DE202022102746U1

DE202022102746U1 - Eine Vorrichtung zur Herstellung von Ethanol aus lignozellulosehaltiger Biomasse

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Publication number: DE202022102746U1
Application number: DE202022102746.3U
Authority: DE
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Priority date: 2022-05-18
Filing date: 2022-05-18
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2032-05-19

Abstract

Vorrichtung (100) zur Gewinnung von Ethanol aus lignocellulosehaltiger Biomasse, wobei die Vorrichtung (100) Folgendes umfasst:
einen geschlossenen Behälter (102) zum Sammeln und Lagern der lignozellulosehaltigen Biomasse wie Reishülsen in Form von Pulver, wobei das Pulver durch Mischen mit einem Mischer erhalten wird, wobei das gesammelte Pulver bei einer Temperatur unter Raumtemperatur gelagert wird;
eine Vorbehandlungskammer (104) in Verbindung mit einem geschlossenen Behälter (102) zum Durchführen einer Vielzahl von Vorbehandlungsverfahren mit dem gesammelten Reishülsenpulver, wobei eine Vielzahl von Reagenzien/Chemikalien dem gesammelten Reishülsenpulver zum Durchführen von Delignifizierung und De-Toxifizierung zugesetzt werden;
einen Filtertiegel (106) in Verbindung mit der Vorbehandlungskammer (104) zum Sammeln und Filtern der vorbehandelten Reishülsen nach dem Waschen mit destilliertem Wasser unter Absaugen und Trocknen bei 30-40°C;
einen Enzymextraktionskolben (108) in Verbindung mit der Vorbehandlungskammer (104) für die Extraktion von rohem Cellulaseenzym aus Trichoderma reesei, wobei die Extraktion durch Zugabe (pro Liter) von 40-50 g Weizenkleie, 10-20 g Hefeextrakt, 5-15 g Glucose, 1. 5-3 g NH₄Cl, 0.5 g Thiaminhydrochlorid, 2.0 g K₂HPO₄, 0.5 g MgSO₄.7H₂O, 0.1 g CaCl2 und 0.5 g KCl, wobei Trichoderma reesei inkubiert und zentrifugiert wird, um einen Überstand zu erzeugen, der eine Enzymquelle ist;
ein Reagenzglas (110) in Verbindung mit dem Kolben (108), wobei 0.5 bis 2 ml 0.05 M Natriumcitrat mit einem pH-Wert von 4.8 mit 0.5 ml des Enzyms gemischt werden, um eine zweite Lösung herzustellen, wobei ein Streifen Filterpapier in dem Reagenzglas angeordnet und 60 Minuten lang in einem Wasserbad bei 50°C gehalten wird, wobei nach 60 Minuten das Reagenzglas herausgenommen wird und die Menge der durch die Cellulase freigesetzten Zucker unter Verwendung der Dinitrosalicylsäure (DNSA)-Methode bestimmt wird;
ein Gefäß (112) in Verbindung mit dem Enzymextraktionskolben (108) und dem Reagenzglas (110) für die enzymatische Hydrolyse von 200-400 g nativer und delignifizierter Reishülse (d.h. 2 % Salpetersäure (HNO₃), 10 % HNO₃, 2 % Natriumhydroxid (NaOH) und 10 % NaOH), wobei die Reishülsen vor der Zugabe der vorbereiteten Enzyme 1-5 Stunden lang in einem Citratpuffer eingeweicht werden, wobei Natriumazid in einer Konzentration von 0.005 % zugegeben wird, um das mikrobielle Wachstum während des Verlaufs der Enzymhydrolyse einzuschränken; und
einen Erlenmeyerkolben (114) in Verbindung mit dem Gefäß (112) zur Ethanolherstellung durch Mischen von 20 g/l vorbehandelter Reishülsen aus der Hydrolyse mit 200 ml Citratpuffer (pH 5.0 ± 0. 2, 50 mM), gefolgt von einer 15-minütigen Sterilisation bei 15 psi (121°C), wobei die Reishülsen in Citratpuffer eingeweicht und mit Cellulase in einem Substrat-Enzym-Verhältnis von 1:5 (20 g vorbehandeltes Substrat: 100 ml rohe Cellulase) ergänzt werden, wobei immobilisierte Hefezellen in verschiedenen Konzentrationen beimpft, fermentiert und zur Analyse der Ethanolkonzentration zentrifugiert werden.

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Gebiet der Ethanolherstellung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur Herstellung von Ethanol aus lignozellulosehaltiger Biomasse wie Reishülsen, gefolgt von einer Optimierung der gleichzeitigen Saccharifikation und der Fermentationsparameter durch Saccharomyces cerevisiae NCIM 3455.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In den letzten Jahrzehnten wurden die verschiedenen Probleme im Zusammenhang mit der globalen Umwelt und Wirtschaft ernsthaft in Betracht gezogen. Daher hat sich die vorherrschende wissenschaftliche Forschung auf die Erforschung verschiedener Herstellungsverfahren und Technologien aus erneuerbaren Ressourcen oder Rohstoffen konzentriert. Die steigenden Preise für fossile Brennstoffe und die erschreckende Emission von Treibhausgasen haben die Erforschung alternativer und nachhaltiger Energiequellen in den Vordergrund gerückt. Aufgrund des weltweit steigenden Energiebedarfs, der Erschöpfung der fossilen Brennstoffe und der Gefahren für die Umwelt hat die Herstellung von Ethanol und anderen Biokraftstoffen aus lignozellulosehaltiger Biomasse große Bedeutung erlangt.
US10047299B2 offenbart die Herstellung von Kraftstoff aus FCC-Produkten. Sie umfasst eine mit Wasserstoff behandelte katalytische Slurry-Ölzusammensetzung mit einer Dichte bei ^~15° C von etwa 0.92 g/cc bis etwa 1.02 g/cc, einem T50-Destillationspunkt von etwa 340° C bis etwa 390° C., und einen T90-Destillationspunkt von etwa 450° C bis etwa 525° C, wobei die hydrierte katalytische Slurry-Ölzusammensetzung etwa 1.0 Gew.-% oder weniger an n-Heptan-Unlöslichem, etwa 50 Gew.% bis etwa 70 Gew.-% Aromaten, einen Schwefelgehalt von etwa 1000 wppm oder weniger und einen Wasserstoffgehalt von etwa 10.0 Gew.-% bis 12.0 Gew.-%, wobei ein ^~700° F.- (^~371° C.) Anteil der hydrobehandelten katalytischen Slurry-Ölzusammensetzung weniger als etwa 5.0 Gew.-% Paraffine enthält.
In der heutigen Zeit ist es notwendig, neue Biomasse, wie z. B. weniger genutzte Agrarabfälle, in das Portfolio der Biomasse-Rohstoffe aufzunehmen, was zu einer Diversifizierung führt und die Nachhaltigkeit der Bioethanolproduktion in der Zukunft gewährleistet. Aufgrund ihres übermäßigen natürlichen Vorkommens hat die Lignozellulose als Biomassequelle enorme Aufmerksamkeit erlangt.
US10723621B2 beschreibt die Umwandlung von organischem Material in Biogas durch anaerobe Vergärung, wobei das Biogas gereinigt wird, um ein brennbares flüssiges Ausgangsmaterial mit Methan zu erhalten. In einer Anlage zur Kraftstoffherstellung wird ein brennbares flüssiges Ausgangsmaterial zur Erzeugung von erneuerbarem Wasserstoff verwendet, der zur Hydrierung von aus Rohöl gewonnenen Kohlenwasserstoffen in einem Verfahren zur Herstellung von Transport- oder Heizkraftstoff eingesetzt wird. Der erneuerbare Wasserstoff wird mit Kohlenwasserstoffen aus Rohöl kombiniert, die unter Bedingungen entschwefelt wurden, um den flüssigen Kohlenwasserstoff mit dem erneuerbaren Wasserstoff zu hydrieren, oder alternativ kann der erneuerbare Wasserstoff einem Reaktor zugeführt werden, der so betrieben wird, dass die Kohlenwasserstoffe gleichzeitig entschwefelt und hydriert werden.
Der oben erwähnte Stand der Technik offenbart jedoch die Umwandlung von organischem Material in Biogas und dann in eine brennbare Flüssigkeit, die Methan enthält. Er enthält jedoch keine Angaben zur Herstellung von Kraftstoff für den Verkehr.
Lignozellulose-Biomasse ist heute eine hervorragende Quelle für die Herstellung von flüssigen Kraftstoffen. Eine Möglichkeit in dieser Richtung ist der physikalisch-chemische und enzymatische Abbau von Reishülsen zu vergärbaren Zuckern und die anschließende Umwandlung in Bioethanol. In keinem der oben erwähnten Stand der Technik wird jedoch die Herstellung von Ethanol aus Reishülsen beschrieben.
Daher besteht die Notwendigkeit, ein kosteneffizientes und umweltfreundliches Bio-Progressionssystem zur Gewinnung von Zellulose-Ethanol aus Reishülsen zu entwickeln.
Der technische Fortschritt, der durch die vorliegende Erfindung offenbart wird, überwindet die Einschränkungen und Nachteile bestehender und konventioneller Systeme und Methoden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf eine Vorrichtung zur Gewinnung von Ethanol aus Reishülsen.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung zur Gewinnung von Ethanol aus Risikohülsen zu entwickeln,
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein kostengünstiges und umweltfreundliches Gerät zu entwickeln, und
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine maximale Ethanolkonzentration zu erreichen.

In einer Ausführungsform, eine Vorrichtung zur Gewinnung von Ethanol aus lignozellulosehaltiger Biomasse, wobei die Vorrichtung umfasst: einen geschlossenen Behälter zum Sammeln und Lagern der lignozellulosehaltigen Biomasse wie Reishülsen in Form von Pulver, wobei das Pulver durch Mischen mit einem Mischer erhalten wird, wobei das gesammelte Pulver bei einer Temperatur unterhalb der Raumtemperatur gelagert wird; eine Vorbehandlungskammer in Verbindung mit einem geschlossenen Behälter zum Durchführen einer Vielzahl von Vorbehandlungsverfahren mit dem gesammelten Reishülsenpulver, wobei eine Vielzahl von Reagenzien/Chemikalien zu dem gesammelten Reishülsenpulver zum Durchführen von Delignifizierung und De-Toxifizierung zugegeben werden;einen Filtertiegel in Verbindung mit der Vorbehandlungskammer zum Sammeln und Filtern der vorbehandelten Reishülsen nach dem Waschen mit destilliertem Wasser unter Absaugen und Trocknen bei 30-40°C; einen Enzymextraktionskolben in Verbindung mit der Vorbehandlungskammer für die Extraktion von rohem Cellulase-Enzym aus Trichoderma reesei, wobei die Extraktion durch Zugabe von (pro Liter) 40-50 g Weizenkleie, 10-20 g Hefeextrakt, 5-15 g Glucose, 1.5-3 g NH₄Cl, 0.5 g Thiaminhydrochlorid, 2.0 g K₂HPO₄, 0.5 g MgSO₄.7H₂O, 0.1 g CaCl₂ und 0.5 g KCl, wobei der Trichoderma reesei inkubiert und zentrifugiert wird, um einen Überstand zu erzeugen, der eine Enzymquelle darstellt; ein Reagenzglas in Verbindung mit dem Kolben, in dem 0. 5-2 ml 0.05 M Natriumcitrat mit einem pH-Wert von 4.8 mit 0.5 ml des Enzyms gemischt werden, um eine zweite Lösung herzustellen, wobei ein Streifen Filterpapier in dem Reagenzglas angeordnet und 60 Minuten lang in einem Wasserbad bei 50°C gehalten wird,wobei nach 60 Minuten die Röhrchen entnommen werden und die von der Cellulase freigesetzte Zuckermenge unter Verwendung der Dinitrosalicylsäure (DNSA)-Methode bestimmt wird; und ein Gefäß in Verbindung mit dem Enzymextraktionskolben für die enzymatische Hydrolyse von 200-400 g nativer und delignierter Reishülsen (d.h. 2 % Salpetersäure (HNO₃), 10 % HNO₃, 2 % Natriumhydroxid (NaOH) und 10 % NaOH), wobei die Reishülsen vor der Zugabe der vorbereiteten Enzyme 1-5 h lang in einem Citratpuffer eingeweicht werden, wobei Natriumazid in einer Konzentration von 0. 005% zugesetzt wird, um das mikrobielle Wachstum während des Verlaufs der enzymatischen Hydrolyse einzuschränken; und ein Erlenmeyer-Gefäß in Verbindung mit dem Gefäß für die Ethanolherstellung durch Mischen von 20 g/l vorbehandelter Reishülsen, die aus der Hydrolyse stammen, mit 200 ml Citratpuffer (pH 5.0 ± 0. 2.50 mM), gefolgt von einer 15-minütigen Sterilisation bei 15 psi (121°C), wobei die Reishülsen in Citratpuffer eingeweicht und mit Cellulase in einem Substrat-Enzym-Verhältnis von 1:5 (20 g vorbehandeltes Substrat: 100 ml rohe Cellulase) ergänzt werden, wobei immobilisierte Hefezellen in verschiedenen Konzentrationen beimpft, fermentiert und zur Analyse der Ethanolkonzentration zentrifugiert werden.
In einer Ausführungsform wird die gesammelte Reishülse mit dem Mixer bei 3000 U/min zu 100 Mesh (0.15 mm) feinem Pulver verarbeitet, wobei die pulverisierte Reishülse in dem geschlossenen Behälter bei 3-5°C aufbewahrt wird, um jeden wahrscheinlichen Abbau oder Verfall zu vermeiden.
In einer Ausführungsform umfasst die Vielzahl der in der Vorbehandlungskammer durchgeführten Vorbehandlungsverfahren die Dampfexplosion, Überkalkungsverfahren, Neutralisierung und Aktivkohlebehandlung, wobei die Standardverfahren der Überkalkung (Kalziumoxid), Neutralisierung (HCl) und Aktivkohlebehandlung für den Entgiftungsprozess eingesetzt werden.
In einer Ausführungsform filtert eine Vakuumfiltrationskammer in Verbindung mit der Vorbehandlungskammer den Niederschlag und die nach der Neutralisierung gebildeten Salze heraus, wobei die neutralisierte Mischung 20-40 Minuten lang unter normalem Mischen belassen wird, um eine filtrierte Lösung zu erhalten.
In einer Ausführungsform ist ein Orbitalschüttler mit der Vorbehandlungskammer verbunden, um nach Zugabe von 2.5 % Aktivkohle zu der gefilterten Lösung ein erstes Gemisch zu bilden und 20-40 Minuten lang kontinuierlich zu mischen, wobei das erste Gemisch zweimal erneut gefiltert wird, um die Aktivkohle zu entfernen, und der pH-Wert auf 6.0-6.5 eingestellt wird.
In einer Ausführungsform umfasst die Vielzahl von Reagenzien/Chemikalien zur Durchführung der Vielzahl von Vorbehandlungsverfahren: verdünnte Salpetersäure (1-5% v/v), konzentrierte Salpetersäure (5-15% v/v), Natriumhydroxid (0.1-5% w/v), Natriumhydroxid (5-15% w/v) mit Dampfexplosion bei 120-200°C für etwa 15-30 min.
In einer Ausführungsform wird T. reesei separat gezüchtet und mit aktiv wachsenden und isolierten Pilzen beimpft, wobei die Masken 10 Tage lang auf einem Rotationsschüttler bebrütet werden, wobei nach 8-12 Tagen Inkubation die Kulturbrühe 10-30 Minuten lang bei 10,000 U/min zentrifugiert wird, um Myzelien und Sporen zu entfernen, wobei der Überstand gesammelt und als Enzymquelle verwendet wird, die bei 1-10 °C gelagert wird.
In einer Ausführungsform wird die Hydrolyse in einem Gefäß durchgeführt, das mit einem Rührwerk zum Rühren und einem Außenmantel für die Wasserzirkulation zur Aufrechterhaltung der erforderlichen Temperatur ausgestattet ist und 3 I Citratpuffer (pH 5.0 ± 0.2, 50 mM, 50 ± 0.5°C) bei 100 U/min enthält.
In einer Ausführungsform wird das in dem Citratpuffer eingeweichte Substrat mit Cellulase 5 FPU/g bei einem Verhältnis von Substrat zu Enzym von 1:5 ergänzt, wobei die Proben nach 48 h entnommen, zentrifugiert und der Überstand auf die insgesamt freigesetzten reduzierenden Zucker analysiert wird, wobei die Menge der reduzierenden Zucker durch die DNSA-Methode geschätzt wird.
In einer Ausführungsform werden die immobilisierten Hefezellen als Inokulum in verschiedenen Konzentrationen, nämlich 2, 4 oder 6 %, verwendet. MgSO₄, 0.5 g/l; KCI, 0.5 g/l, und FeSO₄ 0.01 g/l werden als übliche Nährstoffe in allen Fermentationen verwendet, wobei die Fermentation 72 Stunden lang durchgeführt wird, wonach die Proben entnommen und in einer Laborzentrifuge bei 1200 U/min zentrifugiert werden und die Überstände auf die Ethanolkonzentration analysiert werden.
Um die Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung weiter zu verdeutlichen, wird eine genauere Beschreibung der Erfindung durch Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen davon, die in den beigefügten Figuren dargestellt ist, gemacht werden. Es wird davon ausgegangen, dass diese Figuren nur typische Ausführungsformen der Erfindung zeigen und daher nicht als Einschränkung ihres Umfangs zu betrachten sind. Die Erfindung wird mit zusätzlicher Spezifität und Detail mit den beigefügten Figuren beschrieben und erläutert werden.
Figurenliste
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden besser verstanden, wenn die folgende detaillierte Beschreibung mit Bezug auf die beigefügten Figuren gelesen wird, in denen gleiche Zeichen gleiche Teile in den Figuren darstellen, wobei:

1 ein Blockdiagramm einer Vorrichtung zur Gewinnung von Ethanol aus lignozellulosehaltiger Biomasse zeigt,
2 eine tabellarische Darstellung der Nährstoffkomponenten, die in verschiedenen Nährstoffparametern verwendet werden zeigt,
3 eine tabellarische Darstellung des nach der Dampfexplosions-Vorbehandlung von Reishülsen freigesetzten Zuckers zeigt,
4 eine tabellarische Darstellung der dreistufigen CCD und der experimentellen Antworten auf die abhängige Variable Y zeigt, und
5 eine tabellarische Darstellung des quadratischen Polynommodells für die Ethanolproduktion auf der Grundlage der ANOVA zeigt.

Der Fachmann wird verstehen, dass die Elemente in den Figuren der Einfachheit halber dargestellt sind und nicht unbedingt maßstabsgetreu gezeichnet wurden. Die Flussdiagramme veranschaulichen beispielsweise das Verfahren anhand der wichtigsten Schritte, um das Verständnis der Aspekte der vorliegenden Offenbarung zu verbessern. Darüber hinaus kann es sein, dass eine oder mehrere Komponenten der Vorrichtung in den Figuren durch herkömmliche Symbole dargestellt sind und dass die Figuren nur die spezifischen Details zeigen, die für das Verständnis der Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung relevant sind, um die Figuren nicht mit Details zu überfrachten, die für Fachleute, die mit der vorliegenden Beschreibung vertraut sind, leicht erkennbar sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Um das Verständnis der Erfindung zu fördern, wird nun auf die in den Figuren dargestellte Ausführungsform Bezug genommen und diese mit bestimmten Worten beschrieben. Es versteht sich jedoch von selbst, dass damit keine Einschränkung des Umfangs der Erfindung beabsichtigt ist, wobei solche Änderungen und weitere Modifikationen des dargestellten Systems und solche weiteren Anwendungen der darin dargestellten Grundsätze der Erfindung in Betracht gezogen werden, wie sie einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung normalerweise einfallen würden.
Es versteht sich für den Fachmann von selbst, dass die vorstehende allgemeine Beschreibung und die folgende detaillierte Beschreibung beispielhaft und erläuternd für die Erfindung sind und diese nicht einschränken sollen.
Wenn in dieser Beschreibung von „einem Aspekt“, „einem anderen Aspekt“ oder ähnlichem die Rede ist, bedeutet dies, dass ein bestimmtes Merkmal, eine bestimmte Struktur oder eine bestimmte Eigenschaft, die im Zusammenhang mit der Ausführungsform beschrieben wird, in mindestens einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten ist. Daher können sich die Ausdrücke „in einer Ausführungsform“, „in einer anderen Ausführungsform“ und ähnliche Ausdrücke in dieser Beschreibung alle auf dieselbe Ausführungsform beziehen, müssen es aber nicht.
Die Ausdrücke „umfasst“, „enthaltend“ oder andere Variationen davon sollen eine nicht ausschließliche Einbeziehung abdecken, so dass ein Verfahren oder eine Methode, die eine Liste von Schritten umfasst, nicht nur diese Schritte umfasst, sondern auch andere Schritte enthalten kann, die nicht ausdrücklich aufgeführt sind oder zu einem solchen Verfahren oder einer solchen Methode gehören. Ebenso schließen eine oder mehrere Vorrichtungen oder Teilsysteme oder Elemente oder Strukturen oder Komponenten, die mit „umfasst...a“ eingeleitet werden, nicht ohne weitere Einschränkungen die Existenz anderer Vorrichtungen oder anderer Teilsysteme oder anderer Elemente oder anderer Strukturen oder anderer Komponenten oder zusätzlicher Vorrichtungen oder zusätzlicher Teilsysteme oder zusätzlicher Elemente oder zusätzlicher Strukturen oder zusätzlicher Komponenten aus.
Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie von einem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, allgemein verstanden wird. Das System, die Methoden und die Beispiele, die hier angegeben werden, dienen nur der Veranschaulichung und sind nicht als Einschränkung gedacht.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren im Detail beschrieben.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Probe von Reishülsen aus Reismühlen des Bilaspurdistrikts (22°05'N 82◦09'E/22◦09'N 82°15'E), Chhattisgarh, Indien, beschafft.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird der Wildtyp-Stamm von Saccharomyces cerevisiae NCIM 3455 und T. reesei NCIM 1052 von National Collection of Industrial Microorganisms (NCIM), National Chemical Laboratory, Pune, Indien, bezogen.
Die Hefekultur wird auf Malz-Hefe-Agar-Medium mit folgender Zusammensetzung (g/l) gehalten: Malzextrakt, 3; Hefeextrakt, 3; Pepton, 5; Glucose, 10; Agar, 20, pH 7.0 ± 0.2. Der Stamm von T. reesei NCIM 1052 wird auf PDA-Schichten gehalten, die aus (g/I): Kartoffel, 200; Dextrose, 20; Agar, 25, pH 4.8 ± 0.2 bestehen. Stammkulturen werden bei 4°C gelagert. Das flüssige Medium für das Wachstum des Inokulums für Hefe ist das YEPD-Medium, bestehend aus (g/l): Hefeextrakt, 10; Pepton, 20; Dextrose, 20, pH 5.00 ± 0.2 für 48 Stunden bei 28 ± 0.5°C. Die Inokula werden aerob in 250-ml-Erlenmeyer-Gefäßen mit dem oben genannten Medium bei 28 °C in einem Schüttler (Remi Scientific) bei 200 U/min für 24 Stunden gezüchtet. Die aktiven Zellen werden in einer klinischen Zentrifuge (1200 U/min) zentrifugiert, mit sterilem Wasser gewaschen und als Inokulum verwendet.
1 zeigt ein Blockdiagramm einer Vorrichtung (100) zur Gewinnung von Ethanol aus lignozellulosehaltiger Biomasse, wobei die Vorrichtung (100) Folgendes umfasst: einen geschlossenen Behälter (102), eine Vorbehandlungskammer (104)
einen Filtertiegel (106), einen Enzymextraktionskolben (108), eine Vakuumfiltrationskammer (104a), einen Orbitalschüttler (104b), ein Reagenzglas (110) und ein Gefäß (112) sowie einen Erlenmeyerkolben (114).
Geschlossener Behälter (102) zum Sammeln und Lagern der lignozellulosehaltigen Biomasse wie Reishülsen in Form von Pulver, wobei das Pulver durch Mischen mit einem Mixer erhalten wird, wobei das gesammelte Pulver bei einer Temperatur unter Raumtemperatur gelagert wird. Die gesammelten Reishülsen werden mit dem Mischer bei 3000 U/min zu einem Pulver mit einer Maschenweite von 100 Maschen (0.15 mm) zerkleinert, wobei die pulverisierten Reishülsen in einem geschlossenen Behälter bei 3-5 °C aufbewahrt werden, um jeglichen wahrscheinlichen Abbau oder Verfall zu vermeiden.
Die Vorbehandlungskammer (104) in Verbindung mit einem geschlossenen Behälter (102) zur Durchführung einer Vielzahl von Vorbehandlungsverfahren mit dem gesammelten Reishülsenpulver, wobei eine Vielzahl von Reagenzien/Chemikalien dem gesammelten Reishülsenpulver zur Durchführung von Delignifizierung und De-Toxifizierung zugesetzt werden. Die Vielzahl der Vorbehandlungsverfahren, die in der Vorbehandlungskammer (104) durchgeführt werden, umfasst die Dampfexplosion, Überkalkungsverfahren, Neutralisierung und Aktivkohlebehandlung, wobei die Standardverfahren der Überkalkung (Kalziumoxid), Neutralisierung (HCl) und Aktivkohlebehandlung für den Entgiftungsprozess eingesetzt werden.Die Vielzahl von Reagenzien/Chemikalien zur Durchführung der Vielzahl von Vorbehandlungsverfahren umfasst: verdünnte Salpetersäure (1-5% v/v), konzentrierte Salpetersäure (5-15% v/v), Natriumhydroxid (0.1-5% w/v), Natriumhydroxid (5-15% w/v) mit Dampfexplosion bei 120-200°C für etwa 15-30 min.
Die mehreren Vorbehandlungskammern (104) bestehen aus: einer Vakuumfiltrationskammer (104a) und einem Orbitalschüttler (104b).
Die Vakuumfiltrationskammer (104a) filtert den Niederschlag und die nach der Neutralisierung gebildeten Salze heraus, wobei die neutralisierte Mischung 20-40 Minuten lang unter normalem Mischen belassen wird, um eine filtrierte Lösung zu erhalten.
Der Orbitalschüttler (104b) ist mit der Vorbehandlungskammer (104) verbunden, um nach Zugabe von 2.5 % Aktivkohle zu der gefilterten Lösung ein erstes Gemisch zu bilden und 20-40 Minuten lang kontinuierlich zu mischen, wobei das erste Gemisch zweimal erneut gefiltert wird, um die Aktivkohle zu entfernen, und der pH-Wert auf 6.0-6.5 eingestellt wird.
Der Filtertiegel (106) in Verbindung mit der Vorbehandlungskammer (104) zum Sammeln und Filtern der vorbehandelten Reishülsen nach dem Waschen mit destilliertem Wasser unter Absaugen und Trocknen bei 30-40°C. Enzymextraktionskolben (108) in Verbindung mit der Vorbehandlungskammer (104) zur Extraktion von rohem Cellulase-Enzym aus Trichoderma reesei, wobei die Extraktion durch Zugabe (pro Liter) von 40-50 g Weizenkleie, 10-20 g Hefeextrakt, 5-15 g Glucose, 1. 5-3 g NH₄Cl, 0.5 g Thiaminhydrochlorid, 2.0 g K₂HPO₄, 0.5 g MgSO₄.7H₂O, 0.1 g CaCl₂ und 0.5 g KCl, wobei Trichoderma reesei inkubiert und zentrifugiert wird, um einen Überstand zu erzeugen, der eine Enzymquelle ist.T. reesei wird separat gezüchtet und mit aktiv wachsenden und isolierten Pilzen beimpft, wobei die Masken 10 Tage lang auf einem Rotationsschüttler bebrütet werden, wobei nach 8-12 Tagen der Bebrütung die Kulturbrühe 10-30 Minuten lang bei 10 000 U/min zentrifugiert wird, um Myzelien und Sporen zu entfernen, wobei der Überstand gesammelt und als Enzymquelle verwendet wird, die bei 1-10°C gelagert wird.
Das Reagenzglas (110) in Verbindung mit dem Kolben (108), wobei 0.5 bis 2 ml 0.05 M Natriumcitrat mit einem pH-Wert von 4.8 mit 0.5 ml des Enzyms gemischt werden, um eine zweite Lösung herzustellen, wobei ein Streifen Filterpapier in dem Reagenzglas angeordnet und 60 Minuten lang in einem Wasserbad bei 50 °C gehalten wird, wobei nach 60 Minuten das Reagenzglas herausgenommen wird und die Menge der durch die Cellulase freigesetzten Zucker unter Verwendung der Dinitrosalicylsäure (DNSA)-Methode bestimmt wird.
Das Gefäß (112) in Verbindung mit dem Enzymextraktionskolben (108) und dem Reagenzglas (110) für die enzymatische Hydrolyse von 200-400 g nativer und delignifizierter Reishülse (d.h. 2 % Salpetersäure (HNO₃), 10 % HNO₃, 2 % Natriumhydroxid (NaOH) und 10 % NaOH), wobei die Reishülsen vor der Zugabe der vorbereiteten Enzyme 1-5 Stunden lang in einem Citratpuffer eingeweicht werden, wobei Natriumazid in einer Konzentration von 0.005 % zugegeben wird, um das mikrobielle Wachstum während des Verlaufs der enzymatischen Hydrolyse zu begrenzen.
Die Hydrolyse wird in einem Gefäß durchgeführt, das mit einem Rührwerk zum Rühren und einem Außenmantel für die Wasserzirkulation ausgestattet ist, um die erforderliche Temperatur aufrechtzuerhalten, und das 3-1 Citratpuffer (pH 5.0 ± 0.2, 50 mM, 50 ± 0.5°C) bei 100 U/min enthält. Das in dem Citratpuffer eingeweichte Substrat wird mit 5 FPU/g Cellulase im Verhältnis von Substrat zu Enzym von 1:5 versetzt, wobei die Proben nach 48 h entnommen, zentrifugiert und der Überstand auf die freigesetzten reduzierenden Gesamtzucker analysiert werden, wobei die Menge der reduzierenden Zucker durch die DNSA-Methode geschätzt wird.
Erlenmeyerkolben (114) in Verbindung mit dem Gefäß (112) zur Herstellung von Ethanol durch Mischen von 20 g/l vorbehandelter, durch Hydrolyse gewonnener Reishülsen mit 200 ml Citratpuffer (pH 5.0 ± 0. 2, 50 mM), gefolgt von einer 15-minütigen Sterilisation bei 15 psi (121°C), wobei die Reishülsen in Citratpuffer eingeweicht und mit Cellulase in einem Substrat-Enzym-Verhältnis von 1:5 (20 g vorbehandeltes Substrat: 100 ml rohe Cellulase) ergänzt werden, wobei immobilisierte Hefezellen in verschiedenen Konzentrationen beimpft, fermentiert und zur Analyse der Ethanolkonzentration zentrifugiert werden.
Die Immobilisierung der Hefe erfolgt durch die Natriumalginatmethode. Der Batch-Versuch wird gemäß dem zentralen zusammengesetzten Versuchsplan für die Ethanolproduktion in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben durchgeführt.
2 zeigt eine tabellarische Darstellung der Nährstoffkomponenten, die für verschiedene Nährstoffparameter verwendet werden. Die Parameter wie Temperatur, Inokulumkonzentration und Nährstofffaktor wurden als die wichtigsten ausgewählt. Der Prozess wird mit einer anfänglichen Substratkonzentration von 20 g/l vorbehandeltem Substrat (d.h. Reishülsen) und 200 ml Citratpuffer (pH 5.0 ± 0.2, 50 mM) durchgeführt, gefolgt von einer 15-minütigen Sterilisation bei 15 psi (121°C). Das in Citratpuffer eingeweichte Substrat wird mit Cellulase in einem Verhältnis von 1:5 (20 g vorbehandeltes Substrat: 100 ml rohe Cellulase) versetzt oder es werden 5 FPU Cellulase pro Gramm Substrat zur Hydrolyse verwendet.Die Saccharifikation erfolgt 24 Stunden lang bei 50°C. Danach wird im selben Gefäß eine gleichzeitige Fermentation durch Zugabe von 50 ml sterilisiertem entgiftetem Hydrolysat (nach der Vorbehandlung) und verschiedenen Nährstoffen bei niedrigeren Temperaturen (30/32/34°C) durchgeführt.
Immobilisierte Hefezellen werden als Inokulum in verschiedenen Konzentrationen verwendet, nämlich 2, 4 oder 6 %. MgSO₄, 0.5 g/l; KCI, 0.5 g/l, und FeSO₄ 0.01 g/l werden als allgemeine Nährstoffe in allen Fermentationsversuchen verwendet, mit Ausnahme der oben genannten Nährstoffparameter. Die Gärung dauert 72 Stunden. Danach werden die Proben entnommen und in einer Laborzentrifuge bei 1200 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, und die Überstände werden auf ihre Ethanolkonzentration untersucht.
Die reduzierenden Gesamtzucker werden mit der Dinitrosalicylsäure-Methode bestimmt. Die quantitative und qualitative Analyse der Zucker in den Hydrolysaten nach der Vorbehandlung erfolgt mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit C18-Säule und einem SPD 20A UV-Detektor bei 284 nm und einem Datenprozessor mit Register. Die Proben werden vor der Injektion durch Membranfilter 0,45µm (Millipore) gefiltert. Die Temperatur der Säule wird bei 35 °C gehalten, das Injektionsventil ist auf 20 µl eingestellt. Der UV-Detektor wird bei 40 °C betrieben. Als Lösungsmittel werden Wasser (90 %) und Methanol (10 %) als mobile Phase mit einer Durchflussrate von 1 ml/min verwendet. Alle Experimente wurden in doppelter Ausführung durchgeführt, und alle angegebenen Ergebnisse sind Mittelwerte. Die durchschnittliche Standardabweichung der erzielten Ergebnisse beträgt weniger als 4 %.
Beim zentralen zusammengesetzten Versuchsplan (Central Composite Design, CCD) beträgt die Gesamtzahl der Versuchskombinationen 2K + 2K + n₀, wobei K die Anzahl der unabhängigen Variablen und n₀ die Anzahl der Wiederholungen der Versuche am zentralen Punkt ist, was bedeutet, dass für dieses Verfahren 20 Versuche erforderlich sind. Die für diese Studie gewählte abhängige Variable ist die Ethanolkonzentration, Y (g/l). Als unabhängige Variablen wurden die Inkubationstemperatur (30, 32 und 34°C) X1, der Inokulumgehalt (2, 4 und 6 %) X2 und die Nährstoffe (1/2/3) X3 gewählt. Es wird ein mathematisches Modell entwickelt, das die Beziehungen zwischen der prozessabhängigen Variable und den unabhängigen Variablen in einer Gleichung zweiter Ordnung beschreibt. Versuchsdaten werden entsprechend der folgenden Polynomgleichung zweiter Ordnung (1) angepasst. $Y = b o + \sum_{i = 1}^{k} b i x i + \sum_{i = 1}^{k} b i j x^{2} i + \sum_{i i < j}^{k} \sum_{i < j}^{k} b i j x i x j + e$
wobei i und j lineare bzw. quadratische Koeffizienten sind, während „b“ der Regressionskoeffizient, k die Anzahl der untersuchten und optimierten Faktoren im Versuch und „e“ der Zufallsfehler ist. Die Qualität von fit der Gleichung zweiter Ordnung wird durch das Bestimmtheitsmaß R2 ausgedrückt, und seine statistische Signifikanz wird durch den F-Test bestimmt. Die Signifikanz der einzelnen Koeffizienten wird mit dem Student's t-Test bestimmt. Der Student's t-Test wird verwendet, um die Signifikanz der Regressionskoeffizienten der Parameter zu bestimmen. Die P-Werte (Wahrscheinlichkeitswert) werden als Instrument zur Überprüfung der Signifikanz der Interaktionseffekte verwendet, die wiederum Hinweise auf die Muster der Interaktionen zwischen den Variablen geben können. Im Allgemeinen deuten größere Werte für t und kleinere Werte für P darauf hin, dass der entsprechende Koeffizient signifikant ist.
3 zeigt eine tabellarische Darstellung des nach der Dampfexplosions-Vorbehandlung von Reishülsen freigesetzten Zuckers. Von allen Chemikalien führte die Dampfexplosions-Vorbehandlung von Bagasse mit HNO₃ (6 % v/v) zu einer maximalen Hydrolyse.
Das nach dieser Vorbehandlung erhaltene Hydrolysat bestand aus 11.58 % Xylose, 6.35 % Glucose und 4.52 % Fructose. Bei der Vorbehandlung von Lignozellulose kommt es zu einer erheblichen Verringerung des Ligningehalts und zur Dekristallisation der Zellulose. Auch ein Teil der Hemicellulose wird während der Vorbehandlung reduziert, was sich auf die Mikro- und Makrozugänglichkeit der Cellulasen zur Cellulose auswirkt. Darüber hinaus bietet die Vorbehandlung eine verbesserte Oberfläche für die katalytischen Reaktionen, die stattfinden können.
Die saure Reaktion bewirkt die Umwandlung von Zellulose in Glukose und von Hemizellulose in Xylosekomponenten. Xylose, ein Hemicellulosezucker, ist der größte Zucker, der im Filtrat freigesetzt wird. Die amorphe Natur der Hemizellulose ist für ihren leichten Abbau verantwortlich. Die kristalline Beschaffenheit der Zellulose hingegen erlaubt keinen einfachen Abbau durch Mineralsäure, vor allem dann nicht, wenn deren Konzentration niedrig ist. Die Dampfexplosionsvorbehandlung mit 6 % HNO3 hat gezeigt, dass die leicht hydrolysierbare Fraktion des Xylans abgebaut wird. Der Zucker blieb bei einem durchschnittlichen Volumen des Hydrolysats von 10.0 ml konzentrierter. In großem Maßstab, wo das Volumen des Hydrolysats größer ist, würde sich die gleiche Bedingung umkehren.
Diese vorbehandelte Biomasse kann aus bis zu 90 % Zellulose bestehen und somit die enzymatische Hydrolyse erheblich unterstützen. Zellulosemikrofibrillen sind in Zellwänden mit geringer oder keiner Lignifizierung offenbar leichter für enzymatische Angriffe zugänglich. Die Umwandlung von Zellulose in Glukose durch enzymatische Hydrolyse ist einer der wichtigsten Schritte bei der Umwandlung von zellulosehaltiger Biomasse zur Herstellung von Biokraftstoff. In dieser Studie wird die enzymatische Hydrolyse von mit 6 % HNO₃ vorbehandelten Reishülsen zur Depolymerisation der Kohlenhydratfraktion der Zellwand in fermentierbare Zucker durchgeführt. Die Enzymaktivität (U/ml) der rohen Cellulase, die von T.reesei NCIM 1052 beträgt 311.1 Imol/ml/min und wird mit 5 FPU/g Substrat beladen. Anschließend wird die enzymatische Hydrolyse bei physikalischen Parametern (50 ± 0.5°C, 100 rpm) durchgeführt. Wie erwartet, stieg der Zelluloseumsatz mit zunehmender Inkubationszeit an. Während des gesamten Verlaufs der enzymatischen Hydrolyse ist ein regelmäßiger Anstieg der freigesetzten Zucker bis zu 60 Stunden zu verzeichnen, danach bleibt er konstant. Die enzymatische Saccharifikation von mit 6 % HNO₃ vorbehandelten Reishülsen erbrachte nach 60 Stunden Behandlung ein Maximum von 150.10 ± 0.38 mg/g (1.5 ± 0.40 g/l) Glucose mit einem Hydrolysegrad von 60 ± 0.34 %.
Eine Enzymkonzentration von 5 FPU/g Substrat hat sich als geeignet erwiesen, die in vorbehandelten Reishülsen vorhandene Zellulose abzubauen.
Saccharomyces-Arten werden für die Bioethanolproduktion aus verschiedenen Substraten erforscht. Wichtige Prozessvariablen für die Ethanolproduktion aus vorbehandelten Substraten werden mit Hilfe der Response-Surface-Methode (RSM) auf der Grundlage von CCD-Experimenten (Central Composite Design) optimiert.
4 zeigt eine tabellarische Darstellung der dreistufigen CCD und der experimentellen Antworten der abhängigen Variablen Y. Die dreistufige Matrix des zentralen zusammengesetzten Versuchsplans und die experimentellen Antworten der abhängigen Variablen (Ethanolkonzentration) sind in 4 aufgeführt.
5 zeigt eine tabellarische Darstellung des quadratischen Polynommodells für die Ethanolproduktion auf der Grundlage der ANOVA. Neben dem linearen Effekt der Ethanolkonzentration Y g/l gibt die Response-Surface-Methode auch einen Einblick in die quadratischen und kombinierten Effekte der Parameter. Die Analysen werden mit Hilfe der statistischen Instrumente Fisher's F-Test und Student's t-Test durchgeführt. Die Regressionskoeffizienten, t- und P-Werte für alle linearen, quadratischen und kombinierten Effekte mit einem Signifikanzniveau von 95 % sind in 5 dargestellt.
In diesem Fall sind A, B, C, AB, AC, BC, A², B², C² signifikante Modellterme. Werte >0.1000 zeigen an, dass die Modellterme nicht signifikant sind. Die ANOVA des Regressionsmodells für den Ethanolertrag zeigte, dass das Modell aufgrund eines sehr hohen F-Wertes und eines sehr niedrigen Wahrscheinlichkeitswertes signifikant ist. Die aus der ANOVA gewonnene Regressionsgleichung zeigt, dass das R2 (Bestimmtheitsmaß) 0.9202 beträgt (ein Wert von >0.75 zeigt die Signifikanz des Modells an).Dies ist eine Schätzung des Anteils der Gesamtvariation in den Daten, der durch das Modell erklärt wird, und somit ist das Modell in der Lage, 99.9 % der Variation in der Antwort zu erklären. Das „bereinigte R2“ beträgt 0.8484, was darauf hinweist, dass das Modell gut ist (für ein gutes statistisches Modell sollte der R2-Wert im Bereich von 0-1.0 liegen, und je näher der Wert bei 1.0 liegt, desto mehr fit das Modell als gut). Das „Predicted R2“ von 0,8034 steht in angemessener Übereinstimmung mit dem „Adjusted R2“ von 0.8484, d.h. die Differenz beträgt <0,2. Die „Angemessene Genauigkeit“ misst das Signal-Rausch-Verhältnis. Ein Verhältnis von >4 ist wünschenswert. Ein Verhältnis von 13.427 weist auf ein angemessenes Signal hin. Daher kann dieses Modell zur Navigation im Designraum verwendet werden.
Die Ethanolkonzentration stieg mit zunehmender Inokulumkonzentration bis zu 6 % und Temperatur bis zu 32 °C stetig an. Eine höhere Inokulumkonzentration und eine höhere Temperatur steigern also die Ethanolausbeute.
Für die Ethanolproduktion aus Reishülsen wurde eine Einzelstudie auf modularer Fermenterebene durchgeführt. Die Reaktionsanalyse ergab, dass die maximale Ethanolkonzentration (6.24 g/l) von S. cerevisiae NCIM 3455 bei den optimalen Prozessbedingungen aus Reishülsen erreicht werden konnte. Für die Fermentation sind die optimalen Werte für die unabhängigen Variablen nach RSM 32°C Inkubationstemperatur, 6 % Inokulumkonzentration und der Nährstofffaktor 2.Auf der Grundlage des Geräts werden die optimalen Arbeitsbedingungen festgelegt, um einen hohen Ethanolertrag zu erzielen. Diese optimierten Parameter wurden für die Ethanolproduktion im modularen Fermenter für 72 Stunden festgelegt. Die Ergebnisse der Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (GLC) zeigten, dass die fermentierte Brühe des modularen Fermenters nach 72 Stunden eine Ethanolkonzentration von 6.02 g/l aufwies.
Daraus wird geschlossen, dass Reishülsen eine potenzielle, erneuerbare und kostengünstige Biomasse für die Herstellung von Ethanol durch Fermentation sind. Mit 6 % HNO₃ vorbehandelte Reishülsen zeigten die höchste Saccharifikation. Daraus lässt sich schließen, dass zellulosehaltiges Ethanol durch gleichzeitige Saccharifikation und Fermentation aus Reishülsen mit der Hefe S. cerevisiae NCIM 3455 unter den optimierten Prozessbedingungen in anaerober Batch-Fermentation gewonnen wird. Weitere Forschungsarbeiten zu anderen Kombinationen und zur Verbesserung der verschiedenen Aspekte dieser Methode im Hinblick auf eine höhere Zellulose-Ethanol-Ausbeute sowie zu Machbarkeitsuntersuchungen und zur wirtschaftlichen Rentabilität sind erforderlich.Die leichte Zugänglichkeit und die Kosteneffizienz machen die Reishülsen beliebt. Ihre überschüssige Verfügbarkeit und Erneuerbarkeit symbolisieren einen echten Vorteil gegenüber den schwindenden fossilen Brennstoffen für die Bioethanolproduktion. Die Verwendung von Reishülsen könnte das Entsorgungsproblem lösen und die Kosten für die Abfallbehandlung senken.
Die Figuren und die vorangehende Beschreibung geben Beispiele für Ausführungsformen. Der Fachmann wird verstehen, dass eines oder mehrere der beschriebenen Elemente durchaus zu einem einzigen Funktionselement kombiniert werden können. Alternativ dazu können bestimmte Elemente in mehrere Funktionselemente aufgeteilt werden. Elemente aus einer Ausführungsform können einer anderen Ausführungsform hinzugefügt werden. Die Reihenfolge der hier beschriebenen Prozesse kann beispielsweise geändert werden und ist nicht auf die hier beschriebene Weise beschränkt.
Außerdem müssen die Handlungen eines Flussdiagramms nicht in der dargestellten Reihenfolge ausgeführt werden; auch müssen nicht unbedingt alle Handlungen durchgeführt werden. Auch können die Handlungen, die nicht von anderen Handlungen abhängig sind, parallel zu den anderen Handlungen ausgeführt werden. Der Umfang der Ausführungsformen ist durch diese spezifischen Beispiele keineswegs begrenzt. Zahlreiche Variationen sind möglich, unabhängig davon, ob sie in der Beschreibung explizit aufgeführt sind oder nicht, wie z. B. Unterschiede in der Struktur, den Abmessungen und der Verwendung von Materialien. Der Umfang der Ausführungsformen ist mindestens so groß wie in den folgenden Ansprüchen angegeben.
Vorteile, andere Vorteile und Problemlösungen wurden oben im Hinblick auf bestimmte Ausführungsformen beschrieben. Die Vorteile, Vorzüge, Problemlösungen und Komponenten, die dazu führen können, dass ein Vorteil, ein Nutzen oder eine Lösung auftritt oder ausgeprägter wird, sind jedoch nicht als kritisches, erforderliches oder wesentliches Merkmal oder Komponente eines oder aller Ansprüche zu verstehen.
Bezugszeichenliste

100: Blockschaltbild eines Geräts
102: Geschlossener Behälter
104: Vorbehandlungskammer
104a: -Vakuum-Filtrationskammer
104b: Ein Orbitalschüttler
106: Filtertiegel
108: Enzymextraktionskolben
110: Reagenzglas
112: Gefäß
114: Erlenmeyerkolben

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 10047299 B2 [0003]
US 10723621 B2 [0005]

Claims

Vorrichtung (100) zur Gewinnung von Ethanol aus lignocellulosehaltiger Biomasse, wobei die Vorrichtung (100) Folgendes umfasst: einen geschlossenen Behälter (102) zum Sammeln und Lagern der lignozellulosehaltigen Biomasse wie Reishülsen in Form von Pulver, wobei das Pulver durch Mischen mit einem Mischer erhalten wird, wobei das gesammelte Pulver bei einer Temperatur unter Raumtemperatur gelagert wird; eine Vorbehandlungskammer (104) in Verbindung mit einem geschlossenen Behälter (102) zum Durchführen einer Vielzahl von Vorbehandlungsverfahren mit dem gesammelten Reishülsenpulver, wobei eine Vielzahl von Reagenzien/Chemikalien dem gesammelten Reishülsenpulver zum Durchführen von Delignifizierung und De-Toxifizierung zugesetzt werden; einen Filtertiegel (106) in Verbindung mit der Vorbehandlungskammer (104) zum Sammeln und Filtern der vorbehandelten Reishülsen nach dem Waschen mit destilliertem Wasser unter Absaugen und Trocknen bei 30-40°C; einen Enzymextraktionskolben (108) in Verbindung mit der Vorbehandlungskammer (104) für die Extraktion von rohem Cellulaseenzym aus Trichoderma reesei, wobei die Extraktion durch Zugabe (pro Liter) von 40-50 g Weizenkleie, 10-20 g Hefeextrakt, 5-15 g Glucose, 1. 5-3 g NH₄Cl, 0.5 g Thiaminhydrochlorid, 2.0 g K₂HPO₄, 0.5 g MgSO₄.7H₂O, 0.1 g CaCl2 und 0.5 g KCl, wobei Trichoderma reesei inkubiert und zentrifugiert wird, um einen Überstand zu erzeugen, der eine Enzymquelle ist; ein Reagenzglas (110) in Verbindung mit dem Kolben (108), wobei 0.5 bis 2 ml 0.05 M Natriumcitrat mit einem pH-Wert von 4.8 mit 0.5 ml des Enzyms gemischt werden, um eine zweite Lösung herzustellen, wobei ein Streifen Filterpapier in dem Reagenzglas angeordnet und 60 Minuten lang in einem Wasserbad bei 50°C gehalten wird, wobei nach 60 Minuten das Reagenzglas herausgenommen wird und die Menge der durch die Cellulase freigesetzten Zucker unter Verwendung der Dinitrosalicylsäure (DNSA)-Methode bestimmt wird; ein Gefäß (112) in Verbindung mit dem Enzymextraktionskolben (108) und dem Reagenzglas (110) für die enzymatische Hydrolyse von 200-400 g nativer und delignifizierter Reishülse (d.h. 2 % Salpetersäure (HNO₃), 10 % HNO₃, 2 % Natriumhydroxid (NaOH) und 10 % NaOH), wobei die Reishülsen vor der Zugabe der vorbereiteten Enzyme 1-5 Stunden lang in einem Citratpuffer eingeweicht werden, wobei Natriumazid in einer Konzentration von 0.005 % zugegeben wird, um das mikrobielle Wachstum während des Verlaufs der Enzymhydrolyse einzuschränken; und einen Erlenmeyerkolben (114) in Verbindung mit dem Gefäß (112) zur Ethanolherstellung durch Mischen von 20 g/l vorbehandelter Reishülsen aus der Hydrolyse mit 200 ml Citratpuffer (pH 5.0 ± 0. 2, 50 mM), gefolgt von einer 15-minütigen Sterilisation bei 15 psi (121°C), wobei die Reishülsen in Citratpuffer eingeweicht und mit Cellulase in einem Substrat-Enzym-Verhältnis von 1:5 (20 g vorbehandeltes Substrat: 100 ml rohe Cellulase) ergänzt werden, wobei immobilisierte Hefezellen in verschiedenen Konzentrationen beimpft, fermentiert und zur Analyse der Ethanolkonzentration zentrifugiert werden.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die gesammelten Reishülsen durch den Mischer bei 3000 U/min zu 100 Mesh (0.15 mm) starkem Pulver verarbeitet werden, wobei die pulverisierten Reishülsen in dem geschlossenen Behälter bei 3-5°C aufbewahrt werden, um jeden wahrscheinlichen Abbau oder Verfall zu vermeiden.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vielzahl der in der Vorbehandlungskammer (104) durchgeführten Vorbehandlungsverfahren die Dampfexplosion, Überkalkungsverfahren, Neutralisierung und Aktivkohlebehandlung umfasst, wobei die Standardverfahren der Überkalkung (Kalziumoxid), Neutralisierung (HCl) und Aktivkohlebehandlung für den Entgiftungsprozess verwendet werden.
Vorrichtung nach Anspruch 3, bei der eine Vakuumfiltrationskammer (104a) in Verbindung mit der Vorbehandlungskammer (104) den Niederschlag und die nach der Neutralisation gebildeten Salze herausfiltert, wobei die neutralisierte Mischung 20-40 Minuten lang unter normalem Mischen belassen wird, um eine filtrierte Lösung zu erhalten.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei der Vorbehandlungskammer (104) ein Orbitalschüttler (104b) zugeordnet ist, um nach Zugabe von 2.5 % Aktivkohle zu der gefilterten Lösung ein erstes Gemisch zu bilden und 20-40 Minuten lang kontinuierlich zu mischen, wobei das erste Gemisch zweimal erneut gefiltert wird, um Aktivkohle zu entfernen, und der pH-Wert auf 6.0-6.5 eingestellt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vielzahl von Reagenzien/Chemikalien zur Durchführung der Vielzahl von Vorbehandlungsverfahren umfasst: verdünnte Salpetersäure (1-5% v/v), konzentrierte Salpetersäure (5-15% v/v), Natriumhydroxid (0.1-5% w/v), Natriumhydroxid (5-15% w/v) mit Dampfexplosion bei 120-200°C für etwa 15-30 min.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei T. reesei separat gezüchtet und mit aktiv wachsenden und isolierten Pilzen geimpft wird, wobei die Masken 10 Tage lang auf einem Rotationsschüttler bebrütet werden, wobei nach 8-12 Tagen Inkubation die Kulturbrühe 10-30 Minuten lang bei 10000 U/min zentrifugiert wird, um Myzelien und Sporen zu entfernen, wobei der Überstand gesammelt und als Enzymquelle verwendet wird, die bei 1-10 °C gelagert wird.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Hydrolyse in einem Gefäß durchgeführt wird, das mit einem Rührwerk zum Rühren und einem Außenmantel für die Wasserzirkulation ausgestattet ist, um die erforderliche Temperatur aufrechtzuerhalten, und das 3-1 Citratpuffer (pH 5.0 ± 0.2, 50 mM, 50 ± 0.5°C) bei 100 U/min enthält.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das in dem Citratpuffer getränkte Substrat mit Cellulase 5 FPU/g bei einem Verhältnis von Substrat zu Enzym von 1:5 ergänzt wird, wobei die Proben nach 48 h entnommen, zentrifugiert und der Überstand auf die insgesamt freigesetzten reduzierenden Zucker analysiert wird, wobei die Menge an reduzierenden Zuckern durch das DNSA-Verfahren geschätzt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die immobilisierten Hefezellen als Inokulum in verschiedenen Konzentrationen, nämlich 2, 4 oder 6 %, verwendet werden. MgSO₄, 0.5 g/l; KCI, 0.5 g/l, und FeSO₄ 0.01 g/l werden als übliche Nährstoffe in allen Fermentationen verwendet, wobei die Fermentation 72 Stunden lang durchgeführt wird, wonach die Proben entnommen und in einer Laborzentrifuge bei 1200 U/min zentrifugiert werden und die Überstände auf die Ethanolkonzentration analysiert werden.