DE202004020847U1

DE202004020847U1 - Screeningsystem

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Publication number: DE202004020847U1
Application number: DE202004020847U
Authority: DE
Original assignee: Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Current assignee: Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Priority date: 2004-12-04
Filing date: 2004-12-04
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2014-12-05

Abstract

Screeningsystem für Wirkstoffe, umfassend eine Mikrotiterplatte (1) mit einer Vielzahl von Wells (8) mit je einem Testfluid sowie einen formschlüssig auf diesen aufsetzbaren Deckel (2) mit einer Vielzahl von Erhebungen mit jeweils einer Testsubstanz, wobei die Erhebungen durch separat einsetzbare Komponenten (3) gebildet werden und Überwachungseinheiten zur online-Überwachung eines Screeningversuchs vorgesehen sind.

Description

Die Neuerung betrifft ein Screeningsystem gemäß des ersten Schutzanspruchs.
Screeningsyteme der eingangs genannten Art dienen dem systematischen Austesten von chemischen oder biochemischen Substanzen wie Wirkstoffen auf eine Vielzahl von anderen Substanzen oder Umgebungsbedingungen, z.B. für den Einsatz als Reinigungsmittel im Haushalt. Ziel dieser Untersuchungen ist beispielsweise eine Vorauswahl von geeigneten Substanzen hinsichtlich ihrer Wirkung auf Keime. Andere Bereiche liegen bei medizinischen Anwendungen, beispielsweise in der Diagnostik.
Oft werden Screeningversuche im Labor einzeln in Petrischalen oder in einfachen Substratplatten mit einzelnen wenigen (z.B. vier bis acht petrischalenähnlichen) Vertiefungen durchgeführt, in denen eine Probe mit einer Testsubstanz ausgesetzt wird. Auch Versuche zur Aufzucht von Keimen auf den Materialproben erfolgt in vergleichbaren Behältnissen.
Alternativ kommen im Rahmen von Screeningsystemen so genannte Mikrotiterplatten (MTP) zum Einsatz, meist als Einwegartikel. Sie umfassen eine chemisch und biologisch inerte Substratplatte, meist aus Kunststoff, über dessen Substratfläche eine Vielzahl gleichartiger Vertiefungen, so genannter Wells, verteilt ist. Die Vertiefungen dienen als Containment für je eine Probe einer zu untersuchenden Substanz, welche dann mit der Mikrotiterplatte gemeinsam einer bestimmten Behandlung zugeführt werden. Die Probenvolumina einer Einzelprobe liegen dabei meist im Mikro- oder Nanoliterbereich, d.h. in einem mikrotechnischen Bereich. Für bestimmte Untersuchungen können die Wells durch Fluidkanäle untereinander verbunden sein und sind damit parallel oder seriell durch ein Fluid durchströmbar.
Die vorgenannten Mikrotiterplatten sind als Standardprodukte im Medizin- oder Biobereich bekannt und von verschiedenen Herstel lern kommerziell erhältlich. Typische Anwendungsfelder für Mikrotiterplatten finden sich in der Mikrobiologie, Immunologie, Hämatologie oder der DNA-Analyse.
In der US 6.599.696 B2 wird ein Screeningsystem offenbart, bei dem eine Substratplatte ähnlich einer Mikrotiterplatte mit mehreren Wells formschlüssig durch ein Deckel abdeckbar ist. Auf der Deckelunterseite befinden sich Erhebungen, die bei aufgesetztem Deckel in die Wells hineinragen. Die Erhebungen können mit verschiedenen Beschichtungen als Testsubstanz versehen werden. Auf den Erhebungen wird zunächst ein Biofilm gezüchtet, der anschließend nach Aufsetzen des Deckels den Wirkstoffen in den Wells ausgesetzt wird.
Die US 6.596.505 B2 offenbart ein vergleichbares System zur Untersuchung von biologischen Beschichtungen.
Die Erhebungen sind jedoch nicht auswechselbar und aus dem Material des Deckels. Insofern eignet sich ein derartiges Screeningsystem praktisch ausschließlich für eine Beschichtungszusammensetzung, die simultan in alle Wells hineinragt. Eine simultane Untersuchung von beispielsweise verschiedenen Testsubstanzen in verschiedenen Testfluiden ist, wenn überhaupt, nur mit einem erheblichen Aufwand oder einer hohen Kontaminationsgefahr bei den Teststoffen untereinander möglich.
Es ist daher Aufgabe der Neuerung, ein universell einsetzbares Screeningsystem vorzuschlagen, welches sich auch für ein einfach durchzuführendes simultanes Testen verschiedener Testsubstanzen in verschiedenen Testfluiden eignet.
Die Aufgabe wird durch ein Screeningsystem mit den Merkmalen des ersten Schutzanspruchs gelöst. Die Unteransprüche geben vorteilhafte Ausgestaltungen des Screeningsystems wieder.
Das Screeningsystem umfasst eine Mikrotiterplatte, alternativ auch eine Substratplatte mit mehreren Wells, sowie einen De ckel, der auf die Mikrotiterplatte oder Substratplatte aufsetzbar ist. Beim Aufsetzen des Deckels auf die Mikrotiterplatte erfolgt eine formschlüssige Verbindung, die scherende Bewegungen der vorgenannten Komponenten zueinander verhindert. Auf der Deckelunterseite befinden sich Erhebungen, die bei aufgesetztem Deckel in die Wells hineinragen. Vorzugsweise ragt dabei nur eine Erhebung in den Well hinein, und zwar bevorzugt in der Weise, dass der Abstand zwischen Erhebung und substratseitigen Wandung des Wells einen Mindestabstand nicht unterschreitet. Dabei bietet es sich an, die Erhebung mittig (konzentrisch) im Well zu positionieren.
Wesentlich ist jedoch auch, dass die Erhebungen nicht Bestandteil des Deckels sind, sondern als separate Komponenten in diesen einsetzbar sind. Die Erhebungen werden dabei jeweils durch eine Extremität der Komponenten, vorzugsweise die Pinspitze eines Pins gebildet. Die Komponenten werden entweder in deckelseitige Sackbohrungen in die Deckelunterseite oder in durchgehende Bohrungen im Deckel in diesen eingesetzt, wobei diese durch den Deckel formschlüssig axial und lateral im Well positioniert sind. Die Fixierung der Komponenten, vorzugsweise der Pins, oder die Aufnahme oder Adaption von zusätzlichen Überwachungseinheiten kann anstelle des Deckels auch durch eine zusätzliche Halterung als separates Bauteil auf dem Deckel übernommen werden.
Vorzugsweise sind die Komponenten (Pins) in der vorgenannten separaten Halterung eingesetzt, wobei die Extremitäten (Pinspitzen) durch Durchbrüche im Deckel in die Wells hineinragen. Die Durchbrüche im Deckel dienen dabei der Führung nicht nur der Komponenten sondern auch der Halterung auf dem Deckel und damit zu den Wells der Mikrotiterplatte. Dies bietet sich besonders dann an, wenn das Screeningsystem mit zusätzlichen Überwachungseinheiten wie optischen oder elektrischen System (z.B. Mikroskop, Kamerasysteme, Potentialmesssystem etc.) oder anderen Analysen- oder Messwerterfassungseinheiten für eine online-Überwachung während des Versuchs, beispielsweise mit Tei len im Pin, ausgestattet werden soll. Diese werden dann bevorzugt über die Halterung oder am Deckel an das Screeningsystem angedockt.
Grundsätzlich bietet es sich, wenn auch nicht zwingend, an, den Deckel als sterile Einwegkomponente aus dem selbem Material wie die Mikrotiterplatte herzustellen. Dies kompensiert auch thermische Ausdehungen zwischen diesen Komponenten. Eine separate Halterung der vorgenannten Art ist je nach Einsatz bevorzugt auch als sterilierbare Mehrwegkomponente zu konzipieren.
Weiterhin weist sich die Neuerung durch weitere bevorzugte Ausgestaltungsmöglichkeiten und/oder Vorteile aus:
Die Komponenten, insbesondere die Pins können auch beim simultanen Einsatz in einem Screeningversuch in einem Screeningsystem aus unterschiedlichen Materialien (z.B. Thermoplaste, Metalle, Keramik, Gummi etc.) bestehen, und zwar in kompakter, strukturierter oder auch poröser Form einerseits und als Materialverbund mit zwei oder mehreren Materialfraktionen andererseits. Außerdem können die Komponenten, insbesondere die vorgenannten Extremitäten oder andere Bereiche desselben, grundsätzlich auch unterschiedliche Geometrien (z.B. kreisförmiger oder polygoner Voll- oder Hohlquerschnitt, Spitze zur Aufnahme von Materialproben, Spitze zum Einklipsen von Mikrosystemen etc.) sowie je nach Art des Screeningversuchs unterschiedliche, auch optisch wirkende wie spiegelnde Oberflächenstrukturen (z.B. Nanostrukturen für „Lotuseffekt" etc.) oder Beschichtungen aufweisen.
Bei der Neuerung kann auf kommerziell erhältliche Standardmikrotiterplatten zurückgegriffen werden, die grundsätzlich nicht zu modifizieren sind, an deren Geometrie aber der Deckel angepasst werden muss.
Deckel und Pins sind voneinander trennbar und für eine Wiederverwendung separat reinigbar und bedarfsweise sterilierbar.
Das Screeningsystem eignet sich besonders auch für mehrstufige Screeningversuche, wobei zischen den Schritten der Deckel mit den Komponenten (Pins) von einer Mikrotiterplatte auf eine andere Mikrototerplatte mit einem anderen Testfuid ausgewechselt werden kann. Beispielsweise kann in einem ersten Schritt in einem ersten Testfuid eine Keimbildung erfolgen, in einem zweiten Schritt ein Aufbau einer Beschichtung in einer Nährflüssigkeit als zweites Testfluid ausgehend von den Keimen erfolgen, um in weiteren Schritt die Wechselwirkung dieser Beschichtung mit einem dritten oder weiteren Testfluid zu überprüfen. Auch Trocknungs- oder Bewetterungsvorgänge in einem Gas, Dampf oder Aerosol als Testfluid, bewegte Testfluide (z.B. Spülungen, Verdünnungsreihen etc.) in einer Mikrotiterplatte mit durchspülbaren Wells oder auch elektrolytische, elektrostatische oder auch elektrophoretische Vorgänge mit Elektroden (separate Elektroden im Well oder die Wellwandung und die Extremitäten als Elektroden) sind wie alle anderen biologischen, chemischen oder physikalischen Wechselwirkungen zwischen einem Testfluid und einer Testsubstanz grundsätzlich als Einzelschritte in der Neuerung mit eingeschlossen. Insofern kann sich auch die Testsubstanz während eines Screeningversuchs ändern oder wechseln, wie beispielsweise von einem Keimbildungssubstrat zu einer Beschichtung der vorgenannten Art oder bei chemischer Veränderung der Testsubstanzoberflächen (wie Korrosion, Passivierung, Elementeinlagerungen etc.).
Ferner seien weitere Vorteile der Neuerung genannt, die die Durchführung von Screeningversuchen mit der Neuerung, insbesondere die Reihenfolge der Versuchsdurchführung betreffen:
Die vorgenannten Komponenten (Pins), insbesondere deren Extremitäten (Pinspitzen) lassen sich vor dem Einsetzen in den Deckel individuell mit Wirkstoffen oder anderen Substanzen physikalisch (z.B. Bestrahlung) und/oder chemisch behandeln oder imprägnieren, bevor sie dem eigentlichen Screeningversuch oder der Anzucht von Keimen in einem mit Nährflüssigkeit gefüllten Well zugeführt werden.
Im Screeningsystem wird das Testfluid oder das Medium, in dem die Keime angezüchtet werden, üblicherweise nicht bewegt. Somit kann der Flüssigkeitsstand in den Wells definiert eingestellt werden. Eine Verdunstung kann insbesondere bei nicht ausgasenden Reaktionen von Testsubstanz und Testfluid durch eine entsprechende Gestaltung des Deckels als dichtende Abdeckung weitgehend unterdrückt werden. Damit ist – über die Eintauchtiefe der Extremitäten, vorzugsweise der Pinspitzen – auch die Größe der mit Keimen bewachsenen Oberfläche an den Pins festgelegt. Unter Keimen sind alle eukaryotischen oder prokaryotische Organismen, Viren oder Prionen in natürlicher oder gentechnisch veränderter Form einzeln oder in Kombination zu verstehen. Das erlaubt eine Bestimmung der Keimzahl pro Fläche als Maß für die Wirksamkeit einer getesteten Substanz sowie die Ermittlung von Dosis-Wirkungs-Kurven, wie z.B. LD50 Dosis, bei der 50% der Keime eines Kollektivs getötet werden oder die ED50 Dosis (effektive Dosis für 50° Wirkung).
Die Neuerung eignet sich insbesondere für ein Wirkstoffscreening. Dabei ist eine schnelle Aussage darüber zu treffen, ob und in welcher Weise ein Wirkstoff (z.B. im Testfluid) auf eine bestimmte Oberfläche (z.B. Testsubstanz, d.h. Beschichtung oder Pinmaterial) wirkt, beispielsweise hinsichtlich qualitativer und quantitativer Beschreibung der eingesetzten Wirkstoffe hinsichtlich Wirkungsqualität, Wirkungsart, Wirkungsstärke (Ausmaß der Abweichung vom Ausgangszustand) und/oder Wirkungsdauer (Zeit zwischen Beginn und Ende einer Wirkung, sowie der eingesetzten Pinmaterialien (Testsubstanzen) oder modifizierter Testoberflächen (Pinoberflächen) hinsichtlich Biokompatibilität, Material- bzw. Oberflächenwiderstandskraft gegenüber Testfluiden bzw. Testkeimen. Auch eignet sich das System zur Selektion von Keimen, vorliegend in ihrer natürlichen Form oder gentechnisch verändert, und selektive Medien und/oder Pinmaterialien und/oder Pinoberflächen. Das Screeningsystem dient dann beispielsweise dazu, viele verschiedene Wirkstoff-Testsubstanz-Paarungen in einem Screeningsystem simultan, d.h. bei einer Um gebungsbedingung zu testen (z.B. Austestung von Verdünnungsreihen).
Die Neuerung und einzelne Details dieser werden beispielhaft, d.h. nicht auf konkrete Zusammenhänge beschränkend anhand von Ausführungsbeispielen mit den folgenden Figuren näher erläutert. Es zeigen
1 eine Schnittdarstellung einer Mikrotiterplatte sowie eines formschlüssig auf diese aufsetzbaren Deckels,
2 eine Ausführungsform eines Pins,
3 eine Schnittdarstellung einer Pinspitze mit eingesetzter Materialprobe für optische Untersuchung sowie
4a bis c Detailschnittdarstellungen je eines Deckelabschnitts mit mehreren Pins.
Ein Screeningsystem gemäß der Neuerung, dargestellt in 1, umfasst neben einer Mikrotiterplatte 1 (z.B. Standardprodukt mit 96 Wells) den vorgenannten Deckel 2 sowie eine Vielzahl von in den Deckel eingesetzte und einzeln entnehmbare Pins 3. Die Pinspitzen 4 ragen aus der Deckelunterseite 5 hinaus. Der Deckel 2 lässt sich formschlüssig auf die Mikrotiterplatte 1 aufsetzen, wobei die Deckelunterseite direkt auf der Mikrotiterplatte aufliegt und über formschlüssige Führungsränder 6 und 7 auf dieser gegen laterale Scherbewegungen gesichert wird.
Die Pins sind im aufgesetzten Deckel so positioniert, dass die Pinspitzen 4 mittig in den Wells 8 der Miktrotiterplatte hineinragen. Dabei wird ein Mindestabstand, vorzugsweise auch ein maximaler Abstand, der Pinspitzenoberflächen zu den Wandungen der Wells sichergestellt. Dadurch wird in vorteilhafter Weise sichergestellt, dass sich eine auf der Pinspitzenoberfläche ein vorzugsweise biologisches oder chemisches Reaktionsprodukt aus dem Testfluid (im Well) und der Testsubstanz, vorzugsweise das Pinmaterial oder eine Beschichtung auf der Pinspitze, als neue Schicht auf der Pinspitze aufbauen kann. Besonders werden durch diese geometrischen Rahmenbedingungen die Möglichkeit mehrstufiger Screeningversuche erweitert. Beispielsweise können Keime auf einer Testsubstanz, die sich in einem ersten Testfluid bilden, in einer zweiten Stufe in einer Nährflüssigkeit weiter zu einer Beschichtung gezüchtet und/oder selektiert werden. Dabei muss lediglich ein Austausch der Mikrotiterplatte unter dem Deckel erfolgen, d.h. ein Austausch der Wells mit dem ersten Testfluid durch Wells mit der Nährflüssigkeit. Es bietet sich an, den genannten Abstand an jedem Punkt der Pinspitzenwandung konstant zu konzipieren, was in besonders vorteilhafter Weise auch bei fortgeschrittener Dicke der gezüchteten Beschichtung eine ausreichenden Zugang der Nährflüssigkeit über die gesamte Beschichtungsfläche sicherstellt.
Eine Ausführungsform der vorgenannten Komponente zeigt 2 in der Form eines Pins 3. Die Komponente der dargestellten Ausführungsform ist einstückig und besteht aus einem Pinschaft 9 und der vorgenannten Pinspitze 4 (Extremität). Der Pinschaft dient der Führung des Pins im Deckel, während die Pinspitze als wiederverwertbare Biofilm- bzw. Keimträger (Testsubstanz) oder als Testsubstanz selbst dient. Der dargestellte Pin ist rotationssymmetrisch und ragt während eines Screeningschritts konzentrisch in einen Well hinein.
Pins (bzw. die vorgenannten Komponenten allgemein) aus einem optisch transparenten Material wie Glas oder Plexiglas (komplett oder Teile der Pins) ermöglichen optische Untersuchungen oder Kontrollen der bekannten Art (Reflexionsmessungen, Färbungen, Fluoreszenzmessungen etc.) einer vorgenannten Beschichtung noch während des Screeningversuchs. Auch Untersuchungen mittels Mikroskop oder Kamera durch den Pinschaft zur Pinspitze hin bieten sich hierbei an, wobei das hierfür benötigte Licht durch die Miktrotiterplatte oder ebenfalls durch den Pinschaft eingeleitet werden kann. Auch lässt sich ein mögliches Eindringen des Testfluids oder Teile bzw. Wirkstoffe desselben in ein transparentes Pinspitzenmaterial optisch und über den gesamten Screeningversuch hinweg on-line beobachten. Es versteht sich von selbst, dass die Pinflächen, die als Anschlussfläche zu einem optischen System mit erhöhter Auflösung (Mikroskop, Kamera etc.) oder für Spiegelungen herangezogen werden, eine geringe Oberflächenrauhigkeit in optischer Qualität (Rauhigkeit bzw. absolute Strukturhöhen z.B. < 20nm) aufweisen, d.h. vorzugsweise poliert sind.
Darüber hinaus können die vorgenannten Komponenten wie die Pins so gestaltet sein, dass sie ein oder mehrere optische, fluidische, elektrische und/oder sonstige Mikrosysteme zur integrierten Analytik aufnehmen können bzw. enthalten (Analytik in der Komponente oder im Pin). Insbesondere können integrierte Licht- oder Bildleiter im Pin Analytik in an den Pin angeschlossenen Spektrometern oder sonstigen Geräten ermöglichen (Analytik außerhalb der Mikrotiterplatte). Darüber hinaus können die Pins so gestaltet sein, dass sie sowohl Materialproben an ihrer Spitze als auch Mikrosysteme zur Analytik aufnehmen bzw. enthalten können (Analytik im Pin). Insbesondere können integrierte Licht- oder Bildleiter im Pin Analytik in an den Pin angeschlossenen Spektrometern oder sonstigen Geräten ermöglichen (Analytik außerhalb der Mikrotiterplatte), ggf. in Beziehung zu den am Pin befindlichen Materialproben. Nur im einfachsten Fall stellt der gesamte Pin den vorgenannten Lichtleiter dar.
3 zeigt beispielhaft den Querschnitt einer Pinspitze, umfassend einen röhrenförmigen Lichtleiter 13 sowie einer distalseitig eingesetzten Probe 14 als Testsubstanz. Das distale Ende 15 des Lichtleiters ist vorzugsweise so geformt, dass ein durch den Lichtleiter 13 geleiteter Lichtstrahl 16 durch Spiegelung auf die Probe 14 umgeleitet wird. Die Probe lässt sich dann über die vorgenannten optischen Systeme proximalseitig durch den röhrenförmigen Lichtleiter beobachten und analysieren (z.B. spektroskopische Streif- oder Durchlichtmessungen). Alternativ lässt sich über einen auf die Probe und von dort mittels einer zweiten Spiegelung umgelenkten und über den Lichtleiter 13 wie der zurückgeführten Lichtstrahl 16 die Dicke einer Beschichtung auf der Probe 14 laufen überwachen (Analogie zur Lichtschranke mit kontinuierlicher Lichtstärkenmessung je nach Abdeckungsgrad).
Pins aus verschiedenen Materialien können in den Deckel als Träger problemlos und ohne einen direkten Kontakt untereinander eingesetzt werden. Der Deckel dient als inerte Trennung zwischen den Pins untereinander und verhindert Wechselwirkungen zwischen unterschiedlichen Pinmaterialien. Weitere Fremdmaterialien wie Klebstoffe oder Dichtmittel sind grundsätzlich nicht erforderlich.
Ein Testfluid kann gleichzeitig an verschiedenen, individuell für jeden Versuch zusammenstellbaren Modelloberflächen als Pinoberflächen (Testsubstanz, Pins aus verschiedenen Materialien, mit verschiedenen Oberflächen oder Geometrien) getestet werden. Dies kann unter identischen Bedingungen in derselben Mikrotiterplatte geschehen, sodass in vorteilhafter Weise keine Handhabung bedingten Versuchsunterschiede zwischen Proben (Testsubstanz, Pinspitze) aus unterschiedlichen Materialien vorliegen.
4a bis c geben beispielhaft verschiedene Möglichkeiten einer Pinpositionierung im Deckel wieder.
4a gibt eine Ausführungsform wieder, bei der eine Vielzahl von Pins von unten vorzugsweise reibschlüssig (alternativ auch magnetisch) in durchgehende oder, wie dargestellt, in Sacköffnungen eingesetzt wird. Diese Ausführungsform ist vor allem bei Screeningvorrichtungen mit vorgenannten Überwachungseinrichtungen von Vorteil. Die Schnittstelle zwischen der Überwachungsvorrichtung und Pin ist dabei vorzugsweise fest im Deckel installiert. Ferner sichert diese Ausführungsform eine absolute Fluiddichtigkeit im Bereich der Pinaufnahmen, was eine Anwendung vor allem bei Screeningversuchen mit Druckunterschieden (z.B. bei Ausgasungen etc.) begünstigt. In der dargestellten Form ist eine separate Dichtung zwischen den Pins und damit den Wells nicht vorgesehen. Die Pinschäfte 9 können jedoch grundsätzlich so dimensioniert werden, dass sie die einzelnen Wells der Mikrotiterplatte vollständig abdecken und je nach erforderlicher Dichtwirkung mit oder ohne zusätzliche Dichtung (z.B. über die Pinspitze übergezogener Ringdichtung oder eine auf die Mikrotiterplatte aufgelegte Dichtungsfläche mit Durchbrüchen für die Pinspitzen) die Wells mehr oder weniger gegeneinander isolieren.
4b zeigt dagegen eine Ausführungsform mit einem Deckel mit einer Vielzahl von Durchbrüchen zum formschlüssigen Einsetzen der Pins. Die Pins werden von der Deckeloberseite 9 mit der Pinspitze 4 zuerst in die Durchbrüche eingesetzt und über den Pinschaft geführt und vorzugsweise reibschlüssig und vorzugsweise dichtend gehalten. Bevorzugt weisen die Durchbrüche je einen axialen Anschlag für den gegenüber die Pinspitze 4 breiteren Pinschaft 9 auf, während die Pinspitzen ohne Berührung mit dem Deckelmaterial aus der Deckelunterseite hervorstehen. Eine dichtende Separierung der Wells untereinander erfolgt, sofern erforderlich, beispielsweise durch planes Aufliegen des Deckels auf der Mikrotierplatte oder, wie in der vorgenannten Ausführungsform beschrieben, mit einer separaten Dichtungsfläche mit Durchbrüchen für die Pinspitzen.
4c gibt dagegen eine Ausführungsform wieder, bei der die Pins durch eine vorgenannte separate Halterung 12 gehalten werden, wobei die Pinspitzen 4 durch Durchbrüche im Deckel 2 durch diesen hindurchragen und Pins und damit die Halterung auf dem Deckel und damit auf den Wells der Miktrotiterplatte führen. Es bietet sich an, den Deckel als Dichtungsfläche und/oder im Sinne des vorgenannten axialen Anschlags für den Pinschaft zu konzipieren.
In Rahmen der zuletzt genannten Ausführungsform wurde ein Deckel für eine Standardmikrotiterplatte mit 96 Wells durch Einbringen von Bohrungen und Aufsetzten einer Halterung (vgl. 4c) dergestalt modifiziert, dass durch den modifizierten Deckel hindurch in jedes Well der Mikrotiterplatte ein Stift (Pin, siehe Anhang, hineinragt. Alle 96 Pins sind einzeln entnehmbar und können nach Abschluss von Tests ggf. gereinigt, sterilisiert und wieder neu eingesetzt werden.
Um mit der Neuerung, vorzugsweise mit den genannten Ausführungsformen, Substanzen in ihrer Wirkung auf Keime auszutesten, werden die Wells einer Mikrotiterplatte mit den betreffenden Testfluiden (z.B. Wirkstoffe) gefüllt. Abweichend vom üblichen Verfahren können auch Verdünnungsreihen dieser Substanzen angelegt werden. Der Deckel mit eingesetzten Pins wird aufgesetzt. Dabei ragen alle Pins in jeweils ein Well hinein, d.h. die Substanzen können auf die eingetauchten Spitzen der Pins einwirken. Nach einer definierten Einwirkdauer wird der Deckel mitsamt Pins abgenommen. Gegebenenfalls wird der Deckel nun zum Spülen auf eine neue mit Spülflüssigkeit gefüllte Mikrotiterplatte aufgesetzt und nach dem Spülen wieder abgenommen. Auf eine wiederum neue, diesmal mit Keimkulturen beimpfte, Mikrotiterplatte aufgesetzt, werden an den Pins Keime angezüchtet (festgelegte Bedingungen, festgelegte Dauer). Die Pins können schließlich einzeln entnommen und auf die Menge der angewachsenen Keime untersucht werden. Die Menge der Keime am Pin erlaubt eine Aussage über die Wirksamkeit der Substanz, der der Pin ausgesetzt war.
Grundsätzlich sind die Pins so geformt, dass sie in der auf den Deckel aufgesetzten Halterung geführt werden. Diese Führung gewährleistet, dass die Pins beim Einsetzen oder Entnehmen mit ihrem vorderen Ende keine Bereiche des durchbohrten Deckels oder der aufgesetzten Halterung berühren. Die Führung stellt auch sicher, dass jeder Pin jeweils in das Zentrum eines Wells hineinragt, und zwar nach allen Seiten hin mit gleichem Abstand zur Wandung des jeweiligen Wells (konzentrische Anordnung der Pinspitze im Well). Ein Absatz der vorgenannten Art zwischen Pinspitze und Pinschaft am Pin stellt sicher, dass der gleiche Abstand auch zum Boden des Wells eingehalten wird, da der Pin mit diesem Absatz auf der ursprünglichen Oberfläche des Deckels aufsitzt.
Unabhängig vom Material der Mikrotiterplatte, des Deckels sowie der Halterung können die Pins aus beliebigen Materialien hergestellt werden. Dies erlaubt, wie zuvor angeführt, insbesondere Wirkungen verschiedener Stoffe (z.B. Testfluide) auf unterschiedlichen Materialoberflächen (Testsubstanzen) auszutesten.
Bei der Herstellung des Screeningsystems bieten sich die Herstellungsverfahren der Mikrostrukturtechnik an, insbesondere bei mikrostrukturierten Kunststoffbauteilen (insbesondere die Testsubstanzen: Komponenten, insbes. Pins, aber auch des Deckels oder der Halterung). Die Vielfalt der hierbei zur Verfügung stehenden Materialien erlaubt dabei, den spezifischen Anforderungen an die Produkte gerecht zu werden. So nutzt man biokompatible und beschichtbare Kunststoffe für die Diagnostik, sterilisierbare Kunststoffe für medizinische Applikationen sowie transparente Kunststoffe für optische Anwendungen. Die Mikrostrukturprodukte werden dabei mit verschiedenen Verfahren hergestellt, wie z.B. Laser-Mikromaterialbearbeitung (z.B. Excimerlaser-Strukturierung), Rapid Micro Product Development (RMPD) oder Heißprägen. Mikrospritzguß erlaubt den Einsatz von Kunststoffen, deren Biokompatibilität bereits in konventionellen Diagnostika nachgewiesen wurde. Im Gegensatz zum Heißprägen von Kunststoffen gestattet der Mikrospritzguß eine wesentlich wirtschaftlichere Produktion von mikrostrukturierten Einwegartikeln mit großen Stückzahlen.
Mikrospritzguß ist eine Weiterentwicklung der konventionellen Spritzgußtechnologie. Zur Abformung von mikrostrukturierten Produkten wie die Pins oder auch der Deckel wird ein Formeinsatz benötigt, der das Negativ der herzustellenden Struktur trägt. Diese inverse Struktur wird meist durch Mikrostrukturierungsprozesse in Verbindung mit galvanischen Abformungen in Metall hergestellt. Zur Verfügung stehen neben lithographischen Methoden auch die Mikrofunkenerosion, Laserbearbeitung, Ätzver fahren und mikro-mechanische Verfahren. Die Auswahl der verwendeten Methoden zur Formeinsatzherstellung hängt dabei von mehreren Parametern ab: Design der Mikrostrukturen, geometrische Abmessungen, Aspektverhältnisse und Anforderungen an die Oberflächenqualität. Wesentliches Merkmal der Mikrospritzgußtechnik ist, dass diese zeit- und kostenintensiven Mirostrukturierungsverfahren nur einmal, zur Formeinsatzherstellung, eingesetzt werden müssen. Der Mikrospritzguß dient dann zur Serien-Replikation der Mikrostrukturprodukte in Kunststoff.
Beispielhaft wird die Vorgehensweise eines Screeningversuchs wie folgt dargestellt:

1. Sterilisation des Sreeningssystems
2. Einsetzen des mit Pins bestückten Deckels auf eine Mikrotiterplatte mit auszutestenden keimtötenden Substanzen (im Beispiel: Putzmittel) als Testfluide
3. fünfmaliges Spülen mit einer Kochsalzlösung
4. Anzüchten von Keimen (im Beispiel: Staphylococcus aureus) an den Pins in der Miktrotiterplatte, die mit S. aureus geimpftem CASO broth (Nährmedium) befüllt ist (37 °C, über Nacht)
5. Einsetzen des Pin-bestückten Deckels in eine Mikortiterplatte mit den auszutestenden keimtötenden Substanzen
6. dreimaliges Spülen in einer mit einer Kochsalzlösung gefüllten Mikrotiterplatte
7. Einsetzen des Pin-bestückten Deckels in eine Mikrotiterplatte mit ungeimpftem Nährmedium
8. zweimaliges Wiederholen der Punkte (5) – (7) alle 24 h
9. dreimaliges Spülen in einer mit einer Kochsalzlösung gefüllten Mikrotiterplatte
10. Die Pins werden entnommen und einzeln in mit NaCl gefüllte Eppendorf-Cups gegeben. 30 Sek. Ultraschallbad, 5 min. Zentrifugieren, Entnahme der Pins
11. Abzentrifugierte Zellen in den Cups aufmixen, Verdünnungsreihen anlegen, auf Nährbodenplatten ausstreichen, inkubieren, entstandene Kolonien auszählen.

Mit den Versuchen konnten die folgenden Ergebnisse erzielt werden:

– Nachweis der Funktionsfähigkeit des Screeningsystems.
– Das System war durch γ-Strahlung hinreichend sterilisierbar (Beleg durch mitlaufende keimfreie Kontrollproben).
– Auf den Pinoberflächen konnte jeweils ein Biofilm mit ca. 5·10⁷ KBE/cm² gezüchtet werden (KBE bzw. cfu: Keimbildende Einheiten).
– Es ist bekannt, dass sich bei maximaler Zelldichte des verwendeten Keims bei dieser Inkubationsmethode ca. 10⁹ Keime in einem ml Flüssigkeit befinden. Durch Wiegen der Pins wurde festgestellt, dass die anhaftende Flüssigkeitsmenge etwa 1 mg = 1 μl beträgt. Darin können sich also maximal 10⁶ Zellen befinden. Geht man davon aus, dass sich die Zellzahl in der anhaftenden Flüssigkeit beim mehrfachen Abspülen der Pins auf 1/10 der ursprünglichen Menge reduziert, so verbleiben 10⁵ Zellen. Da X·10⁷ Zellen auf einem Pin nachgewiesen werden konnten, sind eventuelle Zellen in flüssigen Anhaftungen für die Messung nicht entscheidend.

1: Mikrotiterplatte
2: Deckel
3: Pin, Komponente
4: Pinspitze, Extremität
5: Deckelunterseite
6: Führungsrand (Deckel)
7: Führungsrand (Mikrotiterplatte)
8: Well
9: Pinschaft
10: Deckeloberseite
11: Anschlag
12: Halterung
13: Lichtleiter
14: Testsubstanz
15: distale Ende
16: Lichtstrahl

Claims

Screeningsystem für Wirkstoffe, umfassend eine Mikrotiterplatte (1) mit einer Vielzahl von Wells (8) mit je einem Testfluid sowie einen formschlüssig auf diesen aufsetzbaren Deckel (2) mit einer Vielzahl von Erhebungen mit jeweils einer Testsubstanz, wobei die Erhebungen durch separat einsetzbare Komponenten (3) gebildet werden und Überwachungseinheiten zur online-Überwachung eines Screeningversuchs vorgesehen sind.
Screeningsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten (3) je eine Extremität (4) aufweisen, die mittig in je einen Well (8) unter Bildung hineinragt, wobei an jeder Stelle zwischen Extremität und Wellwandung ein Mindestabstand sichergestellt ist.
Screeningsystem nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine separate Halterung (12) für die Komponenten (3) vorgesehen ist, welche auf den Deckel (2) aufgesetzt ist, wobei die Extremitäten (4) durch Durchbrüche im Deckel hindurchragen und relativ zu den Wells geführt sind.
Screeningsystem nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten (3) durch den Deckel (2) gehalten und relativ zu den Wells (8) geführt sind.
Screeningsystem nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Deckel (2) eine dichtende Abdeckung der Wells (8) darstellt, wo bei die Wells untereinander isoliert sind.
Screeningsystem nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Testsubstanz durch die Extremität (4) selbst oder durch eine Beschichtung oder eine Probe (14) auf der Extremität gebildet wird.
Screnningsystem nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten (3) einstückig sind.
Screeningsystem nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Überwachungseinheiten auf optischen oder elektrischen Systemen basieren.
Screeningsystem nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein optisch transparentes oder elektrisch leitenden Material zwischen der Überwachungseinheit und der Testsubstanz oder Testfluid vorgesehen ist.
Screeningsystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Material in der Komponente integriert ist.
Screeningsystem nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten durch Pins (3) mit je einer Pinspitze (4) als Extremität gebildet sind.