Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von β-Lactoglobulin, d. h. eines
elektrophoretisch reinen Proteinkonzentrates aus der Molke, das als Lebensmittel-Zusatzstoff,
als Diätetikum oder zur Herstellung von pharmazeutischen Produkten geeignet ist.The invention relates to a process for the production of β-lactoglobulin, i.e. H. one
electrophoretically pure protein concentrate from whey, which is used as a food additive,
is suitable as a dietetic or for the manufacture of pharmaceutical products.
Es ist bekannt, daß sich das mengenmäßig wichtigste Protein der Molke, das β-Lactoglobulin,
durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Verfahren gewinnen läßt (Deutsche
Milchwirtschaft 48 (1997) 13, 479-482). Das am intensivsten bearbeitete Verfahren basiert
auf der thermischen Stabilität von β-Lactoglobulin im sauren Milieu (EP 0 20 94 14; EP 0 36 88 64;
EP 0 60 46 84 A1; EP 0 76 51 25; Journal of Dairy Research 66 (1999) 255-236).
Weitere Verfahren beruhen auf der gezielten Präzipitation in Gegenwart von Salzen (Journal
of Food Science 53 (1988) 743-752) oder auf der Löslichkeit von β-Lactoglobulin in 3%-
iger Trichloressigsäure (Journal of Dairy Science 50 (1967) 1363-1367) sowie auf der
Fraktionierung durch Ionenaustausch-Chromatographie (WO 95/19 714; EP 0 32 16 05). Ein
weiteres Verfahren zur technischen Isolierung von nativem β-Lactoglobulin aus Molke beruht
darauf, daß natives β-Lactoglobulin durch Pepsin nicht hydrolysiert werden kann (Deutsche
Milchwirtschaft 48 (1997) 13, 479-482), während bereits minimal geschädigtes Protein
proteolysierbar ist. Das Molkenprotein in mikrofiltrierter Molke oder in ultrafiltrierten
Molkenproteinkonzentraten wird daher mit Pepsin unter Einhaltung eines Enzym/Substrat-
Verhältnisses (E/S) von 1/200 und bei pH 1,8 für mindestens 120 min bei 37°C unter pH-
Stat-Bedingungen proteolysiert. Danach muß das Enzym bei pH 3,5 thermisch inaktiviert
werden. Durch Mikrofiltration werden die restlichen nicht-hydrolysierten bzw. aggregierten
Molkenproteine, die Lipoproteine sowie große Teile des inaktivierten Enzyms abgetrennt.
Aus dem Mikrofiltrationspermeat kann man durch Ultrafiltration mit Membranen der
Trenngrenze von 30 kDa und Diafiltration mit entionisiertem Wasser hochreines natives, β-
Lactoglobulin als Retentat isolieren. Nach diesem Verfahren lassen sich präparativ aus 1 kg
Molke bis zu 1,65 g β-Lactoglobulin gewinnen, d. h. die Ausbeute beträgt bei einer, β-
Lactoglobulin-Konzentration in der Ausgangsmolke von 3,2 g/l maximal 51,5%. Dieses
Verfahren ermöglicht zwar die Gewinnung von reinem, nativen β-Lactoglobulin, jedoch ist
das Gesamtverfahren aufgrund einer mehrstündigen Proteinhydrolyse und einer Vielzahl
weiterer aufeinanderfolgender Verfahrensschritte sehr zeitaufwendig, ausrüstungsintensiv und
damit unwirtschaftlich. Alle bisher bekannten Verfahren ermöglichen es zudem nicht, die
Ausbeute bei gleichbleibender Reinheit und Nativität des Proteins über das angegebene Maß
hinaus zu erhöhen. Ferner ist beim enzymatischen Verfahren nachteilig, daß für die
Diafiltration kostenintensives entionisiertes Wasser benötigt wird und daß der Enzymeinsatz
hoch ist. β-Lactoglobulin ist deshalb bis heute in der Herstellung so teuer, daß der Einsatz
beispielsweise als Lebensmittel-Zusatzstoff aus Kostengründen nicht sinnvoll ist.It is known that the most important protein in whey, the β-lactoglobulin,
can be won by a variety of different processes (German
Dairy Farming 48 (1997) 13, 479-482). The most intensively processed procedure is based
on the thermal stability of β-lactoglobulin in an acidic environment (EP 0 20 94 14; EP 0 36 88 64;
EP 0 60 46 84 A1; EP 0 76 51 25; Journal of Dairy Research 66 (1999) 255-236).
Other methods are based on the targeted precipitation in the presence of salts (Journal
of Food Science 53 (1988) 743-752) or on the solubility of β-lactoglobulin in 3% -
trichloroacetic acid (Journal of Dairy Science 50 (1967) 1363-1367) and on the
Fractionation by ion exchange chromatography (WO 95/19 714; EP 0 32 16 05). On
Another method for the technical isolation of native β-lactoglobulin from whey is based
that native β-lactoglobulin cannot be hydrolyzed by pepsin (German
Milchwirtschaft 48 (1997) 13, 479-482), while already minimally damaged protein
is proteolyzable. The whey protein in microfiltered whey or in ultrafiltered
Whey protein concentrates are therefore treated with pepsin while maintaining an enzyme / substrate
Ratio (E / S) of 1/200 and at pH 1.8 for at least 120 min at 37 ° C below pH
Stat conditions proteolyzed. The enzyme must then be thermally inactivated at pH 3.5
become. The remaining non-hydrolysed or aggregated are by microfiltration
Whey proteins, the lipoproteins and large parts of the inactivated enzyme are separated.
From the microfiltration permeate, ultrafiltration with membranes can be used
Separation limit of 30 kDa and diafiltration with deionized water, high-purity native, β-
Isolate lactoglobulin as retentate. This procedure can be used to prepare 1 kg
Obtain whey up to 1.65 g β-lactoglobulin, i.e. H. the yield is at a, β-
Lactoglobulin concentration in the whey of 3.2 g / l maximum 51.5%. This
Although the process enables the production of pure, native β-lactoglobulin, it is
the whole process due to a multi-hour protein hydrolysis and a multitude
further successive process steps are very time consuming, equipment intensive and
therefore uneconomical. All previously known methods also do not allow the
Yield with the same purity and nativity of the protein over the given measure
increase beyond. It is also disadvantageous in the enzymatic process that for
Diafiltration requires costly deionized water and that the use of enzymes
is high. To this day, β-lactoglobulin is so expensive to manufacture that it can be used
For example, as a food additive is not useful for reasons of cost.
Der vorliegenden Erfindung liegt das Problem zugrunde, die Vielzahl von notwendigen
Verfahrensschritten für die Gewinnung von β-Lactoglobulin aus Molke oder Molkenprotein-
Konzentrat, bzw. -Isolat auf Basis der Pepsinhydrolyse zu reduzieren bei gleichzeitiger
Ausbeutesteigerung und Enzymeinsparung. Dieses Problem wird durch das Verfahren nach
Patentanspruch 1 gelöst.The problem underlying the present invention is the multitude of necessary ones
Process steps for the production of β-lactoglobulin from whey or whey protein
Concentrate or isolate based on pepsin hydrolysis to reduce while simultaneously
Increased yield and enzyme savings. This problem is addressed by the procedure
Claim 1 solved.
Überraschenderweise hat es sich gezeigt, daß auf die gesonderte langwierige peptische
Hydrolyse in einem thermostatierten Reaktor verzichtet werden kann, wenn man die
Pepsinhydrolyse des Molkenproteins während der Ultrafiltration bei pH 1,5 bis 2,5, bei einem
Enzym/Substrat-Verhältnis von 1/250 bis 1/10000, vorzugsweise 1/2000 bis 1/5000 sowie
bei Temperaturen von höchstens 50°C durchführt, die Ultrafiltration bis zu einem
Konzentrationsfaktor von 1 bis 25 unter Beibehaltung eines konstanten Flüssigkeitsniveaus
betreibt und die Hydrolyse durch Diafiltration beendet. Die molare Trenngrenze der
Membranen wird dabei so gewählt, daß eine kompetitive Hemmung des Pepsins durch
Abbauprodukte vermieden wird. Zu erwarten war dieser Effekt nicht, da während der
Ultrafiltration β-Lactoglobulin permanent mechanisch und thermisch belastet wird, was leicht
zu Veränderungen in der Konformation des Proteins durch Entfaltung der Polypeptidketten
führen kann. Dabei würden die für Pepsin spezifischen Peptidbindungen aus dem Inneren der
Proteinmoleküle freigelegt und das β-Lactoglobulin wäre nicht mehr pepsinresistent. Deshalb
wurden Rührtank-Membranreaktoren bis jetzt auch nur für die Gewinnung von Peptiden und
Aminosäuren aus enzymatisch total-hydrolysierten Proteinen eingesetzt. Besonders vorteilhaft
ist die Ultrafiltration im Gleichgewichts- anstatt im Chargenbetrieb in einer Crossflow-Anlage
zu betreiben, da durch den kontinuierlichen Austausch von peptidhaltigem Permeat durch
frische Molke oder Molkenproteinkonzentrat bzw. -isolat das Enzym/Substrat-Verhältnis auf
einem äußerst geringen Niveau konstant gehalten werden kann. Dies führt dazu, daß nach
intensivem Waschen des Proteins durch Diafiltration die Enzymaktivität so stark reduziert ist,
daß auf den Verfahrensschritt "Enzyminaktivierung" verzichtet werden kann ohne daß im
getrocknetem β-Lactoglobulin eine peptische Restaktivität nachweisbar ist. Ein weiterer
wesentlicher Vorteil der Erfindung liegt in der Verwendbarkeit von Trinkwasser anstatt von
entionisiertem Wasser für die Diafiltration. Die im Molkenproteolysat vorhandenen
Chloridionen verhindern eine Belagsbildung von unlöslichen Kalziumsalzen auf den
Ultrafiltrationsmembranen, die sonst zum Verstopfen der Membranen führen würden.Surprisingly, it has been shown that on the separate lengthy peptic
Hydrolysis in a thermostatted reactor can be dispensed with if the
Pepsin hydrolysis of the whey protein during ultrafiltration at pH 1.5 to 2.5, at one
Enzyme / substrate ratio of 1/250 to 1/10000, preferably 1/2000 to 1/5000 as well
at temperatures of at most 50 ° C, the ultrafiltration up to one
Concentration factor from 1 to 25 while maintaining a constant liquid level
operates and ends the hydrolysis by diafiltration. The molar cut off of the
Membranes are chosen so that a competitive inhibition of pepsin by
Degradation products is avoided. This effect was not to be expected, since during the
Ultrafiltration β-lactoglobulin is permanently subjected to mechanical and thermal stress, which is easy
changes in the conformation of the protein by unfolding the polypeptide chains
can lead. The peptide bonds specific for pepsin would be from inside the
Protein molecules exposed and the β-lactoglobulin would no longer be pepsin resistant. Therefore
So far, stirred tank membrane reactors have only been used for the extraction of peptides and
Amino acids from enzymatically totally hydrolyzed proteins used. Particularly advantageous
is ultrafiltration in equilibrium instead of batch operation in a crossflow system
to operate because of the continuous exchange of peptide-containing permeate
fresh whey or whey protein concentrate or isolate the enzyme / substrate ratio
can be kept constant at an extremely low level. This leads to that after
intensive washing of the protein by diafiltration the enzyme activity is reduced so much
that the process step "enzyme inactivation" can be dispensed with without
dried p-lactoglobulin a peptic residual activity is detectable. Another
An essential advantage of the invention lies in the usability of drinking water instead of
deionized water for diafiltration. The ones present in the whey proteolysate
Chloride ions prevent the formation of insoluble calcium salts on the
Ultrafiltration membranes that would otherwise clog the membranes.
Als Substrat für die peptische Proteolyse können Lab- und Sauermolke,
Molkenproteinkonzentrate oder -isolate dienen. Besonders vorteilhaft ist jedoch die
Verwendung von kostengünstiger durch Zentrifugieren oder Mikrofiltration entfetteter Molke.
Dabei spielt der Molkentyp keine Rolle, da Pepsin das in der Labmolke zusätzlich enthaltene
Caseinmakropeptid problemlos abbaut. Die Proteolyse erfolgt während der Ultrafiltration bei
pH 1,5 bis 2,5 und bei Temperaturen von höchstens 50°C im Crossflow-Verfahren. Es
können alle gebräuchlichen säurefesten Ultrafiltrationsmembranen eingesetzt werden, und
zwar sowohl anorganische keramische als auch Polymermembranen mit einer molekularen
Trenngrenze von 1000 bis 100000 Da, vorzugsweise 10000 Da. Das saure Molkenpermeat
läßt sich nach Neutralisation und Aufkonzentrierung vorteilhaft für die Lactoseherstellung
nutzen, so daß beim erfindungsgemäßen Verfahren keine umweltbelastende Abprodukte
anfallen. Die peptische Proteolyse des Molkenproteins wird so lange fortgeführt, bis sich ein
deutlicher Leistungsabfall bei der Ultrafiltration einstellt. Das ist spätestens bei einem
Konzentrationsfaktor von 25 der Fall. Nun wird die Zufuhr von frischem Substrat gesperrt
und die peptisch behandelte Molke wird mit Leitungswasser bis zum Erreichen eines pH-Wert
von 3,5 bis 5,0 diafiltriert. Je nach Verwendungszweck kann das Proteinisolat zusätzlich mit
Hilfe der Mikrofiltration vor der Sprühtrocknung noch blankfiltriert und entfettet werden.
Dieser fakultative Verfahrensschritt hat aber keinen Einfluß mehr auf die elektrophoretische
Reinheit des β-Lactoglobulins. Der Gehalt an Restfett kann aber auch durch Zentrifugieren
reduziert werden. Die zu wählende Variante hängt in hohem Maße von den geforderten
Produkteigenschaften des Anwenders ab. Der reduzierte Restfettgehalt hat den Vorteil, daß
die Funktionalität, vor allem die Schaum- und Emulgiereigenschaften, des isolierten β-
Lactoglobulins deutlich verbessert werden können.As a substrate for peptic proteolysis, rennet and sour whey,
Whey protein concentrates or isolates are used. However, the is particularly advantageous
Use of inexpensive whey defatted by centrifugation or microfiltration.
The type of whey is irrelevant since pepsin also contains the whey
Degrades casein macropeptide easily. Proteolysis takes place during ultrafiltration
pH 1.5 to 2.5 and at temperatures of up to 50 ° C in the crossflow process. It
all common acid-resistant ultrafiltration membranes can be used, and
both inorganic ceramic and polymer membranes with a molecular one
Separation limit of 1000 to 100000 Da, preferably 10000 Da. The sour whey permeate
After neutralization and concentration, it can be used advantageously for lactose production
use, so that no environmentally harmful waste products in the inventive method
attack. The peptic proteolysis of the whey protein is continued until a
sets a clear drop in performance in ultrafiltration. That is at the latest with one
Concentration factor of 25 the case. Now the supply of fresh substrate is blocked
and the peptically treated whey is rinsed with tap water until a pH is reached
from 3.5 to 5.0 diafiltered. Depending on the intended use, the protein isolate can also be used
With the help of microfiltration, be bare filtered and degreased before spray drying.
This optional process step no longer has any influence on the electrophoretic
Purity of β-lactoglobulin. The residual fat content can also be determined by centrifugation
be reduced. The variant to be chosen depends to a large extent on the required
Product properties of the user. The reduced residual fat content has the advantage that
the functionality, especially the foam and emulsifying properties, of the isolated β-
Lactoglobulins can be improved significantly.
Ausführungsbeispieleembodiments
Die Erfindung wird an drei Beispielen erläutert.The invention is illustrated by three examples.
Beispiel 1example 1
1000 l Labmolke mit einem Gehalt von 3,2 g/l β-Lactoglobulin werden zentrifugiert und mit
konz. Salzsäure auf pH 1,5 eingestellt. Anschließend wird der Umlaufbehälter einer
Ultrafiltrationsanlage mit dieser Molke gefüllt und Pepsin in einem E/S = 1/10000, bezogen
auf den Molkenproteingehalt, zugegeben. Die Ultrafiltration erfolgt bei 42°C und mit
Membranen der molekularen Trenngrenze von 30000 Da, wobei ständig so viel frische Molke
zugegeben wird wie Permeat abgezogen wird. Das Permeat wird zur Entsalzung und
Aufkonzentrierung nanofiltriert und dient als Rohstoff für die Lactoseherstellung. Der Zulauf
frischer Molke wird bei Erreichen des Konzentrationsfaktors 25 gestoppt und die Diafiltration
erfolgt mit Leitungswasser, bis sich ein pH-Wert von 3,0 einstellt. Nach Sprühtrocknung
erhält man 3,1 kg elektrophoretisch reines β-Lactoglobulin mit einem Proteinanteil von 75,1
%. Die Ausbeute beträgt 72,7% bezogen auf das ursprünglich in der Molke vorhandene β-
Lactoglobulin.1000 l of rennet whey with a content of 3.2 g / l of β-lactoglobulin are centrifuged and with
conc. Hydrochloric acid adjusted to pH 1.5. Then the circulation tank becomes one
Ultrafiltration system filled with this whey and pepsin in an E / S = 1/10000
on the whey protein content, added. The ultrafiltration takes place at 42 ° C and with
Membranes with a molecular separation limit of 30,000 Da, with so much fresh whey all the time
is added as permeate is withdrawn. The permeate is used for desalination and
Concentration is nanofiltered and serves as a raw material for lactose production. The inflow
fresh whey is stopped when the concentration factor 25 is reached and the diafiltration
with tap water until a pH of 3.0 is reached. After spray drying
3.1 kg of electrophoretically pure β-lactoglobulin with a protein content of 75.1 are obtained
%. The yield is 72.7% based on the β- originally present in the whey
Lactoglobulin.
Beispiel 2Example 2
1000 l Sauermolke werden mikrofiltriert und mit konz. Salzsäure auf pH 2,5 eingestellt. Die
peptische Hydrolyse erfolgt bei einem E/S von 1/250 und bei einer Temperatur von 50°C in
einer Ultrafiltrationsanlage gemäß Beispiel 1 bis zum Erreichen des Konzentrationsfaktors 10.
Nach Diafiltration mit Trinkwasser bis pH 5,0 und bei Temperaturen von 45°C wird das
Proteinretentat durch Mikrofiltration von unlöslichen Spuren sowie vom Restfett befreit und
anschließend sprühgetrocknet. Das Mikrofiltrations-Retentat wird dem folgenden Ansatz
wieder zugegeben, so daß Ausbeuteverluste minimiert werden können. Es fallen 2,2 kg
elektrophoretisch reines β-Lactoglobulin mit einem Proteinanteil von 89,6% an, wobei die
Ausbeute 61,6% beträgt.1000 l sour whey are microfiltered and concentrated. Hydrochloric acid adjusted to pH 2.5. The
peptic hydrolysis takes place at an E / S of 1/250 and at a temperature of 50 ° C
an ultrafiltration system according to Example 1 until the concentration factor 10 is reached.
After diafiltration with drinking water up to pH 5.0 and at temperatures of 45 ° C
Protein retentate freed from insoluble traces and residual fat by microfiltration and
then spray dried. The microfiltration retentate takes the following approach
added again so that losses in yield can be minimized. There are 2.2 kg
electrophoretically pure β-lactoglobulin with a protein content of 89.6%, the
Yield is 61.6%.
Beispiel 3Example 3
100 l Molkenproteinkonzentrat werden auf einen Proteingehalt von 1,0% mit Trinkwasser
verdünnt und mit konz. Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt. Die peptische Hydrolyse erfolgt bei
einem E/S von 1/400 und bei einer Temperatur von 40°C in einer Ultrafiltrationsanlage bis
zu einem Konzentrationsfaktor von 1,0. Nach Diafiltration mit Trinkwasser bis pH 4,0 wird
das Proteinisolat sprühgetrocknet. Es fallen 0,4 kg elektrophoretisch reines β-Lactoglobulin
mit einem Proteinanteil von 83,2% an, wobei die Ausbeute 66,5% beträgt.100 l of whey protein concentrate are made up to a protein content of 1.0% with drinking water
diluted and with conc. Hydrochloric acid adjusted to pH 2.0. The peptic hydrolysis takes place at
an E / S of 1/400 and at a temperature of 40 ° C in an ultrafiltration system up to
to a concentration factor of 1.0. After diafiltration with drinking water up to pH 4.0
spray dried the protein isolate. 0.4 kg of electrophoretically pure β-lactoglobulin fall
with a protein content of 83.2%, the yield being 66.5%.