with 0.05 M Tris-HCl buffer pH 7 »2 rewashed
Aus dem wirkstoffhaltigen FiItrat (ca. 400 ml) wird der Wirkstoff, wie in Beispiel 1 beschrieben, ausgefällt, wobei 3»19 g eines an fibrinolytisch wirksamer Protease angereicherten Produktes mit 4,5 GE/mg erhalten werden, das zur Gewinnung des hochgereinigten Wirkstoffes nach Beispiel 1 der Gelchromatographie zu unterwerfen ist«The active ingredient-containing filtrate (approx. 400 ml) becomes the Active ingredient, as described in Example 1, precipitated, with 3 »19 g of an enriched in fibrinolytically active protease Product with 4.5 GE / mg are obtained, which is used to obtain the highly purified active ingredient according to Example 1 to be subjected to gel chromatography "
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