Die Erfindung betrifft einen Zellkulturträger für Bioreaktoren zur Isolierung, Vermehrung und Ernte von Zellen, insbesondere von NK- Zellen, T-Lymphozyten und tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL) und mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmark, wobei der Träger eine für die jeweilige Zellart spezifische Beschichtung aufweist (adhäsiv; Rezeptor/Ligand; Ko-Rezeptor usw.).The invention relates to a cell culture support for bioreactors for the isolation, propagation and harvest of cells, in particular NK cells, T lymphocytes and tumor infiltrating lymphocytes (TIL) and mesenchymal stem cells from bone marrow, wherein the carrier has a specific for each cell type coating (adhesive Receptor / ligand, co-receptor, etc.).
Aus dem Stand der Technik sind eine Vielzahl von Zellkulturträgern für die Züchtung und Vermehrung von Zellen bekannt. Zur Kultivierung von Zellen in hoher Dichte ist es erforderlich, dass sich diese an ein künstliches oder natürliches Substrat anheften oder in Berührung mit der Oberfläche des Zellkulturträgers geraten, damit das Überleben, die Vermehrung der Zellen und/oder das bevorzugte Wachstum eines enthaltenen Phenotyps sichergestellt wird. Die Produktion einer gewünschten Zellart erfordert in erster Linie, dass die Substratoberfläche eine besondere/spezifische heraussagende Zelladhäsion oder Zellberührung ermöglicht und die Fähigkeit zur Unterstützung des Zellwachstuns besitzt.From the prior art, a variety of cell culture carriers for the growth and proliferation of cells are known. Culturing high density cells requires them to attach to or contact the surface of the cell culture support to ensure an artificial or natural substrate to ensure survival, proliferation of the cells, and / or preferential growth of a contained phenotype , The production of a desired cell type primarily requires that the substrate surface allow for particular / prominent cell adhesion or cell contact and have the ability to support cell growth.
Die DE 42 06 585 A1 offenbart eine Vorrichtung zur Behandlung von Zellkulturen, insbesondere von Hepatozyten, auf plattenartigen Zellkulturträger, wobei wenigstens ein Teil der Oberflächen der Zellkulturträger gasdurchlässig ist. Auf dem Zellkulturträger ist eine Kollagenschicht aufgetragen, auf der oder in der die Zellkultur angeordnet ist. Mit geringem Abstand über der Kollagenschicht ist der nächste Zellkulturträger angeordnet. In den Zwischenraum zwischen der Kollagenschicht und dem nächsten Zellkulturträger ist Kulturmedium einleitbar.The DE 42 06 585 A1 discloses an apparatus for treating cell cultures, in particular hepatocytes, on plate-like cell culture carriers, wherein at least a part of the surfaces of the cell culture carriers is gas-permeable. On the cell culture carrier, a collagen layer is applied, on or in which the cell culture is arranged. At a short distance above the collagen layer, the next cell culture carrier is arranged. Culture medium can be introduced into the intermediate space between the collagen layer and the next cell culture carrier.
In der DE 69 022 778 T2 wird ausgeführt, dass für die Adhäsion an Zellen hochmolekulare Materialien erforderlich sind, deren Oberflächen mit Niedertemperaturplasma, Sputtern, UV-Licht, Elektronenstrahlen behandelt sind und die mit einem monomolekularen, anhaftender Film bedeckt sind, der mit Zelladhäsionsfaktoren und Zellwachstumsfaktoren behandelte Materialien enthält.In the DE 69 022 778 T2 It is stated that adhesion to cells requires high molecular weight materials whose surfaces are treated with low temperature plasma, sputtering, UV light, electron beams and which are covered with a monomolecular adherent film containing materials treated with cell adhesion factors and cell growth factors.
Dabei sind zelladhäsive Filme aus Collagen, Fibronektin, Vitronektin und Laminin bekannt.Cell-adhesive films of collagen, fibronectin, vitronectin and laminin are known.
Die Erfindung gemäß DE 69 115 928 T2 betrifft eine Unterlage für die Kultivierung von haftungsabhängigen Zellen (CAD) in Form von Mikroträgem aus einem biokompatiblen Material. Erfindungsgemäß wird eine Unterlage für die Kultivierung von CAD in Form von Mikroträgern aus einem biokompatiblen Material bereitgestellt, wobei die Mikroträger eine zweidimensionale Geometrie besitzen und zwei aneinander liegende Flächen zur Anhaftung mit einer Stärke von 35 um oder weniger aufweisen. Auf jeder der beiden Flächen können sich die Zellen anheften und entwickeln, ohne dass ein Eindringen der Zellen zwischen die beiden Flächen möglich ist. Die Mikroträger bestehen aus einem Polymermaterial, beispielsweise ein Polymer mit zahlreichen aromatischen Gruppen und insbesondere Polystyrol, aber auch Scheibchen aus hydrophilem Material, wie Cellophan oder Poly-D-hydroxybutyrat. Die Mikroträger sind biokompatibel, wobei unter Biokompatibilität verstanden wird, dass die CAD an den Flächen der erfindungsgemäßen Mikroträger haften und sich dort vermehren können. Zu diesem Zweck ist vorgesehen, dass die beiden Flächen der erfindungsgemäßen Mikroträger mit einer dünnen Metallschicht überzogen sind. Dieser Überzug hat dabei eine Titanbasis, aber auch Platin wird in Betracht gezogenThe invention according to DE 69 115 928 T2 relates to a base for the cultivation of adhesion-dependent cells (CAD) in the form of micro-carriers of a biocompatible material. According to the invention, there is provided a base for culturing CAD in the form of microcarriers of a biocompatible material, wherein the microcarriers have a two-dimensional geometry and have two juxtaposed surfaces for adhesion with a thickness of 35 μm or less. On each of the two surfaces, the cells can attach and develop without permitting the cells to penetrate between the two surfaces. The microcarriers consist of a polymer material, for example a polymer with numerous aromatic groups and in particular polystyrene, but also slices of hydrophilic material, such as cellophane or poly-D-hydroxybutyrate. The microcarriers are biocompatible, it being understood by biocompatibility that the CAD adhere to the surfaces of the microcarriers according to the invention and can multiply there. For this purpose, it is provided that the two surfaces of the microcarriers according to the invention are coated with a thin metal layer. This coating has a titanium base, but also platinum is considered
Die DE 10 2004 053 164 A1 betrifft beschichtete Mikroträger für die Kultivierung tierischer und humaner Zellen vorwiegend in mit Nährmedium gefüllten durchmischten Gefäßen, wie beispielsweise Festbett- oder Wirbelbettreaktoren. Der Mikroträger besteht aus einem partikulären anorganischen porösen oder nichtporösen Matrixmaterial, das zu einem Stück verfestigt ist, und einer zellkulturkompatiblen, Hydrolyse-stabilen Epoxid-Amin-Polymer-Beschichtung, die diesem Stück aufgelagert sind. Die Größe der Partikel liegt in einem Bereich von 100 bis 1000 um, vorzugsweise in einem Bereich von 180 bis 590 um. Geeignete Matrixmaterialien für die Mikroträger sind beispielsweise Glas, Keramiken, Silicagel, Gips, Metalloxide, Metallsilicate oder Tricalciumphosphate. Besonders vorteilhaft als Trägermaterial eignet sich ein Glas aus dem System Si02-CaO-Na20-MgO-K20-Al203-Fe203. Das als Beschichtung des anorganischen Matrixmaterials verwendete vernetzte Epoxid-Amin-Polymer wird aus einer oder mehreren Epoxidkomponenten und einem oder mehreren Amin-Komponenten hergestellt.The DE 10 2004 053 164 A1 relates to coated microcarriers for the cultivation of animal and human cells predominantly in nutrient medium-filled mixed vessels, such as fixed bed or fluidized bed reactors. The microcarrier consists of a particulate inorganic porous or nonporous matrix material solidified into a piece, and a cell culture compatible, hydrolysis-stable epoxy-amine polymer coating superimposed on that piece. The size of the particles is in a range of 100 to 1000 μm, preferably in a range of 180 to 590 μm. Suitable matrix materials for the microcarriers are, for example, glass, ceramics, silica gel, gypsum, metal oxides, metal silicates or tricalcium phosphates. Particularly advantageous as a support material is a glass of the system Si0 2 -CaO-Na 2 0-MgO-K 2 0-Al 2 0 3 -Fe 2 0 3 . The crosslinked epoxy-amine polymer used as a coating of the inorganic matrix material is made from one or more epoxy components and one or more amine components.
In der DE10 2005 035 434 A1 werden Zellkulturträger offenbart, auf denen Zellen effizient anhaften und wachsen und von denen die gewachsenen Zellen einfach gelöst werden. Die Zellkulturträger enthalten jeweils ein körniges Grundmaterial und eine Deckschicht, die die Oberfläche des Grundmaterials abdeckt. Die Deckschicht besteht hauptsächlich aus einem Calciumphosphat-basierten Apatit, bei dem ein Teil des Calciums fehlt. Solche Zellkulturträger werden in Zellkulturen verwendet, in denen die Zellen auf den Oberflächen der Zellkulturträger haften und dort wachsen. Insbesondere werden diese Zellkulturträger in dreidimensionalen Kulturen hoher Dichte (Suspensionskulturen) verwendet. Der Ca-Mangel in dem Calciumphosphat-basierten Apatit liegt vorzugsweise in einem Bereich von 1 bis 30 Mol-%.In the DE10 2005 035 434 A1 Cell culture carriers are disclosed on which cells efficiently attach and grow and from which the grown cells are easily released. The cell culture carriers each contain a granular base material and a cover layer which covers the surface of the base material. The cover layer consists mainly of a calcium phosphate-based apatite, which lacks part of the calcium. Such cell culture carriers are used in cell cultures in which the cells adhere to and grow on the surfaces of the cell culture carriers. In particular, these cell culture carriers are used in three-dimensional high density cultures (suspension cultures). The Ca deficiency in the calcium phosphate-based apatite is preferably in a range of 1 to 30 mol%.
Die Erfindung gemäß WO 2010/136136 A3 betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines beschichteten Zellkulturträgers zur In-vitro-Kultivierung von Stammzellen, insbesondere zur Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen, wobei eine Lösung, die einen Polyurethanharnstoff umfasst, auf einen Zellträger aufgebracht und getrocknet wird. Der Polyurethanharnstoff wird zuvor durch Umwandlung von mindestens einer Polycarbonatpolyol-Komponente, mindestens einer Polyisocyanatkomponente und mindestens einer Diamino-Komponente hergestellt. Antioxidantien oder Pigmente, aber auch Griffhilfsmittel, Farbstoffe, Mattierungsmittel, UV-Stabilisatoren, Lichtstabilisatoren, Hydrophilierungsmittel, Hydrophobierungsmittel und/oder Verlaufshilfsmittel können als Zusätze eingesetzt werden. Beschichtet werden vielerlei Substrate wie Glas, Siliciumwafer, Metalle, Keramiken und Kunststoffe. Bevorzugt ist die Beschichtung von Zellkulturträgern aus Glas, Siliciumwafer, Kunststoff oder Metallen. Als Metalle werden beispielsweise medizinischer Edelstahl und Nickel-Titan-Legierungen genannt werden. Als Polymermaterialien, aus denen der Zellkulturträger aufgebaut ist, werden Polyamid; Polystyrol; Polycarbonat; Polyether; Polyester; Polyvinylacetat; natürliche und synthetische Kautschuke; Blockcopolymere aus Styrol und ungesättigten Verbindungen wie Ethylen, Butylen und Isopren; Polyethylen oder Copolymeren aus Polyethylen und Polypropylen; Silikon; Polyvinylchlorid (PVC) und Polyurethanen eingesetzt. Zur besseren Haftung der erfindungsgemäßen Polyurethane auf dem Zellkulturträger können als Untergrund vor dem Auftragen dieser Beschichtungsmaterialien noch weitere geeignete Beschichtungen aufgetragen werden. Besonders bevorzugt ist die Beschichtung von Glas oder Siliciumwafern zur Herstellung von Zellkulturträgern.The invention according to WO 2010/136136 A3 relates to a method for producing a coated cell culture carrier for the in vitro cultivation of stem cells, in particular for the cultivation of mesenchymal stem cells, wherein a solution comprising a polyurethaneurea is applied to a cell carrier and dried. The polyurethaneurea is previously prepared by converting at least one polycarbonate polyol component, at least one polyisocyanate component, and at least one diamino component. Antioxidants or pigments, but also handle auxiliaries, dyes, matting agents, UV stabilizers, light stabilizers, hydrophilizing agents, water repellents and / or leveling agents can be used as additives. Many substrates such as glass, silicon wafers, metals, ceramics and plastics are coated. The coating of cell culture carriers made of glass, silicon wafer, plastic or metals is preferred. As metals, for example, medical stainless steel and nickel-titanium alloys may be mentioned. As polymer materials constituting the cell culture carrier, polyamide; polystyrene; polycarbonate; polyether; Polyester; polyvinyl acetate; natural and synthetic rubbers; Block copolymers of styrene and unsaturated compounds such as ethylene, butylene and isoprene; Polyethylene or copolymers of polyethylene and polypropylene; Silicone; Polyvinyl chloride (PVC) and polyurethanes used. For better adhesion of the polyurethanes according to the invention to the cell culture carrier, it is possible to apply further suitable coatings as substrate before application of these coating materials. Particularly preferred is the coating of glass or silicon wafers for the production of cell culture carriers.
Als Lösemittel für die Herstellung der Polyurethanharnstoff-Lösungen kommen werden alle denkbaren Lösemittel und Lösemittelgemische wie Dimethylformamid, N-Methylacetamid, Tetramethylharnstoff, N-Methylpyrrolidon, aromatische Lösemittel wie Toluol, lineare und cycüsche Ester, Ether, Ketone und Alkohole in Frage. Beispiele für Ester und Ketone sind Ethylacetat, Butylacetat, Aceton, v-Butyrolacton, Methylethylketon und Methylisobutylketon eingesetzt. Bevorzugt sind Mischungen aus Alkoholen mit Toluol. Beispiele für Alkohole, die gemeinsam mit Toluol verwendet werden können, sind Ethanol, n-Propanol, iso-Propanol und I-Methoxy-2-propanol.Suitable solvents for the preparation of the polyurethaneurea solutions are all conceivable solvents and solvent mixtures such as dimethylformamide, N-methylacetamide, tetramethylurea, N-methylpyrrolidone, aromatic solvents such as toluene, linear and cycüsche esters, ethers, ketones and alcohols in question. Examples of esters and ketones are ethyl acetate, butyl acetate, acetone, v-butyrolactone, methyl ethyl ketone and methyl isobutyl ketone. Preference is given to mixtures of alcohols with toluene. Examples of alcohols which can be used together with toluene are ethanol, n-propanol, isopropanol and 1-methoxy 2 propanol.
Die Beschichtungen aus den Polyurethanharnstofflösungen können mittels verschiedener Verfahren auf den Zellkulturträger aufgebracht werden. Geeignete Beschichtungstechniken sind beispielsweise Rakeln, Drucken, Transferbeschichten, Sprühen, Spincoating oder Tauchen.The coatings of the polyurethaneurea solutions can be applied to the cell culture carrier by various methods. Suitable coating techniques are, for example, doctoring, printing, transfer coating, spraying, spin coating or dipping.
In der WO 2016/202329 A1 wird ein bioaktives Beschichtungsmaterial zur Beschichtung von Kunststoffmaterialien für Zellkulturen, vorzugsweise Kunststoffeinwegmaterialien, zum Beispiel aus Polystyren (TCP) als Kunststoff offenbart, insbesondere ein zellinstruktives Beschichtungsmaterial für Zellkulturmaterialien aus Kunststoff, zum Beispiel Polystyren. Das bioaktives Beschichtungsmaterial umfasst ein Polymerkonjugat aus jeweils einem polymeren Ankermolekül mit oberflächenaktiven Ankergruppen einerseits und aus jeweils einem oder mehreren biologisch aktiven Molekülen andererseits, wobei das Ankermolekül ein amphiphiles Molekül mit einem hydrophoben Teil aus Styren-, Methacrylsäure- oder Isobuteneinheiten und einem hydrophilen Teil aus Maleinsäureanhydrid- oder Maleinsäure-Einheiten ist.In the WO 2016/202329 A1 For example, a bioactive coating material is disclosed for coating plastic materials for cell cultures, preferably disposable plastic materials, for example polystyrene (TCP) as a plastic, in particular a cell-structural coating material for plastic cell culture materials, for example polystyrene. The bioactive coating material comprises a polymer conjugate each comprising a polymeric anchor molecule having surface-active anchor groups on the one hand and one or more biologically active molecules on the other hand, wherein the anchor molecule is an amphiphilic molecule having a hydrophobic part of styrene, methacrylic acid or isobutene units and a hydrophilic part of maleic anhydride - or maleic acid units.
Die EP 1 270 533 A2 beschreibt eine Trägermaterial für Zellkulturträger aus keramische Materialien für eine verbesserte Unterstützung für die Kultur von verankerungsabhängigen eukaryotischen Zellen und prokaryotischen Zellen , die eine kristalline Kernoxidkeramik umfassen, die mit einer amorphen polyanionischen intergranularen Phase dispergiert ist. Das keramisches Material besteht aus einem Oxid der kristallinen Kernoxidkeramik vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Zirkonium (IV) oxid, Aluminiumoxid, Silizium (IV) oxid, Titan (IV) oxid, Hafnium (IV) oxid, Cer (IV) oxid und Mischungen davon ausgewählt. Die polyanionische Verbindung in der amorphen intergranularen Phase ist aus der Gruppe bestehend aus Phosphaten, Manganaten, Molybdaten, Wolframaten oder Mischungen davon ausgewählt.The EP 1 270 533 A2 describes a carrier material for cell culture carriers of ceramic materials for improved support for the culture of anchorage-dependent eukaryotic cells and prokaryotic cells comprising a crystalline core oxide ceramic dispersed with an amorphous polyanionic intergranular phase. The ceramic material consists of an oxide of the crystalline core oxide ceramic preferably selected from the group consisting of zirconium (IV) oxide, alumina, silicon (IV) oxide, titanium (IV) oxide, hafnium (IV) oxide, cerium (IV) oxide and mixtures thereof selected. The polyanionic compound in the amorphous intergranular phase is selected from the group consisting of phosphates, manganates, molybdates, tungstates, or mixtures thereof.
Mit dem aus dem Stand der Technik dargestellten Zellkulturträger aus einem Trägermaterial mit einer Beschichtung aus zelladhäsivem Material lassen sich Zellen nur in einer Menge isolieren, vermehren und ernten, die für eine Zelltherapie ungeeignet ist, wobei die Zeilen auch eine geringe zytotoxische Wirkung aufweisen.With the cell culture carrier of the prior art made of a carrier material with a coating of cell-adhesive material, cells can be isolated, propagate and harvest only in an amount that is unsuitable for cell therapy, the lines also have a low cytotoxic effect.
Aufgabe der Erfindung ist es, einen Zellkulturträger zu entwickeln, mit dessen Hilfe Zellen, insbesondere NK- Zellen sowie autologe, tumorinfiltrierende Lymphozyten und autologe T- Lymphozyten in ausreichender Menge isoliert, ex vivo spezifisch aktiviert sowie vermehrt und geerntet werden können. Die geernteten Immunzellzellen werden als Suspension lebender Zellen in vivo für eine Therapie gegen Tumorzellen verwendet, wobei die Zellen eine hohe spezifische Toxizität besitzen gegen das jeweils einmalige Gemisch an mutierten Lymphozyten eines Patienten-individuellen Tumors bzw. seiner Metastasen. Lymphozyten ie jeweils individuellen TumorzellenThe object of the invention is to develop a cell culture carrier with the aid of which cells, in particular NK cells and autologous, tumor infiltrating lymphocytes and autologous T lymphocytes can be isolated in sufficient quantity, ex vivo specifically activated as well as increased and harvested. The harvested immune cells are used as a suspension of living cells in vivo for therapy against tumor cells, which cells have a high specific toxicity against the unique mixture of mutant lymphocytes of a patient-specific tumor or its metastases. Lymphocytes ie each individual tumor cells
Die Aufgabe wird durch einen Zellkulturträger (20) gelöst, der aus einem hydrophilen, mit Niedertemperatur- Plasma behandelten Trägerkörper (21) mit einer zelladhäsiven Beschichtung (22) besteht, wobei in die zelladhäsive Beschichtung (22) aktivierende Antikörper eingearbeitet sind.The task is performed by a cell culture carrier ( 20 ), which consists of a hydrophilic, treated with low-temperature plasma carrier body ( 21 ) with a cell-adhesive coating ( 22 ) consists, wherein in the cell-adhesive coating ( 22 ) activating antibodies are incorporated.
Der Trägerkörper (21) besteht aus Kunststoff, Glas, Metall oder keramische Materialien.The carrier body ( 21 ) is made of plastic, glass, metal or ceramic materials.
Die zelladhäsive Beschichtung (22) besteht aus Fibronektin, RetroNectin, Collagen, Gelatine, Laminin, Chinitin und/oder Kombinationen davon. Als aktivierende Antikörper werden Immunglobuline, ß-Lymphozyten, Anti CD 16, Anti CD3, Anti CD28, Anti137, Anti CD 39, Anti CD103 und/oder Kombinationen davon in die zelladhäsive Beschichtung eingearbeitet.The cell-adhesive coating ( 22 ) consists of fibronectin, retronectin, collagen, gelatin, laminin, quinitine and / or combinations thereof. As activating antibodies, immunoglobulins, β-lymphocytes, anti-CD16, anti-CD3, anti-CD28, anti-137, anti-CD39, anti-CD103 and / or combinations thereof are incorporated into the cell-adhesive coating.
Der erfindungsgemäße Zellkulturträger kann in Festbett-Bioreaktoren, Fließbett-Reaktoren, Walzen- Bioreaktoren, Hohlfaser- Bioreaktoren oder Mäander-Bioreaktoren, die mit einer zelladhäsiven oder Beschichtung mit darin enthaltenen aktivierenden Antikörper zur Isolierung und Vermehrung von Zellen eingesetzt werden. Mit dem erfindungsgemäßen Zellkulturträger gelingt es auch , aus kleingeschnittenen Gewebestücken bestimmte Zellen sowohl in das im Bioreaktor befindliche Medium auswachsen zu lassen, als auch die Zellen gleichzeitig dynamisch und stressfrei zu expandieren, differenzieren, aktivieren, stimulieren und dann von Geweberesten abzutrennen. Insbesondere können auf diese Weise NK-Zellen, tumorinfiltrierende autologe T- Lymphozyten (TIL) aus Tumorgewebe, Metastasengewebe, deren Umgebungsgewebe und aus Lymphknoten, die von Tumorzellen befallenen sind, aber auch die Gesamtfraktion oder einzelne Zellarten der hämatopoetischen Zellen, hämatopoetischen Stammzellen, hämatopoetischen Progenitorzellen, Immunzeifen darin, gewonnen werden, wobei der Bioreaktor jeweils im Perfusionsbetrieb arbeitet.The cell culture carrier of the present invention may be used in fixed bed bioreactors, fluidized bed reactors, roller bioreactors, hollow fiber bioreactors, or meander bioreactors equipped with a cell adhesive or coating with activating antibody contained therein to isolate and propagate cells. With the cell culture carrier according to the invention, it is also possible to grow certain cells out of chopped tissue pieces both into the medium contained in the bioreactor, and to simultaneously expand and differentiate, activate, stimulate and then separate the cells from tissue residues in a dynamic and stress-free manner. In particular, NK cells, tumor infiltrating autologous T lymphocytes (TIL) from tumor tissue, metastatic tissue, surrounding tissue, and lymph nodes affected by tumor cells, but also the total fraction or individual cell types of hematopoietic cells, hematopoietic stem cells, hematopoietic progenitor cells Immunceifen in it, the bioreactor works each in perfusion mode.
Die Erfindung wird nun näher an Beispielen erläutert, wobei 1 eine Skizze des Zellkulturträgers (20) und die 2 eine Skizze des Mäander- Bioreaktors aus DE 20 2018 004 857.7 mit der Oberseite (18) der Bodenfläche (6) als Zellkulturträger (20) zeigt, wobei
- 1
- Bioreaktorgefäß
- 2
- Deckel
- 3
- Unterlay- Kammer
- 4
- Mänder- Perfusions- Kammer
- 5
- Overiay- Kammer
- 6
- Bodenplatte mit Beschichtung (22) als Zellkulturträger (20)
- 7
- Folie
- 8
- Trennwand
- 9
- Zuführung Unterlay- Atmosphäre
- 10
- Abführung Unterlay-Atmosphäre
- 11
- Zuführung Kulturmedium
- 12
- Abführung Kulturmedium
- 13
- Zuführung Overlay- Atmosphäre
- 14
- Abführung Overlay-Atmosphäre
- 15
- Auslaufstutzen
- 16
- Siebgewebe
- 17
- Überlauf für Zellbrühe
- 18
- Oberseite der Bodenplatte (6)
- 19
- Gerinne
- 20
- Zellkulturträger
- 21
- Trägerkörper
- 22
- Beschichtung
bedeuten.The invention will now be explained in more detail by way of example, in which: 1 a sketch of the cell culture carrier ( 20 ) and the 2 a sketch of the meander bioreactor DE 20 2018 004 857.7 with the top ( 18 ) of the floor surface ( 6 ) as a cell culture carrier ( 20 ), where - 1
- bioreactor vessel
- 2
- cover
- 3
- Underlay chamber
- 4
- Mander perfusion chamber
- 5
- Overiay chamber
- 6
- Base plate with coating ( 22 ) as a cell culture carrier ( 20 )
- 7
- foil
- 8th
- partition wall
- 9
- Feeder underlay atmosphere
- 10
- Exhaustion underlay atmosphere
- 11
- Feed culture medium
- 12
- Dissipation of culture medium
- 13
- Feeder overlay atmosphere
- 14
- Dissipation overlay atmosphere
- 15
- outlet connection
- 16
- mesh
- 17
- Overflow for cell broth
- 18
- Top of the bottom plate ( 6 )
- 19
- Flume
- 20
- Cell culture carriers
- 21
- support body
- 22
- coating
mean.
Ausführungsbeispiel 1Embodiment 1
Der Mäander-Perfusions-Bioreaktor gemäß DE 20 2018 004 857.7 besteht aus einen rechteckigen Bioreaktorgefäß (1) aus vorzugsweise klarem Polymermaterial, das mit einem Deckel (2) steril verschlossen ist. Das Bioreaktorgefäß (1} ist in drei übereinander angeordneten Kammern (3, 4, 5) unterteilt, wobei die unterste Kammer (3) als Unterlay- Kammer, die über der Unterlay-Kammer (3) angeordnete Kammer (4) als Mäander- Perfusions- Kammer und die über der Mäander- Perfusions-Kammer (4) angeordnete Kammer (5) als Overlay- Kammer ausgebildet sind. Die Unterlay- Kammer(3) und die Mäander- Perfusions- Kammer (4) sind durch eine gelochte Bodenplatte (6) mit einer unten an der gelochten Bodenplatte (6) angeordneten semipermeabten Folie (7) voneinander getrennt. Auf der Oberseite (18) der Bodenplatte (6) sind streifenförmigen unterteilenden und eine mäanderförmige Durchströmung der Mäander- Perfusions-Kammer (4) mit Gasen und Medium erzwingenden Trennwänden (8) angeordnet, wobei der Abstand (A) der Trennwände (8) voneinander sowie von den Seiten- und Stirnwänden der Mäander-Perfusions- Kammer (4) so gewählt ist, dass sich in dem Stromfaden, in dem durch die Trennwände (8) gebildeten Gerinne, eine gemittelte laminare Oberströmung mit einer Froudezahl < 0,005 bildet. Dieser Abstand (A) beträgt 2 bis 25 mm, bevorzugt 4 bis 6 mm.The meander perfusion bioreactor according to DE 20 2018 004 857.7 consists of a rectangular bioreactor vessel ( 1 ) of preferably clear polymer material, which is provided with a lid ( 2 ) is sterile closed. The bioreactor vessel ( 1 } is in three superimposed chambers ( 3 . 4 . 5 ), the lowest chamber ( 3 ) as a sublay chamber overlying the underlay chamber ( 3 ) arranged chamber ( 4 ) as a meander perfusion chamber and that above the meander perfusion chamber ( 4 ) arranged chamber ( 5 ) are formed as an overlay chamber. The underlay chamber ( 3 ) and the meander perfusion chamber ( 4 ) are by a perforated bottom plate ( 6 ) with a bottom of the perforated bottom plate ( 6 ) arranged semipermeable film ( 7 ) separated from each other. On the top ( 18 ) of the bottom plate ( 6 ) are strip-shaped dividing and a meandering flow through the meander perfusion chamber ( 4 ) with gases and medium-enforcing partitions ( 8th ), wherein the distance (A) of the partitions ( 8th ) and from the side and end walls of the meander perfusion chamber ( 4 ) is selected so that in the current thread in which through the partitions ( 8th ) formed an average laminar upper flow with a Froude number <0.005. This distance (A) is 2 to 25 mm, preferably 4 to 6 mm.
Die Bodenplatte (6) der Mäander- Perfusions- Kammer (4) ist als Trägerkörper (21) eines Zellkulturträgers (20) ausgebildet und ist auf der in Richtung der Mäander-Perfusios- Kammer (4) zeigende Oberseite(18) mit einer zelladhäsiven Beschichtung (22) versehen. Dazu wird in Wasser gelöstes Fibronektin gemischt mit Anti-CD3 als aktivierendem Antikörper in die durch die Trennwände (8) gebildeten Gerinne (19) des Mäander Bioreaktors verbracht, gleichmäßig durch Kippen des Mäander Bioreaktors verteilt und ausgetrocknet.The bottom plate ( 6 ) of the meander perfusion chamber ( 4 ) is as a carrier body ( 21 ) of a cell culture carrier ( 20 ) and is in the direction of the meander perfusion chamber ( 4 ) facing top ( 18 ) with a cell-adhesive coating ( 22 ) Provided. For this purpose, fibronectin dissolved in water is mixed with anti-CD3 as the activating antibody through the partitions ( 8th ) formed channels ( 19 ) of the meander bioreactor, evenly distributed by tilting the meander bioreactor and dried out.
An der Unterlay-Kammer (3) sind in unterschiedlicher Höhe Zu- und Abführungen (13, 14) für eine geregelte Durchströmung mit Gasen, insbesondere von Luft, gemischt mit unterschiedlichen Volumen-Prozent an Sauerstoff (5% bis 50%, bevorzugt 10 bis 25% Volumenprozent). Der Sauerstoff gelangt dann durch Diffusion durch die semipermeable Folie (7) und durch die gelochte Bodenplatte (6) in die Mäander- Perfusions- Kammer (4), wo dann das Kulturmedium bei der Durchströmung der Mäander- Perfusions- Kammer (4) durch Perfusion mit O2 versorgt wird, Die Mäander- Perfusions- Kammer (4) ist mit Zu- und Abführungen für Kulturmedien (11,12) versehen, wobei das Kulturmedium aus einem CellGrow-Medium besteht, das mit einem spezifischen Gemisch aus AB Humanserum, Cytokinen, Antikörpern und irradiierten humanen Feederzellen zeitweilig supplementiert ist. Diesem Kulturmedium werden die während einer Operation vom Patienten entnommenen und zerkleinerten autologen Tumor-Gewebestücke in einer Größe von 1 bis 2 mm3 zugegeben und mit dem Kulturmedium in die Mäander-Perfusions-Kammer (4) zugeführt. Die zerkleinerten Gewebestücke werden im Bioreaktor gleichmäßig verteilt und im Perfusionsbetrieb kultiviert, wobei das Kulturmedium über die in die Overlay-Kammer (5) über die Zu- und Abführungen (13,14) mit der entsprechenden Overiay-Atmosphäre geregelt versorgt wird.At the sublay chamber ( 3 ) are at different heights 13 . 14 ) for a controlled flow with gases, in particular of air, mixed with different volume percent of oxygen (5% to 50%, preferably 10 to 25% by volume). The oxygen then passes through diffusion through the semipermeable film ( 7 ) and through the perforated bottom plate ( 6 ) into the meander perfusion chamber ( 4 ), where then the culture medium in the flow through the meander perfusion chamber ( 4 ) is perfused with O 2 , the meander perfusion chamber ( 4 ) with additions and exits for cultural media ( 11 . 12 ), wherein the culture medium consists of a CellGrow medium, which is temporarily supplemented with a specific mixture of AB human serum, cytokines, antibodies and irradiated human feeder cells. The autologous tumor tissue pieces of size 1 to 2 mm3 taken and comminuted by the patient during surgery are added to this culture medium and introduced into the meander perfusion chamber ( 4 ). The minced pieces of tissue are evenly distributed in the bioreactor and cultured in the perfusion mode, with the culture medium via the in the overlay chamber ( 5 ) on inflows and outflows ( 13 . 14 ) is supplied regulated with the appropriate Overiay atmosphere.
In einem Kuitivierungslauf über 7 bis 14 Tage wachsen normalenweise TIL in größerer Menge aus den Gewebestücken aus. Über den mit Siebgewebe (16) versehenen Auslassstutzen (15) der Overlay-Kammer (5) des Bioreaktorgefäßes (1) werden die TIL als Filtratvon den Geweberesten abgetrennt.In a Cuitivierungslauf about 7 to 14 Days usually grow in larger quantities from the tissue pieces TIL. About the with sieve fabric ( 16 ) provided outlet ( 15 ) of the overlay chamber ( 5 ) of the bioreactor vessel ( 1 ), the TIL are separated as filtrate from the tissue remnants.
Mit zunehmender Zellzahl im Verlauf der Vermehrung der Zellmenge (TIL oder andere Zellen) wird die Zufuhr von frischem Medium kontinuierlich erhöht, wobei das erhöhte Zuführen von frischem Medium durch einen entsprechenden Algorithmus automatisch gesteuert wird. Die Bodenströmung verbleibt dabei nahe einer Froudezahl 0. Durch diese langsame Bewegung des Kulturmediums wird eine Aufwirbelung der Zellen vermieden. Es findet aber eine häufige Berührung zwischen den Komponenten der zelladhäsiven Beschichtung und den darauf sedimentierten Zellen statt.As the cell number increases (TIL or other cells), the supply of fresh medium is continuously increased, with the increased supply of fresh medium being automatically controlled by a corresponding algorithm. The bottom flow remains close to a Froude number 0 , This slow movement of the culture medium avoids whirling of the cells. However, there is frequent contact between the components of the cell-adhesive coating and the cells sedimented thereon.
Die beschriebenen Strömungsverhältnisse verhindern Zellstress und sorgen für eine homogene Versorgung mit Nährstoffen über die gesamte am Boden des Gerinnes aufwachsende Zellschicht.The described flow conditions prevent cell stress and ensure a homogenous supply of nutrients over the entire cell layer growing on the bottom of the channel.
Ausführungsbeispiel 2;Embodiment 2;
In einen Mäander- Bioreaktor, beschrieben wie im Beispiel 1, mit der als Bodenfläche (6) der Gerinne (19) des Mäander- Bioreaktors ausgebildeten Zellkulturträger (20) aus dem Trägerkörper (21) und einer zelladhäsiven Beschichtung (22)mit darin angereicherten Anti- CD3 als aktivierende Antikörper, werden TILs aus zerkleinerten Gewebestücken gewonnen, wobei auch hier die Bedingungen der Bodenströmung in der Mäander- Perfusions-Kammer (4) nahe einer Froudezahl 0 eingehalten werden. Ausgangsmaterial dafür sind Gewebeteile, die bei operativer Entfernung eines Tumors, von Tumormetastasen oder von Tumorzelten befallenen Lymphknoten anfallen. Die zerkleinerten Gewebestücke werden durch den größer dimensionierten und mit einem steril verschließenden Stopfen eingefüllt und durch Schwenken des mit Medium gefüllten Mäander-Perfusions-Bioreaktors gleichmäßig auf dem Boden verteilt. Nach Verschließen des Einfüllstutzens wird die Kultivierung wie in Beispiel 1 in Gang gesetzt. Nach 3 bis 7 Tagen wachsen die in den tumorösen Gewebestücken enthaltenen Tumor-infiitrierten T-Lymphozyten (TIL) in Mengen aus. Je nach gewählten Medium und zugesetzten Supplementen werden die TIL in dieser Prozess-Phase aktiviert, durch weiteren Kontakt mit den anfangs noch vorhandenen Gemisch von mutierten Tumorzellen aus einem individuellen Tumorstück (gewonnen aus einem Tumor-Resektat) mutierten Tumorzellen spezifisch geprimt. In der Regel wachsen innerhalb einer Woche 1,5 bis 2 × 109 TIL im Meander Perfusions-Bioreaktor mit 30 cm2 Bodenfläche hoch. Nach Aufschütteln des Mäander-Perfusions-Bioreaktors werden die TIL durch den seitlichen Auslass-Stutzen (15), der mit einem Siebgewebe versehen ist, in ein steriles Gefäß oder in einen größer dimensionierten Mäander-Bioreaktor für die weitere Expansion. Die Gewebestücke, aus denen die TIL ausgewachsen sind, werden vollständig vom Siebgewebe des ersten Mäander-Bioreaktors zurückgehalten.In a meander bioreactor, as described in Example 1, with the floor surface ( 6 ) of the channels ( 19 ) of the meander bioreactor cell culture carrier ( 20 ) from the carrier body ( 21 ) and a cell-adhesive coating ( 22 ) with enriched anti-CD3 as activating antibodies, TILs are obtained from shredded pieces of tissue, in which case the conditions of the bottom flow in the meander perfusion chamber ( 4 ) near a Froude figure 0 be respected. The starting material for this are tissue parts which are obtained in the case of surgical removal of a tumor, tumor metastases or lymph nodes affected by tumor tents. The shredded tissue pieces are filled through the larger-sized and with a sterile occlusive stopper and evenly distributed by pivoting the media-filled meander perfusion bioreactor on the ground. After closing the filler neck, the cultivation is started as in Example 1. To 3 to 7 Days, the tumor-infiltrated T lymphocytes (TIL) contained in the tumorous tissue pieces grow in quantities. Depending on the selected medium and added supplements, the TILs are activated in this process phase, specifically primed by further contact with the initially remaining mixture of mutant tumor cells from an individual tumor piece (obtained from a tumor resectate) mutant tumor cells. As a rule, 1.5 to 2 × 10 9 TIL grow within a week in the Meander perfusion bioreactor with a surface area of 30 cm 2 . After shaking the meander-perfusion-bioreactor, the TIL through the side outlet-neck ( 15 ), which is provided with a mesh, in a sterile vessel or in a larger sized meander bioreactor for further expansion. The tissue pieces from which the TILs are grown are completely retained by the mesh of the first meander bioreactor.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION
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Zitierte PatentliteraturCited patent literature
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