DE19941447C2

DE19941447C2 - Procedure for the indirect determination of the blood coagulation status

Info

Publication number: DE19941447C2
Application number: DE19941447A
Authority: DE
Inventors: Wolf Bertling
Original assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Current assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Priority date: 1999-08-14
Filing date: 1999-08-31
Publication date: 2002-06-27
Anticipated expiration: 2019-09-01
Also published as: DE50006173D1; DE19941447A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur indirekten Bestimmung des physiologischen Blutparameters mit folgenden Schritten: DOLLAR A a) Entnahme von Prothrombin enthaltender Körperflüssigkeit, DOLLAR A b1) Ermittlung einer ersten Konzentration an carboxyliertem Protein unter Verwendung eines ersten Antikörpers und Ermittlung einer zweiten Konzentration an decarboxyliertem Protein unter Verwendung eines zweiten Antikörpers, DOLLAR A c) Bildung eines ersten Quotienten aus erster und zweiter Konzentration und DOLLAR A d) Korrelation des Quotienten mit dem physiologischen Blutparameter.The invention relates to a method for the indirect determination of the physiological blood parameter with the following steps: DOLLAR A a) removal of body fluid containing prothrombin, DOLLAR A b1) determination of a first concentration of carboxylated protein using a first antibody and determination of a second concentration of decarboxylated protein Use of a second antibody, DOLLAR A c) formation of a first quotient from the first and second concentration and DOLLAR A d) correlation of the quotient with the physiological blood parameter.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur indirekten Bestimmung des Blutgerinnungsstatus.The invention relates to a method for indirect Determination of the blood clotting status.

Die Bestimmung des Blutgerinnungsstatus kann indirekt durch Ermittlung der Prothrombinkonzentration in menschlichen Körperflüssigkeiten erfolgen. Bei Prothrombin handelt es sich um ein Protein, welches vorwiegend im Plasma des menschlichen Bluts vorkommt. Dieses Protein ist durch eine Vitamin-K abhänige γ-Carboxylase modifizierbar. Prothrombin ist mitverantwortlich für die Blutgerinnung. Es wandelt lösliches Fibrinogen in unlösliches Fibrin um.The blood clotting status can be determined indirectly by Determination of the prothrombin concentration in human Body fluids take place. Prothrombin is a protein that is predominantly found in human plasma Blood. This protein is through a vitamin K. dependent γ-carboxylase modifiable. Is prothrombin jointly responsible for blood clotting. It changes soluble Fibrinogen to insoluble fibrin.

Die durch Prothrombin induzierte Umwandlung des Fibrinogens erfolgt nur dann, wenn Prothrombin in natürlicher carboxylierter Form vorliegt. Die Carboxylierung erfolgt in der Leber durch eine Carboxylase unter Bindung des Co-Faktors Vitamin K. Die Aktivität der Carboxylase ist von der Konzentration an Vitamin K abhängig. Wenn die Vitamin-K- Bindungsstelle der Carboxylase blockiert wird, ist sie nicht aktiv. Es entsteht dann eine abnormale nicht carboxylierte Form des Prothrombins, welche nicht gerinnungsaktiv ist. Die Wirkung oral verabreichter Anticoagulantien beruht auf der Wirkung der Blockierung der Vitamin K Bindungsstellen der Carboxylase.Prothrombin-induced conversion of the fibrinogen occurs only when prothrombin in natural carboxylated form is present. The carboxylation takes place in the liver by a carboxylase with binding of the co-factor Vitamin K. The activity of the carboxylase is of the Vitamin K concentration dependent. If the vitamin K Binding site of the carboxylase is not blocked active. An abnormal non-carboxylated then arises Form of prothrombin, which is not clotting active. The Effect of orally administered anticoagulants is based on the Effect of blocking the vitamin K binding sites of the Carboxylase.

Beim gesunden Menschen liegt das Prothrombin in natürlicher, d. h. carboxylierter, Form vor. Die Carboxylierung wird durch Vitamin-K als Co-Faktor bewirkt. Bei kranken Menschen, insbesondere bei Menschen mit Leberschäden, oder bei Zugabe von Antikoagulantien, kommt Prothrombin auch in der abnormalen Form vor.In healthy people, prothrombin is natural, d. H. carboxylated, form before. The carboxylation is through Vitamin K as a co-factor. In sick people, especially in people with liver damage, or when added of anticoagulants, prothrombin also comes in the abnormal shape.

Das carboxylierte Prothrombin bewirkt eine Gerinnung nur dann, wenn zuvor Ca²⁺-Ionen gebunden werden. Nur dann ist das carboxylierte Prothrombin in der Lage, an die Membranen der Blutplättchen zu binden und eine Gerinnung zu bewirken. Nur die carboxylierte Form des Prothrombins kann Calcium binden. Somit läßt der Gehalt an carboxyliertem Prothrombin auf den Blutgerinnungsstatus schließen.The carboxylated prothrombin only causes coagulation if Ca ²⁺ ions are bound beforehand. Only then is the carboxylated prothrombin able to bind to the platelet membranes and cause coagulation. Only the carboxylated form of prothrombin can bind calcium. The content of carboxylated prothrombin thus indicates the blood coagulation status.

Aus der US 4,769,320 ist ein Verfahren bekannt, bei dem die Ermittlung des Gehalts an carboxyliertem Prothrombin unter Verwendung von Antikörpern mittels Immunoassay erfolgt. Die Antikörper sind spezifisch für carboxyliertes Prothrombin in Gegenwart von Calcium. Sie binden nicht an decarboxyliertes Prothrombin. Es wird ein Kit zur Bestimmung des Pegels von carboxyliertem Prothrombin in einer Plasmaprobe beschrieben, der einen solchen Antikörper enthält.From US 4,769,320 a method is known in which the Determination of the carboxylated prothrombin content under Antibodies are used by means of immunoassay. The Antibodies are specific for carboxylated prothrombin in Presence of calcium. They do not bind to decarboxylated Prothrombin. A kit for determining the level of described carboxylated prothrombin in a plasma sample, that contains such an antibody.

Aus der US 5,252,712 ist ein monoklonaler Antikörper bekannt, der spezifisch für nicht-carboxyliertes Prothrombin ist. Unter Verwendung dieses Antikörpers läßt sich mittels Immunoassay die Konzentration an nicht-carboxyliertem Prothrombin ermitteln. Auch damit ist eine Aussage über den Blutgerinnungsstatus möglich.From US 5,252,712 a monoclonal antibody is known which is specific for non-carboxylated prothrombin. Using this antibody can be Immunoassay the concentration of non-carboxylated Determine prothrombin. This is also a statement about the Blood clotting status possible.

In der US 4,780,410 ist ein Sandwich-Immunoassay-Verfahren zur Quantifizierung von einem decarboxylierten Prothrombin offenbart. Bei dem Verfahren wird ein gegen decarboxyliertes Prothrombin gerichteter immobilisierter monoklonaler Antikörper verwendet. Daran bindendes decarboxyliertes Prothrombin wird mittels eines zweiten gegen Prothrombin gerichteten Antikörpers detektiert. Es wird auch ein Kit zur Durchführung des Verfahrens beschrieben.No. 4,780,410 is a sandwich immunoassay method for the quantification of a decarboxylated prothrombin disclosed. The process uses an anti-decarboxylated Prothrombin-directed immobilized monoclonal Antibody used. Decarboxylated which binds to it Prothrombin is used to protect against prothrombin directed antibody detected. There will also be a kit for Implementation of the procedure described.

Aus der JP 05 284 994 A sind drei monoklonale Antikörper bekannt. Ein erster bindet spezifisch an humanes decarboxyliertes Prothrombin, ein zweiter spezifisch an humanes Prothrombin, humanes Thrombin und humanes decarboxyliertes Prothrombin und ein dritter spezifisch an humanes decarboxyliertes Prothrombin und humanes Prothrombin.JP 05 284 994 A describes three monoclonal antibodies known. A first binds specifically to human decarboxylated prothrombin, a second specific human prothrombin, human thrombin and human decarboxylated prothrombin and a third specifically human decarboxylated prothrombin and human prothrombin.

Aus von Kries, R. et al., Thrombosis and Haemostasis 68 (1992), Seiten 383-387 ist es bekannt, decarboxyliertes Prothrombin im Blut mittels eines ELISAs mit einem monoklonalen Antikörper zu bestimmen.From von Kries, R. et al., Thrombosis and Haemostasis 68 (1992), pages 383-387, it is known to decarboxylate Prothrombin in the blood by means of an ELISA with a to determine monoclonal antibodies.

Nach dem Stand der Technik tritt das Problem auf, daß das zu analysierende Probenmaterial nicht immer unmittelbar nach der Entnahme der Probe analysiert wird. Durch die Versendung des Probenmaterials vergehen mitunter 1 bis 2 Tage. Die meisten der an der Blutgerinnung beteiligten Faktoren sind hoch empfindlich und schnell inaktiv. Während dieser Zeit wird u. a. sowohl carboxyliertes als auch nicht-carboxyliertes Prothrombin in der Probe abgebaut. Eine Verfälschung der Ergebnisse des Blutgerinnungsstatus ist die Folge.In the prior art, there arises a problem in that analyzing sample material not always immediately after the Taking the sample is analyzed. By sending the Sample material sometimes takes 1 to 2 days. Most the factors involved in blood clotting are high sensitive and quickly inactive. During this time u. a. both carboxylated and non-carboxylated Prothrombin degraded in the sample. A falsification of the As a result, blood clotting status results.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere die Genauigkeit der Ermittlung des Blutgerinnungsstatus mittels der Bestimmung des Proteingehalts erhöht werden. The object of the invention is to overcome the disadvantages of the prior art of technology to eliminate. In particular, it should Accuracy of blood clotting status determination using the determination of the protein content can be increased.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 2 und 8 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 3 bis 7 und 9 bis 13.This object is achieved by the features of claims 1, 2 and 8 solved. Appropriate embodiments of the invention result from the features of claims 3 to 7 and 9 to 13.

Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur indirekten Bestimmung des Blutgerinnungsstatus mit folgenden Schritten vorgesehen:
According to the invention, a method for the indirect determination of the blood coagulation status is provided with the following steps:

a) Withdrawal of body fluid, which by a Vitamin K dependent γ-carboxylase modifiable Contains protein,
b) determining a first concentration of carboxylated Protein using a first antibody and Determination of a second concentration decarboxylated protein using a second Antibody,
c) Formation of a first quotient from the first and second Concentration and
d) Correlation of the quotient with the blood coagulation status.

Nach einer weiteren Variante ist ein Verfahren zur indirekten Bestimmung des Blutgerinnungsstatus mit folgenden Schritten vorgesehen:
According to a further variant, a method for the indirect determination of the blood coagulation status is provided with the following steps:

a) Withdrawal of body fluid, which by a Vitamin K dependent γ-carboxylase modifiable Contains protein,
b) Determination of a total concentration of carboxylated and decarboxylated protein using a third antibody and determination of a second Concentration of decarboxylated protein below Using a second antibody,
c) Calculation of a first concentration of carboxylated protein according to the following relationship:
C3 - C2 = C1
and formation of a first quotient from the first and second concentration

oder
or

1. Formation of a second quotient from third and first Concentration and
2. Correlation of the first or second quotient with the Coagulation status.

Unter einem durch eine Vitamin-K abhängige γ-Carboxylase modifizierbaren Protein wird ein Protein verstanden, das in Abhängigkeit des Blutgerinnungsstatus anteilig sowohl in caboxylierter als auch in decarboxylierter Form vorliegen kann.Under a γ-carboxylase dependent on a vitamin K modifiable protein is understood to be a protein that is found in Dependence on the blood clotting status proportionately both are present in caboxylated as well as in decarboxylated form can.

Mit den erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, auf der Basis des Gehalts an modifizierbarem Protein den Blutgerinnungsstatus genau zu ermitteln. Durch die Betrachtung sowohl des Gehalts an carboxyliertem Protein als auch des Gehalts an decarboxyliertem Protein und das Inbeziehungsetzen der beiden vorgenannten Proteingehalte werden Fehler bei der Bestimmung des Blutgerinnungsstatus minimiert.With the method according to the invention, it is possible to Basis of the modifiable protein content Determine blood clotting status accurately. By contemplation both the carboxylated protein content and the Decarboxylated protein content and relatedness of the two aforementioned protein contents will result in errors in the Determination of blood coagulation status minimized.

Bei der Körperflüssigkeit kann es sich zweckmäßigerweise um Plasma, Blut, Speichel, Urin oder dgl. handeln. Geeignet sind grundsätzlich alle Körperflüssigkeiten, in der das modifizierbare Protein in einem Gehalt enthalten ist, der eine Messung ermöglicht.The body fluid can expediently be Act plasma, blood, saliva, urine or the like. Are suitable basically all body fluids in which the modifiable protein is contained in a content that enables a measurement.

Nach einem Ausgestaltungsmerkmal der Erfindung erfolgt die Bestimmung der ersten, zweiten und/oder dritten Konzentration mittels eines enzym- oder fluoreszenz-immunologischen Verfahrens. Dabei kann als enzym-immunologisches Verfahren ELISA oder Strip-Assay verwendet werden.According to a design feature of the invention, the Determination of the first, second and / or third concentration by means of an enzyme or fluorescence immunological Process. It can be used as an enzyme-immunological method ELISA or strip assay can be used.

Es ist aber auch möglich, daß die erste, zweite und/oder dritte Konzentration und/oder der erste bzw. zweite Quotient mittels einer Farbreaktion oder Fluoreszenzdetektion ermittelt wird. Damit ist eine besonders schnelle und einfache Ermittlung des Blutgerinnungsstatus möglich.But it is also possible that the first, second and / or third concentration and / or the first or second quotient by means of a color reaction or fluorescence detection is determined. This is a particularly fast and easy determination of the blood clotting status possible.

Bei dem einen durch eine Vitamin-K abhängige γ-Carboxylase modifizierbaren Protein handelt es sich vorzugsweise um Prothrombin, Nephrocalcin oder Osteocalcin. Es ist auch denkbar zur Bestimmung des Blutgerinnungsstatus andere Proteine zu benutzen, die von einer Vitamin-K abhängigen Carboxylase carboxyliert werden und ebenfalls mittels oral verabreichbarer Anticoagulantien beeinflußbar sind. Nephrocalcin ist z. B. im Urin nachweisbar. Es muß bei Benutzung dieses Proteins kein Blut entnommen werden. Das bedeutet für Patienten, deren Blutgerinnungsstatus laufend überwacht werden muß, eine erhebliche Erleichterung.In one, γ-carboxylase dependent on a vitamin K modifiable protein is preferably Prothrombin, nephrocalcin or osteocalcin. It is also conceivable for determining the blood clotting status others Use proteins that are dependent on vitamin K Carboxylase are carboxylated and also by means of oral administrable anticoagulants can be influenced. Nephrocalcin is e.g. B. detectable in urine. It must be No blood can be drawn using this protein. The means for patients whose blood clotting status is ongoing must be monitored, a significant relief.

Es ist ferner ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, wobei mindestens zwei Antikörper enthalten sind, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus einem ersten Antikörper (A1) zur enzym-immunologischen Bestimmung einer ersten Konzentration (C1) der carboxylierten Form des Proteins, einem zweiten Antikörper (A2) zur enzym immunologischen Bestimmung einer zweiten Konzentration (C2) der decarboxylierten Form des Proteins und einem dritten Antikörper (A3) zur enzym-immunologischen Bestimmung einer Gesamtkonzentration (C3) an carboxyliertem und decarboxylier tem Protein.It is also a kit for performing the invention Method provided, wherein at least two antibodies are selected from a group consisting of a first antibody (A1) for enzyme immunological Determination of a first concentration (C1) of the carboxylated Form of the protein, a second antibody (A2) to the enzyme immunological determination of a second concentration (C2) the decarboxylated form of the protein and a third Antibodies (A3) for the enzyme-immunological determination of a Total concentration (C3) of carboxylated and decarboxylated protein.

Es kann sich beim ersten, zweiten und dritten Antikörper um nach dem Stand der Technik bekannte Antikörper handeln. Solche Antikörper sind z. B. aus der US 5,252,712 und US 4,769,320 bekannt, deren Inhalt hiermit in die Beschreibung einbezogen wird.The first, second and third antibodies can be act antibodies known in the art. Such antibodies are e.g. B. from US 5,252,712 and US 4,769,320 known, the content of which is hereby incorporated into the description is included.

Der erste und der zweite Antikörper können jeweils auf einem separaten Feld eines Teststreifens aufgenommen sein. Das ermöglicht eine besonders einfache Ermittlung des jeweiligen Gehalts z. B. mittels Farbreaktion.The first and second antibodies can each be on one separate field of a test strip. The enables a particularly simple determination of the respective Salary z. B. by means of a color reaction.

Der dritte Antikörper kann auf einem Feld eines weiteren Teststreifens aufgenommen sein.The third antibody can be on a field of another Test strip.

Zur Vervollständigung des Kits kann jeweils ein Konjugat des ersten und ein Konjugat des zweiten Antikörpers mit einem Enzym oder einem Fluoreszenz-Farbstoff enthalten sein. Vorteilhafterweise kann auch ein Konjugat des dritten Antikörpers mit einem Enzym oder einem Fluoreszenz-Farbstoff enthalten sein.To complete the kit, one conjugate of each first and a conjugate of the second antibody with a Enzyme or a fluorescent dye can be included. Advantageously, a conjugate of the third Antibody with an enzyme or a fluorescent dye be included.

Bei dem Protein handelt es sich vorzugsweise um Prothrombin, Nephrocalcin oder Osteocalcin.The protein is preferably prothrombin, Nephrocalcin or osteocalcin.

Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand der Zeichnung erläutert: Es zeigenThe method according to the invention is described below with reference to FIG Drawing explains: Show it

Fig. 1 die Korrelation des Blutgerinnungsstatus mit cPT/dcPT, Fig. 1 shows the correlation of the blood clotting status with CPT / dcPT,

Fig. 2 die Korrelation des Blutgerinnungsstatus mit dcPT/cPT und Fig. 2 shows the correlation of the blood clotting status having dcPT / CPT and

Fig. 3 die Korrelation des Blutgerinnungsstatus mit dcPT. Fig. 3 shows the correlation of the blood clotting status having dcPT.

In Fig. 1 ist der Quotient aus der Konzentration von carboxyliertem und decarboxyliertem Prothrombin über dem Blutgerinnungsstatus INR aufgetragen. Die Konzentration ist hier als OD-Wert gemessen. Bei einem ermittelten Quotienten von 0,5 ergibt sich ein Blutgerinnungsstatus INR von 3,8.The ratio of the concentration of carboxylated and decarboxylated prothrombin over the blood coagulation status INR is plotted in FIG. 1. The concentration is measured here as an OD value. With a determined quotient of 0.5, the blood coagulation status INR is 3.8.

In Fig. 2 ist der Quotient aus decarboxyliertem mit carboxyliertem Prothrombin über dem Blutgerinnungsstatus aufgetragen. Es ist ersichtlich, daß der Quotienten hier besonders gut mit dem Blutgerinnungsstatus INR korreliert.In Fig. 2 the quotient of decarboxylated with carboxylated prothrombin is plotted against the blood coagulation status. It can be seen that the quotient correlates particularly well with the blood coagulation status INR.

Fig. 3 zeigt die nach dem Stand der Technik bekannte Korrelation von dcPT mit dem Blutgerinnungsstatus INR. Diese verändert sich mit zunehmendem Alter der Proben. FIG. 3 shows the correlation of dcPT with the blood coagulation status INR known from the prior art. This changes with increasing age of the samples.

example

Für Serienmessungen besonders geeignet ist der sogenannte Sandwich-ELISA.The so-called is particularly suitable for series measurements Sandwich ELISA.

a) Sample preparation

Zu deren Durchführung werden die Kavitäten von Mikrotiterplatten (z. B. Maxisorb, NUNC) über Nacht bei 4°C mit je 50 µl Capture-Antikörper (10 µg/ml in Carbonatpuffer) beschichtet. Die Platten werden 3mal mit PBS gewaschen. Zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen werden die Platten 1 h bei Zimmertemperatur mit 50 µl 1% BSA in PBS pro Kavität geblockt. Die Platten werden dann 3mal mit PBS/0,05%Tween 20 gewaschen.The cavities of Microtiter plates (e.g. Maxisorb, NUNC) overnight at 4 ° C each with 50 µl capture antibody (10 µg / ml in carbonate buffer) coated. The plates are washed 3 times with PBS. to The plates become saturated with unspecific binding sites 1 h at room temperature with 50 µl 1% BSA in PBS per cavity blocked. The plates are then 3 times with PBS / 0.05% Tween 20 washed.

Anschließend werden die Antigene wie folgt aufgetragen (50 µl/Kavität):
Kalibrierplasmen, 1 : 50 verdünnt in PBS/0,1% BSA
Normalplasma, 1 : 50 verdünnt in PBS/0,1% BSA
Patientenplasma, 1 : 50 verdünnt in PBS/0,1% BSA
Prothrombindefizientes Plasma (negative Kontrolle)The antigens are then applied as follows (50 µl / cavity):
Calibration plasmas, diluted 1:50 in PBS / 0.1% BSA
Normal plasma, diluted 1:50 in PBS / 0.1% BSA
Patient plasma, diluted 1:50 in PBS / 0.1% BSA
Prothrombin-deficient plasma (negative control)

Die Platten werden 1 h bei Zimmertemperatur inkubiert und anschließend 3mal mit PBS/0,05%Tween 20 gewaschen. Es werden 50 µl/Kavität Kaninchen anti Gesamt-Prothrombin (10 µg/ml) zufügt. Dann werden die Platten 1 h bei Zimmertemperatur inkubiert und anschließend 3mal mit PBS/0,05%Tween 20 gewaschen. Es werden 50 µl/Kavität Ziege anti Kaninchen Antikörper, Biotin-konjugiert, (Dianova, 1 : 20000 in PBS/0,1% BSA) zufügt. Die Platten werden 1 h bei Zimmertemperatur inkubiert und dann 3mal mit PBS/0,05%Tween 20 gewaschen.The plates are incubated for 1 hour at room temperature and then washed 3 times with PBS / 0.05% Tween 20. It will 50 µl / cavity rabbit anti total prothrombin (10 µg / ml) inflicts. Then the plates are 1 h at room temperature incubated and then 3 times with PBS / 0.05% Tween 20 washed. 50 µl / cavity goat anti rabbit Antibody, biotin conjugated, (Dianova, 1: 20000 in PBS / 0.1% BSA) adds. The plates are kept at room temperature for 1 h incubated and then washed 3 times with PBS / 0.05% Tween 20.

Es werden 50 µl/Kavität Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Roche Diagnostics, 1 : 1000 in Konjugatpuffer) zugefügt. Die Platten werden 1 h bei Zimmertemperatur inkubiert und anschließend 3mal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen.There are 50 ul / cavity streptavidin-peroxidase conjugate (Roche Diagnostics, 1: 1000 in conjugate buffer) was added. The Plates are incubated for 1 hour at room temperature and then washed 3 times with PBS / 0.05% Tween 20.

Dann werden 50 µl/Kavität ABTS-Lösung (Roche Diagnostics, 1 mg/ml) zugefügt, und die Platten werden ½ h-1 h bei Zimmertemperatur inkubiert. Schließlich werden die Platten im ELISA-Reader gemessen.Then 50 µl / well ABTS solution (Roche Diagnostics, 1 mg / ml), and the plates are ½ h-1 h at Incubated room temperature. Finally, the plates in the ELISA reader measured.

b) evaluation

Es werden
It will

a) the absorption values (OD) of the total prothrombin (Cavities coated with anti total prothrombin mac),
b) the OD of descarboxy prothrombin (cavities with anti Descarboxy-Prothrombin mAK) and
c) the OD of carboxylated prothrombin (OD total PT - OD Descarboxy PT)

bestimmt.certainly.

Dann werden Eichkurven aus den gemessenen OD-Werten (siehe Fig. 1-3: Punkte A, B, C und D) der Kalibrierplasmen erstellt und der INR der Patientenplasmen berechnet.Then calibration curves are created from the measured OD values (see Fig. 1-3: points A, B, C and D) of the calibration plasmas and the INR of the patient plasmas is calculated.

Claims

1. Procedure for the indirect determination of the blood coagulation status with the following steps:

a) removal of body fluid which contains a protein which can be modified by a γ-carboxylase which is dependent on vitamin K,
b) determining a first concentration (C1) of carboxylated protein using a first antibody (A1) and determining a second concentration (C2) of decarboxylated protein using a second antibody (A2),
c) formation of a first quotient (Q1) from first (C1) and second concentration (C2) and
d) Correlation of the quotient (Q) with the blood coagulation status.

2. Procedure for the indirect determination of the blood coagulation status with the following steps:

a) removal of body fluid which contains a protein which can be modified by a γ-carboxylase which is dependent on vitamin K,
b) determining a total concentration (C3) of carboxylated and decarboxylated protein using a third antibody (A3) and determining a second concentration (C2) of decarboxylated protein using a second antibody (A2),
c) Calculation of a first concentration (C1) of carboxylated protein according to the following relationship:
C3 - C2 = C1
and formation of a first quotient (Q1) from first (C1) and second concentration (C2)

or

1. Formation of a second quotient (Q2) from third (C3) and first concentration (C1) and
2. Correlation of the first and second quotients (Q1, Q2) with the blood coagulation status.

3. The method according to claim 1 or 2, wherein the Body fluid plasma, blood, saliva, urine or the like is.

4. The method according to any one of the preceding claims, wherein the determination of the first (C1), second (C2) and / or third concentration (C3) by means of an enzyme or fluorescence-immunological process takes place.

5. The method according to any one of the preceding claims, wherein as an enzyme-immunological process ELISA or strip Assay is used.

6. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first (C1), second (C2) and / or third concentration (C3) and / or the first or second quotient (Q1, Q2) by means of a color reaction or fluorescence detection is determined.

7. The method according to any one of the preceding claims, wherein the γ-carboxylase dependent on a vitamin K modifiable protein prothrombin, nephrocalcin or Is osteocalcin.

8. Kit for performing the method according to one of the preceding claims, wherein at least two Antibodies are selected from a group consisting of a first antibody (A1) for the enzyme immunological determination of a first concentration (C1) the carboxylated form of the protein, a second Antibodies (A2) for enzyme immunological determination a second concentration (C2) of the decarboxylated Form of the protein and a third antibody (A3) enzyme-immunological determination of a total concentration tion (C3) on carboxylated and decarboxylated protein.

9. Kit according to claim 8, wherein the first (A1) and the second Antibodies (A2) each on a separate field of a Test strips are included.

10. Kit according to claim 8 or 9, wherein the third antibody (A3) on a field of another test strip is taken.

11. Kit according to one of claims 8 to 10, wherein each Conjugate of the first (A1) and a conjugate of the second Antibody (A2) with an enzyme or a fluorescent Dye is included.

12. Kit according to one of claims 8 to 11, wherein a conjugate of the third antibody (A3) with an enzyme or a Fluorescent dye is included.

13. Kit according to any one of claims 8 to 12, wherein the protein Is prothrombin, nephrocalcin or osteocalcin.