DE19962395C1 - Poly-3-hydroxybutyrate production, for use as biodegradable polymer in packaging or medicinal applications, by culturing Agrobacterium strain using D- or D,L-carnitine as inexpensive substrate - Google Patents

Poly-3-hydroxybutyrate production, for use as biodegradable polymer in packaging or medicinal applications, by culturing Agrobacterium strain using D- or D,L-carnitine as inexpensive substrate

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Abstract

Preparation of poly-3-hydroxybutyrate (PHB) involves culturing one or more Agrobacterium strain(s) which can utilize D,L- and/or D-carnitine as sole carbon and nitrogen source is new. Independent claims included for the use of Agrobacterium radiobacter wt3 (DSM 13186) for the preparation of PHB by culturing with: (i) D-carnitine in a minimal medium; or (ii) D,L-carnitine.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Poly-3-hydroxybutyrat (PHB).The invention relates to a process for the production of poly-3-hydroxybutyrate (PHB).

Es ist bereits bekannt, PHB herzustellen und anzuwenden. PHB gehört in die struktu­ rell vielseitige Gruppe der Polyhydroxyalkansäuren, die durch mehrere Gattungen gramnegativer und grampositiver Bakterien gebildet werden. PHB wird intrazellulär in Granula angereichert, die durch Membranen umschlossen sind. In diesen Mem­ branen sollen die Enzyme zum Abbau von PHB (PHA-Depolymerasen) lokalisiert sein. Die Granula können elektronenoptisch oder durch Anfärbung mit Sudan Schwarz dargestellt werden. Chemisch handelt es sich um Polyester von Hydroxyal­ kansäuren (PHAs). Die Bezeichnung PHA bezieht sich auf Polymere von 3-Hydroxy­ butyrat, Polymere verwandter Hydroxyalkansäuren wie 3-Hydroxyvaleriansäure, 3- Hydroxyhexansäure, 3-Hydroxyoctansäure, 3-Hydroxydecansäure sowie auch auf Kopolymere und Polymere aus mehr als einer Hydroxyalkansäure.It is already known to manufacture and use PHB. PHB belongs in the structure rell versatile group of polyhydroxyalkanoic acids by several genera Gram-negative and gram-positive bacteria are formed. PHB becomes intracellular enriched in granules enclosed by membranes. In this mem The enzymes for the degradation of PHB (PHA depolymerases) are to be localized his. The granules can be electron optically or by staining with Sudan Are shown in black. Chemically they are polyesters from Hydroxyal kanoic acids (PHAs). The term PHA refers to 3-hydroxy polymers butyrate, polymers of related hydroxyalkanoic acids such as 3-hydroxyvaleric acid, 3- Hydroxyhexanoic acid, 3-hydroxyoctanoic acid, 3-hydroxydecanoic acid as well Copolymers and polymers of more than one hydroxyalkanoic acid.

Das Molekulargewicht der Polyhydroxyalkansäuren beläuft sich auf einen weiten Be­ reich (von ca. 50.000 bis mehrere Millionen). Es ist abhängig vom jeweiligen Mikroor­ ganismus, von den Wachstumsbedingungen der Organismen und von den Extrak­ tionsbedingungen für das Polymer. PHAs werden als Kohlenstoff- und Energiequelle gespeichert, wenn ein Überschuß an Kohlenstoff bei gleichzeitiger Limitation weiterer "Nährstoffe" (Stickstoff, Phosphat, Sauerstoff, Magnesium etc.) vorliegt.The molecular weight of the polyhydroxyalkanoic acids is broad rich (from approximately 50,000 to several million). It depends on the particular microor ganism, the growth conditions of the organisms and the extracts conditions for the polymer. PHAs are used as a source of carbon and energy saved when an excess of carbon while limiting further "Nutrients" (nitrogen, phosphate, oxygen, magnesium etc.) is present.

Es sind vier unterschiedliche Stoffwechselwege für die Synthese von PHB bekannt, wobei Acetyl-CoA und 3-Hydroxyacyl-CoA als Zwischenprodukte ursächlich genutzt werden. Bei Rhodospirillum rubrum und bei Agrobacterium wird durch die b-Ketothio­ lase Acetoacetyl-CoA gebildet, welches danach NADH-abhängig zu L(+)- Hydroxybutyryl-CoA reduziert wird. L-(+)-Hydroxybutyryl-CoA wird dann durch 2 Crotonyl-CoA-Hydratasen zu D-(-)-Hydroxybutyryl-CoA umgewandelt. Danach erfolgt die Polymerisation durch die PHA-Synthase. Four different metabolic pathways are known for the synthesis of PHB, where acetyl-CoA and 3-hydroxyacyl-CoA are used as intermediates become. In Rhodospirillum rubrum and Agrobacterium the b-Ketothio lase acetoacetyl-CoA, which is then NADH-dependent to L (+) - Hydroxybutyryl-CoA is reduced. L - (+) - Hydroxybutyryl-CoA is then replaced by 2 Crotonyl-CoA hydratases converted to D - (-) - hydroxybutyryl-CoA. After that is done the polymerization by the PHA synthase.  

Polyhydroxyalkansäuren werden mikrobiologisch synthetisiert und sind biologisch abbaubar insbesondere durch Mikroorganismen des Bodens. PHA ist thermoplas­ tisch und schmilzt bei ca. 180°C. Dadurch ist es gut verformbar und kann in etablier­ ten Herstellungsverfahren für Plasteartikel eingesetzt werden (Ersatz für Polyethylen mit einem ähnlichen Schmelzpunkt bei 190°C). Dadurch ist ein solches Polymer für Verpackungen geeignet, die im landwirtschaftlichen Bereich keine Entsorgung erfor­ dert. Solche Polymere, die biologisch verträglich und abbaubar sind können in vielen Bereichen Anwendung finden. Dies bezieht sich auch auf medizinische Aspekte (Gelenk- und Gefäßprothesen). Abbauprodukte aus Poly-3-hydroxybutyrat ist 3-Hyd­ roxybutyrat als natürlicher Metabolit des Zellstoffwechsels auch beim Menschen. Durch den sehr verzögerten Abbau von PHB ergibt sich eine besondere Eignung in der medizinischen Anwendung.Polyhydroxyalkanoic acids are microbiologically synthesized and are biological degradable especially by soil microorganisms. PHA is thermoplastic table and melts at approx. 180 ° C. As a result, it is easily deformable and can be established in Manufacturing processes for plastic articles are used (replacement for polyethylene with a similar melting point at 190 ° C). This makes such a polymer for Suitable packaging that does not require disposal in the agricultural sector different. Such polymers that are biologically compatible and degradable can be used in many Areas. This also applies to medical aspects (Joint and vascular prostheses). Degradation products from poly-3-hydroxybutyrate is 3-hyd roxybutyrate as a natural metabolite of cell metabolism also in humans. The very delayed degradation of PHB results in a particular suitability in medical application.

Dabei erfolgt die Kultivierung auf verschiedenen Substraten und unter unterschiedli­ chen Wachstumsbedingungen. Die Substrate sind oft relativ teuer. Deshalb wird nach solchen Substraten gesucht, die eine ökonomische Produktion von PHB ermöglichen. Diese Substrate sollten einen möglichst hohen PHB-Gehalt liefern.The cultivation is carried out on different substrates and different growth conditions. The substrates are often relatively expensive. That is why searched for such substrates that economic production of PHB enable. These substrates should provide the highest possible PHB content.

Es ist eine Übersicht publiziert (Brandl et al.) über eingesetzte Substrate (incl. Prei­ se), die verwendeten Mikroorganismen (ausschließlich Bakterien) sowie die erzielten PHB-Gehalte. Es kommt zum Ausdruck, dass sich mit Glucose als Kohlenstoff- und Energiequelle höhere PHD-Ausbeuten als mit preisgünstigem Methanol erzielen las­ sen.An overview is published (Brandl et al.) Of the substrates used (incl. Price se), the microorganisms used (bacteria only) and the achieved PHB levels. It is expressed that glucose as a carbon and Energy source read higher PHD yields than with inexpensive methanol sen.

Die Erfindung hat die Aufgabe, ein physiologisches, d. h. in der Natur nicht vorkom­ mendes Substrat für die Produktion von Poly-3-hydroxybutyrat zu nutzen.The invention has the task of a physiological, ie. H. not found in nature Use substrate for the production of poly-3-hydroxybutyrate.

Bisher war lediglich bekannt, dass Agrobacterium sp. (DSM 8888) in der Lage ist, L-, aber auch D-Carnitin als einzige C- und N-Quelle zu verwerten. Von anderen Spe­ zies von Agrobacterium ist diese Eigenschaft nicht bekannt.So far it was only known that Agrobacterium sp. (DSM 8888) is capable of L-, but also to use D-carnitine as the only C and N source. From other spe zies of Agrobacterium this property is not known.

Es wurde überraschenderweise gefunden, dass A. radiobacter wt3 (DSM 13 186) zum D-Carnitin­ abbau befähigt ist, wobei PHB entsteht. Der Verfahrensablauf ist wie folgt zu beschreiben. It was surprisingly found that A. radiobacter wt3 (DSM 13 186) became D-carnitine degradation is capable, whereby PHB arises. The procedure is as follows describe.  

Den auf Minimalmedium gewachsenen Bakterien wird D-Carnitin, oder D,L-Carnitin als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zugesetzt. Nach einer Inkubationszeit zwischen 24 und 168 Stunden werden die Bakterien geerntet und der PHB-Gehalt ermittelt. Die Konzentration des Carnitins im Inkubationsmedium liegt zwischen 10 mM und 500 mM. Verschiedene Millieubedingungen können limitiert sein. Die Inku­ bationszeit betreffend werden 72 bis 96 Stunden bevorzugt.The bacteria grown on minimal medium becomes D-carnitine, or D, L-carnitine added as the only source of carbon and nitrogen. After an incubation period between 24 and 168 hours the bacteria are harvested and the PHB content determined. The concentration of carnitine in the incubation medium is between 10 mM and 500 mM. Different milieu conditions can be limited. The Inku With regard to the period of time, 72 to 96 hours are preferred.

Auf kommerziell erhältlichen, festen Medien mit Zusatz von Fleischextrakt kann die Stammhaltung erfolgen.On commercially available solid media with the addition of meat extract, the Take stock.

Die Gewinnung von PHB kann mit unterschiedlichen Lösungsmitteln und anschlie­ ßender Fällung des Polymers erfolgen. Solche Lösungsmittel sind z. B. Chloroform, Methylenchlorid oder Dichlorethan. Verschiedene Methoden, die den Verdau des zellulären Nicht-PHB-Materials beinhalten, wurden entwickelt.The extraction of PHB can with different solvents and then The polymer is precipitated. Such solvents are e.g. B. chloroform, Methylene chloride or dichloroethane. Different methods that help digest the cellular non-PHB material have been developed.

Der Nachweis von PHB kann gaschromatographisch erfolgen. Hierbei sind verschie­ denen Verfahren möglich. Eine Methode, bei der der Abbau des PHB relativ gering ist, ist das Verfahren nach Riis und Mai (RIIS und MAI, 1988). Hierbei erfolgen Ex­ traktion und Propanolyse simultan. Extraktionsmittel ist Dichlorethan oder Trichloret­ han. Nach Auswaschen der Säure mit Wasser kann der 3-Hydroxybuttersäureester gaschromatographisch bestimmt werden.PHB can be detected by gas chromatography. Here are different which procedures possible. A method in which the degradation of the PHB is relatively low is the method according to Riis and Mai (RIIS and MAI, 1988). Ex traction and propanolysis simultaneously. The extractant is dichloroethane or trichloret han. After washing out the acid with water, the 3-hydroxybutyric acid ester be determined by gas chromatography.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von PHB hat einige Vorteile ge­ genüber bekannten Technologien. Einige Vorteile des Verfahrens sind:
The method according to the invention for the production of PHB has some advantages over known technologies. Some advantages of the procedure are:

  • 1. D-Carnitin, das als Abfallprodukt bei der chemischen Herstellung von L-Carnitin entsteht, stellt ein sehr kostengünstiges Ausgangsmaterial für die PHB-Synthese dar.1. D-carnitine, which is a waste product from the chemical production of L-carnitine is a very inexpensive starting material for PHB synthesis represents.
  • 2. Für die mikrobiologische Synthese müssen keine weiteren Biochemikalien ein­ gesetzt werden.2. No other biochemicals are required for the microbiological synthesis be set.
  • 3. Der Aufwand für Medien und Energie ist gering.3. The effort for media and energy is low.
  • 4. Der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm A. radiobacter wt3 ist gut zu handhaben.4. The A. radiobacter wt3 strain used according to the invention is easy to handle.

Im folgenden wird das Verfahren an einigen Ausführungsbeispielen erläutert: The method is explained below using a few exemplary embodiments:  

Beispiel 1example 1

Mehrere 500 ml-Kolben, die Miller-Minimalmedium (MILLER, 1972) und 0,5% D-Car­ nitin enthalten (pH 7-8) werden mit wenigen ml einer Vorkultur von A. radiobacter wt3, die auf demselben Medium gewachsen ist, angeimpft. Diese Kulturen werden bei 25-30°C unter Schütteln inkubiert.Several 500 ml flasks, the Miller minimal medium (MILLER, 1972) and 0.5% D-Car contain nitin (pH 7-8) with a few ml of a preculture of A. radiobacter wt3, which has grown on the same medium, inoculated. These cultures will incubated at 25-30 ° C with shaking.

Die Bildung von PHB ist in Abhängigkeit von Wachstum und Inkubationszeit in Tabel­ le 1 dargestellt. Der PHB Gehalt wird in % der Bakterientrockensubstanz (BTS) ange­ geben.The formation of PHB is dependent on growth and incubation time in Tabel le 1 shown. The PHB content is expressed in% of the dry bacterial substance (BTS) give.

Tabelle 1 Table 1

PHB-Synthese durch A. radiobacter wt3 in Abhängigkeit von der Zeit PHB synthesis by A. radiobacter wt3 as a function of time

Beispiel 2Example 2

Gemäß Beispiel 1 werden Agrobacterium sp. DSM 8888 und A. radiobacter wt3 mit jeweils 1% D- oder D,L-Carnitin kultiviert.According to Example 1, Agrobacterium sp. DSM 8888 and A. radiobacter wt3 with each cultivated 1% D- or D, L-carnitine.

Tabelle 2 zeigt den Gehalt an PHB nach einer Inkubationszeit von 72 Stunden.Table 2 shows the PHB content after an incubation period of 72 hours.

Tabelle 2 Table 2

PHB-Bildung wachsender Bakterien mit D- bzw. D,L-Carnitin als Substrat PHB formation of growing bacteria with D- or D, L-carnitine as substrate

Polyhydroxyalkansäuren werden mikrobiologisch synthetisiert und sind biologisch abbaubar insbesondere durch Mikroorganismen des Bodens. PHA ist thermoplas­ tisch und schmilzt bei ca. 180°C. Dadurch ist es gut verformbar und kann in etablier­ ten Herstellungsverfahren für Plasteartikel eingesetzt werden (Ersatz für Polyethylen mit einem ähnlichen Schmelzpunkt bei 190°C). Dadurch ist ein solches Polymer für Verpackungen geeignet, die im landwirtschaftlichen Bereich keine Entsorgung erfor­ dert. Solche Polymere, die biologisch verträglich und abbaubar sind können in vielen Bereichen Anwendung finden. Dies bezieht sich auch auf medizinische Aspekte (Gelenk- und Gefäßprothesen). Abbauprodukte aus Poly-3-hydroxybutyrat ist 3-Hyd­ roxybutyrat als natürlicher Metabolit des Zellstoffwechsels auch beim Menschen. Durch den sehr verzögerten Abbau von PHB ergibt sich eine besondere Eignung in der medizinischen Anwendung.Polyhydroxyalkanoic acids are microbiologically synthesized and are biological degradable especially by soil microorganisms. PHA is thermoplastic table and melts at approx. 180 ° C. As a result, it is easily deformable and can be established in Manufacturing processes for plastic articles are used (replacement for polyethylene with a similar melting point at 190 ° C). This makes such a polymer for Suitable packaging that does not require disposal in the agricultural sector different. Such polymers that are biologically compatible and degradable can be used in many Areas. This also applies to medical aspects (Joint and vascular prostheses). Degradation products from poly-3-hydroxybutyrate is 3-hyd roxybutyrate as a natural metabolite of cell metabolism also in humans. The very delayed degradation of PHB results in a particular suitability in medical application.

Dabei erfolgt die Kultivierung auf verschiedenen Substraten und unter unterschiedli­ chen Wachstumsbedingungen. Die Substrate sind oft relativ teuer. Deshalb wird nach solchen Substraten gesucht, die eine ökonomische Produktion von PHB ermöglichen. Diese Substrate sollten einen möglichst hohen PHB-Gehalt liefern.The cultivation is carried out on different substrates and different growth conditions. The substrates are often relatively expensive. That is why searched for such substrates that economic production of PHB enable. These substrates should provide the highest possible PHB content.

Es ist eine Übersicht publiziert (Brandl et al.) über eingesetzte Substrate (incl. Prei­ se), die verwendeten Mikroorganismen (ausschließlich Bakterien) sowie die erzielten PHB-Gehalte. Es kommt zum Ausdruck, dass sich mit Glucose als Kohlenstoff- und Energiequelle höhere PHB-Ausbeuten als mit preisgünstigem Methanol erzielen las­ sen.An overview is published (Brandl et al.) Of the substrates used (incl. Price se), the microorganisms used (bacteria only) and the achieved PHB levels. It is expressed that glucose as a carbon and Energy source higher PHB yields than with inexpensive methanol sen.

Die Erfindung hat die Aufgabe, ein physiologisches, d. h. in der Natur nicht vorkom­ mendes Substrat für die Produktion von Poly-3-hydroxybutyrat zu nutzen.The invention has the task of a physiological, ie. H. not found in nature Use substrate for the production of poly-3-hydroxybutyrate.

Bisher war lediglich bekannt, dass Agrobacterium sp. (DSM 8888) in der Lage ist, L-, aber auch D-Carnitin als einzige C- und N-Quelle zu verwerten. Von anderen Spe­ zies von Agrobacterium ist diese Eigenschaft nicht bekannt.So far it was only known that Agrobacterium sp. (DSM 8888) is capable of L-, but also to use D-carnitine as the only C and N source. From other spe zies of Agrobacterium this property is not known.

Es wurde überraschenderweise gefunden, dass A. radiobacter wt3 (DSM 13186) zum D-Carnitin­ abbau befähigt ist, wobei PHB entsteht. Der Verfahrensablauf ist wie folgt zu beschreiben. It was surprisingly found that A. radiobacter wt3 (DSM 13186) became D-carnitine degradation is capable, whereby PHB arises. The procedure is as follows describe.  

Beispiel 3Example 3

Gemäß Beispiel 1 wird unter Phosphat- bzw. Sauerstofflimitation mit 1% D-Carnitin als Wachstumssubstrat inkubiert.According to Example 1 is under phosphate or oxygen limitation with 1% D-carnitine incubated as a growth substrate.

In Tabelle 3 sind die PHB-Ausbeuten nach einer Inkubationszeit von 96 Stunden dar­ gestellt.Table 3 shows the PHB yields after an incubation period of 96 hours posed.

Tabelle 3 Table 3

PHB-Produktion wachsender Bakterien unter Limitationsbedingungen PHB production of growing bacteria under limitation conditions

Der verwendete Stamm Agrobacterium radiobacter wt3 ist in der Deutschen Samm­ lung für Mikroorganismen unter der Nummer DSM 13186 hinterlegt worden. The strain Agrobacterium radiobacter wt3 used is in the German collection for microorganisms under the number DSM 13186.  

Literaturliterature

Brandl, H., Gross, R. A., Lenz, R. W. and Fuller, R. C., 1990. Plastics from bacteria and for bacteria: poly(-hydroxyalkanoates) as natural, biocompatile, and biodegradble polyesters. Adv. Biochem. Eng. Biotech. 41: 77-93
Miller, J. H., 1972. Experiments in molecular genetics. Cols Spring Harbor Laboratory, Cols Spring Harbor, New York. 431-432
Riis, V. and Mai, W., 1988. Gaschromatographic determination of poly-3-hydroxybutyric acid in microbial biomass after hydrochloric acid propanolysis. J. Chromatogr. 445: 285-289Brandl, H., Gross, RA, Lenz, RW and Fuller, RC, 1990. Plastics from bacteria and for bacteria: poly (-hydroxyalkanoates) as natural, biocompatible, and biodegradble polyesters. Adv. Biochem. Closely. Biotech. 41: 77-93
Miller, JH, 1972. Experiments in molecular genetics. Cols Spring Harbor Laboratory, Cols Spring Harbor, New York. 431-432
Riis, V. and Mai, W., 1988. Gaschromatographic determination of poly-3-hydroxybutyric acid in microbial biomass after hydrochloric acid propanolysis. J. Chromatogr. 445: 285-289

Claims (7)

1. Verfahren zur Herstellung von Poly-3-hydroxybutyrat aus Agrobakterien, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Stämme von Agrobacterium, welche die gemeinsame Eigenschaft aufweisen, D,L- und/oder D-Carnitin als einzige C- und N- Quelle zu nutzen, kultiviert werden.1. A process for the preparation of poly-3-hydroxybutyrate from Agrobacteria, characterized in that one or more strains of Agrobacterium, which have the common property, D, L and / or D-carnitine as the only C and N source use, be cultivated. 2. Verfahren zur Herstellung von Poly-3-hydroxybutyrat aus Agrobacterien nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm Agrobacterium radiobacter wt3, hinterlegt als DSM 13186, kultiviert wird, wobei D,L- oder D-Carnitin als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle genutzt werden.2. Process for the preparation of poly-3-hydroxybutyrate from Agrobacteria after Claim 1, characterized in that the strain Agrobacterium radiobacter wt3, deposited as DSM 13186, is cultivated, with D, L- or D-carnitine being the only one Carbon and nitrogen sources can be used. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von D,L- und D-Carnitin im Kulturmedium mit Mineralsalzen 5,0 bis 20,0 g/l, betragen.3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the concentration of D, L- and D-carnitine in the culture medium with mineral salts 5.0 to 20.0 g / l. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthese von Poly-3-hydroxybuttersäure unter aeroben Kulturbedingungen erfolgt.4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that the synthesis of Poly-3-hydroxybutyric acid takes place under aerobic culture conditions. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Mangelbedingun­ gen an Phosphat, Sauerstoff und der alleinigen Kohlenstoff- und Stickstoffquelle D- Carnitin erzeugt werden.5. The method according to claim 1 to 4, characterized in that deficiency conditions of phosphate, oxygen and the sole carbon and nitrogen source D- Carnitine can be produced. 6. Verwendung des Mikroorganismus Agrobacterium radiobacter wt3 (DSM 13186) zur Herstellung von Poly-3-hydroxybutyrat durch Kultivieren auf D-Carnitin in einem Minimalmedium.6. Use of the microorganism Agrobacterium radiobacter wt3 (DSM 13186) for the preparation of poly-3-hydroxybutyrate by culturing on D-carnitine in a minimal medium. 7. Verwendung des Mikroorganismus Agrobacterium radiobacter wt3 zur Herstellung von Poly-3-hydroxybutyrat durch Kultivieren auf D,L-Carnitin.7. Use of the microorganism Agrobacterium radiobacter wt3 for the production of poly-3-hydroxybutyrate by culturing on D, L-carnitine.
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Biosis Abstract 1977: 214072 *
Biosis Abstract 1994: 363944 *
Chemical Abstracts 123: 7927 *

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