DE19933212A1 - Method and device for high-throughput analysis of molecular interactions via surface plasmon resonance - Google Patents

Method and device for high-throughput analysis of molecular interactions via surface plasmon resonance

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Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren und Vorrichtung zur Hochdurchsatzanalyse molekularer Interaktionen über Oberflächen Plasmonen Resonanz mittels entsprechend modifizierter Detektionssysteme. DOLLAR A Die Erfindung ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse (HDA) von Bibliotheken, bestehende aus mehreren hunderten von tausenden kleiner Molekülbestandteile, auf Interaktion und/oder Bindung an potentielle Zielstrukturen für Medikamente. Eine weitere Anwendung dieser Erfindung besteht in der Untersuchung differentieller Protein Expression direkt aus Gewebeproben.The present invention describes a method and device for high-throughput analysis of molecular interactions via surface plasmon resonance by means of appropriately modified detection systems. DOLLAR A The invention enables high throughput analysis (HDA) of libraries, consisting of several hundreds of thousands of small molecular components, for interaction and / or binding to potential drug target structures. Another application of this invention is to investigate differential protein expression directly from tissue samples.

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren und Vorrichtung zur Hochdurchsatzanalyse molekularer Interaktionen über Oberflächen Plasmonen Resonanz.The present invention describes a method and device for High throughput analysis of molecular interactions across surface plasmons Resonance.

Die Analyse einer großen Anzahl von Molekülen, wie zum Beispiel Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Oligosacchariden, Phagen, kleinerer synthetischer Moleküle, Antikörper oder von Enzymen, mit Hilfe anderer Moleküle über Oberflächen Plasmanen Resonanz (OPR) ist durch den derzeit möglichen Probendurchsatz von etwa 200 Proben/Tag begrenzt. Diese Begrenzung des Probendurchsatzes entsteht durch die aufwendigen Mechanismen konventioneller OPR-Systeme zur Versorgung mit Lösungsmitteln, kombiniert mit einem festen Anregungs- und Detektierungssystem, welches zur Realzeit-Messung von interagierenden Molekülen entworfen wurde. Der Durchsatz dieser konventionellen OPR-Systeme ist befriedigend geeignet zur sekundären oder tertiären Untersuchung einer kleinen Zahl bereits bekannter Interaktionspartner, bei welchen zum Beispiel respektive kinetische oder stöchiometrische Informationen zur Interaktion aus der Messung des OPR-Winkels gewonnen werden sollen.The analysis of a large number of molecules, such as proteins, peptides, Nucleic acids, oligosaccharides, phages, smaller synthetic molecules, antibodies or of enzymes, with the help of other molecules via surface plasmas resonance (OPR) is due to the currently possible sample throughput of around 200 samples / day limited. This limitation of the sample throughput arises due to the complex Mechanisms of conventional OPR systems for the supply of solvents, combined with a fixed excitation and detection system, which is used for Real-time measurement of interacting molecules was designed. The throughput This conventional OPR system is suitable for secondary or satisfactory tertiary investigation of a small number of already known interaction partners, at which, for example, respectively kinetic or stoichiometric information on Interaction should be obtained from the measurement of the OPR angle.

OPR stellt ein hochsensitives Verfahren dar, welches im Prinzip geeignet wäre um auch eine primäre Analyse von Molekülinteraktionen durchzuführen. Dadurch wäre die Identifizierung von solchen Molekülen möglich, welche mit anderen Molekülen interagieren. Konventionelle Verfahren sind jedoch derzeit nicht in der Lage den hierfür notwendigen Durchsatz zu bewältigen.OPR is a highly sensitive process, which in principle would also be suitable perform a primary analysis of molecular interactions. That would make it Identification of such molecules possible, which with other molecules to interact. However, conventional methods are currently not able to do this to manage the necessary throughput.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und Vorrichtung zur Hochdurchsatzanalyse molekularer Interaktionen über Oberflächen Plasmonen Resonanz bereitzustellen. The present invention has for its object a method and device for high throughput analysis of molecular interactions over surface plasmons To provide resonance.  

Die Erfindung ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse (HDA) von Bibliotheken kleiner Molekülbestandteile auf Interaktion in Form von Kompetition, Inhibition und/oder Bindung an potentiellen Zielstrukturen. Interaktive Zielstrukturen und/oder identifizierte Interaktionen können Indikationen für eine Medikamentenentwicklung darstellen. Derartige Bibliotheken können aus mehreren hunderten von tausenden Bestandteilen bestehen.The invention enables high throughput analysis (HDA) of libraries smaller Molecular components on interaction in the form of competition, inhibition and / or Binding to potential target structures. Interactive target structures and / or identified Interactions can be indications for drug development. Such libraries can consist of several hundreds of thousands of components consist.

Eine weitere Anwendung dieser Erfindung besteht in der Untersuchung differentieller Protein Expression direkt aus Gewebeproben.Another application of this invention is in differential testing Protein expression directly from tissue samples.

Die Erfindung ermöglicht es eine durch eine modifizierten OPR-Detektions-Vorrichtung molekulare Wechselwirkungen mit einem wesentlich gesteigerten Durchsatz zu analysieren. Weiterhin werden Methoden beschrieben, bei welchen diese Vorrichtung eingesetzt werden kann.The invention enables a modified OPR detection device molecular interactions with a significantly increased throughput analyze. Furthermore, methods are described in which this device can be used.

Die in dieser Erfindung beschriebene Vorrichtung enthält:
The device described in this invention includes:

  • - eine Vielzahl von Molekülen, welche analysiert werden sollen, welche als abgegrenzte Meßpunkte in regelmäßiger Anordnung direkt auf einen voraktivierten OPR-Chip (oder eine OPR-Oberfläche) aufgebracht wurden. Diese Vielzahl kann zwischen 1 und 10.000 abgegrenzten Meßpunkten pro cm2 liegen, wobei Methoden um eine derartige Anordnung herzustellen Stand der Technik darstellen. Die Entfernung zwischen den Meßpunkten immobilisierter Moleküle kann optimiert werden, um Signalinterferenzen zwischen einzelnen Meßpunkten zu minimieren oder zu vermeiden. Es ist vorteilhaft, mehrere Meßpunkte auf einem Chip als Kontroll-Punkte anzulegen, wobei diese Kontroll-Punkte das Hintergrundsignal, sowie positive und negative Kontrollmoleküle enthalten können. Mit Hilfe geeignet gewählter Kontrollpunkte ist es möglich eine Kalibrierung des Chips vorzunehmen. Daher kann bei Bedarf die Inkubation eines Chips unabhängig vom Detektionssystem durchgeführt werden. In einer minimalen Ausführungsform braucht ein derartiges Detektionssystem auch kein Flüssigkeitssystem enthalten.a large number of molecules which are to be analyzed and which have been applied as delimited measuring points in a regular arrangement directly to a preactivated OPR chip (or an OPR surface). This large number can lie between 1 and 10,000 delimited measuring points per cm 2 , methods for producing such an arrangement being state of the art. The distance between the measuring points of immobilized molecules can be optimized in order to minimize or avoid signal interference between individual measuring points. It is advantageous to create several measuring points on a chip as control points, which control points can contain the background signal as well as positive and negative control molecules. With the help of suitably selected control points, it is possible to calibrate the chip. If necessary, the incubation of a chip can therefore be carried out independently of the detection system. In a minimal embodiment, such a detection system does not need to contain a liquid system.
  • - einen neuartigen OPR-Chip, welcher durch ein abgeändertes OPR- Detektionssystem ausgewertet wird, bei welchem der OPR-Winkel für jeden Meßpunkt einzeln gemessen wird. Dies kann zum Beispiel erreicht werden, indem der Chip systematisch mit Hilfe eines Präzisions-Koordinaten-Positions-Kontrollgerätes bewegt wird, so daß jeder einzelne Meßpunkt systematisch unterhalb des Detektionssystems positioniert wird. Genannte Präzisions-Koordinaten-Positions-Kontrollgeräte sind Stand der Technik und finden sich in Mikroskopen oder MALDI Massenspektrometern. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, kann der OPR-Winkel schnell mit Hilfe eines Laser-Scanning Systems, welches zum Beispiel in Laser-Scanning Mikroskopen verwendet wird, für jeden Meßpunkt einzeln detektiert werden.- a new type of OPR chip, which is modified by a modified OPR Detection system is evaluated, in which the OPR angle for each measuring point is measured individually. This can be achieved, for example, by using the chip moved systematically with the help of a precision coordinate position control device is so that each individual measuring point systematically below the detection system  is positioned. The above-mentioned precision coordinate position control devices are in place of technology and can be found in microscopes or MALDI mass spectrometers. In a Another embodiment of the invention, the OPR angle can be quickly using a Laser scanning systems, which are used, for example, in laser scanning microscopes is used to be detected individually for each measuring point.
  • - unter Verwendung eines integrierten Systems, welches aus einer Kombination von Detektions- und Flüssigkeitssystem besteht, ein Flüssigkeitssystem, welches eine Vielzahl zu untersuchender Moleküle mit derselben Flüssigkeit beschickt. In einer Ausführung der Erfindung wird ein einzelner Flüssigkeitskanal verwendet, welcher alle Molekülproben auf einem Chip parallel mit Flüssigkeit beschickt. In einer weiteren Ausführung der Erfindung werden bestimmte Kombinationen von Meßpunkten mit einer oder mehreren verschiedenen Flüssigkeiten beschickt, wobei die Steuerung der Beschickung durch mehrere Flüssigkeitskanäle erfolgen kann, welche wiederum über Ventile verbunden und kontrolliert sein können.- Using an integrated system, which consists of a combination of the detection and fluid system, a fluid system which is a Load many molecules to be examined with the same liquid. In a Implementation of the invention uses a single liquid channel, all of which Molecular samples loaded with liquid in parallel on a chip. In another Execution of the invention are certain combinations of measuring points with a or several different liquids, the control of the Feeding can take place through several liquid channels, which in turn are via Valves can be connected and controlled.
  • - In jeder einzelnen Ausführungsform dieser Erfindung wird die Sammlung der Daten, welche die gemessenen OPR-Winkel der einzelnen Meßpunkte enthält, in einer Computer lesbaren Form gespeichert, welche eine spätere Daten Analyse ermöglicht. Vorzugsweise wird diese genannte Sammlung von Daten als digitales Bild gespeichert, dargestellt und analysiert. Innerhalb dieses digitalen Bildes wird die relative Position der einzelnen Meßpunkte eines Chips durch ein vorbestimmtes Pixel innerhalb des Bildes repräsentiert und die Größenordnung des gemessenen OPR-Winkels eines Meßpunkts über einen Grauskala-Wert verdeutlicht.- In each and every embodiment of this invention, the collection of Data containing the measured OPR angles of the individual measuring points in one Computer-readable form saved, which enables later data analysis. This said collection of data is preferably stored as a digital image, presented and analyzed. Within this digital image the relative position of the individual measuring points of a chip by a predetermined pixel within the image represents and the order of magnitude of the measured OPR angle of a measuring point illustrated by a gray scale value.

Ein Verfahren bei der die beschriebene Vorrichtung verwendet werden kann ist die Identifizierung interagierender Moleküle, welches über folgende Schritte erreicht werden kann:
One method in which the described device can be used is the identification of interacting molecules, which can be achieved via the following steps:

  • - Kalibrierung der Vorrichtung und des OPR-Chips durch die Verwendung des zuvor beschriebenen abgeänderten OPR-Detektionssystems, bei welchem der gesamte OPR-Chip (oder eine OPR-Oberfläche) gemessen wird, bevor Moleküle aufgebracht werden. Mit Hilfe dieses "Leer-Daten"-Satzes ist es möglich das System gelegentlich zu kalibrieren und/oder eine Qulitätskontrolle des OPR-Chips vor der Aufbringung der abgegrenzte Meßpunkte in regelmäßiger Anordnung durchzuführen. - Calibration of the device and the OPR chip using the Modified OPR detection system described above, in which the entire OPR chip (or an OPR surface) is measured before molecules are applied become. With the help of this "empty data" set it is possible to occasionally close the system calibrate and / or a quality control of the OPR chip before the application of the to carry out delimited measuring points in a regular arrangement.  
  • - Nach Aufbringung der abgegrenzte Meßpunkte in regelmäßiger Anordnung auf dem OPR-Chip werden die Daten der gemessenen OPR-Winkel für jeden einzelnen Meßpunkt des Chips gesammelt und wie zuvor beschrieben gespeichert. Diese Daten steilen den "Referenzdatensatz" für jedes Einzelmolekül ohne mögliche Interaktionspartner dar.- After applying the delimited measuring points in a regular arrangement The OPR chip contains the data of the measured OPR angles for each individual Measuring point of the chip collected and saved as previously described. These dates steep the "reference data set" for each individual molecule without possible Interaction partner.
  • - Während der sich genannte Chip noch innerhalb des abgeänderten OPR- Detektionssystem befindet kann er mit einem Aliquot der Flüssigkeit überspült und inkubiert werden, welche mögliche Interaktionspartner enthält. Unspezifisch gebundene Moleküle werden anschließend von der Chip-Oberfläche abgewaschen.- While the named chip is still within the modified OPR Detection system it can be flushed with an aliquot of the liquid and incubate which contains possible interaction partners. Unspecifically bound Molecules are then washed off the chip surface.
  • - Nach dem Waschschrittt werden die OPR-Winkel für jeden einzelnen Meßpunkt neu gemessen und die Daten wie zuvor beschrieben als "Experimentdatensatz 1" gespeichert. Dieser "Experimentdatensatz 1" speichert die OPR-Winkel, welche direkt proportional sind zu Größe und Menge interagierender Moleküle, welche an das immobilisierte Protein gebunden sind.- After the washing step, the OPR angles for each individual measuring point measured again and the data as described above as "Experiment data set 1" saved. This "Experiment data set 1" stores the OPR angles, which directly are proportional to the size and amount of interacting molecules attached to the immobilized protein are bound.
  • - Die Schritte Inkubation, Waschen, und die Messung können wahlweise auch mehrere Male wiederholt werden, um die Ausbidung von Interaktions-Komplexen zu erzeugen.- The steps incubation, washing, and the measurement can optionally also to be repeated several times to educate the interaction complexes produce.
  • - Es kann vorteilhaft sein die Schritte Bindung, Inkubation und Waschen unabhängig von der Detektionsvorrichtung nach Sammlung des "Referenzdatensatzes" durchzuführen. Auf diese Art kann eine größere Anzahl von Chips und damit Proben pro OPR-Detektionssystem, speziell wenn es eine simplifizierte Flüssigkeitsversorgung enthält, vorbereitet werden. Es ist anzunehmen, daß eine relative Veränderung im OPR-Winkel der einzelnen Meßpunkte alleine durch die Verwendung unterschiedlicher Meßeinheiten oder durch die Entnahme und Rückführung innerhalb einer Meßeinheit entstehen kann. Aus diesem Grund muß ein normalisierter OPR-Winkel mit Hilfe des "Referenzdatensatzes" anhand der aufgebrachten oben erwähnten Kontrollpunkte kalkuliert werden.- The binding, incubation and washing steps can be advantageous independent of the detection device after collecting the "reference data set" perform. In this way, a larger number of chips and thus samples per OPR detection system, especially if there is a simplified fluid supply contains, be prepared. It can be assumed that a relative change in the OPR angle of the individual measuring points simply by using different ones Units of measurement or by removal and return within a unit of measurement can arise. For this reason, a normalized OPR angle using the "Reference data set" based on the control points mentioned above be calculated.
  • - Die Veränderungen im OPR-Winkel werden für jeden Meßpunkt einzeln nach jeder Inkubationsrunde durch den Vergleich zwischen dem "Referenzdatensatz" und dem, wenn notwendig normalisierten, "Experimentdatensatz" bestimmt. Eine signifikante Änderung des OPR-Winkels für einen bestimmten Meßpunkt, identifiziert eine potentielle Wechselwirkung zwischen dem immobilisierten Molekül und einem Interaktionspartner. - The changes in the OPR angle are individually tracked for each measuring point each round of incubation by comparing the "reference data set" and the "experiment data set" normalized if necessary. A significant change in the OPR angle for a particular measurement point identified a potential interaction between the immobilized molecule and a Interaction partner.  
  • - Nach einer derartigen effizienten Primäranalyse können solche Moleküle, welche eine signifikante Veränderung Ihres respektiven OPR-Winkels zeigen weiter mittels zum Beispiel konventioneller OPR-Analysen charakterisiert werden.- After such an efficient primary analysis, such molecules, which show a significant change in your respective OPR angle can be characterized using conventional OPR analyzes, for example.

Eine weitere Methode bei der die beschriebene Vorrichtung verwendet werden kann ist die Untersuchung differentieller Protein Expression direkt aus Gewebeproben unter der Verwendung folgender Schritte:
Another method in which the device described can be used is the investigation of differential protein expression directly from tissue samples using the following steps:

  • - Ein OPR-Chip wird mit einer Vielzahl von Antikörpern in regelmäßiger Anordnung versehen. Zur nachfolgenden Datenauswertung ist es vorteilhaft Kontrollregionen mit Positivkontrollen, Negativkontrollen und/oder Kontrollantikörpernauf den Chip aufzubringen.- An OPR chip is made with a variety of antibodies in regular Provide arrangement. It is advantageous for the subsequent data evaluation Control regions with positive controls, negative controls and / or To apply control antibodies to the chip.
  • - Ein Proteinrohextrakt wird von der ersten zu analysierenden Gewebeprobe extrahiert und der Chip darin unter Bedingungen inkubiert, welche die Bindung von Proteinen an die fixierten Antikörper erlaubt. Nicht-spezifische Bindungen werden durch einen folgenden Waschschritt mittels einer Waschlösung minimiert oder entfernt.- A crude protein extract is obtained from the first tissue sample to be analyzed extracted and the chip incubated therein under conditions that the binding of Proteins allowed to the fixed antibodies. Non-specific bindings are made through a subsequent washing step is minimized or removed using a washing solution.
  • - Der OPR-Winkel eines jeden Antikörper-Meßpunkts auf dem Chip wird danach gemessen und wie oben beschrieben gespeichert. Bei Bedarf wird der rohe "Experimentdatensatz", anhand der OPR-Winkel gewonnen aus den Kontrollpunkten, normalisiert. Der OPR-Winkel eines jeden gemessenen Punktes ist ein Maß für die Menge an Antikörper und Protein, welches aus der ersten Gewebeprobe an den Antikörper, auf dem respektiven Meßpunkt immobilisiert, gebunden hat.- The OPR angle of each antibody measurement point on the chip is then changed measured and saved as described above. If necessary, the raw "Experiment data set", based on the OPR angle obtained from the control points, normalized. The OPR angle of each measured point is a measure of that Amount of antibody and protein that is transferred from the first tissue sample to the Antibody on which the respective measuring point is immobilized has bound.
  • - Nachdem die entsprechenden OPR-Daten zu der ersten Gewebeprobe eines jeden Antikörper-Meßpunkts gemessen und gespeichert sind, werden die gebundenen Proteine mittels bekannter Methoden vom Chip gelöst und der Chip regeneriert. Alternativ kann ein im wesentlichen identischer und/oder kalibrierter Chip als Ersatz eingesetzt werden.- After the corresponding OPR data for the first tissue sample of a Every antibody measurement point is measured and stored, the bound Proteins are released from the chip using known methods and the chip is regenerated. Alternatively, a substantially identical and / or calibrated chip can be used as a replacement be used.
  • - Ein Proteinrohextrakt einer zweiten Gewebeprobe wird dann extrahiert und der regenerierte oder Ersatz-Chip darin inkubiert, wodurch die respektiven Proteine der zweiten Probe an die angeordneten Antikörper binden können. Unspezifische Bindungen werden abgewaschen und der ORP-Winkel für jeden einzelnen Meßpunkt auf dem Chip wie oben beschrieben gesammelt, um daraus die Menge an Protein bestimmen zu können, welche durch die einzelnen Antikörper gebunden wurde. A crude protein extract of a second tissue sample is then extracted and the regenerated or replacement chip incubated in it, causing the respective proteins of the second sample can bind to the arranged antibodies. Nonspecific Bindings are washed off and the ORP angle for each individual measuring point collected on the chip as described above to extract the amount of protein to be able to determine which was bound by the individual antibodies.  
  • - Bei Bedarf kann dieser Vorgang mit Hilfe eines regenerierten Chips oder Replikachips mit weiteren Gewebeproben wie oben beschrieben wiederholt werden.- If necessary, this process can be done with the help of a regenerated chip or Replica chips can be repeated with further tissue samples as described above.
  • - Veränderungen im OPR-Winkel werden für jeden einzelnen Antikörper- Meßpunkt durch den Vergleich zwischen den "Referenzdaten" und den "Eperimentdaten", oder bei mehreren Experimenten durch Vergleich zwischen den respektiven "Eperimentdaten" festgestellt. Eine signifikante Veränderung im OPR- Winkel-Vergleich eines definierten Antikörpers zwischen zwei Testreihen ist ein Indiz dafür, daß ein bestimmtes Protein, welches an diesen Antikörper binden kann, in den respektiven Proben unterschiedlich hoch exprimiert worden ist. Durch den Vergleich möglicher Abweichungen im OPR-Winkel-Muster oder verschiedener ausgewählter Antikörper-Meßpunkte, kann ein Protein-Expressionsmuster für ein bestimmtes Gewebe bestimmt werden.- Changes in the OPR angle are recorded for each individual antibody Measuring point by comparing the "reference data" and the "Experimental data", or in several experiments by comparison between the respective "experiment data" determined. A significant change in the OPR An angle comparison of a defined antibody between two test series is an indication for the fact that a certain protein, which can bind to this antibody, in the respective samples were expressed at different levels. By comparison possible deviations in the OPR angle pattern or various selected ones Antibody measurement points, a protein expression pattern for a particular Tissues can be determined.

Ein derartiges Verfahren mit einer Vielzahl von Antikörpern in regelmäßiger Anordnung ist zum Beispiel hilfreich zur Interpretation von Interaktionsmustern komplexer Mischungen von Molekülen. Standardisierte Chips mit regelmäßiger Anordnung können produziert werden und sind für eine begrenzte Zeit wiederverwendbar.Such a method with a large number of antibodies in a regular arrangement is helpful, for example, in interpreting interaction patterns more complex Mixtures of molecules. Standardized chips with a regular arrangement can are produced and are reusable for a limited time.

Weiterführende Analysen von interagierenden Molekülen können zum Beispiel mit Hilfe von Massenspektrometern erfolgen, welche entweder den unmodifizierten Chip verwenden oder den Chip nach selektivem Ablösen analysieren.Further analyzes of interacting molecules can be used, for example, with the help mass spectrometers, which either the unmodified chip use or analyze the chip after selective detachment.

Claims (15)

1. Vorrichtung zur Detektion von molekularen Wechselwirkungen zwischen einzelnen Mitgliedern einer Vielzahl n unterschiedlicher molekularer Spezies Si(a) (1 ≦ a ≦ n) und einer weiteren Vielzahl m unterschiedlicher molekularer Spezies Sg(b) (1 ≦ b ≦ m), wobei die Si(a) an einer Phasengrenzfläche immobilisiert sind und die Sg(b), sich in einer nicht-festen Phase befinden, in der sie sich bewegen können, gekennzeichnet durch
  • a) eine Vielzahl von n + x Meßpunkten Mi(c, a) (1 ≦ c ≦ n + x), angeordnet an der Phasengrenzfläche, auf welchen Meßpunkten die Si(a), dergestalt immobilisiert sind, daß auf jedem Meßpunkt fast ausschließlich Moleküle einer Spezies Si(a) immobilisiert sind, und auf der überwiegenden Anzahl der Meßpunkte unterschiedliche Spezies immobilisiert sind, sowie
  • b) ein Detektionssystem, welches in der Lage ist, eine physikalische Eigenschaft einer Phasengrenzfläche an einem Punkt Mi(c, a) der Phasengrenzfläche, welche Eigenschaft sich mit dem Eintreten einer Wechselwirkung zwischen einer am Punkt Mi(c, a) immobilisierten Spezies Si(a) und mindestens einer Spezies Sg(b) ändert, für jeden Meßpunkt Mi(c, a) unabhängig zu bestimmen.
1. Device for the detection of molecular interactions between individual members of a multitude n of different molecular species S i (a) (1 ≦ a ≦ n) and another multitude of m different molecular species S g (b) (1 ≦ b ≦ m), wherein the S i (a) are immobilized on a phase interface and the S g (b) are in a non-solid phase in which they can move, characterized by
  • a) a multiplicity of n + x measuring points M i (c, a) (1 ≦ c ≦ n + x), arranged at the phase interface, on which measuring points the S i (a) are immobilized in such a way that almost at each measuring point only molecules of one species S i (a) are immobilized, and different species are immobilized on the majority of the measuring points, and
  • b) a detection system which is capable of a physical property of a phase interface at a point M i (c, a) of the phase interface, which property occurs with the occurrence of an interaction between a species immobilized at the point M i (c, a) S i (a) and at least one species S g (b) changes to determine M i (c, a) independently for each measuring point.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 besonders gekennzeichnet dadurch, daß jene Phase der die Phasengrenzfläche bildenden Phasen, die nicht die Sg(b) enthält, eine feste Phase ist.2. Device according to claim 1, particularly characterized in that that phase of the phases forming the phase interface which does not contain the S g (b) is a solid phase. 3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 2 besonders gekennzeichnet dadurch, daß besagtes Detektionssystem eine Lichtquelle und einen Lichtdetektor umfaßt.3. Device according to one of claims 1 to 2 particularly marked in that said detection system has a light source and a Includes light detector. 4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 besonders gekennzeichnet dadurch, daß besagte physikalische Eigenschaft der Brechungsindex an der durch die Phasengrenzfläche gebildeten optischen Oberfläche ist.4. Device according to one of claims 1 to 3, particularly marked in that said physical property of the refractive index at the is the optical surface formed by the phase interface. 5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 besonders gekennzeichnet dadurch, daß die Anzahl n der an der Phasengrenzfläche immobilisierten Spezies Si(a) größer ist als 4, vorzugsweise größer ist als 10, besonders bevorzugt größer ist als 50, am vorteilhaftesten größer ist als 100.5. Device according to one of claims 1 to 4, particularly characterized in that the number n of the species S i (a) immobilized at the phase interface is greater than 4, preferably greater than 10, particularly preferably greater than 50, most advantageously greater is as 100. 6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 besonders gekennzeichnet dadurch, daß es möglich ist, die Wechselwirkung zwischen der auf Mi(c, a) immobilisierten Spezies Si(a) und mindestens einer Spezies Sg(b) an der Phasengrenzfläche räumlich und zeitlich unabhängig von der Detektionsvorrichtung und dem Detektionsvorgang durchzuführen.6. Device according to one of claims 1 to 5, particularly characterized in that it is possible for the interaction between the species S i (a) immobilized on M i (c, a) and at least one species S g (b) at the phase interface spatially and temporally independent of the detection device and the detection process. 7. Verfahren zur Detektion von molekularen Wechselwirkungen zwischen einzelnen Mitgliedern einer Vielzahl n unterschiedlicher molekularer Spezies Si(a) (1 ≦ a ≦ n) und einer weiteren Vielzahl m unterschiedlicher molekularer Spezies Sg(b) (1 ≦ b ≦ m), wobei die Si(a) an einer Phasengrenzfläche immobilisiert sind und die Sg(b), sich in einer nicht-festen Phase befinden, in der sie sich bewegen können, gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte
  • a) Immobilisierung der Si(a) an einer Vielzahl von n + x Meßpunkten Mi(c, a) (1 ≦ c ≦ n + x), angeordnet an der Phasengrenzfläche, dergestalt, daß auf jedem Meßpunkt fast ausschließlich Moleküle einer Spezies Si(a) immobilisiert sind, und auf der überwiegenden Anzahl der Meßpunkte unterschiedliche Spezies immobilisiert sind, sowie
  • b) Messung einer physikalischen Eigenschaft der Phasengrenzfläche an den Meßpunkten Mi(c, a) der Phasengrenzfläche, welche Eigenschaft sich mit dem Eintreten einer bindenden Wechselwirkung zwischen der auf Mi(c, a) immobilisierten Spezies Si(a) und mindestens einer Spezies Sg(b) ändert, für jeden Meßpunkt Mi(c, a) unabhängig, sowie
  • c) Herstellen eines Kontakts zwischen der Phasengrenzfläche und der Phase, welche die Sg(b) enthält, in einer Weise, die eine Wechselwirkung zwischen den Si(a) und den Sg(b) erlaubt, sowie
  • d) Messung der physikalischen Eigenschaft der Phasengrenzfläche am Punkt Mi(c, a) der Phasengrenzfläche, welche Eigenschaft sich mit dem Eintreten einer bindenden Wechselwirkung zwischen der auf Mi(c, a) immobilisierten Spezies Si(a) und mindestens einer Spezies Sg(b) ändert, für jeden Meßpunkt Mi(c, a) unabhängig, sowie
  • e) Detektion einer molekularen Wechselwirkung zwischen einer Spezies Si(a) und mindestens einer Spezies Sg(b) durch Vergleich der bei der Messung der besagten physikalischen Eigenschaft am Punkt Mi(c, a) in Schritt d. und Schritt f. erhaltenen Werte für besagte physikalische Eigenschaft, wobei eine Veränderung des erhaltenen Wertes von Schritt d. nach Schritt f. eine molekulare Wechselwirkung anzeigt.
7. A method for the detection of molecular interactions between individual members of a multitude n of different molecular species S i (a) (1 ≦ a ≦ n) and a further multitude of m different molecular species S g (b) (1 ≦ b ≦ m), wherein the S i (a) are immobilized on a phase interface and the S g (b) are in a non-solid phase in which they can move, characterized by the method steps
  • a) Immobilization of the S i (a) at a multiplicity of n + x measurement points M i (c, a) (1 ≦ c ≦ n + x), arranged at the phase interface, in such a way that on each measurement point almost exclusively molecules of one species S i (a) are immobilized, and different species are immobilized on the predominant number of measuring points, and
  • b) measurement of a physical property of the phase interface at the measuring points M i (c, a) of the phase interface, which property occurs with the occurrence of a binding interaction between the species S i (a) immobilized on M i (c, a) and at least one Species S g (b) changes independently for each measuring point M i (c, a), as well
  • c) making contact between the phase interface and the phase containing the S g (b) in a manner that allows an interaction between the S i (a) and the S g (b), and
  • d) measurement of the physical property of the phase interface at point M i (c, a) of the phase interface, which property occurs with the occurrence of a binding interaction between the species S i (a) immobilized on M i (c, a) and at least one species S g (b) changes independently for each measuring point M i (c, a), as well
  • e) Detecting a molecular interaction between a species S i (a) and at least one species S g (b) by comparing the physical property at point M i (c, a) in step d when measuring said physical property. and step f. values obtained for said physical property, with a change in the value obtained from step d. after step f. indicates a molecular interaction.
8. Verfahren nach Anspruch 6 gekennzeichnet dadurch, daß jene Phase der die Phasengrenzfläche bildenden Phasen in Schritt e., die nicht die Sg(b) enthält, eine feste Phase ist.8. The method according to claim 6, characterized in that that phase of the phases forming the phase interface in step e., Which does not contain the S g (b), is a solid phase. 9. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7 gekennzeichnet dadurch, daß die Messung der physikalischen Eigenschaft der Phasengrenzfläche in Schritt d. und Schritt f. unter Verwendung einer Lichtquelle und eines Lichtdetektors durchgeführt wird.9. The method according to claim 6 or 7, characterized in that the measurement the physical property of the phase interface in step d. and step f. using a light source and a light detector. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8 gekennzeichnet dadurch, daß besagte physikalische Eigenschaft der Brechungsindex an der durch die Phasengrenzfläche gebildeten optischen Oberfläche ist.10. The method according to any one of claims 6 to 8, characterized in that said physical property of the refractive index at the by the Phase interface is formed optical surface. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10 besonders gekennzeichnet dadurch, daß die Anzahl n der an der Phasengrenzfläche immobilisierten Spezies Si(a) größer ist als 4, vorzugsweise größer ist als 10, besonders bevorzugt größer ist als 50, am vorteilhaftesten größer ist als 100.11. The method according to any one of claims 7 to 10, particularly characterized in that the number n of the species S i (a) immobilized on the phase interface is greater than 4, preferably greater than 10, particularly preferably greater than 50, most advantageously greater is as 100. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11 gekennzeichnet dadurch, daß Schritt d. und Schritt f. räumlich und zeitlich unabhängig von Schritt e. durchgeführt werden können.12. The method according to any one of claims 7 to 11, characterized in that Step d. and step f. spatially and temporally independent of step e. can be carried out. 13. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Identifikation von molekularen Spezies, die miteinander wechselwirken.13. Use of a device according to one of claims 1 to 6 for Identification of molecular species that interact with each other. 14. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 7 bis 12 zur Identifikation von molekularen Spezies, die miteinander wechselwirken.14. Use of a method according to one of claims 7 to 12 for Identification of molecular species that interact with each other. 15. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung gekennzeichnet dadurch, daß das Verfahren mindesten einen Verfahrensschritt enthält, in dem
  • a) unter Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, oder eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 7 bis 12, eine Wechselwirkung identifiziert wird, welche für einen besonders erwünschten oder besonders unerwünschten physischen Zustand Relevanz besitzt,
  • b) ein Agonist, Inhibitor oder Antagonist der in Schritt h. identifizierten Wechselwirkung identifiziert wird,
  • c) der Inhibitor in einer pharmazeutisch akzeptablen Form formuliert wird.
15. A process for producing a composition, characterized in that the process contains at least one process step in which
  • a) using an apparatus according to one of claims 1 to 6, or a method according to one of claims 7 to 12, an interaction is identified which is relevant to a particularly desired or particularly undesirable physical condition,
  • b) an agonist, inhibitor or antagonist which in step h. identified interaction is identified,
  • c) the inhibitor is formulated in a pharmaceutically acceptable form.
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JP3365809B2 (en) * 1993-03-15 2003-01-14 オリンパス光学工業株式会社 Measurement device using surface plasmon resonance
SE9602545L (en) * 1996-06-25 1997-12-26 Michael Mecklenburg Method of discriminating complex biological samples

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