DE202011106578U1

DE202011106578U1 - Device for determining a substance concentration by means of fluorescence spectroscopy

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Publication number: DE202011106578U1
Application number: DE201120106578
Authority: DE
Original assignee: ARGOS MESSTECHNIK GmbH
Current assignee: ARGOS MESSTECHNIK GmbH
Priority date: 2011-10-11
Filing date: 2011-10-11
Publication date: 2011-10-31
Anticipated expiration: 2021-10-12

Abstract

Vorrichtung (1, 1') zur Bestimmung einer Stoffkonzentration, vorzugsweise Sauerstoffkonzentration, mittels Fluoreszenzspektroskopie, umfassend: – wenigstens eine erste Strahlungsquelle (2), die zum Aussenden wenigstens einer ersten elektromagnetischen Strahlung (S1) ausgebildet ist, vorzugsweise im sichtbaren Bereich des Spektrums; – wenigstens eine erste Modulationseinrichtung (3), dazu zum Modulieren der Intensität der ersten Strahlung mit wenigstens einer ersten (f1) und einer zweiten Modulationsfrequenz (f2), welche unterschiedlich sind, ausgebildet ist; – wenigstens eine Probe (5), die im Strahlengang der ersten Strahlung angeordnet ist, welche Probe dazu ausgebildet ist, eine von der Konzentration des zu bestimmenden Stoffs abhängige Fluoreszenzstrahlung (S1) zu emittieren; – einen Detektor (6), der zum Detektieren der ersten Strahlung ausgebildet und im Strahlengang der ersten Strahlung angeordnet ist; – wenigstens einen Strahlteiler (4), der dazu ausgebildet und angeordnet ist, einen ersten Teil der ersten Strahlung (S1) auf die Probe (5) und einen zweiten Teil der ersten Strahlung auf den...Device (1, 1 ') for determining a substance concentration, preferably oxygen concentration, by means of fluorescence spectroscopy, comprising: - at least one first radiation source (2) which is designed to emit at least one first electromagnetic radiation (S1), preferably in the visible range of the spectrum; - At least one first modulation device (3) is designed to modulate the intensity of the first radiation with at least a first (f1) and a second modulation frequency (f2) which are different; - At least one sample (5) which is arranged in the beam path of the first radiation, which sample is designed to emit fluorescent radiation (S1) that is dependent on the concentration of the substance to be determined; - A detector (6) which is designed to detect the first radiation and is arranged in the beam path of the first radiation; - At least one beam splitter (4) which is designed and arranged to transmit a first part of the first radiation (S1) onto the sample (5) and a second part of the first radiation onto the ...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Gebiet der Bestimmung einer Stoffkonzentration, vorzugsweise Sauerstoffkonzentration, mittels Fluoreszenzspektroskopie, wobei eine Probe mit wenigstens einer ersten elektromagnetischen Strahlung beaufschlagt wird, vorzugsweise im sichtbaren Bereich des Spektrums, wobei die erste Strahlung mit wenigstens einer ersten und einer zweiten Modulationsfrequenz, welche unterschiedlich sind, in ihrer Intensität moduliert wird, und wobei eine von der Probe ausgesandte Fluoreszenzstrahlung mittels eines Detektors bestimmt und für jede Modulationsfrequenz hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer jeweiligen ersten Referenzphasenlage mittels einer Auswerteelektronik ausgewertet wird, welche erste Referenzphasenlage sich bei einer bekannten Stoffkonzentration in der Probe ergibt, vorzugsweise bei einem Fehlen des Stoffs in der Probe, um die Stoffkonzentration in der Probe zu bestimmen.The present invention relates to the technical field of determining a substance concentration, preferably oxygen concentration, by means of fluorescence spectroscopy, wherein a sample is subjected to at least a first electromagnetic radiation, preferably in the visible region of the spectrum, wherein the first radiation having at least a first and a second modulation frequency, which are different, their intensity is modulated, and wherein a fluorescence emitted by the sample is determined by means of a detector and evaluated for each modulation frequency with respect to their phase position relative to a respective first reference phase position by means of an evaluation, which first reference phase position at a known substance concentration in of the sample, preferably in the absence of the substance in the sample to determine the concentration of the substance in the sample.

Speziell betrifft die Erfindung eine Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 zur Bestimmung einer Stoffkonzentration, vorzugsweise Sauerstoffkonzentration, mittels Fluoreszenzspektroskopie, umfassend: wenigstens eine erste Strahlungsquelle, die zum Aussenden wenigstens einer ersten elektromagnetischen Strahlung ausgebildet ist, vorzugsweise im sichtbaren Bereich des Spektrums; wenigstens eine erste Modulationseinrichtung, die zum Modulieren der Intensität der ersten Strahlung mit wenigstens einer ersten und einer zweiten Modulationsfrequenz, welche unterschiedlich sind, ausgebildet ist; wenigstens eine Probe, die im Strahlengang der ersten Strahlung angeordnet ist, welche Probe dazu ausgebildet ist, eine von der Konzentration des zu bestimmenden Stoffs abhängige Fluoreszenzstrahlung zu emittieren; einen Detektor, der zum Detektieren der ersten Strahlung ausgebildet und im Strahlengang der ersten Strahlung angeordnet ist; wenigstens einen Strahlteiler, der dazu ausgebildet und angeordnet ist, einen ersten Teil der ersten Strahlung auf die Probe und einen zweiten Teil der ersten Strahlung auf den Detektor zu lenken und eine Auswerteelektronik, die in signaltechnischer Wirkverbindung mit dem Detektor steht und die dazu ausgebildet ist, eine von der Probe ausgesandte und mittels des Detektors bestimmte Fluoreszenzstrahlung für die erste und die zweite Modulationsfrequenz hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer jeweiligen ersten Referenzphasenlage auszuwerten, welche erste Referenzphasenlage einer bekannten Stoffkonzentration in der Probe entspricht, vorzugsweise einem Fehlen des Stoffs in der Probe, um die Stoffkonzentration in der Probe zu bestimmen.Specifically, the invention relates to a device according to the preamble of claim 1 for determining a substance concentration, preferably oxygen concentration, by means of fluorescence spectroscopy, comprising: at least a first radiation source, which is designed to emit at least a first electromagnetic radiation, preferably in the visible region of the spectrum; at least one first modulation means configured to modulate the intensity of the first radiation having at least a first and a second modulation frequency which are different; at least one sample, which is arranged in the beam path of the first radiation, which sample is adapted to emit a dependent on the concentration of the substance to be determined fluorescence radiation; a detector configured to detect the first radiation and disposed in the optical path of the first radiation; at least one beam splitter, which is designed and arranged to direct a first part of the first radiation onto the sample and a second part of the first radiation onto the detector, and an evaluation electronics, which is in operative signal connection with the detector and which is designed to evaluate a fluorescence radiation emitted by the sample and determined by means of the detector for the first and the second modulation frequency with respect to their phase position relative to a respective first reference phase position, which first reference phase position corresponds to a known substance concentration in the sample, preferably a lack of the substance in the sample to determine the substance concentration in the sample.

Ein derartiges Verfahren bzw. eine derartige Vorrichtung sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Dabei macht man sich den physikalischen Effekt zunutze, dass die von der Probe ausgesandte Fluoreszenzstrahlung zumindest bei bestimmten Stoffen und bei geeigneter Wahl der Wellenlänge der ersten Strahlung sich in Abhängigkeit von der Konzentration des zu bestimmenden Stoffes in ihrem Abklingverhalten verändert („Quenching” bei Sauerstoff). Die Konzentrationsbestimmung erfolgt anhand der Phasenverschiebung zwischen der Anregungsstrahlung und der Fluoreszenzstrahlung. Dies ist beispielsweise in dem Artikel „The Measurement and Analysis of Heterogeneous Emissions by Multifrequency Phase and Modulation Fluorometry” von Jameson et al., Applied Spectroscopy Reviews 20(1), 55–106 (1984) , beschrieben, welcher beispielsweise von Lakowicz in dem Buch „Principles of Fluorescence Spectroscopy”, 3. Auflage, Springer (2006) zitiert wird.Such a method or such a device are generally known to the person skilled in the art. In this case, the physical effect is utilized that the fluorescence radiation emitted by the sample, at least for certain substances and with a suitable choice of the wavelength of the first radiation, changes in its decay behavior as a function of the concentration of the substance to be determined ("quenching" in the case of oxygen). , The concentration is determined on the basis of the phase shift between the excitation radiation and the fluorescence radiation. This is for example in the article "The Measurement and Analysis of Heterogeneous Emission by Multifrequency Phase and Modulation Fluorometry" by Jameson et al., Applied Spectroscopy Reviews 20 (1), 55-106 (1984) , which, for example, by Lakowicz in the book "Principles of Fluorescence Spectroscopy", 3rd Edition, Springer (2006) is quoted.

Mit dem von Jameson et al. vorgeschlagenen und bei Lakowicz zitierten Ansatz einer Zwei-Frequenz-Messung (zwei unterschiedliche Modulationsfrequenzen für die erste Strahlung) lassen sich Streulicht- und Autofluoreszenz-Einflüsse eliminieren, welche nicht auf die zu messende Stoffkonzentration in der Probe zurückzuführen sind. Hierzu gehören auch weitere „optische Fehler”, wie Einflüsse von Filtermaterial, Klebstoffen oder dergleichen. Diese Einflüsse addieren sich in der Auswerteelektronik zusammen mit der auf den zu messenden Stoff rückführbaren Phasenverschiebung zu einer Gesamt-Phasenverschiebung des Fluoreszenzsignals (Fluoreszenzstrahlung) gegenüber dem Anregesignal (zur ersten Strahlungsquelle ausgesandte erste Strahlung).With the of Jameson et al. proposed and quoted by Lakowicz approach of a two-frequency measurement (two different modulation frequencies for the first radiation) can eliminate stray light and autofluorescence influences, which are not due to the measured substance concentration in the sample. This also includes other "optical errors", such as influences of filter material, adhesives or the like. These influences add up in the evaluation together with the traceable to the substance to be measured phase shift to a total phase shift of the fluorescence signal (fluorescence radiation) relative to the excitation signal (first radiation source emitted first radiation).

Mit dem vorbekannten Ansatz ist es – wie bereits ausführt – möglich, optische Störeinflüsse durch Streulicht, Autofluoreszenz der Probe oder dergleichen bei der Auswertung zu eliminieren. Es hat sich jedoch als nachteilig herausgestellt, dass insbesondere Störeinflüsse seitens der Auswerteelektronik selbst, wie deren Temperaturgang etc., mit den vorbekannten Ansätzen nicht erkannt bzw. eliminiert werden können, was die erreichbare Genauigkeit der Konzentrationsbestimmung negativ beeinflusst.With the previously known approach it is possible, as already stated, to eliminate optical interference caused by scattered light, autofluorescence of the sample or the like in the evaluation. However, it has proved to be disadvantageous that, in particular, disturbances on the part of the transmitter itself, such as its temperature response, etc., can not be detected or eliminated with the previously known approaches, which adversely affects the achievable accuracy of the concentration determination.

Die Gesamt-Phasenverschiebung des auszuwertenden Detektionssignals ergibt sich nämlich als Summe mehrerer Phasenverschiebungsanteile, insbesondere eines ersten Phasenverschiebungsanteils aufgrund der eingesetzten Auswerteelektronik, eines zweiten Phasenverschiebungsanteils aufgrund der im Strahlengang vorhandenen optischen Elemente sowie eines dritten Phasenverschiebungsanteils, welcher durch die Probe selbst und insbesondere durch den dort vorhandenen Stoff, dessen Konzentration bestimmt werden soll, bedingt ist.The total phase shift of the detection signal to be evaluated results namely as the sum of a plurality of phase shift components, in particular a first phase shift component due to the evaluation electronics used, a second phase shift component due to the optical elements present in the beam path and a third phase shift component generated by the sample itself and in particular by the latter Substance whose concentration is to be determined is conditional.

Der Erfindung liegt die technische Aufgabe zurgrunde, die Vorrichtung der eingangs genannten Art hinsichtlich der erreichbaren Messgenauigkeit zu verbessern. Dabei ist angestrebt, die durch die eingesetzte Auswerteelektronik und die verwendeten optischen Elemente hervorgerufene Phasenverschiebung bei der Auswertung zu eliminieren, um anschließend über die verbleibende Phasenverschiebung mit erhöhter Genauigkeit auf die zu bestimmende Stoffkonzentration an der Probe schließen zu können.The invention is the technical task of the reason, the device of the type mentioned in terms of the achievable accuracy improve. In this case, it is desirable to eliminate the phase shift caused by the evaluation electronics used and the optical elements used in the evaluation, in order subsequently to be able to conclude with increased accuracy on the substance concentration to be determined on the sample via the remaining phase shift.

Diese Aufgabe wird gelöst mittels einer Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Vorteilhafte Weiterbildungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind Gegenstand von Unteransprüchen, deren Wortlaut hiermit durch ausdrückliche Bezugnahme in die Beschreibung aufgenommen wird, um unnötige Textwiederholungen nach Möglichkeit zu vermeiden.This object is achieved by means of a device having the features of claim 1. Advantageous developments of the device according to the invention are the subject of subclaims, the wording of which is hereby incorporated by express reference into the description in order to avoid unnecessary repetition of text as far as possible.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung eignet sich insbesondere zum Bestimmen einer Sauerstoffkonzentration.The device according to the invention is particularly suitable for determining an oxygen concentration.

Dabei ist verfahrenstechnisch vorgesehen, dass eine Probe, die geeignet ist, eine von der Konzentration des zu bestimmenden Stoffs (z. B. Sauerstoff, O₂) in ihren Eigenschaften abhängige, vorzugsweise zu der Konzentration proportionale Fluoreszenzstrahlung zu emittieren, mit wenigstens einer ersten elektromagnetischen Strahlung beaufschlagt wird. Diese Strahlung ist vorzugsweise im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums angesiedelt. Weiterhin ist vorgesehen, dass die genannte erste Strahlung mit wenigstens einer ersten und einer zweiten Modulationsfrequenz, welche unterschiedlich sind, in ihrer Intensität moduliert wird, wie es bereits aus dem Stand der Technik bekannt ist. Anschließend wird eine von der Probe ausgesandte Fluoreszenzstrahlung mittels eines Detektors bestimmt und für jede Modulationsfrequenz hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer jeweiligen ersten Referenzphasenlage mittels einer Auswerteelektronik ausgewertet. Die erste Referenzphasenlage ergibt sich bei einer bekannten Stoffkonzentration in der Probe, vorzugsweise bei einem Fehlen des Stoffs in der Probe, und lässt sich insbesondere dadurch erhalten, dass die genannte erste Strahlung vor dem Auftreffen auf die Probe mittels eines Strahlteilers in wenigstens zwei Anteile aufgeteilt wird, von denen einer auf die Probe und der andere im Wesentlichen direkt auf den Detektor geleitet wird. Wenn man nun anhand der Phasenverschiebung des Signals mit der ersten Modulationsfrequenz und des Signals mit der zweiten Modulationsfrequenz die Auswertung nach dem von Jameson et al. vorgeschlagenen Lösungsansatz vornimmt, gelingt es, die Einflüsse von Streulicht und Autofluoreszenz der Probe in bestimmten Grenzen auswertetechnisch zu eliminieren.In this case, it is procedurally provided that a sample which is suitable for emitting fluorescent radiation which is dependent on the concentration of the substance to be determined (eg oxygen, O ₂ ) and preferably proportional to the concentration, has at least one first electromagnetic radiation Radiation is applied. This radiation is preferably located in the visible region of the electromagnetic spectrum. It is further provided that the said first radiation having at least a first and a second modulation frequency, which are different, is modulated in intensity, as is already known from the prior art. Subsequently, a fluorescence radiation emitted by the sample is determined by means of a detector and evaluated for each modulation frequency with respect to its phase position relative to a respective first reference phase position by means of evaluation electronics. The first reference phase position results at a known substance concentration in the sample, preferably in the absence of the substance in the sample, and can be obtained, in particular, by dividing said first radiation into at least two portions before striking the sample by means of a beam splitter one of which is directed to the sample and the other essentially directly to the detector. If one now uses the phase shift of the signal with the first modulation frequency and the signal with the second modulation frequency, the evaluation according to the of Jameson et al. proposes proposed solution, it is possible to eliminate the effects of stray light and autofluorescence of the sample within certain limits evaluation technology.

Unter einem „Strahlteiler” wird im Rahmen dieser Beschreibung jedes optische Element verstanden, welches dazu geeignet ist, die erste Strahlung in wenigstens zwei Anteile aufzuteilen, nämlich einen (vorzugsweise vergleichsweise kleinen) Anteil, insbesondere Streuanteils der als Referenzstrahlung direkt zum Detektor gelangt, und einen anderen (vergleichsweise deutlich größeren) Anteil, der als Anregungsstrahlung für die Probe dient. Außerdem dient der Strahlteiler dazu, die von der Probe emittierte Fluoreszenzstrahlung zumindest teilweise in Richtung Detektor umzulenken. Hiermit kann vorteilhafterweise eine Filterfunktion verknüpft sein, so dass nur bestimmte, vorzugsweise relativ langwellige Anteile der Fluoreszenzstrahlung zum Detektor gelangen. Beispielsweise kann in diesem Zusammenhang ein dichroitischer Spiegel Anwendung finden (siehe unten), ohne dass die Erfindung jedoch auf derartige Strahlteiler beschränkt wäre. Bei einem solchen Spiegel erfolgt die „Aufteilung” der ersten Strahlung im Wesentlichen dadurch, dass aufgrund von Streulichteffekten der Gesamtanordnung, insbesondere also der Spiegelumgebung, ein kleiner Strahlungsanteil direkt zum Detektor gelangt. Wie der Fachmann weiterhin erkennt, können für die Aufteilung der ersten Strahlung und für die Umlenkung/Filterung der Fluoreszenzstrahlung auch mehrere getrennte Elemente Verwendung finden.In the context of this description, a "beam splitter" is understood to mean any optical element which is suitable for dividing the first radiation into at least two components, namely a (preferably comparatively small) component, in particular scattered component, which passes directly to the detector as reference radiation, and one other (comparatively much larger) portion, which serves as excitation radiation for the sample. In addition, the beam splitter serves to at least partially redirect the fluorescence radiation emitted by the sample in the direction of the detector. This advantageously can be linked to a filter function, so that only certain, preferably relatively long-wave portions of the fluorescence radiation reach the detector. For example, a dichroic mirror may be used in this connection (see below), without, however, limiting the invention to such beam splitters. In such a mirror, the "distribution" of the first radiation essentially takes place in that due to scattered light effects of the overall arrangement, in particular therefore the mirror environment, a small proportion of radiation passes directly to the detector. As the person skilled in the art further recognizes, it is also possible to use a plurality of separate elements for the division of the first radiation and for the deflection / filtering of the fluorescence radiation.

Um zusätzlich auch die Einflüsse der eingesetzten Auswerteelektronik eliminieren zu können, insbesondere deren Temperaturgang wird im Zuge des vorstehend beschriebenen Verfahrens vorgeschlagen, dass der Detektor zusätzlich mit wenigstens einer zweiten elektromagnetischen Strahlung beaufschlagt wird, welche vorzugsweise ebenfalls im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums angesiedelt ist. Dabei wird die genannte zweite Strahlung mit wenigstens einer dritten Modulationsfrequenz in ihrer Frequenz moduliert, welche dritte Modulationsfrequenz von der ersten Modulationsfrequenz und der zweiten Modulationsfrequenz verschieden ist. Wesentlich dabei ist, dass die zweite Strahlung nicht mit der Probe wechselwirkt und nach ihrem Eintreffen einen Detektor hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer zweiten Referenzphasenlage mittels der Auswerteelektronik ausgewertet wird.In order to additionally eliminate the effects of the evaluation electronics used, in particular their temperature response is proposed in the course of the method described above, that the detector is additionally acted upon with at least a second electromagnetic radiation, which is preferably also located in the visible region of the electromagnetic spectrum. In this case, the said second radiation is modulated in frequency with at least one third modulation frequency, which third modulation frequency is different from the first modulation frequency and the second modulation frequency. It is essential that the second radiation does not interact with the sample and, after its arrival, a detector is evaluated with regard to its phase position relative to a second reference phase position by means of the evaluation electronics.

Auf diese Weise lässt sich die Stoffkonzentration in der Probe unabhängig von Zustandsänderungen, insbesondere temperaturbedingten Zustandsänderungen oder einer Phasendrift der Auswerteelektronik bestimmen. Wesentlich dabei ist, dass zusätzlich zu der vorbekannten Zwei-Frequenz-Technik zusätzlich eine Zwei-Strahlungsquellen-Technik zum Einsatz kommt, wobei die Auswertung aller Signale mittels ein und derselben Auswerteelektronik erfolgt. Da die zweite Strahlung nicht mit der Probe sondern im Wesentlichen nur mit der Auswerteelektronik „wechselwirkt”, kann sie dazu verwendet werden, das Gesamt-Messergebnis bzw. die ermittelte Gesamt-Phasenverschiebung hinsichtlich der Einflüsse, insbesondere des Temperaturgangs, der Auswertelektronik zu korrigieren. Als zweite Referenzphasenlage kann hierbei eine Phasenlage der zweiten Strahlung bzw. des zugehörigen Detektionssignals am Detektor herangezogen werden, welche sich unter Referenzbedingungen, beispielsweise bei einer bekannten Referenztemperatur, ergibt.In this way, the substance concentration in the sample can be determined independently of changes in state, in particular temperature-induced changes in state or a phase drift of the evaluation. It is essential that in addition to the previously known two-frequency technology, a dual-radiation source technique is used in addition, wherein the evaluation of all signals by means of one and the same transmitter is performed. Since the second radiation does not "interact" with the sample but essentially only with the evaluation electronics, it can be used to calculate the overall measurement result or the determined overall phase shift with regard to the influences, in particular the temperature response, of the Correct evaluation electronics. In this case, a phase position of the second radiation or of the associated detection signal at the detector, which results under reference conditions, for example at a known reference temperature, can be used as the second reference phase position.

Eine zur Durchführung des beschriebenen Verfahrens bestimmte erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst zunächst folgende Elemente:

– wenigstens eine erste Strahlungsquelle, die zum Aussenden wenigstens einer ersten elektromagnetischen Strahlung ausgebildet ist, vorzugsweise im sichtbaren Bereich des Spektrums;
– wenigstens eine erste Modulationseinrichtung, dazu zum Modulieren der Intensität der ersten Strahlung mit wenigstens einer ersten und einer zweiten Modulationsfrequenz, welche unterschiedlich sind, ausgebildet ist;
– wenigstens eine Probe, die im Strahlengang der ersten Strahlung angeordnet ist, welche Probe dazu ausgebildet ist, eine von der Konzentration des zu bestimmenden Stoffs abhängige Fluoreszenzstrahlung zu emittieren;
– einen Detektor, der zum Detektieren der ersten Strahlung ausgebildet und im Strahlengang der ersten Strahlung angeordnet ist;
– wenigstens einen Strahlteiler, der dazu ausgebildet und angeordnet ist, einen ersten Teil der ersten Strahlung auf die Probe und einen zweiten Teil der ersten Strahlung auf den Detektor zu lenken;
– eine Auswerteelektronik, die in signaltechnischer Wirkverbindung mit dem Detektor steht und die dazu ausgebildet ist, eine von der Probe ausgesandte und mittels des Detektors bestimmte Fluoreszenzstrahlung für die erste und die zweite Modulationsfrequenz hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer jeweiligen ersten Referenzphasenlage auszuwerten, welche erste Referenzphasenlage einer bekannten Stoffkonzentration in der Probe entspricht, vorzugsweise einem Fehlen des Stoffs in der Probe, um die Stoffkonzentration in der Probe zu bestimmen.

A device according to the invention intended for carrying out the method described comprises at first the following elements:

At least one first radiation source, which is designed to emit at least one first electromagnetic radiation, preferably in the visible region of the spectrum;
At least one first modulation means adapted to modulate the intensity of the first radiation having at least a first and a second modulation frequency which are different;
- At least one sample, which is arranged in the beam path of the first radiation, which sample is adapted to emit a dependent on the concentration of the substance to be determined fluorescence radiation;
A detector which is designed to detect the first radiation and is arranged in the beam path of the first radiation;
At least one beam splitter adapted and arranged to direct a first portion of the first radiation to the sample and a second portion of the first radiation to the detector;
- An evaluation, which is in operative signal connection with the detector and which is adapted to evaluate a emitted from the sample and determined by the detector fluorescence radiation for the first and the second modulation frequency with respect to their phase position relative to a respective first reference phase position, which first reference phase position a known substance concentration in the sample, preferably a lack of the substance in the sample to determine the substance concentration in the sample.

Diese bereits aus dem Stand der Technik bekannten Elemente werden erfindungsgemäß noch ergänzt durch wenigstens eine zweite Strahlungsquelle, die zum Aussenden wenigstens einer zweiten elektromagnetischen Strahlung ausgebildet ist, welche vorzugsweise im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums angesiedelt ist. Die zweite Strahlungsquelle ist derart angeordnet, dass die zweite Strahlung den Detektor ohne Wechselwirkung mit der Probe erreicht. Weiterhin ist wenigstens eine zweite Modulationseinrichtung vorgesehen, die zum Modellieren der Intensität der zweiten Strahlung mit wenigstens einer dritten Modulationsfrequenz ausgebildet ist. Die dritte Modulationsfrequenz ist von der ersten Modulationsfrequenz und der zweiten Modulationsfrequenz verschieden. Schließlich ist der Detektor zum Detektieren der zweiten Strahlung ausgebildet, und die Auswerteelektronik ist dazu ausgebildet, die vom Detektor detektierte zweite Strahlung hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu der bereits angesprochenen zweiten Referenzphasenlage auszuwerten, um die Stoffkonzentration in der Probe unabhängig von Zustandsänderungen, insbesondere von temperaturbedingten Zustandsänderungen, der Auswerteelektronik zu bestimmen.According to the invention, these elements, which are already known from the prior art, are supplemented by at least one second radiation source, which is designed to emit at least one second electromagnetic radiation, which is preferably located in the visible region of the electromagnetic spectrum. The second radiation source is arranged such that the second radiation reaches the detector without interaction with the sample. Furthermore, at least one second modulation device is provided, which is designed to model the intensity of the second radiation with at least one third modulation frequency. The third modulation frequency is different from the first modulation frequency and the second modulation frequency. Finally, the detector is designed to detect the second radiation, and the evaluation electronics are designed to evaluate the second radiation detected by the detector with regard to its phase position relative to the already mentioned second reference phase position, the substance concentration in the sample independent of changes in state, in particular temperature-induced state changes to determine the transmitter.

Kern der vorliegenden Erfindung ist demnach die vorstehend beschriebene Ausgestaltung der Vorrichtung mit einem (Photo-)Detektor nebst zugehöriger Auswertelektronik, zwei Strahlungsquellen und drei unterschiedlichen Modulationsfrequenzen – zwei Modulationsfrequenzen für die erste Strahlung und eine Modulationsfrequenz für die zweite Strahlung. Mit Hilfe dieser Anordnung lassen sich im Wesentlichen alle bekannten Störeffekte kompensieren.The core of the present invention is therefore the above-described embodiment of the device with a (photo) detector and associated evaluation electronics, two radiation sources and three different modulation frequencies - two modulation frequencies for the first radiation and a modulation frequency for the second radiation. With the aid of this arrangement, essentially all known disturbing effects can be compensated.

Eine besonders bevorzugte Weiterbildung des hier beschriebenen Verfahrens sieht vor, dass die erste Strahlung oder eine dritte elektromagnetische Strahlung, die vorzugsweise ebenfalls im sichtbaren Bereich der elektromagnetischen Spektrums angesiedelt ist und die im Wesentlichen parallel zu der ersten Strahlung geführt wird, mit einer vierten Modulationsfrequenz in ihrer Intensität modelliert wird. Dabei ist die vierte Modulationsfrequenz von der ersten, zweiten und dritten Modulationsfrequenz verschieden. Mit der so modulierten ersten oder dritten Strahlung wird anschließend ein an der Probe angeordnetes Referenzobjekt bestrahlt, welches Referenzobjekt im Wesentlichen keine Veränderung seines Fluoreszenzverhaltens in Abhängigkeit von der zu bestimmenden Stoffkonzentration zeigt. Allerdings wird das Referenzobjekt so gewählt, dass es eine Veränderung seines Fluoreszenzverhaltens in Abhängigkeit von seiner Temperatur zeigt. Anschließend wird die am Detektor eintreffende erste oder dritte Strahlung bzw. eine entsprechende Fluoreszenzstrahlung von der Probe/dem Referenzobjekt mit der vierten Modulationsfrequenz hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer dritten Referenzphasenlage mittels der Auswerteelektronik ausgewertet, um zusätzlich eine Temperatur der Probe optisch zu bestimmen. Die genannte dritte Referenzphasenlage ergibt sich beispielsweise für eine bekannte Probentemperatur.A particularly preferred development of the method described here provides that the first radiation or a third electromagnetic radiation, which is preferably also located in the visible region of the electromagnetic spectrum and which is guided substantially parallel to the first radiation, with a fourth modulation frequency in their Intensity is modeled. In this case, the fourth modulation frequency is different from the first, second and third modulation frequency. With the thus modulated first or third radiation, a reference object arranged on the sample is then irradiated, which reference object shows substantially no change in its fluorescence behavior as a function of the substance concentration to be determined. However, the reference object is chosen to show a change in its fluorescence behavior as a function of its temperature. Subsequently, the first or third radiation arriving at the detector or a corresponding fluorescence radiation from the sample / reference object with the fourth modulation frequency is evaluated with respect to its phase position relative to a third reference phase position by means of the evaluation electronics, in order to additionally optically determine a temperature of the sample. Said third reference phase position results, for example, for a known sample temperature.

Auf diese Weise ist es im Rahmen der beschriebenen Weiterbildung des Verfahrens nicht erforderlich, die Probentemperatur, welche einen wichtigen Einfluss auf die zu erzielende Messgenauigkeit haben kann, mittels eines zusätzlichen, elektronischen Messelements zu bestimmen, sondern die Temperaturbestimmung der Probe kann parallel zu der optischen Bestimmung der Stoffkonzentration ebenfalls optisch mittels derselben Auswerteanordnung erfolgen, so dass sich Zustandsänderungen der Auswerteelektronik bedingte Ungenauigkeiten der Temperaturbestimmung ebenfalls mit kompensieren lassen.In this way, it is not necessary in the context of the described development of the method to determine the sample temperature, which can have an important influence on the measurement accuracy to be achieved, by means of an additional, electronic measuring element, but the temperature determination of the sample can be parallel to the optical determination the substance concentration also optically by means of the same evaluation arrangement, so that Changes in state of the evaluation conditional inaccuracies of the temperature determination can also be compensated.

Eine entsprechende Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor, dass entweder die erste Modulationseinrichtung dazu ausgebildet ist, die erste Strahlung mit einer vierten Modulationsfrequenz in ihrer Intensität zu modulieren oder dass wenigstens eine dritte Strahlungsquelle vorgesehen ist, die zum Aussenden wenigstens einer dritten elektromagnetischen Strahlung ausgebildet ist, vorzugsweise im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums, und die in Wechselwirkung steht mit einer dritten Modulationseinrichtung, die dazu ausgebildet ist, die dritte Strahlung mit einer vierten Modulationsfrequenz in ihrer Intensität zu modulieren. In beiden Fällen ist die vierte Modulationsfrequenz von der ersten, zweiten und dritten Modulationsfrequenz verschieden. In diesem Zusammenhang ist weiterhin vorgesehen, dass die Probe ein Referenzobjekt oder einen Referenzbereich umfasst, welcher beispielsweise in Rubin ausgebildet ist oder solches bzw. in seinen Eigenschaften vergleichbares Material enthält. Das Referenzobjekt ist allgemein derart gewählt, dass es im Wesentlichen keine Veränderung seines Fluoreszenzverhaltens in Abhängigkeit von der zu bestimmenden Stoffkonzentration zeigt, wobei jedoch eine Veränderung seines Fluoreszenzverhaltens in Abhängigkeit von der Temperatur auftritt. Keinesfalls ist die Erfindung in diesem Zusammenhang auf die Verwendung von Rubin als Referenzobjekt beschränkt. Weiterhin ist in diesem Zusammenhang die Auswerteelektronik dazu ausgebildet, die vom Detektor detektierte erste oder dritte Strahlung mit der vierten Modulationsfrequenz hinsichtlich ihrer Phasenlage relativ zu einer dritten Referenzphasenlage auszuwerten, um zusätzlich eine Temperatur der Probe optisch zu bestimmen.A corresponding development of the device according to the invention provides that either the first modulation device is designed to modulate the intensity of the first radiation with a fourth modulation frequency or that at least one third radiation source is provided, which is designed to emit at least one third electromagnetic radiation. preferably in the visible region of the electromagnetic spectrum, and which interacts with a third modulation device, which is designed to modulate the intensity of the third radiation at a fourth modulation frequency. In both cases, the fourth modulation frequency is different from the first, second and third modulation frequencies. In this context, it is further provided that the sample comprises a reference object or a reference region, which is formed, for example, in ruby or contains such or comparable in its properties material. The reference object is generally chosen such that it shows substantially no change in its fluorescence behavior as a function of the substance concentration to be determined, but a change in its fluorescence behavior as a function of the temperature occurs. In no case, the invention is limited in this context to the use of ruby as a reference object. Furthermore, in this connection, the evaluation electronics are designed to evaluate the first or third radiation detected by the detector with the fourth modulation frequency with respect to its phase position relative to a third reference phase position in order additionally to optically determine a temperature of the sample.

Wie sich aus dem Vorhergehenden ergibt, kann die optische Temperaturbestimmung der Probe also entweder derart erfolgen, dass die von der vorhandenen ersten Strahlungsquelle ausgesandte erste Strahlung mit der vierten Modulationsfrequenz in ihrer Intensität moduliert wird, oder es kann eine zusätzliche dritte Strahlungsquelle vorgesehen sein, deren Strahlung (dritte Strahlung) dann entsprechend mit der vierten Modulationsfrequenz in ihrer Intensität moduliert wird.As can be seen from the foregoing, the optical temperature determination of the sample can thus be carried out either in such a way that the first radiation emitted by the existing first radiation source is modulated in intensity with the fourth modulation frequency, or an additional third radiation source can be provided whose radiation (Third radiation) is then modulated in accordance with the fourth modulation frequency in intensity.

Eine andere Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor, dass die erste Strahlungsquelle und/oder die zweite Strahlungsquelle als Lumineszenz-Diode oder Leuchtdiode (LED) ausgebildet ist. Vorzugsweise weist die erste Strahlungsquelle eine Wellenlänge von etwa 505 nm und die zweite Strahlungsquelle eine Wellenlänge von 680 nm auf. Wie der Fachmann erkennt, ist die erfindungsgemäße Vorrichtung jedoch keinesfalls auf derartige Strahlungsquellen, insbesondere nicht auf die genannten Wellenlängen beschränkt.Another development of the device according to the invention provides that the first radiation source and / or the second radiation source is designed as a luminescence diode or light emitting diode (LED). Preferably, the first radiation source has a wavelength of about 505 nm and the second radiation source has a wavelength of 680 nm. However, as the person skilled in the art realizes, the device according to the invention is by no means limited to such radiation sources, in particular not to the wavelengths mentioned.

Eine wieder andere Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor, dass der Strahlteiler als dichroitischer Spiegel ausgebildet ist. Derartige Spiegel reflektieren nur einen Teil des Lichtspektrums und sind für den Rest durchlässig. Es ist somit möglich, einfallendes Licht nach der Wellenlänge und somit nach der Farbe zu trennen. Derartige Strahlteiler arbeiten sehr verlustarm, was einen besonderen Anwendungsvorteil darstellt. Bei Verwendung eines dichroitischen Spiegels als Strahlteiler ist es möglich, die Fluoreszenzstrahlung von der Probe bei ihrer Umlenkung in Richtung Detektor zu filtern, so dass nur relativ langwellige Strahlungsanteile zum Detektor gelangen, um die Analysegenauigkeit zu verbessern. Außerdem besitzt ein derartiger Spiegel die Eigenschaft, einen kleinen Teil der anfangs eingestrahlten ersten und/oder dritten Strahlung durch innere „Störeffekte” unmittelbar in Richtung Detektor umzulenken, wo sie als Referenz nutzbar ist, ohne die Auswertung durch übermäßige Intensität zu stören.Yet another development of the device according to the invention provides that the beam splitter is designed as a dichroic mirror. Such mirrors only reflect part of the light spectrum and are permeable to the rest. It is thus possible to separate incident light according to the wavelength and thus to the color. Such beam splitters work very low loss, which represents a special application advantage. When using a dichroic mirror as a beam splitter, it is possible to filter the fluorescence radiation from the sample during its deflection in the direction of the detector, so that only relatively long-wave radiation components reach the detector in order to improve the analysis accuracy. In addition, such a mirror has the property of directing a small portion of the initially irradiated first and / or third radiation through internal "interference effects" directly in the direction of the detector, where it can be used as a reference, without disturbing the evaluation by excessive intensity.

Im Rahmen einer ebenfalls bevorzugten Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann vorgesehen sein, dass die Auswertelektronik als so genanntes „Field-Programmable-Gate-Array” (FPGA) ausgebildet ist, was eine sehr kompakte und zuverlässige Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ermöglicht.Within the scope of a likewise preferred development of the device according to the invention, it can be provided that the evaluation electronics are designed as a so-called "Field Programmable Gate Array" (FPGA), which enables a very compact and reliable design of the device according to the invention.

Eine andere Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor, dass zwischen dem Strahlteiler und der Probe wenigstens ein Lichtleiter oder allgemein ein transparenter Körper mit entsprechenden Eigenschaften für die erste Strahlung und/oder dritte Strahlung angeordnet ist. Über diesen Lichtleiter wird die erste und/oder die dritte Strahlung möglichst verlustfrei zu der Probe geführt, um diese mit der ersten und/oder dritten Strahlung zu beaufschlagen. Außerdem kann der genannte Lichtleiter dazu dienen, die von der Probe ausgesandte Fluoreszenzstrahlung zu dem Strahlteiler zurückzuführen, von welchem sie anschließend zu dem Detektor gelangt.Another development of the device according to the invention provides that between the beam splitter and the sample at least one light guide or generally a transparent body with corresponding properties for the first radiation and / or third radiation is arranged. About this optical fiber, the first and / or the third radiation is guided as lossless as possible to the sample in order to apply these to the first and / or third radiation. In addition, said light guide can serve to return the fluorescence radiation emitted by the sample to the beam splitter, from which it then passes to the detector.

Eine äußerst bevorzugte Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor, dass die Auswerteelektronik Verstärker- und Filtermittel und/oder wenigstens einen Lock-In-Verstärker umfasst, mit welchem sich die Detektorsignale hinsichtlich ihrer Phasenlage genau bestimmen und auswerten lassen, wie vorstehend detailliert beschrieben. Dazu sind die Sende- bzw. Modulationsfrequenzen der Strahlungsquellen mit dem Lock-In-Verstärker synchronisiert.An extremely preferred development of the device according to the invention provides that the transmitter comprises amplifier and filter means and / or at least one lock-in amplifier with which the detector signals can be accurately determined and evaluated with regard to their phase position, as described in detail above. For this purpose, the transmission or modulation frequencies of the radiation sources are synchronized with the lock-in amplifier.

Bei einer wieder anderen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann vorgesehen sein, dass zumindest die erste Strahlungsquelle, die zweite Strahlungsquelle, der Strahlteiler und der Detektor sowie vorzugsweise auch die dritte Strahlungsquelle, soweit vorhanden, und/oder wenigstens ein Abschnitt des Lichtleiters in einer integrierten Anordnung mit einem im Wesentlichen lichtundurchlässigen Gehäuse in oder an diesem Gehäuse angeordnet sind. Auf diese Weise lassen sich insbesondere störende Streulichteinflüsse bereits konstruktiv weitgehend eliminieren. In yet another development of the device according to the invention can be provided that at least the first radiation source, the second radiation source, the beam splitter and the detector and preferably also the third radiation source, if any, and / or at least a portion of the light guide in an integrated arrangement with a substantially opaque housing are arranged in or on this housing. In this way, disturbing stray light effects in particular can already largely be eliminated structurally.

Eine weitere Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor, dass vor dem Detektor wenigstens ein optisches Filterelement angeordnet ist, welches vorzugsweise als einfaches Glasfilter ausgebildet sein kann. Anders als bei den vorbekannten Messapparaturen, welche zum Eliminieren von Störeinflüssen auf die Verwendung teurer Spezialfilter in Form von Mehrschichtsystemen oder dergleichen angewiesen sind, ergibt sich hierdurch ein besonderer Kostenvorteil für eine entsprechend weitergebildete erfindungsgemäße Vorrichtung. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung dient das Filterelement dazu, eine übermäßige Einstrahlung der ersten und/oder dritten Strahlung auf den Detektor zu verhindern. Es wird somit lediglich ein Material benötigt, welches in einem bzw. zwei konkreten Wellenlängenbereich(en) für die genannte Strahlung weitgehend undurchlässig ist. Die erste und/oder dritte Strahlung dient am Detektor bzw. in der Auswerteelektronik lediglich als Referenz, so dass nur eine relativ geringe Intensität benötigt wird – auch um die eigentliche Messstrahlung (Fluoreszenzstrahlung von der Probe) nicht zu überdecken.A further embodiment of the device according to the invention provides that at least one optical filter element is arranged in front of the detector, which may preferably be designed as a simple glass filter. In contrast to the previously known measuring apparatuses, which rely on the use of expensive special filters in the form of multi-layer systems or the like for eliminating disturbing influences, this results in a special cost advantage for a correspondingly further developed device according to the invention. In the context of the present invention, the filter element serves to prevent excessive irradiation of the first and / or third radiation onto the detector. Thus, only a material is required which is substantially impermeable in one or two specific wavelength ranges for the said radiation. The first and / or third radiation serves only as a reference at the detector or in the evaluation electronics, so that only a relatively small intensity is required - even in order not to cover the actual measurement radiation (fluorescence radiation from the sample).

Schließlich kann im Zuge einer wieder anderen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung auch vorgesehen sein, dass zumindest die zweite Strahlungsquelle, die Probe, den Detektor sowie gegebenenfalls das Filterelement auf einer gemeinsamen Seite des Strahlteilers angeordnet sind, vorzugsweise innerhalb des Gehäuses, wodurch sich ein besonders kompakter Aufbau und eine entsprechend flexible Verwendbarkeit der Vorrichtung erreichen lässt.Finally, in the course of another development of the device according to the invention, it can also be provided that at least the second radiation source, the sample, the detector and optionally the filter element are arranged on a common side of the beam splitter, preferably within the housing, resulting in a particularly compact construction and achieve a correspondingly flexible usability of the device.

Weiter Vorteile und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der ZeichnungFurther advantages and features of the present invention will become apparent from the following description of exemplary embodiments with reference to the drawing

1 zeigt schematisch eine erste Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung, welche sich zur Durchführung des beschriebenen Verfahrens eignet; 1 shows schematically a first embodiment of the device according to the invention, which is suitable for carrying out the method described;

2 zeigt schematisch eine andere Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung, welche sich zur Durchführung einer alternativen Ausgestaltung des beschriebenen Verfahrens eignet. 2 schematically shows another embodiment of the device according to the invention, which is suitable for carrying out an alternative embodiment of the method described.

1 zeigt schematisch eine Vorrichtung zur Bestimmung einer Stoffkonzentration, vorzugsweise Sauerstoffkonzentration mittels Fluoreszenzspektroskopie, welche Vorrichtung in ihrer Gesamtheit mit dem Bezugszeichen 1 bezeichnet ist. Die Vorrichtung 1 umfasst bei Bezugszeichen 2 eine erste Strahlungsquelle in Form einer grünen Lumineszenz-Diode (LED) mit einer Wellenlänge von 505 nm. Die erste Strahlungsquelle 2 ist somit in der Lage, eine erste elektromagnetische Strahlung auszusenden, die im sichtbaren Bereich dieses elektromagnetischen Spektrums angesiedelt ist. In signaltechnischer Wirkverbindung mit der ersten Strahlungsquelle 2 weist die Vorrichtung 1 eine erste Modulationseinrichtung 3 auf, die dazu ausgebildet ist, die Intensität der von der ersten Strahlungsquelle ausgesendeten Strahlung, welche in 1 mit dem Bezugszeichen S1 bezeichnet ist, mit einer ersten und einer zweiten Modulationsfrequenz f1 bzw. f2 sinusförmig zu modulieren, wobei gilt: f1 ≠ f2. Im Strahlengang der ersten Strahlung S1 ist zunächst ein Strahlteiler 4 in Form eines dichroitischen Spiegels angeordnet, welcher dazu ausgebildet ist, die erste Strahlung S1 (durchgezogene, dicke Pfeile in 1) größtenteils in Richtung einer Probe 5 durchzulassen. Ein kleinerer Teil der ersten Strahlung S1 gelangt aufgrund von Streulichteffekten der Spiegelumgebung bzw. der Gesamtanordnung in Richtung eines Detektors 6. Hierauf wird weiter unten noch genauer eingegangen. 1 schematically shows a device for determining a substance concentration, preferably oxygen concentration by means of fluorescence spectroscopy, which device in its entirety by the reference numeral 1 is designated. The device 1 includes at reference numerals 2 a first radiation source in the form of a green luminescence diode (LED) with a wavelength of 505 nm. The first radiation source 2 is thus able to emit a first electromagnetic radiation, which is located in the visible range of this electromagnetic spectrum. In signaling connection with the first radiation source 2 has the device 1 a first modulation device 3 which is adapted to the intensity of the radiation emitted by the first radiation source, which in 1 is denoted by the reference symbol S1 to modulate sinusoidally with a first and a second modulation frequency f1 and f2, where: f1 ≠ f2. In the beam path of the first radiation S1 is first a beam splitter 4 arranged in the form of a dichroic mirror, which is adapted to the first radiation S1 (solid, thick arrows in 1 ) mostly in the direction of a sample 5 pass. A smaller part of the first radiation S1 passes in the direction of a detector due to scattered light effects of the mirror environment or of the overall arrangement 6 , This will be discussed in more detail below.

Zwischen dem Strahlteiler 4 und der Probe 5 ist ein transparenter Körper 7 in Form einer optischen Faser, eines Lichtstabs oder dergleichen angeordnet, durch welchen die erste Strahlung S1 zu der Probe 5 gelangt. Vor dem Detektor 6 ist im Strahlengang noch ein Filterelement 8 angeordnet, auf dessen Eigenschaften ebenfalls weiter unten noch genauer eingegangen wird. In signaltechnischer Wirkverbindung mit dem Detektor 6 stehen elektrische Verstärker/Filtermittel oder dergleichen 9 sowie ein Lock-In-Verstärker 10. Die Verstärker/Filtermittel 9 und der Lock-In-Verstärker 10 bilden zusammen eine Auswertelektronik 11 der Vorrichtung 1.Between the beam splitter 4 and the sample 5 is a transparent body 7 in the form of an optical fiber, a light rod or the like, through which the first radiation S1 to the sample 5 arrives. In front of the detector 6 is still a filter element in the beam path 8th whose properties are also discussed in more detail below. In signal communication with the detector 6 stand electrical amplifier / filter means or the like 9 and a lock-in amplifier 10 , The amplifiers / filter media 9 and the lock-in amplifier 10 together form an electronic evaluation system 11 the device 1 ,

Des Weiteren umfasst die Vorrichtung 1 noch eine zweite Strahlungsquelle 12, welche derart relativ zu dem Strahlteiler 4 angeordnet ist, dass eine von ihr ausgesandte zweite Strahlung S2 ohne Wechselwirkung mit der Probe 5 im Wesentlichen direkt zu dem Filterelement 8 bzw. dem Detektor 6 gelangt. In signaltechnischer Wirkverbindung mit der zweiten Strahlungsquelle 12 weist die Vorrichtung 1 noch eine weitere (zweite) Modulationseinrichtung 13 auf, welche dazu ausgebildet ist, die von der zweiten Strahlungsquelle 12 ausgesandte Strahlung S2 in ihrer Intensität mit einer dritten Modulationsfrequenz f3 sinusförmig zu modulieren. Dabei ist die dritte Modulationsfrequenz f3 von der ersten Modulationsfrequenz f1 und der zweiten Modulationsfrequenz f2 verschieden.Furthermore, the device comprises 1 still a second radiation source 12 which is relative to the beam splitter 4 is arranged, that emitted by her second radiation S2 without interaction with the sample 5 essentially directly to the filter element 8th or the detector 6 arrives. In signaling connection with the second radiation source 12 has the device 1 yet another (second) modulation device 13 which is adapted to that of the second radiation source 12 emitted radiation S2 sinusoidally modulate in intensity with a third modulation frequency f3. Here is the third Modulation frequency f3 of the first modulation frequency f1 and the second modulation frequency f2 different.

Die von der zweiten Strahlungsquelle 12 ausgesandte elektromagnetische Strahlung S2 ist in 1 mittels dünner, durchgezogener Pfeile symbolisiert. Bei der zweiten Strahlungsquelle 12 handelt es sich gemäß 1 ebenfalls um eine LED-Strahlungsquelle mit einer Wellenlänge von 680 nm. Allerdings ist die vorliegende Erfindung keinesfalls auf die vorstehend lediglich exemplarisch angeführten Arten von Strahlungsquelien beschränkt.The from the second radiation source 12 emitted electromagnetic radiation S2 is in 1 symbolized by thin, solid arrows. At the second radiation source 12 is it according to 1 Also, the present invention is by no means limited to the above-exemplified types of radiation sources.

Die von der ersten Strahlungsquelle 2 ausgesandte erste Strahlung S1 gelangt – wie bereits ausgeführt – über den transparenten Körper 7 als Anregungsstrahlung zu der Probe 5. Bei der Probe 5 handelt es sich um eine Probe (Spot), welche in der Lage ist, einen Stoff, beispielsweise Sauerstoff, dessen Konzentration mit der Vorrichtung 1 bestimmt werden soll, anzulagern. Der genannte Stoff in der Probe 5 wird durch die erste Strahlung S1 zum Aussenden von Fluoreszenzstrahlung angeregt, welche in 1 mit dem Bezugszeichen S1' bezeichnet und mittels gestrichelter Pfeile symbolisiert ist und welche in ihren Eigenschaften (z. B. Intensität, Phasenlage, Abklingverhalten) von der Konzentration des zu bestimmenden Stoffs in/an der Probe 5 abhängig ist, vorzugsweise wenigstens angenähert proportional. Diese Fluoreszenzstrahlung S1' gelangt über den transparenten Körper 7 zurück zum Strahlteiler 4 und wird dort teilweise in Richtung des Filterelements 8 bzw. des Detektors 6 umgelenkt. Der Detektor 6 empfängt bzw. detektiert also zunächst die unveränderte erste Strahlung S1, die zweite Strahlung oder Referenzstrahlung S2 sowie die von der Probe 5 emittierte Fluoreszenzstrahlung S1'. In Bezug auf Letztere übernimmt der Strahlteiler 4 zusätzlich noch eine Filterfunktion, wobei nur relativ langwellige Anteile zum Detektor 6 reflektiert werden.The from the first radiation source 2 emitted first radiation S1 passes - as already stated - on the transparent body 7 as excitation radiation to the sample 5 , In the sample 5 it is a sample (spot) that is capable of producing a substance, such as oxygen, its concentration with the device 1 should be determined to accumulate. The named substance in the sample 5 is excited by the first radiation S1 for emitting fluorescence radiation, which in 1 designated by the reference symbol S1 'and symbolized by dashed arrows and which in their properties (eg, intensity, phase position, decay behavior) of the concentration of the substance to be determined in / on the sample 5 is dependent, preferably at least approximately proportional. This fluorescence radiation S1 'passes over the transparent body 7 back to the beam splitter 4 and there is partially in the direction of the filter element 8th or the detector 6 diverted. The detector 6 So first receives or detects the unchanged first radiation S1, the second radiation or reference radiation S2 and that of the sample 5 emitted fluorescence radiation S1 '. With respect to the latter, the beam splitter takes over 4 additionally a filter function, whereby only relatively long-wave portions to the detector 6 be reflected.

Das Filterelement 8 ist als einfaches Glasfilter ausgebildet und dient dazu, im Wesentlichen nur die relativ zu den Strahlungen S1, S2 schwache Fluoreszenzstrahlung S1' von der Probe 5 in Richtung Detektor 6 durchzulassen. Für die im Vergleich zu der genannten Strahlung S1' relativ starken Referenzstrahlungsanteile S1, S2 ist das Filterelement 8 dagegen im Wesentlichen undurchlässig ausgebildet und verhindert deren übermäßiges Auftreffen auf den Detektor 6. Die vom Detektor 6 detektierte Strahlung wird anschließend mittels der Auswerteelektronik 11, welche nach Art eines FPGA ausgebildet ist, zur Bestimmung der Stoffkonzentration an der Probe 5 hinsichtlich ihrer Phasenverschiebung ausgewertet. Die Phasenverschiebungen des Signals S1' gegenüber dem Signal S1 erlauben – aufgrund der beiden enthaltenen Modulationsfrequenzen – die Eliminierung von optischen Störeinflüssen. Die Phasenverschiebung des Signal S2 ermöglicht in neuartiger Weise die Eliminierung von Störeinflüssen der Auswertelektronik einschließlich des Detektors. Wie der Fachmann weiß, sind zu diesem Zweck die Sendefrequenzen (Modulationsfrequenzen) der Strahlungsquellen 2, 12 mit dem Lock-In-Verstärker 10 synchronisiert.The filter element 8th is designed as a simple glass filter and serves to substantially only the relative to the radiation S1, S2 weak fluorescent radiation S1 'of the sample 5 towards the detector 6 pass. For the reference radiation portions S1, S2, which are relatively strong in comparison with the stated radiation S1 ', is the filter element 8th On the other hand, it is substantially impermeable and prevents its excessive impact on the detector 6 , The one from the detector 6 detected radiation is then by means of the evaluation 11 , which is designed in the manner of an FPGA, for determining the substance concentration on the sample 5 evaluated in terms of their phase shift. The phase shifts of the signal S1 'relative to the signal S1 allow - due to the two modulation frequencies contained - the elimination of optical interference. The phase shift of the signal S2 allows in a novel way the elimination of disturbing influences of the evaluation electronics including the detector. As the person skilled in the art knows, the transmission frequencies (modulation frequencies) of the radiation sources are for this purpose 2 . 12 with the lock-in amplifier 10 synchronized.

Wie mittels der gestrichelten Box in 1 symbolisiert ist, sind die erste Strahlungsquelle 2, die zweite Strahlungsquelle 12, der Strahlteiler 4, der transparente Körper 7 (zumindest teilweise) und das Filterelement 8 innerhalb eines Gehäuses 14 angeordnet, welches für elektromagnetische Störstrahlung von außerhalb der Vorrichtung 1 im Wesentlichen undurchlässig ist.As indicated by the dashed box in 1 symbolized are the first source of radiation 2 , the second radiation source 12 , the beam splitter 4 , the transparent body 7 (at least in part) and the filter element 8th within a housing 14 arranged, which is for electromagnetic interference from outside the device 1 is essentially impermeable.

Die 2 zeigt eine Abwandlung der Vorrichtung 1 gemäß 1, wobei die Abgabemittelvorrichtung gemäß 2 in ihrer Gesamtheit mit dem Bezugszeichen 1' bezeichnet ist. Es wird im Folgenden nur auf die Unterschiede zwischen den Vorrichtungen gemäß 1 und 2 näher eingegangen, wobei ansonsten gleiche Bezugszeichen gleiche oder gleichwirkende Elemente bezeichnen.The 2 shows a modification of the device 1 according to 1 wherein the dispensing means device according to 2 in their entirety with the reference numeral 1' is designated. It will be explained below only on the differences between the devices according to 1 and 2 discussed in greater detail, otherwise the same reference numerals designate the same or equivalent elements.

Zusätzlich zu der ersten Strahlungsquelle 2 weist die Vorrichtung 1' gemäß 2 vor dem Strahlteiler 4 noch eine dritte Strahlungsquelle 22 auf, welche ebenfalls als LED ausgebildet ist und vorzugsweise eine andere Wellenlänge aufweist als die erste Strahlungsquelle 2. In signaltechnischer Wirkverbindung mit der dritten Strahlungsquelle 22 weist die Vorrichtung 1' eine dritte Modulationseinrichtung 23, welche dazu ausgebildet ist, die von der dritten Strahlungsquelle 22 ausgesandte elektromagnetische Strahlung in ihrer Intensität mit einer vierten Modulationsfrequenz f4 zu modulieren, wobei die vierte Modulationsfrequenz f4 von den ersten bis dritten Modulationsfrequenzen f1–f3 verschieden ist. Die von der dritten Strahlungsquelle 23 ausgesandte elektromagnetische Strahlung ist in 2 mit dem Bezugszeichen S3 bezeichnet und wird durch strichpunktierte Pfeile symbolisiert.In addition to the first radiation source 2 has the device 1' according to 2 in front of the beam splitter 4 still a third radiation source 22 which is also designed as an LED and preferably has a different wavelength than the first radiation source 2 , In operative signaling connection with the third radiation source 22 has the device 1' a third modulation device 23 , which is adapted to that of the third radiation source 22 Emit emitted electromagnetic radiation in intensity with a fourth modulation frequency f4, wherein the fourth modulation frequency f4 is different from the first to third modulation frequencies f1-f3. The third radiation source 23 emitted electromagnetic radiation is in 2 denoted by the reference S3 and is symbolized by dash-dotted arrows.

Zwischen dem Strahlteiler 4 und der Probe 5 weist die Vorrichtung 1' neben dem transparenten Körper 7 noch einen weiteren transparenten Köper 7' auf, über welchen die dritte Strahlung S3 nach Passieren des Strahlteilers 4 zumindest anteilig zu der Probe 5 gelangt.Between the beam splitter 4 and the sample 5 has the device 1' next to the transparent body 7 yet another transparent body 7 ' via which the third radiation S3 after passing through the beam splitter 4 at least proportionately to the sample 5 arrives.

Die Probe 5 weist gemäß der Ausgestaltung in 2 einen ersten Probenabschnitt 5a auf, welcher in seiner Ausgestaltung und Funktion der Probe 5 gemäß 1 entspricht. Mit anderen Worten: in ihrem Abschnitt 5a ist die Probe 5 gemäß 2 wiederum dazu ausgebildet, eine von der Konzentration des mit der Vorrichtung 1' zu bestimmenden Stoffs abhängige Fluoreszenzstrahlung zu emittieren. Entsprechend ist die Vorrichtung 1' dazu ausgebildet, dass die erste Strahlung S1 in dem Bereich 5a auf die Probe 5 auftritt, so dass entsprechend der Abschnitt 5a der Probe 5 die Fluoreszenzstrahlung S1' aussendet, wie weiter oben anhand von 1 ausführlich beschrieben.The sample 5 has according to the embodiment in 2 a first sample section 5a on, which in its design and function of the sample 5 according to 1 equivalent. In other words, in her section 5a is the sample 5 according to 2 in turn, one adapted to the concentration of the device 1' to emit dependent fluorescence radiation to be determined substance. Accordingly, the device 1' designed so that the first radiation S1 in the area 5a to the test 5 occurs, so according to the section 5a the sample 5 the fluorescence radiation S1 'emits, as described above with reference to 1 described in detail.

Gemäß 2 weist die Probe 5 jedoch noch einen zweiten Bereich oder Abschnitt 5b auf, welcher von dem ersten Bereich oder Abschnitt 5a durch eine optische Barriere 5c getrennt ist. Die optische Barriere 5c bewirkt, dass keine Strahlung aus dem einen Bereich 5a der Probe 5 in den anderen Bereich 5b der Probe 5 gelangt, und umgekehrt. Die Vorrichtung 1' ist dazu ausgebildet, dass die dritte Strahlung S3 nach Passieren des Strahlteilers 4 anteilig auf den Bereich 5b der Probe 5 gelenkt wird, wobei es sich um einen Referenzbereich handelt.According to 2 has the sample 5 but still a second area or section 5b on which of the first area or section 5a through an optical barrier 5c is disconnected. The optical barrier 5c causes no radiation from one area 5a the sample 5 in the other area 5b the sample 5 arrives, and vice versa. The device 1' is designed so that the third radiation S3 after passing through the beam splitter 4 proportionate to the area 5b the sample 5 is directed, which is a reference area.

In diesem Bereich 5b umfasst die Probe 5 ein Referenzmaterial oder Referenzobjekt, dessen Fluoreszenzstrahlung S3' nicht von einer Konzentration des zu bestimmenden Stoffs sondern im Wesentlichen nur von einer Temperatur der Probe 5 abhängt. Vorzugsweise ist der Bereich 5b der Probe 5 deshalb in Rubin ausgebildet oder umfasst zumindest ein entsprechendes bzw. vergleichbares Material.In this area 5b includes the sample 5 a reference material or reference object whose fluorescence radiation S3 'does not depend on a concentration of the substance to be determined but essentially only on a temperature of the sample 5 depends. Preferably, the area 5b the sample 5 therefore formed in ruby or comprises at least one corresponding or comparable material.

Gemäß der Ausgestaltung in 2 gelangen demnach vom Strahlteiler 4 folgende Strahlungsanteile über das Filterelement 8 zum Detektor 6: ein Teil der unveränderten ersten Strahlung S1, ein Teil der unveränderten zweiten Strahlung (Referenzstrahlung) S2, die vom Bereich 5a der Probe 5 ausgesandte Fluoreszenzstrahlung S1', ein Teil der unverfälschten dritten Strahlung S3 sowie die von dem Bereich 5b der Probe 5 ausgesandte Fluoreszenzstrahlung S3'. Die Auswerteelektronik 11 kann dann wiederum die Konzentration des zu bestimmenden Stoffs an der Probe 5 (Bereich 5a) ermitteln, wobei zusätzlich anhand der von dem Bereich 5b ausgesandten Fluoreszenzstrahlung S3' die Temperatur der Probe 5 über eine Phasenverschiebung beispielsweise gegenüber dem Referenzsignal S3 bestimmbar ist, so dass sich Temperatureinflüsse bei der Konzentrationsbestimmung eliminieren bzw. zumindest berücksichtigen lassen.According to the embodiment in 2 thus arrive from the beam splitter 4 following radiation components over the filter element 8th to the detector 6 : a part of the unchanged first radiation S1, a part of the unchanged second radiation (reference radiation) S2 coming from the area 5a the sample 5 emitted fluorescence radiation S1 ', a portion of the unadulterated third radiation S3 and that of the area 5b the sample 5 emitted fluorescence radiation S3 '. The evaluation electronics 11 can then turn the concentration of the substance to be determined on the sample 5 (Area 5a ), in addition to that of the area 5b emitted fluorescence radiation S3 'the temperature of the sample 5 can be determined via a phase shift, for example, with respect to the reference signal S3, so that can eliminate or at least take into account temperature effects in the concentration determination.

Wie der Fachmann weiß, sind zu diesem Zweck die Sendefrequenzen (Modulationsfrequenzen) der Strahlungsquellen 2, 12, 22 mit dem Lock-In-Verstärker 10 synchronisiertAs the person skilled in the art knows, the transmission frequencies (modulation frequencies) of the radiation sources are for this purpose 2 . 12 . 22 with the lock-in amplifier 10 synchronized

Das Filterelement 8 ist wiederum als einfaches Glasfilter ausgebildet und dient dazu, im Wesentlichen nur die relativ zu den Strahlungen S1, S2 und S3 relativ schwachen Fluoreszenzstrahlungen S1', S3' von der Probe 5 in Richtung Detektor 6 durchzulassen, Für die im Vergleich zu den Fluoreszenzstrahlungen S1' und S3' relativ starken Referenzstrahlungsanteile S1, S2 und S3 ist das Filterelement 8 also im Wesentlichen undurchlässig ausgebildet und verhindert deren übermäßiges Auftreffen auf den Detektor 6.The filter element 8th is in turn formed as a simple glass filter and serves to substantially only relative to the radiation S1, S2 and S3 relatively weak fluorescence radiation S1 ', S3' of the sample 5 towards the detector 6 For the comparatively strong reference radiation components S1, S2 and S3 compared to the fluorescence radiation S1 'and S3' is the filter element 8th thus formed substantially impermeable and prevents their excessive impact on the detector 6 ,

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

"The Measurement and Analysis of Heterogeneous Emission by Multifrequency Phase and Modulation Fluorometry" by Jameson et al., Applied Spectroscopy Reviews 20 (1), 55-106 (1984) [0003]
"Principles of Fluorescence Spectroscopy", 3rd Edition, Springer (2006) [0003]
Jameson et al. [0004]
Jameson et al. [0010]

Claims

Contraption ( 1 . 1' ) for determining a substance concentration, preferably oxygen concentration, by means of fluorescence spectroscopy, comprising: at least one first radiation source ( 2 ) configured to emit at least a first electromagnetic radiation (S1), preferably in the visible region of the spectrum; At least one first modulation device ( 3 ) for modulating the intensity of the first radiation having at least a first (f1) and a second modulation frequency (f2), which are different; - at least one sample ( 5 ) which is arranged in the beam path of the first radiation, which sample is designed to emit a fluorescence radiation (S1) dependent on the concentration of the substance to be determined; A detector ( 6 ), which is designed to detect the first radiation and arranged in the beam path of the first radiation; At least one beam splitter ( 4 ), which is designed and arranged, a first part of the first radiation (S1) to the sample ( 5 ) and a second part of the first radiation on the detector ( 6 ) to steer; - an evaluation electronics ( 11 ), which are in signal communication with the detector ( 6 ) and which is adapted to receive one of the sample ( 5 ) and evaluated by means of the detector fluorescence radiation for the first (f1) and the second modulation frequency (f2) with respect to their phase position relative to a respective first reference phase position, which first reference phase position of a known substance concentration in the sample ( 5 ), preferably a lack of the substance in the sample in order to determine the substance concentration in the sample, characterized by - at least one second radiation source ( 12 ), which is designed to emit at least one second electromagnetic radiation (S2), preferably in the visible region of the spectrum, which second radiation source is arranged such that the second radiation reaches the detector ( 6 ) without interaction with the sample ( 5 ) reached; At least one second modulation device ( 13 ) configured to modulate the intensity of the second radiation (S2) with at least one third modulation frequency (f3) different from the first modulation frequency (f1) and the second modulation frequency (f2); the detector ( 6 ) is designed for detecting the second radiation (S2) and wherein the evaluation electronics ( 11 ) is designed to evaluate the second radiation detected by the detector with regard to its phase position relative to a second reference phase position in order to determine the substance concentration in the sample ( 5 ) regardless of changes in state, in particular temperature-related state changes, the evaluation ( 11 ).

Contraption ( 1 . 1' ) according to claim 1, characterized in that the first radiation source ( 2 ) and / or the second radiation source ( 12 ) is formed as a luminescence diode, LED, preferably with a radiation wavelength of about 505 nm for the first radiation source ( 2 ) and about 680 nm for the second radiation source ( 12 ).

Contraption ( 1 . 1' ) according to claim 1 or 2, characterized in that the beam splitter ( 4 ) is designed as a dichroic mirror.

Contraption ( 1 . 1' ) according to at least one of claims 1 to 3, characterized in that the evaluation electronics ( 11 ) is designed as a Field Programmable Gate Array, FPGA.

Contraption ( 1' ) according to at least one of claims 1 to 4, characterized in that the first modulation device ( 3 ) is adapted to modulate the intensity of the first radiation (S1) with a fourth modulation frequency, which fourth modulation frequency (f4) is different from the first, second and third modulation frequency, or that at least one third radiation source (S2) is provided, which is designed to emit at least one third electromagnetic radiation (S3), preferably in the visible region of the spectrum, and which interacts with a third modulation device ( 23 ) which is adapted to modulate the intensity of the third radiation (S3) at a fourth modulation frequency (f4), which fourth modulation frequency (f4) is different from the first (f1), second (f2) and third (f3) modulation frequencies is; where the sample ( 5 ) a reference object ( 5b ), preferably ruby, comprises which reference object ( 5a ) shows essentially no change in its fluorescence behavior as a function of the substance concentration, but shows a change in its fluorescence behavior as a function of the temperature, and wherein the evaluation electronics ( 11 ) is adapted to that of the detector ( 6 ) detected fluorescence radiation (S1 ', S3') with the fourth modulation frequency in terms of their phase position relative to a third reference phase position to evaluate in addition to determine a temperature of the sample.

Contraption ( 1 . 1' ) according to at least one of claims 1 to 5, characterized in that between the beam splitter ( 4 ) and the sample ( 5 ) at least one light guide ( 7 . 7 ' ) is arranged for the first radiation (S1) and / or the third radiation (S3) and / or the fluorescence radiation (S1 ', S3').

Contraption ( 1 . 1' ) according to at least one of claims 1 to 6, characterized in that the evaluation electronics ( 11 ) Amplifier and filter means ( 9 ) and / or at least one lock-in amplifier ( 10 ).

Contraption ( 1 . 1' ) according to at least one of claims 1 to 7, characterized in that at least the first radiation source ( 2 ), the second radiation source ( 12 ), the beam splitter ( 4 ) and the detector ( 6 ) and preferably the third radiation source ( 22 ) according to claim 5 and / or at least a portion of the light guide ( 7 . 7 ' ) according to claim 6 in an integrated arrangement with a substantially opaque housing ( 14 ) in and / or on the housing ( 14 ) are arranged.

Contraption ( 1 . 1' ) according to at least one of claims 1 to 8, characterized in that in front of the detector ( 6 ) at least one optical filter element ( 8th ), preferably a simple glass filter.

Contraption ( 1 . 1' ) according to at least one of claims 1 to 9, characterized in that at least the second radiation source ( 12 ), the sample ( 5 ), the detector ( 6 ) and possibly the filter element ( 8th ) according to claim 9 on a common side of the beam splitter ( 4 ) are arranged, preferably within the housing ( 14 ) according to claim 8.

Contraption ( 1 . 1' ) according to at least one of claims 1 to 10, characterized in that a single common photodetector ( 6 ) including evaluation electronics ( 11 ) is designed and arranged to emit electromagnetic radiation from at least two radiation sources ( 2 . 12 ) at at least three different modulation frequencies (f1-f3) to receive and in particular disturbing influences of the evaluation ( 11 ), preferably temperature-dependent disturbing influences, to compensate.