DE19954444A1 - Verfahren zum Schutz von Säugetierzellen mittels überexprimierter G-2/M-Zellzykluskoppler - Google Patents

Abstract

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Schutz von Säugetierzellen und ist gekennzeichnet durch eine Überexpression von G-2/M-Zellzykluskopplern.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Schutz von Säugetierzellen mittels überexprimierter G-2/M-Zellzykluskoppler. In einer bevorzugten Variante wird das Protein des G-2/M-Zellzykluskopplers, sein Gen oder die entsprechende cDNA in eine zu schützende Zielzelle eingeführt bzw. zur Überexpession gebracht.

Zellschädigungen, wie Zytotoxizität und Zelltod in Säugetierzellen können durch verschiedene Ursachen hervorgerufen werden, einschließlich, physikalischer, chemischer oder biologischer Agenzien. Unabhängig von der Natur des auslösenden Agenz führen sie sämtlich zur Entkopplung des Zellzyklusses.

Daher lag der Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen Agenz­ unabhängigen Mechanismus und ein entsprechendes Verfahren zu entwickeln, der die Zelle vor den Folgen einer Zellzyklusentkopplung, d. h. Zytotoxixität oder Zelltod, wodurch auch immer hervorgerufen, schützt.

Bekanntermaßen replizieren Säugetierzellen ihr Genom nur während eines umschriebenen Zeitabschnittes, der als DNA-Synthesephase oder kurz als S-Phase bezeichnet wird. Diese ist Teil der vier Phasen des Zellzyklus, die die G1-Phase, S-Phase, G2-Phase und Mitose umfassen. Ihre jeweilige Dauer ist relativ konstant: Die G1-Phase ist von unterschiedlicher Länge, in schnell proliferierenden Zellen liegt sie zwischen 2 und 20 Stunden. Die Dauer der S-Phase beträgt ca. 6-10 Stunden, die Dauer der G2-Phase: 2-4 Stunden und die der Mitose ca. 3-4 Stunden.

Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß eine Zelle vor Zytotoxizität geschützt ist, wenn in ihr oder in einer benachbarten Zelle ein G-2/M-Zellzykluskoppler überexprimiert wird. D. h. zytotoxische Einflüsse auf die Säugetierzellen, ausgelöst durch beliebige Ursachen, so z. B. durch physikalische, chemische oder biologische Agenzien, wie z. B. Viren, können in ihren zytotoxischen Eigenschaften gehemmt werden.

Die Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen gelöst. Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Schutz von Säugetierzellen bereitgestellt, nachdem eine Überexpression von mindestens einem G-2/M-Zellzykluskoppler erfolgt.

G-2/M-Zellzykluskoppler im Sinne der Erfindung sind CDK-Zyklin- Komplex-regulierende Proteine wie z. B. der Zellzyklusregulator p21.

In einer Ausführungsvariante der Erfindung wird mindestens ein G-2/M- Zellzykluskoppler direkt in einer zu schützenden Zielzelle überexprimiert. Dabei ist es unerheblich ob die Überexpression vor, während oder nach einem die Zelle schädigenden Ereignis stattfindet.

In einer anderen Ausführungsvariante findet die Überexpression in einer der Zielzelle benachbarten Zelle statt, die dann einen indirekten Schutzeffekt für die Zielzelle vermittelt. Der vermittelte Schutzeffekt wird sekundär und/oder tertiär über indirekte Mechanismen ausgelöst, unabhängig ob die zur Zytotoxizität oder zum Zelltod führende Ursache bzw. das dazu führende Agenz bzw. dessen Wirkung vor/während oder nach der Expression vorhanden war.

Eine Zelle schädigende Ereignisse können z. B. eine Virusinfektion, Strahlung oder chemisch induzierte Ereignisse sein.

Gemäß der Erfindung wird das Protein (mindestens ein G-2/M- Zellzykluskoppler), das Gen für mindestens einen G-2/M- Zellzykluskoppler oder dessen cDNA in eine zu schützende Zielzelle oder in eine andere Zelle eingeführt und dort zur Expression bzw. Überexpression gebracht.

Dabei erfolgt der Transfer der G-2/M-Zellzykluskoppler-DNA mittels an sich bekannter Gentechniken durch Übertragung der reinen DNA, bzw. unter Verwendung viraler oder nichtviraler Vektoren, so z. B. durch retrovirale, adenovirale, baculovirale, parvovirale, adenoassoziierte Viren, Lentiviren herpesvirale Vektoren und/oder andere virale bzw. nichtivrale Vektoren.

Die G-2/M-Zellzykluskoppler, seine Gene oder die entsprechende cDNA können auch in Kombination mit anderen Agenzien, so z. B. mit anderen therapeutischen Genen bzw. deren DNA-Sequenzen eingesetzt werden, die ebenfalls in viralen oder nichtviralen Vektoren verpackt sein können, in die Zelle eingebracht werden.

Sie können in einem Vektor oder in unterschiedlichen Vektoren lokalisiert sein. Bei Vorliegen in unterschiedlichen Materialien können sie unabhängig voneinander in die Zellen eingebracht werden.

In einer bevorzugten Ausführungsvariante wird die DNA für mindestens einen G-2/M-Zellzykluskoppler vor Einführung der anderen Agenzien in der Zielzelle oder einer Nachbarzelle zur Expression gebracht.

Die Erfindung wird am Beispiel des Zellzyklusregulators p21, auf den sie jedoch nicht beschränkt werden soll, näher erläutert.

Unter Verwendung an sich bekannter Techniken wird das Protein bzw. das Gen von p21 oder dessen cDNA in eine zu schützende Zielzelle eingebracht und zur Expression bzw. zur Überexpression gebracht. Dazu existieren verschiedene Methoden, so z. B. die Übertragung von reiner DNA oder der Einsatz von viralern oder nichtviralen Vektoren. Unabhängig von ihrer Natur transferieren solche Systeme in die Zielzelle eine Expressionskassette, die zur Überexpression von p21 führt, gegebenenfalls unter Kontrolle eines Promotors. Insgesamt gibt es eine große Vielfalt sowohl von Gentransfersystemen als auch von Expressionskassetten für die zu schützende Zelle.

Das Produkt des p21-Gens, das p21^WAF1/CIP1-Protein (p21) ist ein bekannter Zellzyklusregulator, der als Hemmer von Zyklin-abhängigen Kinasen (CDK) den Wiedereintritt senescenter Zellen in den Zellzyklus verhindert. Diese Funktion des p21 schließt verschiedene Mechanismen ein, wie Hypophosphorylierung des Retinoblastom-Genproduktes (Rb), Bindung an "proliferating cell nuclear antigen" (PCNA), Bindung an CDK- Zyklin-Komplexen wie Zyklin D-CDK4, Zyklin E-CDK2 und Zyklin A- CDK2. Während die Wechselwirkung von p21 mit PCNA die DNA- Replikation blockiert, verhindert die Wechselwirkung mit CDK-Zyklin- Komplexen den Zellzyklusbeginn durch G1 Arrest. Die Gegenwart von p21 und seiner zellulären Funktion ist von Lebenswichtigkeit für das Überleben der Zelle unter zellulärem Streß.

In Bezug auf einen möglichen Gentransfer von p21 sind adenovirale Vektoren wegen ihrer hohen Transfereffizienz in-vitro und in-vivo besonders bevorzugte Vektoren. Da Ad-Vektoren aber auch zytotoxische Eigenschaften besitzen, wird, gemäß der Erfindung, der zellschützende Effekt von p21 im nachfolgenden anhand des Adenovirus-vermittelten Gentransfers dargestellt.

Replikationsdefiziente, rekombinante Adenoviren (Ad-Vektoren) gehören zu den am häufigsten benutzten Gentransfervehikeln. Sie sind besonders effizient für den in vivo- und in vitro-Gentranfer. Aufgrund ihrer hohen Titer und Stabilität sind sie besonders gut für medizinische und biotechnologische Anwendungen geeignet. Sie können eine Vielzahl von natürlichen Zellen und Geweben infizieren. Ihre Transgenexpression erfolgt epichromosomal, wodurch die Genexpression zeitlich begrenzt ist. Nach Infektion durch den Ad-Vektor wird der Wirtszellmetabolismus durch die Expression viraler Gene zugunsten der epichromosomalen Transgenexpression verändert. Dies läßt sich durch Messung von Glukose und Enzymen des Energiestoffwechsels wie Laktat nachweisen. Sie demonstrieren, daß durch die adenoviral bedingte Transgenexpression Energie verbraucht wird (Tabelle 1: Glukose, Laktat).

Unabhängig davon kommt es aber leider auch zu einer Schädigung der Wirtszelle, was man durch Erfassung der entsprechenden zytotoxischen Parametern darstellen kann. Dabei steigen im Vergleich zu uninfizierten Zellen solche Enzyme an, die als Maß für Zell- und/oder Membranschädigungen gelten (Tabelle 1: LDH, ALAT, ASAT).

Tabelle 1

Messung von enzymalen und Energiestoffwechselparametern in menschlichen Lebersellen nach Infektion mit einem adenoviralen Gentransfer-Vektor (AdRSV.alpha1- AT). Als Kontrolle dienten pufferbehandelte (uninfizierte) menschliche Leberzellen. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte aus drei unabhängigen Messungen, ±SD, zum Zeitpunkt 0 h, bzw. zum Zeitpunkt 48 h nach Versuchsbeginn.

Zum Nachweis, daß die Überexpression von p21 nun Zytotoxizität und zytotoxisch bedingtem Zelltod in Säugetierzellen verhindert, wurde für das nächste Experiment derselbe Ad-Vektor benutzt, der jedoch jetzt statt einer cDNA des irrelevanten Reportergens alpha-1-Antitrypsin, eine cDNA des p21-Protein enthält (AdCMV.p21).

Dadurch wird die Eigenschaft des Ad-Vektors zur Transgenexpression nicht gestört, die zytotoxische Eigenschaft des Ad-Vektors aber blockiert. Zur Nachweisführung erfolgten im nächsten Schritt daher Kotransfektionsexperimente. Dazu wurden menschliche Leberzellen mit einem Ad-Vektor infiziert der für das irrelevante Reportergen β- Galaktosidase kodiert (AdCMV.β-Gal).

Um zu demonstrieren daß p21 zytoprotektiv wirkt, wurde der AdCMV.β- Gal Suspension zu gleichen Teilen eine AdCMV.p21 Suspension vor Infektion beigemischt. Als Kontrolle diente ein Gemisch aus AdCMV.β-Gal und AdCMV.Null, einem Ad-Vektor der eine leere Expressionskassette enthält.

Wie der Abb. 1 entnommen werden kann, führte die Koexpression von AdCMV.β-Gal und AdCMV.p21 zu einer deutlichen Steigerung der Transgenexpression des Reportergens β-Galaktosidase. Daß dieses Ereignis wirklich auf die zytoprotektive Wirkung von p21 zurückzuführen ist, kann daran abgelesen werden, daß es trotz gleichbleibenden Energieverbrauchs zu einer Normalisierung von zytotoxischen Enzymen kommt. Dieses Resultat ist nicht nur transgenunabhängig, sondern auch unabhängig von den eingesetzten Promotoren, wie der Vergleich zwischen RSV und CMV Promotor zeigt (Abb. 1A, B, C).

Anhand der in Tabelle 2 dargestellten Resultate wird nachgewiesen, daß die zellprotektive Wirkung der Überexpression von p21 nicht durch G1- Arrest, sondern durch Zellzyklusprogression in der geschädigten Zelle erfolgt.

Im Unterschied zu gesunden, nichtinfizierten Zellen (Mock), zeichnen sich Zellen die mit Kontroll-Adenovirus-Vektoren infiziert wurden, (Ad.RSV.hAAT.2 oder AdCMV.RbDcdk) durch ein deutliches Auftreten von Zytotoxizität aus, wie anhand der Zellzyklusstörungen d. h. Zunahme der Zellen in der G₂/M Phase gezeigt wird. Konsequenterweise führen diese zytotoxischen Ereignisse auch zu einer Abnahme an der Gesamtzellzahl zu Versuchsende (Zellzahl).

Im Gegensatz dazu zeichnen sich AdCMV.p21 infizierte Zellen, die p21 überexprimieren, durch eine normale Zellzyklusverteilung und eine Gesamtzellzahl aus, die sich von gesunden, lebenden und nichtinfizierten Zellen nicht unterscheiden.

Tabelle 2

Einfluß der Überexpression von 21 auf die Zellzahl und Verteilung der lebenden (Ann^-) und toten Zellen (Ann⁺) in der Zellzykluspahse G₂/M. Dargestellt sind die Mittelwerte (± Standardabweichung)

Claims (16)

1. Verfahren zum Schutz von Säugetierzellen, gekennzeichnet durch eine Überexpression von G-2/M- Zellzykluskopplern.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als G-2/M-Zellzykluskoppler CDK- Zyklin-Komplex regulierende Proteine wie z. B. der Zellzyklusregulator p21, eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Schutz vor Zellschädigungen, die zur Entkopplung des Zellzyklusses führen, erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Schutz der Zelle vor Zytotoxizität erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Schutz vor Zelltod, erfolgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Überexpression direkt in einer zu schützenden Zielzelle stattfindet oder in einer anderen benachbarten Zelle, die dann einen indirekten Schutzeffekt für die Zielzelle vermittelt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Überexpression vor, während oder nach einem die Zelle schädigenden Ereignis stattfindet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als die Zelle schädigendes Ereignis, eine Vireninfektion, Strahlung und/oder ein chemisch induziertes Ereignis ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für mindestens einen G-2/M-Zellzykluskoppler oder dessen cDNA in eine zu schützende Zielzelle oder in eine andere Zelle eingeführt und dort zur Expression bzw. Überexpression gebracht wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein G-2/M-Zellzykluskoppler als Protein in den Organismus eingebracht wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Transfer der G-2/M-Zellzykluskoppler-DNA mittels an sich bekannter Gentechniken durch Übertragung der reinen DNA, bzw. unter Verwendung viraler oder nichtviraler Vektoren erfolgt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß retrovirale, adenovirale, baculovirale, parvovirale, adenoassoziierte Viren, Lentiviren herpesvirale Vektoren und/oder andere virale bzw. nichtivrale Vektoren eingesetzt werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein G-2/M-Zellzykluskoppler, sein Gen oder die entsprechende cDNA in Kombination mit anderen Agenzien, vorzugsweise Viren, Genen, DNA-Sequenzen in die Zelle eingebracht wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen oder die cDNA und die anderen Agenzien in unterschiedlichen Materialien, wie Vektoren, lokalisiert sind und unabhängig voneinander in die Zellen eingebracht werden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA für den G-2/M-Zellzykluskoppler vor Einführung der anderen Agenzien zur Expression gebracht wird.

16. Verwendung von mindestens einem überproduzierten (exprimierten) G-2/M-Zellzykluskoppler zum Schutz von Säugetierzellen vor Zellschädigungen, wie Zytotoxizität und Zelltod.