DE10200549A1 - Sorting and counting of biological particles, comprises marking with paramagnetic or dielectric nanoparticles, to be passed a sensor which registers field changes to give signals which can be counted electronically - Google Patents

Sorting and counting of biological particles, comprises marking with paramagnetic or dielectric nanoparticles, to be passed a sensor which registers field changes to give signals which can be counted electronically

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Abstract

Sorting and counting biological particles, where the non-agglutinate particles are marked with paramagnetic or dielectric nano particles of 5-500 nm. The marking is through bi-functional molecules, genetic probes, viruses or specific adsorbent proteins, and the marked biological particles are boosted in an electrical or magnetic field before or after counting. Sorting and counting biological particles, where the non-agglutinate particles are marked with paramagnetic or dielectric nano particles of 5-500 nm. The marking is through bi-functional molecules, genetic probes, viruses or specific adsorbent proteins, and the marked biological particles are boosted in an electrical or magnetic field before or after counting. The biological particles are carried by a shrouding liquid continuously or separately as a string of pearls past a sensor (46), which can be capacitative or magnetic e.g. gradiometeric, magnetoresistive or flux-gate. The sensor is a component part of a micro-electromechanical system (40) with micro-fluid elements of 5-500 mum. The field changes registered as the marked particles flow past are converted into signals which can be counted electronically.

Description

STAND DER TECHNIKSTATE OF THE ART

Techniken zur magnetischen Trennung von Zellen gehen bis in den Anfang der Nanobiotechnologie in den 90-er Jahren zurück. Die immer fortschreitende Integration von biologischen Funktionen in mikroelektromechanische Systeme (BioMEMS) führte 1996 zur Veröffentlichung eines voll integrierten magnetischen "Filters" für biologische Partikel. Seit 2001 gibt es "Bio- Chips" für intelligente Mikrosysteme, die den empfindlichen qualitativ-magnetischen Nachweis von relevanten Stoffen in der medizinischen Diagnostik ermöglichen. Techniques for magnetic separation of cells go all the way the beginning of nanobiotechnology back in the 90s. The progressive integration of biological Functions in microelectromechanical systems (BioMEMS) 1996 to release a fully integrated magnetic "Filters" for biological particles. Since 2001 there have been "organic Chips "for intelligent microsystems that are sensitive qualitative-magnetic detection of relevant substances in the enable medical diagnostics.

Im Bereich der biomedizinisch-analytischen Messtechnik zeichnet sich schon heute ab, dass mit sogenannten lab-onchip-Systemen große Teile der medizinischen Diagnostik, Umweltanalytik und Qualitätskontrollen in der Lebensmittelindustrie von komplizierten Labormeßstationen auf billige, einfach zu bedienende mikroelektronische Systeme übertragbar sind. In the field of biomedical-analytical measurement technology is already emerging today with so-called lab-onchip systems large parts of medical diagnostics, Environmental analysis and quality controls in the Food industry from complicated laboratory measuring stations cheap, easy-to-use microelectronic systems are transferable.

Für die Zählung bzw. Sortierung von Zellen sind inzwischen Verfahren geschützt, die komplexe durchflußcytometrische Analysen mit mobilen bench-top-Geräten ermöglichen (US 6097485). Andere beschreiben das nützliche Zusammenwirken von klassischer Durchflußcytometrie und magnetischen Partikeln als Festphasen (US 6280618 B2). Ein anderes Patent schildert die Zählung von magnetisch markierten Zellen in einer mikrosystemtechnischen Einheit (DE 199 39 208). For the counting or sorting of cells are meanwhile Process protected, the complex flow cytometric Enable analysis with mobile bench-top devices (US 6097485). Others describe the useful interaction of classic flow cytometry and magnetic particles as solid phases (US 6280618 B2). Another patent describes the counting of magnetically marked cells in one microsystem unit (DE 199 39 208).

NACHTEILE UND PROBLEMEDISADVANTAGES AND PROBLEMS

Diese Quantifizierung von Zellen erfolgt derzeit, trotz dem stark weiter entwickelten Stand der Technik, mit der in Betrieb und Anschaffung äußerst teuren, aber für Sonderanwendungen geeigneten Durchflußcytometrie, mit zeitraubenden Kulturverfahren oder mit nur halbquantitativen Schnellverfahren. This quantification of cells is currently taking place, despite that highly developed state of the art with which in Operation and purchase extremely expensive, but for Flow cytometry suitable for special applications time-consuming culture processes or with only semi-quantitative Quick method.

Der Stand der Technik erlaubt noch keine Sortierung und Quantifizierung biologischen Partikeln mit mobilen und preiswerten Vorrichtungen oder ist nicht derart aufgebaut, dass mit den derzeit verfügbaren Sensoren eine maximale Messgenauigkeit erreicht wird. The state of the art does not yet allow sorting and Quantification of biological particles with mobile and inexpensive devices or is not constructed in such a way that with the currently available sensors a maximum Measurement accuracy is achieved.

AUFGABETASK

Die Nachweisgrenze des Standes der Technik der Detektion von mit biologischen Partikeln verbundenen magnetisierbaren Beads soll wesentlich herabgesetzt werden. The detection limit of the prior art for the detection of magnetizable beads associated with biological particles should be significantly reduced.

Es soll eine Methode entwickelt werden, um auch in komplexen Matrizes biologische Partikel exakt zu sortieren und zu quantifizieren. A method is to be developed, even in complex Matrices to sort and sort biological particles exactly quantify.

LÖSUNGSPRINZIPSOLUTION PRINCIPLE

Die gesuchten Zellen sollen nicht agglutinierend über . Antikörpern mit magnetisierbaren Nanopartikeln markiert werden. Anschließend werden im Magnetfeld die Zellen von dem Umgebungsmedium abgetrennt. Darauf werden die Zellen im Hüllflußstrom durch einen Mikrochip gepumpt und ergeben dort an einem Sensor ein elektronisches Meßsignal. Dieses analoge Signal wird mittels einer geeigneten Elektronik als Meßwert dargestellt. The cells sought should not over agglutinate. Antibodies labeled with magnetizable nanoparticles become. Then the cells of the Surrounding medium separated. Then the cells in the Sheath flow stream pumped through a microchip and result there an electronic measurement signal on a sensor. This analog The signal is measured using suitable electronics shown.

BEISPIELEXAMPLE

In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird eine zu untersuchende Probe (2) zu einem vorgefertigten Reagenz in einem Einweggefäß (4) gegeben, welches in eine Öffnung an der gesamten Messvorrichtung eingesetzt werden kann. Das vorgefertigte Reagenz ist derart hergestellt, dass sich einzelne paramagnetische Beads (5-500 nm) spezifisch an die Zielpartikel anlagern, ohne dass es zu einer Agglutination der biologischen Partikel kommt. Dies kann entweder durch ein geeignetes Mischungsverhältnis von Antikörper-beschichteten Beads und biologischen Partikeln erreicht werden, oder durch den Einsatz von monovalenten Beads (Beads mit nur einer Bindungsstelle). In a preferred embodiment, a sample ( 2 ) to be examined is added to a prefabricated reagent in a disposable container ( 4 ) which can be inserted into an opening in the entire measuring device. The prefabricated reagent is produced in such a way that individual paramagnetic beads (5-500 nm) attach specifically to the target particles without causing agglutination of the biological particles. This can be achieved either by a suitable mixing ratio of antibody-coated beads and biological particles, or by using monovalent beads (beads with only one binding site).

In der Messvorrichtung wird nach einer Inkubation unter regulierten Bedingungen die Mischung aus Reagenz und Probe durch ein Dreiwegeventil (7) mittels einer Pumpe (9) angesaugt. Mit dieser Pumpe kann anhand der Drehzahl oder ähnlicher Parameter die genaue geförderte Flüssigkeitsmenge bestimmt werden. Während des Ansaugvorganges ist der Rückhalte-Elektromagnet (32) angeschalten und bewirkt, dass markierte biologische Partikel an der Innenwand der Teflonkapillare (31) zurückgehalten werden, während die übrige Probe mit nicht markierten Partikeln durch das Dreiwegeventil (8) und die Pumpe (9) in das Auffangbehältnis (14) fließt. Ist die gesamte Probe in die Kapillare gesaugt, so dass mittels einem Leitfähigkeitssensor das Ansaugen von Luft in das Verbindungsstück zwischen Ventil (7) und Gefäß (4) gemessen wird, so wird am Ventil (7) die Verbindung zwischen dem Waschpufferbehälter (12) und der Kapillare geöffnet. Dadurch werden die in der Kapillare festgehaltenen markierten Zellen mit einem festgelegten Volumen gewaschen. After an incubation under regulated conditions, the mixture of reagent and sample is drawn into the measuring device through a three-way valve ( 7 ) by means of a pump ( 9 ). This pump can be used to determine the exact amount of liquid delivered based on the speed or similar parameters. During the suction process, the retention electromagnet ( 32 ) is switched on and causes marked biological particles to be retained on the inner wall of the Teflon capillary ( 31 ), while the remaining sample with unmarked particles is held by the three-way valve ( 8 ) and the pump ( 9 ). flows into the collecting container ( 14 ). If the entire sample sucked into the capillary is measured so that by means of a conductivity sensor the suction of air into the connection piece between the valve (7) and container (4), so the valve (7), the connection between the wash buffer container (12) and the capillary opened. As a result, the labeled cells held in the capillary are washed with a fixed volume.

Danach wird am Ventil (8) die Verbindung von der Kapillare zur Mikrofluidik des mikroelektromechanischen System (40) umgeleitet. Gleichzeitig wird der Elektromagnet (32) ausgeschaltet. Und mit der Pumpe (10) oder Flüssiggaspatrone wird ein konstanter Druck der Hüllflußflüssigkeit aus Behälter (16) in der Hüllflußkammer (44) erzeugt. Die Piezopumpe (42) pumpt nun mit geregelter Flußrate die aus der Kapillare (31) mobilisierten markierten biologischen Partikel in die Hüllflußkammer (44). Dort werden die Partikel perlenschnurartig hintereinander gereiht und an einem . magnetoresistiven Sensor (46) vorbeigeführt. Die Partikel werden mit dem Hüllfluß im Einweggefäß (6) aufgefangen. Die Pumpe (42), die Hüllflußkammer (44) und der Sensor (46) sind mit allen Verbindungsleitungen als eine Einheit von mikroelektromechanischem System und Mikrofluidik aufgebaut, die modulartig in der Messvorrichtung ausgetauscht werden kann. The connection from the capillary to the microfluidic of the microelectromechanical system ( 40 ) is then diverted at the valve ( 8 ). At the same time, the electromagnet ( 32 ) is switched off. And with the pump ( 10 ) or liquid gas cartridge, a constant pressure of the envelope flow liquid from the container ( 16 ) is generated in the envelope flow chamber ( 44 ). The piezo pump ( 42 ) now pumps the marked biological particles mobilized from the capillary ( 31 ) into the envelope flow chamber ( 44 ) at a controlled flow rate. There the particles are lined up one after the other like pearl strings and on one. magnetoresistive sensor ( 46 ) passed. The particles are collected with the enveloping flow in the disposable container ( 6 ). The pump ( 42 ), the envelope flow chamber ( 44 ) and the sensor ( 46 ) are constructed with all the connecting lines as a unit of a microelectromechanical system and microfluidics, which can be exchanged in a modular manner in the measuring device.

Das Meßsignal des magnetischen Sensors (46) wird in einer geeigneten Vorrichtung aus rauscharmem Verstärker, Analog- Digital-Wandler, Computer, Software, Display und Drucker in einer für den Anwender nutzbaren Form dargestellt. Hierbei wird die Anzahl und Stärke der einzelnen, durch markierte Partikel bedingte, Feldänderungen ausgewertet und mit dem entsprechenden Volumina verrechnet. The measurement signal of the magnetic sensor ( 46 ) is shown in a suitable device consisting of a low-noise amplifier, analog-digital converter, computer, software, display and printer in a form that can be used by the user. The number and strength of the individual field changes caused by marked particles are evaluated and offset against the corresponding volumes.

Claims (5)

1. Verfahren zum Sortieren und Zählen von biologischen Partikeln dadurch gekennzeichnet, dass a) die biologischen Partikel nicht agglutinierend mit paramagnetischen oder dielektrischen Nanopartikeln (5-500 nm) markiert werden, b) die Markierung über bifunktionale Moleküle, Gensonden, Viren oder spezifisch adsorbierende Proteine erfolgt, c) die markierten biologischen Partikel vor oder nach der Zählung im elektrischen oder magnetischen Feld angereichert werden, d) die biologischen Partikel in einem Hüllflußstrom kontinuierlich und vereinzelt an einem magnetischen (gradiometrischen, magnetoresistiven oder flux-gate) oder kapazitiven Sensor vorbeigeführt werden, e) der Sensor Bestandteil eines mikroelektromechanischen Systems mit mikrofluidischen Elementen (5-500 µm) ist und die Feldänderungen beim Vorbeiführen markierter biologischer Partikel in elektronisch zählbare Signale umwandelt. 1. A method for sorting and counting biological particles characterized in that a) the biological particles are not agglutinatingly labeled with paramagnetic or dielectric nanoparticles (5-500 nm), b) the labeling takes place via bifunctional molecules, gene probes, viruses or specifically adsorbing proteins, c) the labeled biological particles are enriched in the electric or magnetic field before or after the count, d) the biological particles are continuously and individually guided past a magnetic (gradiometric, magnetoresistive or flux-gate) or capacitive sensor in an envelope flow, e) the sensor is part of a microelectromechanical system with microfluidic elements (5-500 µm) and converts the field changes when passing marked biological particles into electronically countable signals. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Anreicherungen parallel erfolgen und die entsprechenden biologischen Partikel in einem Sensor nacheinander gezählt werden. 2. The method according to claim 1, characterized in that several enrichments take place in parallel and the corresponding biological particles in a sensor be counted one after the other. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Anreicherungen und Zählungen der entsprechenden biologischen Partikel parallel erfolgen. 3. The method according to claim 1, characterized in that several enrichments and counts of the corresponding biological particles take place in parallel. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Anreicherungsschritte auch in das mikroelektromechanischen Systems mit mikrofluidischen Elementen integriert ist. 4. The method according to claim 1, characterized in that the enrichment steps also in that microelectromechanical system with microfluidic Elements is integrated. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zu quantifizierende Moleküle vor der nicht agglutinierenden Markierung zunächst an eine suspendierte Festphase (z. B. Nanopartikel) gekoppelt werden. 5. The method according to claim 1, characterized in that to quantifying molecules before the non-agglutinating ones First mark on a suspended solid phase (e.g. Nanoparticles).
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