DE19954444A1 - Verfahren zum Schutz von Säugetierzellen mittels überexprimierter G-2/M-Zellzykluskoppler - Google Patents
Verfahren zum Schutz von Säugetierzellen mittels überexprimierter G-2/M-ZellzykluskopplerInfo
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Abstract
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Schutz von Säugetierzellen und ist gekennzeichnet durch eine Überexpression von G-2/M-Zellzykluskopplern.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Schutz von Säugetierzellen
mittels überexprimierter G-2/M-Zellzykluskoppler. In einer bevorzugten
Variante wird das Protein des G-2/M-Zellzykluskopplers, sein Gen oder
die entsprechende cDNA in eine zu schützende Zielzelle eingeführt bzw.
zur Überexpession gebracht.
Zellschädigungen, wie Zytotoxizität und Zelltod in Säugetierzellen können
durch verschiedene Ursachen hervorgerufen werden, einschließlich,
physikalischer, chemischer oder biologischer Agenzien. Unabhängig von
der Natur des auslösenden Agenz führen sie sämtlich zur Entkopplung
des Zellzyklusses.
Daher lag der Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen Agenz
unabhängigen Mechanismus und ein entsprechendes Verfahren zu
entwickeln, der die Zelle vor den Folgen einer Zellzyklusentkopplung, d. h.
Zytotoxixität oder Zelltod, wodurch auch immer hervorgerufen, schützt.
Bekanntermaßen replizieren Säugetierzellen ihr Genom nur während
eines umschriebenen Zeitabschnittes, der als DNA-Synthesephase oder
kurz als S-Phase bezeichnet wird. Diese ist Teil der vier Phasen des
Zellzyklus, die die G1-Phase, S-Phase, G2-Phase und Mitose umfassen.
Ihre jeweilige Dauer ist relativ konstant: Die G1-Phase ist von
unterschiedlicher Länge, in schnell proliferierenden Zellen liegt sie
zwischen 2 und 20 Stunden. Die Dauer der S-Phase beträgt ca. 6-10
Stunden, die Dauer der G2-Phase: 2-4 Stunden und die der Mitose ca. 3-4
Stunden.
Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß eine
Zelle vor Zytotoxizität geschützt ist, wenn in ihr oder in einer
benachbarten Zelle ein G-2/M-Zellzykluskoppler überexprimiert wird. D. h.
zytotoxische Einflüsse auf die Säugetierzellen, ausgelöst durch beliebige
Ursachen, so z. B. durch physikalische, chemische oder biologische
Agenzien, wie z. B. Viren, können in ihren zytotoxischen Eigenschaften
gehemmt werden.
Die Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen gelöst. Erfindungsgemäß wird
ein Verfahren zum Schutz von Säugetierzellen bereitgestellt, nachdem eine
Überexpression von mindestens einem G-2/M-Zellzykluskoppler erfolgt.
G-2/M-Zellzykluskoppler im Sinne der Erfindung sind CDK-Zyklin-
Komplex-regulierende Proteine wie z. B. der Zellzyklusregulator p21.
In einer Ausführungsvariante der Erfindung wird mindestens ein G-2/M-
Zellzykluskoppler direkt in einer zu schützenden Zielzelle überexprimiert.
Dabei ist es unerheblich ob die Überexpression vor, während oder nach
einem die Zelle schädigenden Ereignis stattfindet.
In einer anderen Ausführungsvariante findet die Überexpression in einer
der Zielzelle benachbarten Zelle statt, die dann einen indirekten
Schutzeffekt für die Zielzelle vermittelt. Der vermittelte Schutzeffekt wird
sekundär und/oder tertiär über indirekte Mechanismen ausgelöst,
unabhängig ob die zur Zytotoxizität oder zum Zelltod führende Ursache
bzw. das dazu führende Agenz bzw. dessen Wirkung vor/während oder
nach der Expression vorhanden war.
Eine Zelle schädigende Ereignisse können z. B. eine Virusinfektion,
Strahlung oder chemisch induzierte Ereignisse sein.
Gemäß der Erfindung wird das Protein (mindestens ein G-2/M-
Zellzykluskoppler), das Gen für mindestens einen G-2/M-
Zellzykluskoppler oder dessen cDNA in eine zu schützende Zielzelle oder in
eine andere Zelle eingeführt und dort zur Expression bzw. Überexpression
gebracht.
Dabei erfolgt der Transfer der G-2/M-Zellzykluskoppler-DNA mittels an
sich bekannter Gentechniken durch Übertragung der reinen DNA, bzw.
unter Verwendung viraler oder nichtviraler Vektoren, so z. B. durch
retrovirale, adenovirale, baculovirale, parvovirale, adenoassoziierte Viren,
Lentiviren herpesvirale Vektoren und/oder andere virale bzw. nichtivrale
Vektoren.
Die G-2/M-Zellzykluskoppler, seine Gene oder die entsprechende cDNA
können auch in Kombination mit anderen Agenzien, so z. B. mit anderen
therapeutischen Genen bzw. deren DNA-Sequenzen eingesetzt werden, die
ebenfalls in viralen oder nichtviralen Vektoren verpackt sein können, in
die Zelle eingebracht werden.
Sie können in einem Vektor oder in unterschiedlichen Vektoren lokalisiert
sein. Bei Vorliegen in unterschiedlichen Materialien können sie
unabhängig voneinander in die Zellen eingebracht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante wird die DNA für mindestens
einen G-2/M-Zellzykluskoppler vor Einführung der anderen Agenzien in
der Zielzelle oder einer Nachbarzelle zur Expression gebracht.
Die Erfindung wird am Beispiel des Zellzyklusregulators p21, auf den sie
jedoch nicht beschränkt werden soll, näher erläutert.
Unter Verwendung an sich bekannter Techniken wird das Protein bzw.
das Gen von p21 oder dessen cDNA in eine zu schützende Zielzelle
eingebracht und zur Expression bzw. zur Überexpression gebracht. Dazu
existieren verschiedene Methoden, so z. B. die Übertragung von reiner DNA
oder der Einsatz von viralern oder nichtviralen Vektoren. Unabhängig von
ihrer Natur transferieren solche Systeme in die Zielzelle eine
Expressionskassette, die zur Überexpression von p21 führt, gegebenenfalls
unter Kontrolle eines Promotors. Insgesamt gibt es eine große Vielfalt
sowohl von Gentransfersystemen als auch von Expressionskassetten für
die zu schützende Zelle.
Das Produkt des p21-Gens, das p21WAF1/CIP1-Protein (p21) ist ein
bekannter Zellzyklusregulator, der als Hemmer von Zyklin-abhängigen
Kinasen (CDK) den Wiedereintritt senescenter Zellen in den Zellzyklus
verhindert. Diese Funktion des p21 schließt verschiedene Mechanismen
ein, wie Hypophosphorylierung des Retinoblastom-Genproduktes (Rb),
Bindung an "proliferating cell nuclear antigen" (PCNA), Bindung an CDK-
Zyklin-Komplexen wie Zyklin D-CDK4, Zyklin E-CDK2 und Zyklin A-
CDK2. Während die Wechselwirkung von p21 mit PCNA die DNA-
Replikation blockiert, verhindert die Wechselwirkung mit CDK-Zyklin-
Komplexen den Zellzyklusbeginn durch G1 Arrest. Die Gegenwart von p21
und seiner zellulären Funktion ist von Lebenswichtigkeit für das
Überleben der Zelle unter zellulärem Streß.
In Bezug auf einen möglichen Gentransfer von p21 sind adenovirale
Vektoren wegen ihrer hohen Transfereffizienz in-vitro und in-vivo
besonders bevorzugte Vektoren. Da Ad-Vektoren aber auch zytotoxische
Eigenschaften besitzen, wird, gemäß der Erfindung, der zellschützende
Effekt von p21 im nachfolgenden anhand des Adenovirus-vermittelten
Gentransfers dargestellt.
Replikationsdefiziente, rekombinante Adenoviren (Ad-Vektoren) gehören
zu den am häufigsten benutzten Gentransfervehikeln. Sie sind besonders
effizient für den in vivo- und in vitro-Gentranfer. Aufgrund ihrer hohen
Titer und Stabilität sind sie besonders gut für medizinische und
biotechnologische Anwendungen geeignet. Sie können eine Vielzahl von
natürlichen Zellen und Geweben infizieren. Ihre Transgenexpression
erfolgt epichromosomal, wodurch die Genexpression zeitlich begrenzt ist.
Nach Infektion durch den Ad-Vektor wird der Wirtszellmetabolismus
durch die Expression viraler Gene zugunsten der epichromosomalen
Transgenexpression verändert. Dies läßt sich durch Messung von Glukose
und Enzymen des Energiestoffwechsels wie Laktat nachweisen. Sie
demonstrieren, daß durch die adenoviral bedingte Transgenexpression
Energie verbraucht wird (Tabelle 1: Glukose, Laktat).
Unabhängig davon kommt es aber leider auch zu einer Schädigung der
Wirtszelle, was man durch Erfassung der entsprechenden zytotoxischen
Parametern darstellen kann. Dabei steigen im Vergleich zu uninfizierten
Zellen solche Enzyme an, die als Maß für Zell- und/oder
Membranschädigungen gelten (Tabelle 1: LDH, ALAT, ASAT).
Zum Nachweis, daß die Überexpression von p21 nun Zytotoxizität und
zytotoxisch bedingtem Zelltod in Säugetierzellen verhindert, wurde für das
nächste Experiment derselbe Ad-Vektor benutzt, der jedoch jetzt statt
einer cDNA des irrelevanten Reportergens alpha-1-Antitrypsin, eine cDNA
des p21-Protein enthält (AdCMV.p21).
Dadurch wird die Eigenschaft des Ad-Vektors zur Transgenexpression
nicht gestört, die zytotoxische Eigenschaft des Ad-Vektors aber blockiert.
Zur Nachweisführung erfolgten im nächsten Schritt daher
Kotransfektionsexperimente. Dazu wurden menschliche Leberzellen mit
einem Ad-Vektor infiziert der für das irrelevante Reportergen β-
Galaktosidase kodiert (AdCMV.β-Gal).
Um zu demonstrieren daß p21 zytoprotektiv wirkt, wurde der AdCMV.β-
Gal Suspension zu gleichen Teilen eine AdCMV.p21 Suspension vor
Infektion beigemischt. Als Kontrolle diente ein Gemisch aus AdCMV.β-Gal
und AdCMV.Null, einem Ad-Vektor der eine leere Expressionskassette
enthält.
Wie der Abb. 1 entnommen werden kann, führte die Koexpression von
AdCMV.β-Gal und AdCMV.p21 zu einer deutlichen Steigerung der
Transgenexpression des Reportergens β-Galaktosidase. Daß dieses
Ereignis wirklich auf die zytoprotektive Wirkung von p21 zurückzuführen
ist, kann daran abgelesen werden, daß es trotz gleichbleibenden
Energieverbrauchs zu einer Normalisierung von zytotoxischen Enzymen
kommt. Dieses Resultat ist nicht nur transgenunabhängig, sondern auch
unabhängig von den eingesetzten Promotoren, wie der Vergleich zwischen
RSV und CMV Promotor zeigt (Abb. 1A, B, C).
Anhand der in Tabelle 2 dargestellten Resultate wird nachgewiesen, daß
die zellprotektive Wirkung der Überexpression von p21 nicht durch G1-
Arrest, sondern durch Zellzyklusprogression in der geschädigten Zelle
erfolgt.
Im Unterschied zu gesunden, nichtinfizierten Zellen (Mock), zeichnen sich
Zellen die mit Kontroll-Adenovirus-Vektoren infiziert wurden,
(Ad.RSV.hAAT.2 oder AdCMV.RbDcdk) durch ein deutliches Auftreten von
Zytotoxizität aus, wie anhand der Zellzyklusstörungen d. h. Zunahme der
Zellen in der G2/M Phase gezeigt wird. Konsequenterweise führen diese
zytotoxischen Ereignisse auch zu einer Abnahme an der Gesamtzellzahl zu
Versuchsende (Zellzahl).
Im Gegensatz dazu zeichnen sich AdCMV.p21 infizierte Zellen, die p21
überexprimieren, durch eine normale Zellzyklusverteilung und eine
Gesamtzellzahl aus, die sich von gesunden, lebenden und nichtinfizierten
Zellen nicht unterscheiden.
Claims (16)
1. Verfahren zum Schutz von Säugetierzellen,
gekennzeichnet durch eine Überexpression von G-2/M-
Zellzykluskopplern.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß als G-2/M-Zellzykluskoppler CDK-
Zyklin-Komplex regulierende Proteine wie z. B. der Zellzyklusregulator
p21, eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß ein Schutz vor Zellschädigungen, die zur
Entkopplung des Zellzyklusses führen, erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß ein Schutz der Zelle vor Zytotoxizität
erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß ein Schutz vor Zelltod, erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Überexpression direkt in einer zu schützenden Zielzelle stattfindet
oder in einer anderen benachbarten Zelle, die dann einen indirekten
Schutzeffekt für die Zielzelle vermittelt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß
eine Überexpression vor, während oder nach einem die Zelle
schädigenden Ereignis stattfindet.
8. Verfahren nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß als die Zelle schädigendes Ereignis, eine
Vireninfektion, Strahlung und/oder ein chemisch induziertes Ereignis
ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß
das Gen für mindestens einen G-2/M-Zellzykluskoppler oder dessen
cDNA in eine zu schützende Zielzelle oder in eine andere Zelle
eingeführt und dort zur Expression bzw. Überexpression gebracht wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein G-2/M-Zellzykluskoppler
als Protein in den Organismus eingebracht wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, daß
der Transfer der G-2/M-Zellzykluskoppler-DNA mittels an sich
bekannter Gentechniken durch Übertragung der reinen DNA, bzw.
unter Verwendung viraler oder nichtviraler Vektoren erfolgt.
12. Verfahren nach Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet, daß
retrovirale, adenovirale, baculovirale, parvovirale, adenoassoziierte
Viren, Lentiviren herpesvirale Vektoren und/oder andere virale bzw.
nichtivrale Vektoren eingesetzt werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet, daß
mindestens ein G-2/M-Zellzykluskoppler, sein Gen oder die
entsprechende cDNA in Kombination mit anderen Agenzien,
vorzugsweise Viren, Genen, DNA-Sequenzen in die Zelle eingebracht
wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet, daß
das Gen oder die cDNA und die anderen Agenzien in unterschiedlichen
Materialien, wie Vektoren, lokalisiert sind und unabhängig
voneinander in die Zellen eingebracht werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 13 oder 14,
dadurch gekennzeichnet, daß
die DNA für den G-2/M-Zellzykluskoppler vor Einführung der anderen
Agenzien zur Expression gebracht wird.
16. Verwendung von mindestens einem überproduzierten (exprimierten)
G-2/M-Zellzykluskoppler zum Schutz von Säugetierzellen vor
Zellschädigungen, wie Zytotoxizität und Zelltod.
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|---|---|---|---|
| DE19954444A DE19954444A1 (de) | 1999-11-11 | 1999-11-11 | Verfahren zum Schutz von Säugetierzellen mittels überexprimierter G-2/M-Zellzykluskoppler |
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|---|---|---|---|
| DE19954444A DE19954444A1 (de) | 1999-11-11 | 1999-11-11 | Verfahren zum Schutz von Säugetierzellen mittels überexprimierter G-2/M-Zellzykluskoppler |
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ID=7928798
Family Applications (1)
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| BIOTECHNO 1995:25241595, Abstr. zu: Bedi,A. et al., Blood 86 (3), 1995, 1148-58 * |
| EMBASE 1999297405/AN, Abstr. zu: Kusumoto,M. et al., Clin. Cancer Res. 5/8, 1999, 2140-7 * |
| MEDLINE 1999060621/AN, Abstr. zu: Yu,D. et al., Molecular Cell 2 (5), 1998, 581-91 * |
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