DE19940131B4

DE19940131B4 - Method and device for obtaining biologically active substances

Info

Publication number: DE19940131B4
Application number: DE19940131A
Authority: DE
Inventors: Christoph Pfefferle
Original assignee: Pfefferle Christoph Dr
Current assignee: Pfefferle Christoph Dr 72581 Dettingen De
Priority date: 1998-08-24
Filing date: 1999-08-24
Publication date: 2004-12-02
Anticipated expiration: 2019-08-25
Also published as: DE19940131A1

Abstract

Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen, welche als Metabolite bei Mikroorganismen auftreten, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
a) Bereitstellung einer Mikroorganismen in einem Nährmedium enthaltenden Kulturbrühe, so daß die Mikroorganismen Metabolite bilden;
b) Einbringen der Kulturbrühe in eine Extraktions-Filtrations-Einheit (1) mit Filter (6);
c) Filtration der Kulturbrühe durch das Filter (6);
d) Leiten des Filtrats durch eine Chromatographieeinheit (2):
e) Inlösungbringen des im Filter (6) zurückgebliebenen Gemischs aus Mikroorganismen und unlöslichen Nährmediumsbestandteilen und/oder Aufbrechen der Mikroorganismen durch Zugabe von organischem Lösungsmittel in die Extraktions-Filtrations-Einheit (1);
f) Filtration der Lösung aus Schritt e) durch das Filter (6);
g) Leiten des Filtrats aus Schritt f) durch die Chromatographieeinheit (2);
h) zumindest einmaliges Wiederholen der Schritte e) bis g) ohne Filterwechsel;
i) Elution von durch die Chromatographieeinheit (2) adsorbierten Substanzen.Process for the production of biologically active substances which occur as metabolites in microorganisms, characterized by the following process steps:
a) provision of a microorganism in a culture broth containing nutrient medium so that the microorganisms form metabolites;
b) introducing the culture broth into an extraction-filtration unit (1) with filter (6);
c) filtering the culture broth through the filter (6);
d) passing the filtrate through a chromatography unit (2):
e) dissolving the mixture of microorganisms and insoluble nutrient medium components remaining in the filter (6) and / or breaking up the microorganisms by adding organic solvent into the extraction-filtration unit (1);
f) filtering the solution from step e) through the filter (6);
g) passing the filtrate from step f) through the chromatography unit (2);
h) repeating steps e) to g) at least once without changing the filter;
i) Elution of substances adsorbed by the chromatography unit (2).

Description

Stand der TechnikState of technology

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen nach dem Oberbegriff von Anspruch 1 bzw. Anspruch 13.The The invention relates to a method and an apparatus for extraction of biologically active substances according to the preamble of claim 1 or claim 13.

In vielen Indikationsgebieten besteht ein großer Bedarf an biologisch aktiven Substanzen und Wirkstoffen, die durch chemische Modifikation zu Therapeutika umgewandelt werden können. Dies gilt beispielsweise in den Bereichen enzyminhibitorische und Rezeptorbinde-Modelle, spezifisch antitumorale antiparasitäre und immunomodulatorisch wirkende Substanzen. Es ist bekannt, zur Gewinnung derartiger Substanzen Mikroorganismen zu verwenden. Die Vertreter der Ordnung Actinomycetales, insbesondere der Gattung Streptomyces, werden aufgrund ihres ausgeprägten Sekundärstoffwechsels hierzu herangezogen. Die biologisch aktiven Substanzen treten als Metabolite im Stoffwechsel der Mikroorganismen auf und müssen zur weiteren Verwendung aus der zur Gewinnung der Metabolite notwendigen Kulturbrühe aus Mikroorganismen und Nährmedium isoliert werden. Darüber hinaus müssen sie in qualitativ hochwertiger Form und ausreichender Menge zur Verfügung gestellt werden, um eine Weiterverarbeitung beispielsweise zu Therapeutika zu ermöglichen. Aus dem Stand der Technik sind bisher keine Verfahren bekannt, die dies auf einfache und schnelle Weise ermöglichen.In Many indication areas have a great need for biologically active ones Substances and active ingredients that are modified into therapeutic agents by chemical modification can be converted. This applies, for example, in the areas of enzyme inhibitory and Receptor binding models, specifically antitumor antiparasitic and immunomodulatory acting substances. It is known to obtain such substances To use microorganisms. The representatives of the order Actinomycetales, especially the genus Streptomyces, are due to their distinctive secondary metabolism used for this. The biologically active substances appear as Metabolites in the metabolism of the microorganisms and must further use from the necessary to obtain the metabolites broth from microorganisms and nutrient medium be isolated. About that have to go out they are provided in high quality form and in sufficient quantity to further processing, for example to therapeutics to enable. Out no methods are known in the prior art which do this enable in a simple and fast way.

Aus der GB 876 096 ist ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Grisonomycin und eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung bekannt. Dieses Verfahren ist durch eine Vielzahl von separaten, voneinander getrennten Schritten der Filtration/Extraktion bzw. der chromatographischen Auftrennung gekennzeichnet, das zeitaufwendig und schwierig zu automatisieren ist.From the GB 876 096 A method for producing the antibiotic grisonomycin and a device suitable for carrying out the method are known. This process is characterized by a large number of separate, separate steps of filtration / extraction or chromatographic separation, which is time-consuming and difficult to automate.

Aus der DE 27 46 209 C2 ist ein Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums und eine entsprechende Vorrichtung bekannt, die einerseits gleichermaßen aus einer Vielzahl von einzelnen voneinander getrennten Schritten besteht und deshalb wiederum zeitaufwendig und schlecht zu automatisieren ist, und das andererseits keine optimale Ausbeute der zu extrahierenden Metabolite gewährleistet.From the DE 27 46 209 C2 A method for producing an antibiotic and a corresponding device are known which, on the one hand, consist equally of a large number of individual steps which are separate from one another and are therefore in turn time-consuming and difficult to automate, and on the other hand do not guarantee an optimal yield of the metabolites to be extracted.

Die GB 917 711 beschreibt ein Verfahren zur Extraktion von Mikroorganismen, das aus vielen Einzelschritten besteht und für die vorstehend genannten Zwecke gänzlich ungeeignet ist.The GB 917 711 describes a process for the extraction of microorganisms, which consists of many individual steps and is completely unsuitable for the purposes mentioned above.

Ferner beschreibt die WO 95/14220 A2 eine Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen aus Mikroorganismen, die aus einer Extraktions-Filtrations-Einheit und einer damit kombinierten Chromatographie-Einheit besteht, die jedoch den Nachteil hat, dass keine einfache und schnelle Homogenisierung des Gemischs aus Mikroorganismen und Kulturflüssigkeit und kein steriles Zuführen von Lösungsmitteln bzw. keine Filtration mittels Druckbeaufschlagung möglich ist, weshalb eine großmaßstabliche Ausgestaltung dieser bekannten Vorrichtung nicht sinnvoll ist.Further WO 95/14220 A2 describes a device for obtaining biologically active substances from microorganisms, which from a Extraction-filtration unit and a combined chromatography unit There is, however, the disadvantage that no easy and quick homogenization of the Mixture of microorganisms and culture fluid and not sterile Feeding of solvents or no filtration by means of pressurization is possible, which is why a large-scale Design of this known device is not useful.

In der EP 0 522 517 A1 wird eine Vorrichtung beschrieben, durch die eine unlösliche Komponente aus einer Suspension in Lösung gebracht bzw. isoliert werden kann, die jedoch für die oben bezeichneten Zwecke ungeeignet ist.In the EP 0 522 517 A1 describes a device by means of which an insoluble component can be brought into solution or isolated from a suspension, but which is unsuitable for the purposes described above.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren und Vorrichtungen derart weiterzubilden bzw. zu verbessern, dass biologisch aktive Metabolite aus Mikroorganismen in qualitativ hochwertiger Form und ausreichender Menge auf einfach und schnelle Art und Weise zur Verfügung gestellt werden können, um eine Weiterverarbeitung bspw. zu Therapeutika zu ermöglichen.task the present invention is therefore the one from the prior art Techniques and devices known in the art, or improve that biologically active metabolites from microorganisms in high quality form and sufficient quantity on simple and quick way can be made available to to enable further processing, for example into therapeutic agents.

Die Erfindung und ihre VorteileThe invention and their advantages

Die vorstehende Aufgabe wird durch die Bereitstellung der Gegenstände der Patentansprüche 1 und 13 vollständig gelöst.The The above task is accomplished by providing the items to the claims 1 and 13 completely solved.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und vorzugsweise mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 13 werden die Mikroorganismen mit einem Nährmedium zu einer Kulturbrühe vermischt und damit zur Bildung von Metaboliten veranlaßt. Durch Zugabe von Lösungsmittel werden die Metabolite aus den Mikroorganismen freigesetzt. Um die Metabolite von den übrigen Bestandteilen der Kulturbrühe zu trennen, wird das Gemisch zunächst über ein Filter und anschließend durch eine Chromatographieeinheit geleitet. Das im Filter zurückgebliebene Gemisch aus Mikroorganismen und unlöslichen Närmediumsbestandteilen wird durch Zugabe von organischem Lösungsmittel in die Extraktions-Filtrations-Einheit in Lösung gebracht und/oder es erfolgt durch diese Maßnahme ein Aufbrechen der Mikroorganismen. Die Lösung wird anschließend durch das Filter filtriert und durch die Chromatographieeinheit geleitet. Diese Schritte werden zumindest einmal ohne Filterwechsel wiederholt, bis anschließend eine Elution von durch die Chromatographieeinheit absorbierten Substanzen erfolgt. Durch die Kombination aus Extraktions-Filtrations-Einheit und Chromatographieeinheit können die von den Mikroorganismen gebildeten Metabolite auf schnelle und einfache Weise als Rohprodukte gewonnen werden. Außerdem kann mit dem Verfahren und der Vorrichtung das gesamte von den Mikroorganismen produzierte Metaboliten-Spektrum erfaßt werden. Hierzu sind nur geringe Mengen an umweltschädlichem Verbrauchsmaterial, wie beispielsweise Lösungsmittel notwendig. Als Lösungsmittel werden Wasser oder organische Lösungsmittel verwendet.In the method according to the invention with the features of claim 1 and preferably by means of the device according to the invention with the features of claim 13, the microorganisms are mixed with a nutrient medium to form a culture broth and are thus caused to form metabolites. The metabolites are released from the microorganisms by adding solvent. In order to separate the metabolites from the other components of the culture broth, the mixture is first passed through a filter and then through a chromatography unit. The mixture of microorganisms and insoluble nutrient medium constituents remaining in the filter is brought into solution by adding organic solvent to the extraction / filtration unit and / or the microorganisms are broken up by this measure. The solution is then filtered through the filter and passed through the chromatography unit. These steps are repeated at least once without changing the filter until an elution of substances absorbed by the chromatography unit then takes place. Through the combination of extraction-filtration unit and Chromatogra The metabolites formed by the microorganisms can be obtained quickly and easily as raw products. In addition, the entire metabolite spectrum produced by the microorganisms can be recorded with the method and the device. This requires only small amounts of environmentally harmful consumables, such as solvents. Water or organic solvents are used as solvents.

Zur Durchführung des Verfahrens werden die Mikroorganismen als Reinkulturen verwendet. Diese erhält man durch Isolierung von Mikroorganismen aus Proben, denen eine Nährlösung zugegeben wird. Die in der Probe enthaltenen Mikroorganismen verteilen sich in der Lösung, der nach kurzer Inkubationszeit geringe Volumina entnommen werden. Diese werden auf festen Nährmedien, welche selektive Bestandteile wie spezifisch wirkende Antibiotika enthalten, ausplattiert und kultiviert. In einer solchen Anreicherungskultur setzt sich der am besten angepaßte Typ durch und überwächst alle Begleitorganismen. Durch Übertragung und Verteilen auf andere Medien läßt sich der angereicherte Stamm leicht isolieren und liegt als Reinkultur, d.h. als Nachkommenschaft einer einzelnen Zelle vor. Zur Gewinnung der biologisch aktiven Substanzen werden die Reinkulturen gattungsspezifisch unter optimalen modifizierten Kultivierungsbedingungen in einem Nährmedium angezogen. Die Mikroorganismen wachsen so lange bis ein Faktor ins Minimum gerät und das Wachstum begrenzt. Zu diesem Zeitpunkt beginnen die Mikroorganismen Sekundärmetabolite zu produzieren. Diese Stoffwechselprodukte zeichnen sich durch eine strukturelle Vielfalt aus und können somit als Wirkstoffe, wie Therapeutika, Stimulanzien oder Futtermittelzusätze verwendet werden. Nach ausreichender Kultivierungsdauer, welche die Organismen für die Produktion der Metabolite benötigen, werden die Ansätze geerntet und komplett der Extraktion zugeführt. Die produzierten Metabolite liegen sowohl in der Kulturbrühe als auch in den Mikroorganismen vor. Um die Gesamtheit des Metabolitenspektrums zu erhalten werden die Zellen chemisch durch organische Lösungsmittel aufgeschlossen. Durch die Klärung über ein Filter werden. die gelösten Metabolite mittels einer Chromatographieeinheit von den übrigen Bestandteilen des Gemisches getrennt. Abschließend liegen die Metabolite als Rohprodukte vor. Zur Lagerung oder Weiterverarbeitung werden sie häufig in einem Vakuum-Zentrifugalverdampfungssystem aufkonzentriert, in Lochtiterplatten überführt und schließlich eingedampft. Damit stellen sie das Endprodukt, die Naturstoffextrakte dar. Zur Lagerung werden die Lochtiterplatten bei –20°C eingefroren und in Gefrierschränken gelagert.to execution In the process, the microorganisms are used as pure cultures. This receives by isolating microorganisms from samples containing a Nutrient solution is added. The microorganisms contained in the sample are distributed in the Solution, from which small volumes are removed after a short incubation period. These are on solid culture media, what selective components like specific antibiotics included, plated and cultivated. In such an enrichment culture sits the most adapted Type through and overgrows everyone Accompanying organisms. By transmission and the enriched strain can be distributed to other media easily isolate and lies as a pure culture, i.e. as a progeny of one single cell. To obtain the biologically active substances the pure cultures are genus-specific under optimal modified Cultivation conditions grown in a nutrient medium. The microorganisms grow until a factor becomes minimal and growth is limited. At this point, the microorganisms start secondary metabolites to produce. These metabolic products are characterized by a structural diversity and can thus used as active ingredients, such as therapeutic agents, stimulants or feed additives become. After sufficient cultivation time, the organisms for the Production of metabolites need are the approaches harvested and completely extracted. The metabolites produced are both in the culture broth as well as in the microorganisms. To the entirety of the metabolite spectrum the cells are obtained chemically by organic solvents open minded. By clarifying a Become filters. the solved Metabolites of the other components by means of a chromatography unit of the mixture separately. Finally, the metabolites are as raw products. For storage or further processing them often in a vacuum centrifugal evaporation system concentrated, transferred to perforated plates and finally evaporated. They represent the end product, the natural product extracts Storage, the perforated plates are frozen at -20 ° C and stored in freezers.

Die Mikroorganismenkultur kann komplett ohne Vorbehandlung dem Extraktor zugeführt werden. Die Behälter des Extraktors dienen gleichzeitig als Bevorratungsbehältnisse der Kulturen bis zur Bearbeitung.The Microorganism culture can be done without pre-treating the extractor supplied become. The containers of the extractor also serve as storage containers of cultures to processing.

Erfindungsgemäß wird die Kultur filtriert und in demselben Behältnis kann der zurückbleibende Filterkuchen durch Zugabe von Lösungsmitteln in folgenden Schritten weiter bearbeitet werden, d. h. Zellen können aufgeschlossen und in den Zellen sich befindende Substanzen können extrahiert werden. Diese Aufarbeitungsschritte lassen sich mehrmals im gleichen Behältnis ohne Filterwechsel wiederholen.According to the Culture filtered and in the same container the remaining filter cake can by adding solvents are further processed in the following steps, d. H. Cells can be unlocked and substances in the cells can be extracted. This Refurbishment steps can be carried out several times in the same container Repeat filter change.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann das Filtrat für eine Nachklärung in ein weiteres, gleichgestaltetes Behältnis geleitet werden und unter Druck filtriert werden.To In a further advantageous embodiment, the filtrate can be used for clarification another, similarly designed container are routed and under Pressure can be filtered.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung ist das Material so gewählt, daß es zu keiner Interaktion mit den freigesetzten Substanzen kommt. Es werden inerte Materialien wie Glas und PTFE verwendet, so dass die Substanzen sich durch das Material chemisch nicht verändern können.To a further advantageous embodiment, the material is chosen so that it there is no interaction with the released substances. It will Inert materials such as glass and PTFE are used so that the substances cannot change chemically due to the material.

Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Filtrat nach dem durch die Chromographieeinheit erfolgten Auftrennen in einer Fraktionierungseinheit separiert. Dadurch können Nährmedienbestandteile, die nicht durch den Stoffwechsel umgesetzt wurden und damit nicht zum produzierten Metabolitenspektrum gehören, größtenteils eliminiert werden. Dies führt zu einer Qualitätsverbesserung der durch das Verfahren gewonnenen biologisch aktiven Substanzen. Die eliminierten Substanzen können eine anschließende pharmakologische Testierung der gewonnenen Metaboliten nicht mehr beeinflußen, so daß falsche Ergebnisse durch diese Begleitsubstanzen ausgeschlossen werden können.To an advantageous embodiment of the method according to the invention the filtrate is after that made by the chromography unit Separation separated in a fractionation unit. This allows nutrient media components, that were not implemented by the metabolism and therefore not belong to the metabolite spectrum produced, are largely eliminated. this leads to to a quality improvement of the biologically active substances obtained by the process. The eliminated substances can a subsequent pharmacological No longer affect the testing of the metabolites obtained, so that wrong Results can be excluded by these accompanying substances.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kulturbrühe vor dem Einbringen in die Extraktions-Filtrations-Einheit mit einem inerten porösen Material, insbesondere mit Celiten, versetzt. Dadurch kann eine Druckfiltration gewährleistet werden.To a further advantageous embodiment of the method according to the invention becomes the culture broth before inserting it into the extraction-filtration unit with a inert porous Material, especially with Celite. This allows a Pressure filtration guaranteed become.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Gemisch aus Mikroorganismen, Zellen der Mikroorganismen und den unlöslichen Nährmediumbestandteilen mit Hilfe von über Düsen einströmende Luft oder Flüssigkeit mit dem Lösungsmittel vermischt. Dies führt auf einfache und schnelle Weise zu einer Homogenisierung des Gemisches.To a further advantageous embodiment of the method according to the invention becomes the mixture of microorganisms, cells of the microorganisms and the insoluble Nährmediumbestandteilen with the help of over Incoming air or liquid with the solvent mixed. this leads to in a simple and quick way to homogenize the mixture.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden die Kulturbrühe und das Gemisch aus Mikroorganismen, Zellen der Mikroorganismen, unlöslichen Nährmediumbestandteilen und Lösungsmittel mit Preßluft durch das Filter gedrückt. Dadurch können besonders schnell und einfach feste Partikel abgetrennt und so die Kulturbrühe und das Gemisch zum Filtrat geklärt werden.According to a further advantageous embodiment of the invention, the culture broth and the mixture of microorganisms, cells of the Mikroor ganisms, insoluble nutrient components and solvents with compressed air through the filter. This allows solid particles to be separated particularly quickly and easily, and the culture broth and the mixture can be clarified to form the filtrate.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird als Chromatographieeinheit eine Säulenchromatographieeinheit, insbesondere mit einer Chromatographiesäule aus Glas, verwendet. Hierbei durchsickert eine mobile Phase (Filtrate) eine stationäre Phase (Säulenpackung). Die Trennung beruht dabei auf Unterschieden in der Wanderungsgeschwindigkeit der Probenbestandteile. Bei der elutions-chromatograhischen Trennung von Substanzen in einer Trennsäule erreichen die Stoffe je nach Verzögerungen, welche durch das Säulenmaterial bedingt werden, zeitlich nacheinander das Säulenende. Durch die unterschiedliche Verweildauer in der Trennsäule können die Metabolite fraktioniert aufgefangen werden. Die mittels der Säulenchromatographie durchgeführte Fest-Flüssig-Extraktion hat gegenüber einer Flüssig-Flüssig-Extraktion den Vorteil, daß das gesamte Metabolitenspektrum erfaßt werden kann und nur sehr geringe Mengen an umweltschädlichen Verbrauchsmaterialien benötigt werden.To a further advantageous embodiment of the invention is as Chromatography unit a column chromatography unit, used in particular with a glass chromatography column. in this connection a mobile phase (filtrate) seeps through a stationary phase (Column packing). The separation is based on differences in the speed of migration of the sample components. In the elution-chromatographic separation of substances in a separation column reach the substances depending on the delays caused by the column material the column end in succession. Due to the different length of stay in the separation column can the metabolites are collected in fractions. The means of column conducted Solid-liquid extraction has opposite a liquid-liquid extraction the advantage that entire spectrum of metabolites can be covered and only very small amounts of environmentally harmful Consumables needed become.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Säulenmaterial ein Adsorberharz verwendet. Durch hydrophobe Wechselwirkungen binden die durch die Chromatographieeinheit zu trennenden Substanzen an die hydrophoben Oberflächen des Adsorberharzes. Durch Erhöhung der organischen Lösungsmittelkonzentration in Wasser kann die Elutionskraft der mobilen Phase erhöht werden, was dazu führt, daß die Substanzen nacheinander entsprechend ihrer lipophilen Eigenschaften eluiert werden.To a further advantageous embodiment of the method according to the invention is used as a column material an adsorber resin used. Bind through hydrophobic interactions the substances to be separated by the chromatography unit the hydrophobic surfaces of the adsorber resin. By increasing the organic solvent concentration the elution power of the mobile phase can be increased in water, which leads to, that the Substances in succession according to their lipophilic properties be eluted.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Mikroorganismen der natürlich vorkommenden Flora und Fauna entnommen.To a further advantageous embodiment of the method according to the invention become the microorganisms of the naturally occurring flora and Taken from fauna.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die einzelnen Verfahrensschritte durch ein speicherprogrammierbares Steuerungssystem und/oder einen mit Software ausgestatteten Rechner gesteuert. Sie laufen damit automatisch ab.To a further advantageous embodiment of the method according to the invention the individual process steps are replaced by a programmable logic controller Control system and / or a computer equipped with software controlled. It runs automatically.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 13 zeichnet sich dadurch aus, daß eine Kombination aus einer Extraktions-Filtrations-Einheit und einer Chromatographieeinheit vorgesehen ist. Damit können die als Metabolite in Mikroorganismen auftretende biologisch aktiven Substanzen auf schnelle und einfache Weise aus den Mikroorganismen gewonnen werden. Hierzu sind lediglich die Kulturansätze bestehend aus Mikroorganismen und einer Nährlösung in die erfindungsgemäße Vorrichtung einzuleiten. Die von den Mikroorganismen produzierten Metabolite sind einerseits in der Nährlösung als auch in den Mikroorganismen selbst vorhanden. Zum Trennen wird die Kulturbrühe einer Chromatographieeinheit zugeführt. Als Endprodukt erhält der Benutzer eine das gesamte Metabolitenspektrum des jeweiligen Mikroorganismus enthaltende Lösung. Zusätzlich kann eine Steuerung vorgesehen sein, welche dafür sorgt, daß die in der Vorrichtung ablaufenden Verfahrensschritte kontrolliert werden.The device according to the invention with the characterizing features of claim 13 stands out characterized in that a Combination of an extraction-filtration unit and one Chromatography unit is provided. It can be used as a metabolite in Biologically active substances appearing quickly on microorganisms and easily obtained from the microorganisms. For this are just the cultural approaches consisting of microorganisms and a nutrient solution in the device according to the invention initiate. The metabolites produced by the microorganisms are on the one hand in the nutrient solution as also present in the microorganisms themselves. To separate it broth fed to a chromatography unit. The user receives as the end product one the entire metabolite spectrum of the respective microorganism containing solution. additionally a controller can be provided which ensures that those running in the device Process steps are controlled.

Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist an die Chromatographieeinheit eine Fraktionierungseinheit angeschlossen. Durch diese können Substanzen eliminiert werden, die durch die Chromatographieeinheit nicht abgetrennt wurden und damit in der als Endprodukt gewonnenen Lösung noch enthalten sind, und die sich störend auf anschließende pharmakologische Testierungen auswirken können.To an advantageous embodiment of the device according to the invention a fractionation unit is connected to the chromatography unit. Through this you can Substances that are not eliminated by the chromatography unit were separated and thus still in the solution obtained as the final product are included, and which are bothersome on subsequent may affect pharmacological testing.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist als Chromatographieeinheit eine Säulenchromatographieeinheit vorgesehen. Diese hat gegenüber anderen bekannten Trennmethoden wie beispielsweise Flüssig-Flüssig-Extraktion den Vorteil, daß das gesamte Metabolitenspektrum erfaßt werden kann und nur sehr geringe Mengen an umweltschädlichen Verbrauchsmaterial notwendig sind.To a further advantageous embodiment of the device according to the invention is a column chromatography unit as a chromatography unit intended. This has opposite other known separation methods such as liquid-liquid extraction the advantage that entire spectrum of metabolites can be covered and only very small amounts of environmentally harmful Consumables are necessary.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist ein speicherprogrammierbares Steuerungssystem und/oder ein Rechner zur Steuerung der Extraktions-Filtrations-Einheit, der Chromatographieeinheit und/oder der Fraktionierungseinheit vorgesehen.To a further advantageous embodiment of the device according to the invention is a programmable logic control system and / or a computer to control the extraction-filtration unit, the chromatography unit and / or the fractionation unit.

Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind der nachfolgenden Beschreibung, der Zeichnung und den Ansprüchen entnehmbar.Further Advantages and advantageous embodiments of the invention are the following description, the drawing and the claims can be removed.

Zeichnungdrawing

In der Zeichnung ist ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt und im folgenden näher beschrieben. Es zeigen:In the drawing is an embodiment of the device according to the invention shown and in more detail below described. Show it:

1 Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen aus Mikroorganismen, 1 Device for obtaining biologically active substances from microorganisms,

2 Extraktions-Filtrations-Einheit der Vorrichtung aus 1, 2 Extraction-filtration unit of the device 1 .

3 Lochfilter und Filterhalter einer Extraktions-Filtrations-Einheit gemäß 2. 3 Hole filter and filter holder according to an extraction-filtration unit 2 ,

Beschreibung des Ausführungsbeispielsdescription of the embodiment

In 1 ist eine Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen aus Mikroorganismen mit einer Extraktions-Filtrations-Einheit 1, einer Chromatographieeinheit 2 und einer Fraktionierungseinheit 3 dargestellt. Die die Mikroorganismen enthaltende Kulturbrühe wird in den zylindrischen Behälter 4 des Extraktors 1 eingefüllt. Über Rohre 5 wird in den Behälter 4 Druckluft eingeleitet. Durch das Filter 6 gelangt das wässrige Kulturfiltrat in die Chromatographieeinheit 2. Der zurückbleibende Filterkuchen wird durch Zugabe von organischem Lösungsmittel über die die Rohre 5 und durch rühren wieder in Lösung gebracht. Dabei werden die Zellen aufgeschlossen. Durch weitere Zugabe von Wässriger Lösung über die Rohre 5 wird die Endkonzentration des organischen Lösungsmittels herabgesetzt Es folgt eine weitere Filtration durch Druckbeaufschlagung über die Rohre 5 über den gleichen Filter 6. Dieses Filtrat gelangt in die Chromatographieeinheit 2. Der zurückbleibende Filterkuchen kann in weiteren Schritten wie oben beschrieben nochmals bearbeitet werden. Bei der Chromatographieeinheit 2 dient ein Adsorberharz 7 als Säulenmaterial. Die durch ihre Wanderungsgeschwindigkeit im Adsorberharz von den übrigen Bestandteilen abgetrennten Metabolite werden über eine Pumpe 8 der Fraktionierungseinheit 3 zugeführt. Diese besteht aus mehreren Fraktionssammelgläsern 9.In 1 is a device for the extraction of biologically active substances from microorganisms with an extraction-filtration unit 1 , a chromatography unit 2 and a fractionation unit 3 shown. The culture broth containing the microorganisms is placed in the cylindrical container 4 of the extractor 1 filled. About pipes 5 is in the container 4 Compressed air introduced. Through the filter 6 the aqueous culture filtrate enters the chromatography unit 2 , The remaining filter cake is removed by adding organic solvent through the tubes 5 and brought back into solution by stirring. The cells are unlocked. By further adding aqueous solution via the pipes 5 the final concentration of the organic solvent is reduced. This is followed by a further filtration by pressurizing the pipes 5 over the same filter 6 , This filtrate enters the chromatography unit 2 , The remaining filter cake can be processed again in further steps as described above. At the chromatography unit 2 serves an adsorber resin 7 as column material. The metabolites separated from the other constituents by their migration speed in the adsorber resin are pumped 8th the fractionation unit 3 fed. This consists of several fraction collection glasses 9 ,

In 2 ist die Extraktions-Filtrations-Einheit 1 mit Filter 6 in Explosionsdarstellung gezeigt. Der Behälter 4 ist mit einem Deckel 10 verschlossen. Zur Positionierung des Filters 6 ist ein Filterhalter 11 mit einem Lochfilter vorgesehen, an welchen sich ein Trichter 12 anschließt, der das Gemisch aus der Extraktions-Filtrations-Einheit in die Chromatographieeinheit einleitet.In 2 is the extraction-filtration unit 1 with filter 6 shown in an exploded view. The container 4 is with a lid 10 locked. For positioning the filter 6 is a filter holder 11 provided with a perforated filter on which there is a funnel 12 connects, which introduces the mixture from the extraction-filtration unit into the chromatography unit.

3 zeigt den Deckel und den Filterhalter mit Lochfilter aus 2. In dieser Darstellung sind die Rohre 5 erkennbar, über die in das in dem Behälter 4 enthaltene Gemisch Druckluft, Wasser oder organische Lösungsmittel eingeleitet werden können. 3 shows the lid and the filter holder with perforated filter 2 , In this illustration, the pipes are 5 recognizable about that in the in the container 4 contained mixture compressed air, water or organic solvents can be introduced.

Alle in der Beschreibung, den nachfolgenden Ansprüchen und der Zeichnung dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.All presented in the description, the following claims and the drawing Characteristics can essential to the invention both individually and in any combination with one another his.

11: Extraktions-Filtrations-EinheitExtraction-filtration unit
22: Chromatographieeinheitchromatographic
33: Fraktionierungseinheitfractionation
44: Behältercontainer
55: Rohrpipe
66: Filterfilter
77: Adsorberharzadsorber
88th: Pumpepump
99: FraktionssammelglasFraction collection glass
1010: Deckelcover
1111: Filterhalter mit Lochfilterfilter holder with perforated filter
1212: Trichterfunnel

Claims

Process for the production of biologically active substances which occur as metabolites in microorganisms, characterized by the following process steps: a) provision of a microorganism in a culture broth containing nutrient medium, so that the microorganisms form metabolites; b) introducing the culture broth into an extraction-filtration unit ( 1 ) with filter ( 6 ); c) Filtration of the culture broth through the filter ( 6 ); d) passing the filtrate through a chromatography unit ( 2 ): e) dissolving the in the filter ( 6 ) remaining mixture of microorganisms and insoluble nutrient medium components and / or breaking up the microorganisms by adding organic solvent into the extraction-filtration unit ( 1 ); f) filtering the solution from step e) through the filter ( 6 ); g) passing the filtrate from step f) through the chromatography unit ( 2 ); h) repeating steps e) to g) at least once without changing the filter; i) Elution of by the chromatography unit ( 2 ) adsorbed substances.

A method according to claim 1, characterized in that in step e) a reduction in the solvent concentration in the extraction-filtration unit ( 1 ) by adding aqueous solution.

A method according to claim 1 or 2, characterized in that following step i), the eluate with a fractionation unit ( 3 ) is fractionated.

Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that in Step e) resuspending the mixture and / or the microorganisms by means of a stirring system he follows.

Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that that in Connection to Step a) a further process step follows: a1) Relocate the culture broth with an inert porous Material, preferably Celite.

Method according to one of the preceding Claims, characterized in that the mixture of microorganisms, cells of the microorganisms and the insoluble nutrient medium components is mixed with the solvent with the aid of air or liquid flowing in via nozzles.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that the culture broth and the mixture of microorganisms, cells of the microorganisms, insoluble nutrient medium components and solvent with compressed air through the filter ( 6 ) are pressed.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that as the chromatography unit ( 2 ) a column chromatography unit is used.

Method according to claim 7, characterized in that an adsorber resin ( 7 ) is used.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized that the Microorganisms of course occurring flora and fauna are taken.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized that the individual process steps through a programmable logic controller Control system and / or a computer equipped with software to be controlled.

Method according to one of the preceding claims, characterized in that, following step c), the filtrate for subsequent clarification in a further extraction-filtration unit ( 1 ) with filter ( 6 ) is introduced and through the filter ( 6 ) is filtered.

Device for obtaining biologically active substances which occur as metabolites in microorganisms, in particular for carrying out the method according to one of Claims 1 to 13, in which a combination of an extraction-filtration unit ( 1 ) and a chromatography unit ( 2 ) is provided, characterized in that means ( 5 . 10 ) are provided, through which the extraction-filtration unit ( 1 ) is closable and the introduction of air and / or liquid into the extraction-filtration unit ( 1 ) enable.

Device according to Claim 13, characterized in that a cover ( 10 ) with integrated tubes ( 5 ) are provided.

Device according to claim 13, characterized in that nozzles are provided, by means of which air and / or liquid into the extraction-filtration unit ( 1 ) can be introduced.

Device according to one of claims 13 to 15, characterized in that the chromatography unit ( 2 ) a fractionation unit ( 3 ) connected.

Device according to one of claims 13 to 16, characterized in that as the chromatography unit ( 2 ) a column chromatography unit is provided.

Device according to one of claims 13 to 17, characterized in that a programmable logic control system and / or a computer for controlling the extraction-filtration unit ( 1 ), the chromatography unit ( 2 ) and / or the fractionation unit ( 3 ) is provided.