DE19946656A1 - Production of biologically activated magnetic particles, useful for detection and quantification of e.g. bacteria, by attachment of specific antibody - Google Patents

Production of biologically activated magnetic particles, useful for detection and quantification of e.g. bacteria, by attachment of specific antibody

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Abstract

Production of biologically activated ferromagnetic particles (A) comprising mixing excess reagent (R1) with ferromagnetic particles (B) coated with a second reagent (R2) and separating aggregated particles consisting of R1 and (B) by partial sedimentation, is new. Production of biologically activated ferromagnetic particles (A) comprising mixing excess reagent (R1) with ferromagnetic particles (B) coated with a second reagent (R2) and separating aggregated particles consisting of R1 and (B) by partial sedimentation, is new. R1/R2 are primary antibody (Ab1) and secondary antibody (Ab2), virus and antibody (Ab3) directed against a viral capsid protein or a spacer molecule-coupled oligonucleotide gene probe (P) and antibody (Ab4) directed against the spacer. An Independent claim is also included for an apparatus for detecting or counting biological microparticles suspended in a liquid sample.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Darstellung von biologisch aktivierten ferromagnetischen Partikeln. Zu­ dem betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum Nachweis und Zählen von suspendierten biologischen Mikropartikeln in flüssigen Proben, insbesondere zum Durchführen des genann­ ten Verfahrens.The invention relates to a method for the representation of biologically activated ferromagnetic particles. To the invention relates to a device for detection and counting suspended biological microparticles in liquid samples, especially for performing the genann procedure.

Das Zählen von Bakterien, Blutzellen oder Zellbestandteilen in wässrigen Lösungen erfolgt bisher mittels Durch­ flusszytometer oder Coultercounter. Hier werden die ent­ sprechenden Partikel gefärbt und anhand von optischen Signalen identifiziert oder durch kapazitive Messungen ge­ zählt.Counting bacteria, blood cells or cell components So far, in aqueous solutions by means of flow cytometer or coulter counter. Here are the ent speaking particles colored and based on optical Signals identified or ge by capacitive measurements counts.

In Kenntnis dieser Gegebenheiten hat sich der Erfinder das Ziel gesetzt, derartige Messungen zu vereinfachen.Knowing these facts, the inventor did it The goal is to simplify such measurements.

Zur Lösung dieser Aufgabe führt die Lehre des unabhängigen Anspruches; die Unteransprüche geben günstige Weiterbildun­ gen an. Zudem fallen in den Rahmen der Erfindung alle Kom­ binationen aus zumindest zwei der in der Beschreibung, der Zeichnung und/oder den Ansprüchen offenbarten Merkmalen.The teaching of the independent leads to the solution of this task Claim; the subclaims give favorable further training to. In addition, all com fall within the scope of the invention binations from at least two of the ones in the description, the Drawing and / or the features disclosed in the claims.

Erfindungsgemäß werden monovalente primäre Antikörper mit ferromagnetischen Partikeln in mehrfachem Überschuss ge­ mischt, welche mit sekundären Antikörpern beschichtet sind; anschließend werden mittels partieller Sedimentation in einer Zentrifuge aggregierte Partikel abgetrennt, die aus einem monovalenten primären Antikörper und antikörperbe­ schichteten ferromagnetischen Teilpartikeln bestehen. An­ stelle primärer Antikörper können auch Viren oder Gensonden verwendet werden, gegen deren Hüllproteine bzw. Spacer­ moleküle die sekundären Antikörper gerichtet sind. According to the invention, monovalent primary antibodies are used Ferromagnetic particles in multiple excess mixes which are coated with secondary antibodies; then, by means of partial sedimentation in a centrifuge separated aggregate particles that from a monovalent primary antibody and antibody layered ferromagnetic partial particles exist. On Instead of primary antibodies, viruses or gene probes can also be used are used against their coat proteins or spacers molecules the secondary antibodies are directed.  

Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung können die biolo­ gischen Partikel immunologisch, phagologisch oder mole­ kularbiologisch mit Partikeln verbunden werden, die beim anschließenden Durchströmen einer Metallspule messbare und zählbare Induktivitätsänderungen auslösen.According to a further feature of the invention, the biolo gische particles immunological, phagological or mole are biologically connected with particles that subsequent flow through a metal coil measurable and trigger countable changes in inductance.

Auch hat es sich als günstig erwiesen, induktivitätsän­ dernde, ferromagnetische Partikel vor dem Durchströmen der Metallspule mittels Elektromagnet in einer Kunststoffkapil­ lare festzuhalten und dort mit den in die Kapillare ein­ strömenden biologischen Mikropartikeln zu verbinden, wäh­ rend die Probe, in welcher diese enthalten waren, aus der Kapillare herausgeführt wird. Zudem sollen durch die Me­ tallspule als Teil eines elektronischen Schwingkreises zählbare Änderungen der Eigenschwingfrequenz erzeugt werden.It has also proven to be cheap, inductive changing ferromagnetic particles before flowing through the Metal coil using an electromagnet in a plastic cap hold on and insert them into the capillary to combine flowing biological microparticles while rend the sample in which they were contained from the Capillary is led out. In addition, the Me tall coil as part of an electronic resonant circuit generates countable changes in the natural oscillation frequency become.

Um den apparativen Aufwand bei der optischen Messung zu um­ gehen und eine höhere Spezifität gegenüber der kapazitiven Messung zu erreichen, wird also für den Nachweis des ein­ zelnen Partikels ein geändertes Messprinzip eingesetzt: Die Messung der Induktivitätsänderung einer Mikrospule aus Me­ tall. Da biologische Partikel aber eine Permeabilitätskon­ stante µ von annähernd 1 haben, müssen diese zum Nachweis und zur Zählung mittels Spule zuvor mit induktivitäts­ ändernden Substanzen markiert werden. Diese Markierung ge­ schieht durch die immunologische, phagologische oder mole­ kularbiologische Ankopplung von ferromagnetischen Parti­ keln, welche monovalent entweder mit Antikörpern, mit Virus-Andockmolekülen oder mit Gensonden an Spacermolekülen verbunden sind.In order to reduce the expenditure on equipment for optical measurement go and have a higher specificity to the capacitive Reaching measurement is therefore used for the detection of a used a different measuring principle for individual particles: the Measurement of the change in inductance of a micro coil made of Me tall. Since biological particles have a permeability con constant µ of approximately 1, they must be used for verification and for counting by means of a coil beforehand with inductivity changing substances are marked. This mark ge shoots through the immunological, phagological or mole biological biological coupling of ferromagnetic parts which are monovalent with either antibodies with Virus docking molecules or with gene probes on spacer molecules are connected.

Die Ankopplung der ferromagnetischen Marker geschieht in einer Vorrichtung, welche gleichzeitig eine Anreicherung der zu zählenden Partikel ermöglicht: Die Marker werden in einer Teflonkapillare mittels eines Elektromagneten als Sorptions-Schicht festgehalten, bis die gesamte Probe in die Kapillare gepumpt wurde und gleichzeitig die überschüs­ sige Probe aus der Kapillare herausgelaufen ist. Hierauf wird der Magnet ausgeschaltet, damit die Marker frei dif­ fundieren und die Oberfläche der biologischen Partikel sättigen können. Darauf wird der Kapillaren-Inhalt mit einer piezoelektrischen Pumpe durch eine Metallspule ge­ pumpt, die als Spirale auf eine Leiterplatte geätzt wurde und mit Kondensator und Widerstand als Schwingkreis ge­ schaltet ist. Der Schwingkreis wird mit einer Frequenz an­ geregt, die derjenigen Eigenschwingfrequenz entspricht, welche generiert wird, wenn sich ein durchschnittlich mar­ kierter biologischer Mikropartikel in der Spule befindet. Dadurch entsteht im Schwingkreis immer dann eine Resonanz­ schwingung, wenn ein entsprechender Mikropartikel durch die Spule tritt.The ferromagnetic markers are coupled in a device which is simultaneously an enrichment of the particles to be counted: The markers are in a Teflon capillary using an electromagnet as Sorption layer held until the entire sample is in the capillary was pumped and at the same time the excess  sample has run out of the capillary. On that the magnet is switched off so that the markers are free dif base and the surface of the biological particles can saturate. Then the capillary content is added a piezoelectric pump through a metal coil pumps, which was etched as a spiral on a circuit board and ge with capacitor and resistor as a resonant circuit is switched. The resonant circuit is at a frequency excited, which corresponds to that natural oscillation frequency, which is generated when an average mar biological microparticles in the coil. This always creates a resonance in the resonant circuit vibration when a corresponding microparticle passes through the Coil occurs.

Ein Beispiel für die Anwendung dieses Verfahrens ist der Nachweis von Kolibakterien in Wasserproben. Hierzu werden monovalente primäre E.-coli-spezifische Antikörper mit an magnetische Beads gekoppelten sekundären Antikörpern konju­ giert. Die Suspension dieser Konjugate wird in die Teflon- Kapillare gepumpt und mittels Elektromagnet dort fixiert. Beim Durchströmen der Kapillare mit der zu untersuchenden Wasserprobe werden Kolibakterien über die primären Antikör­ per an den Konjugaten festgehalten. Nach dem Abschalten des Magneten kann die Suspension von magnetisch markierten Kolibakterien durch die Messspule gepumpt werden. Die An­ zahl der Resonanz-Ereignisse im angeschlossenen Schwing­ kreis entspricht der Anzahl der Kolibakterien in der ur­ sprünglichen Wasserprobe. Durch den Einsatz dieses Gerätes und der entsprechenden Konjugate ist es möglich, ohne den aufwendigen Einsatz der Durchflusszytometrie Bakterien automatisch zu zählen. Des weiteren ist es möglich, mit dieser Messmethode eine Miniaturisierung des Nachweisgerä­ tes zu erreichen. An example of the application of this method is Detection of coli bacteria in water samples. To do this monovalent primary E. coli-specific antibodies magnetic beads coupled secondary antibodies konju yaws. The suspension of these conjugates is transferred to the Teflon Pumped capillary and fixed there by means of an electromagnet. When flowing through the capillary with the one to be examined Water sample will coli bacteria over the primary antibody attached to the conjugates. After switching off the Magnets can be the suspension of magnetically marked Coli bacteria are pumped through the measuring coil. The An number of resonance events in the connected oscillation circle corresponds to the number of coli bacteria in the original initial water test. By using this device and the corresponding conjugates, it is possible without the elaborate use of flow cytometry bacteria count automatically. It is also possible to use a miniaturization of the detection device to achieve it.  

Mit der beschriebenen Technik werden Partikel wie Bakte­ rien, Zellen oder Zellbestandteile in wässrigen Lösungen nachgewiesen und gezählt. Diese Technik ermöglicht eine Mi­ niaturisierung des automatischen Partikelzählverfahrens. Dazu werden die Partikel vor der Messung durch die Reaktion mit monovalenten antikörper- bzw. virenbeschichteten ferro­ magnetischen Partikeln markiert. Die induktive Messung be­ ruht auf dem Passieren der mit den biologischen Partikeln aggregierten ferromagnetischen Partikel durch die Mikro­ spule eines elektronisches Schwingkreises. Die beim Passie­ ren auftretenden Resonanzereignisse werden gezählt.With the technique described, particles become like bacteria cells, cells or cell components in aqueous solutions proven and counted. This technology enables a Mi niaturization of the automatic particle counting process. To do this, the particles are measured before the reaction with monovalent ferro coated with antibodies or viruses marked magnetic particles. The inductive measurement be rests on passing through with the biological particles aggregated ferromagnetic particles through the micro coil of an electronic resonant circuit. The one at the Passie Any resonance events that occur are counted.

Die Vorrichtung kann in der Medizin, Mikrobiologie und Hygiene eingesetzt werden, beispielsweise zum Auszählen von Blutzellen; es können ökologisch relevante Mikroorganismen ausgezählt oder krankheitserregende Keime nachgewiesen werden. The device can be used in medicine, microbiology and Hygiene can be used, for example to count Blood cells; it can be ecologically relevant microorganisms counted or pathogens detected become.  

Weitere Vorteile, Merkmale und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung eines be­ vorzugten Ausführungsbeispieles sowie anhand der Zeichnung; diese zeigt inFurther advantages, features and details of the invention result from the following description of a be preferred embodiment and with reference to the drawing; this shows in

Fig. 1 ein Schema zu einem erfindungsgemäßen Verfahren; FIG. 1 is a schematic of a process of this invention;

Fig. 2 ein Detail der Fig. 1 in schematisierter Schrägsicht. Fig. 2 shows a detail of Fig. 1 in a schematic oblique view.

Vor einem Verfahren zum Nachweis von Kolibakterien in einer durch eine Leitung 10 zugeführten Wasserprobe Z werden mo­ novalente primäre E.-coli-spezifische Antikörper mit an ma­ gnetische Beads gekoppelten sekundären Antikörpern konju­ giert. Die Leitung für die monovalenten magnetischen Parti­ kel F ist mit 12 bezeichnet. Beide Leitungen 10, 12 enthal­ ten Schlauchpumpen 14 und vereinigen sich nach diesen zu einer gemeinsamen Förderleitung 16.Before a method for the detection of coli bacteria in a water sample Z fed through a line 10 , modern primary E. coli-specific antibodies are conjugated with secondary antibodies coupled to magnetic beads. The line for the monovalent magnetic Parti angle F is designated 12 . Both lines 10 , 12 contain th peristaltic pumps 14 and combine to form a common delivery line 16 .

Das Reagenz mit ferromagnetischen, biologisch aktivierten Partikeln wird über die Leitungen 12 und 16 in eine Teflonkapillare 20 gepumpt und dort mittels eines Elektro­ magneten 22 fixiert, dessen Magnetspule mit 24 bezeichnet und dem die Z-förmig aufgewickelte Teflonkapillare 20 in einem konzentrischen Polschuh 26 zugeordnet ist. Dieser begrenzt mit einem von ihm in Radialabstand umgebenen Polstift 28 einen Ringraum 30 für die Teflonkapillare.The reagent with ferromagnetic, biologically activated particles is pumped via the lines 12 and 16 into a Teflon capillary 20 and fixed there by means of an electric magnet 22 , the magnet coil of which is designated 24 and the Z-shaped wound Teflon capillary 20 in a concentric pole piece 26 is assigned . This delimits an annular space 30 for the Teflon capillary with a pole pin 28 surrounded by it at a radial distance.

Beim Durchströmen der Kapillare 20 mit der zu untersuchen­ den Wasserprobe Z werden Kolibakterien als zu zählende bio­ logische Partikel über die primären Antikörper an den fer­ romagnetischen Konjugaten festgehalten. Nach dem Abschalten des Elektromagneten 22 kann die Suspension von magnetisch markierten Kolibakterien dank einer Piezopumpe 32 in einer Messleitung 34 durch eine geätzte Metallspule als Messspule 36 einer mikrosystemtechnischen Einheit 40 transportiert werden. Aus dieser werden die gezählten Partikel in Pfeilrichtung X ausgetragen.When the water sample Z to be examined flows through the capillary 20, coli bacteria as biological particles to be counted are held onto the ferromagnetic conjugates via the primary antibodies. After the electromagnet 22 has been switched off , the suspension of magnetically marked coli bacteria can be transported in a measuring line 34 by means of a piezo pump 32 through an etched metal coil as a measuring coil 36 of a microsystem unit 40 . The counted particles are discharged from this in the direction of arrow X.

Die freien Enden 38, 38a der Messspule 36 sind - nach einem Widerstand 42 und einem Kondensator 44 - an eine Einrichtung 46 zum Anregen der Schwingung und zum Messen von Resonanzereignissen angeschlossen; dort erfolgt eine Umwandlung in Zählimpulse.The free ends 38 , 38 a of the measuring coil 36 are - after a resistor 42 and a capacitor 44 - connected to a device 46 for exciting the vibration and for measuring resonance events; there is a conversion into counts.

Die Anzahl der Resonanzereignisse im angeschlossenen Schwingkreis entspricht der Anzahl der Kolibakterien in der ursprünglichen Wasserprobe Z.The number of resonance events in the connected The resonant circuit corresponds to the number of coli bacteria in the original water sample Z.

Zwischen der Teflonkapillare 20 und der Piezopumpe 32 ist ein - ein Ventil 48 enthaltender - Leitungsabzweig 18 für überschüssige Probeanteile Q vorgesehen, dem in der För­ derleitung 16 ein Ventil 48 nachgeschaltet ist.Between the Teflon capillary 20 and the piezo pump 32 is a - a valve 48 containing - line branch 18 for excess sample Q is provided, which is connected in the För derleitung 16 a valve 48 .

Claims (12)

1. Verfahren für die Darstellung von biologisch aktivier­ ten ferromagnetischen Partikeln, dadurch gekennzeichnet, dass monovalente primäre Antikörper mit ferromagneti­ schen Partikeln im Überschuss gemischt werden, welche mit sekundären Antikörpern beschichtet sind, und an­ schließend mittels partieller Sedimentation aggre­ gierte Partikel abgetrennt werden, die aus einem mo­ novalenten primären Antikörper und antikörperbe­ schichteten ferromagnetischen Teilpartikeln bestehen.1. A method for the display of biologically activated ferromagnetic particles, characterized in that monovalent primary antibodies are mixed with ferromagnetic particles in excess, which are coated with secondary antibodies, and then aggregated particles are separated off by means of partial sedimentation a modern primary antibody and antibody-coated ferromagnetic partial particles. 2. Verfahren für die Darstellung von biologisch aktivier­ ten ferromagnetischen Partikeln, dadurch gekennzeich­ net, dass Viren mit ferromagnetischen Partikeln im Überschuss gemischt werden, welche mit gegen die Hüll­ proteine der Viren gerichteten Antikörpern beschichtet sind, und anschließend mittels partieller Sedimen­ tation aggregierte Partikel abgetrennt werden, die aus einem Virus und antikörper-beschichteten ferromagne­ tischen Teilpartikeln bestehen.2. Procedure for the representation of biologically activated ten ferromagnetic particles, characterized net that viruses with ferromagnetic particles in the Excess are mixed, which with against the envelope Proteins of the virus-directed antibodies coated are, and then by means of partial sediments tation aggregated particles are separated out from a virus and antibody-coated ferromagne table partial particles exist. 3. Verfahren für die Darstellung von biologisch aktivier­ ten ferromagnetischen Partikeln, dadurch gekennzeich­ net, dass spacermolekül-gekoppelte Oligonukleotid-Gen­ sonden mit ferromagnetischen Partikeln im Überschuss gemischt werden, welche mit gegen die Spacermoleküle gerichteten Antikörpern beschichtet sind, und an­ schließend mittels partieller Sedimentation aggre­ gierte Partikel abgetrennt werden, die aus einer Gen­ sonde und antikörper-beschichteten ferromagnetischen Teilpartikeln bestehen. 3. Procedure for the representation of biologically activated ten ferromagnetic particles, characterized net that spacer molecule-coupled oligonucleotide gene probes with excess ferromagnetic particles are mixed, which with against the spacer molecules directed antibodies are coated, and on closing by means of partial sedimentation aggre gated particles are separated from a gene probe and antibody-coated ferromagnetic Particles exist.   4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Partikel immu­ nologisch, phagologisch oder molekularbiologisch mit Partikeln verbunden werden, die als Marker beim an­ schließenden Durchströmen einer Metallspule meßbare und zählbare Induktivitätsänderungen auslösen.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized characterized that the biological particles immu ecological, phagological or molecular biological with Particles are connected, which act as markers at the closing flows through a metal coil measurable and trigger countable changes in inductance. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass induktivitätsändernde, ferromagnetische Partikel vor dem Durchströmen der Metallspule mittels Elektro­ magnet in einer Kunststoffkapillare festgehalten und dort mit den in die Kapillare einströmenden biologi­ schen Mikropartikeln verbunden werden, während die sie enthaltende Probe aus der Kapillare herausgeführt wird.5. The method according to claim 4, characterized in that inductance changing ferromagnetic particles before flowing through the metal coil by means of electro magnet held in a plastic capillary and there with the biologi flowing into the capillary microparticles are connected while they containing sample out of the capillary becomes. 6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeich­ net, dass durch die Metallspule als Teil eines elek­ tronischen Schwingkreises beim Durchströmen der induk­ tivitätsändernden Partikel zählbare Änderungen der Eigenschwingfrequenz erzeugt werden.6. The method according to claim 4 or 5, characterized in net that through the metal coil as part of an elek tronic resonant circuit when flowing through the induc activity-changing particles countable changes in Natural vibration frequency are generated. 7. Vorrichtung zum Nachweis und Zählen für suspendierte biologische Mikropartikel in flüssigen Proben, insbe­ sondere Vorrichtung zum Durchführen der Verfahren nach wenigstens einem der voraufgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Förderleitung (16) für eine zu messende Probe als Messleitung (34) von einer Me­ tallspule als Messspule (36) umgeben und diese an eine Einrichtung (46) zum Anregen der Schwingung und Messen von Resonanzereignissen angeschlossen ist.7. Device for detection and counting for suspended biological microparticles in liquid samples, in particular special device for performing the method according to at least one of the preceding claims, characterized in that a conveying line ( 16 ) for a sample to be measured as a measuring line ( 34 ) from one Me tallspule surrounded as a measuring coil ( 36 ) and this is connected to a device ( 46 ) for exciting the vibration and measuring resonance events. 8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Förderleitung (16) an eine Einrichtung mit Kapillaren (20), insbesondere Teflonkapillaren, ange­ schlossen ist sowie letztere einem Elektromagneten (22) zugeordnet sind. 8. The device according to claim 7, characterized in that the delivery line ( 16 ) is connected to a device with capillaries ( 20 ), in particular Teflon capillaries, and the latter are assigned to an electromagnet ( 22 ). 9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die Kapillaren (20) in einem von einem Polschuh (24) umgebenen Raum (30) angeordnet sind.9. The device according to claim 7 or 8, characterized in that the capillaries ( 20 ) are arranged in a space ( 30 ) surrounded by a pole piece ( 24 ). 10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den Elektromagneten (22) und einem Ventil (48) der Förderleitung (16) eine Zweigleitung (18) für überschüssige Proben (Q) ange­ ordnet ist.10. Device according to one of claims 7 to 9, characterized in that between the electromagnets ( 22 ) and a valve ( 48 ) of the delivery line ( 16 ), a branch line ( 18 ) for excess samples (Q) is arranged. 11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Einrichtung (46) zum Anregen der Schwingung und Messen von Resonanzereignissen zur Metallspule (36) hin wenigstens ein Widerstand (42) und ein Kondensator (44) vorgeordnet sind.11. The device according to one of claims 7 to 10, characterized in that at least one resistor ( 42 ) and a capacitor ( 44 ) are arranged upstream of the device ( 46 ) for exciting the vibration and measuring resonance events towards the metal coil ( 36 ). 12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Messspule (36) mit vorgeord­ neter Piezopumpe (32) und nachgeordnetem Widerstand (42) bzw. Kondensator (44) Teile einer mikrosystem­ technischen Einheit (40) sind.12. Device according to one of claims 7 to 11, characterized in that the measuring coil ( 36 ) with vorgeord Neter piezo pump ( 32 ) and downstream resistor ( 42 ) or capacitor ( 44 ) are parts of a microsystem technical unit ( 40 ).
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