DE19919550A1

DE19919550A1 - Process for the production of organisms with increased sterol glycoside production and use of the sterol glycosides

Info

Publication number: DE19919550A1
Application number: DE1999119550
Authority: DE
Inventors: Ernst Heinz; Dirk Warnecke; Thorsten Zank; Frank Mueller; Ulrich Zaehringer
Original assignee: NORDDEUTSCHE PFLANZENZUCHT HAN
Current assignee: GVS Gesellschaft fuer Verwertungssysteme GmbH
Priority date: 1999-04-29
Filing date: 1999-04-29
Publication date: 2000-11-02
Also published as: WO2000066716A2; WO2000066716A3; AU4914300A

Abstract

The invention relates to a method for producing transgenic organisms including bacteria, fungi, plants and animals, or transgenic cells which exhibit an increased production of steroid glycoside, steroid alkaloid and/or sterol glycoside compared to that of wild-type organisms or cells. The inventive method involves the transfer of DNA sequences which code for sterol glycosyl transferases. The invention also relates to applications of the organisms produced or of the steroid glycosides, steroid alkaloids and/or sterol glycosides synthesized in or by the organisms or cells. Said applications are useful in the pharmaceutical and foodstuff industries as well as for protecting plants.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von transgenen Organis men, einschließlich Bakterien, Pilzen, Pflanzen und Tieren, oder transgenen Zellen, die eine gegenüber Wildtyp-Organismen bzw. -Zellen erhöhte Steroidglykosid-, Steroid alkaloid- und/oder Sterolglykosid-Produktion aufweisen, wobei das Verfahren die Übertragung von DNA-Sequenzen umfaßt, die Dir Sterolglykosyltransferasen kodieren.The present invention relates to a method for producing transgenic organ men, including bacteria, fungi, plants and animals, or transgenic cells that a steroid glycoside, steroid increased compared to wild-type organisms or cells have alkaloid and / or sterol glycoside production, the process being the Transfer of DNA sequences encoding the sterol glycosyltransferases.

Weiter betrifft die Erfindung pharmazeutisch, lebensmitteltechnologisch oder für den Pflanzenschutz nützliche Verwendungen der erzeugten Organismen bzw. der in den oder von den Organismen oder Zellen synthetisierten Steroidglykoside, Steroidalkaloid- und Sterolglykoside.The invention further relates to pharmaceutical, food technology or for Plant protection useful uses of the organisms produced or in the or steroid glycosides, steroid alkaloid and synthesized by organisms or cells Sterol glycosides.

Sterolglykoside sind weit verbreitete Membranlipide, die in sämtlichen Pflanzen, mehreren Algen, einigen Pilzen und Bakterien und auch in tierischen Organismen vorkommen. Im Unterschied zu Sterolen und Sterolestern ist über die Synthese, den Transport und die Funktionen der Sterolglykoside gegenwärtig noch nicht sehr viel bekannt. Grundlage für Funktionsanalysen ist die Annahme, daß sich freie Sterole und Sterolgykoside physio logisch unterscheiden, da die Anheftung eines Glykosylrests an das Sterolgerüst die physiologischen Eigenschaften des Lipids und als Folge hiervon die Charakteristika der Membranen, die verschiedene Anteile an freien Sterolen und Sterolglykosiden enthalten, verändert. Dennoch ist bis heute nicht bekannt, worin die physiologischen Unterschiede von freien Sterolen und Sterolglykosiden in Membranen liegen und warum viele Eukary onten überhaupt Sterolglykoside synthetisieren.Sterol glycosides are widespread membrane lipids found in all plants, several Algae, some fungi and bacteria and also occur in animal organisms. in the The difference to sterols and sterol esters is in the synthesis, the transport and the Functions of the sterol glycosides are not yet very well known. basis for Functional analysis is the assumption that free sterols and sterol gycosides physio logically differentiate, since the attachment of a glycosyl residue to the sterol structure physiological properties of the lipid and, as a result, the characteristics of the lipid Membranes containing different proportions of free sterols and sterol glycosides, changed. However, it is still not known what the physiological differences are of free sterols and sterol glycosides lie in membranes and why many eukarys can synthesize sterol glycosides at all.

Während der letzten Jahre wurden einige DNA-Sequenzen aus verschiedenen Organismen isoliert, von denen vermutet wird, daß sie für Glykosyltransferasen kodieren. Bei Glykosyl transferasen handelt es sich allgemein um Enzyme, die die Übertragung eines bestimmten Zuckerrests, also einer Glykosylgruppe, von einem aktivierten Donorsubstrat auf ein spezi fisches Akzeptormolekül katalysieren. Je nach Art des übertragenen Zuckers bezeichnet man die Enzyme z. B. als Glukosyltransferase, wenn der Transfer eines Glukoserests kata lysiert wird, oder Galaktosyltransferasen, wenn es sich bei dem übertragenen Zucker molekül um Galaktose handelt. So offenbart bspw. WO 94/12646 die Isolierung von cDNA-Klonen für Galaktosyltransferase und Sialyltransferase aus HeLa- bzw. mensch lichen HepG2-Zellen. In Expressionsstudien konnte eine Galaktosyl-transferaseaktivität in transformierten Hefezellen gezeigt werden, wenn UDP-¹⁴C-Galaktose als Donor und das Glykoprotein Ovalbumin oder freies GlcNAc als Akzeptor angeboten wird. Während sich solche DNA-Sequenzen bzw. die von ihnen kodierten Enzyme bspw. für die Synthese und Modifizierung von Glykoproteinen, Glykolipiden und Oligosacchariden eignen, können sie nicht zur Erzeugung von Sterolglykosiden in transgenen Organismen eingesetzt werden, da Sterole von diesen Glykosyltransferasen nicht als spezische Akzeptormoleküle erkannt werden.In recent years, some DNA sequences have been isolated from various organisms that are thought to encode glycosyltransferases. Glycosyl transferases are generally enzymes that catalyze the transfer of a certain sugar residue, i.e. a glycosyl group, from an activated donor substrate to a specific acceptor molecule. Depending on the type of sugar transferred, the enzymes are called z. B. as glucosyltransferase, if the transfer of a glucose residue is lysed kata, or galactosyltransferases, if the sugar transferred is molecular galactose. For example, WO 94/12646 discloses the isolation of cDNA clones for galactosyltransferase and sialyltransferase from HeLa or human HepG2 cells. Expression studies demonstrated galactosyl transferase activity in transformed yeast cells when UDP- ¹⁴ C-galactose is offered as the donor and the glycoprotein ovalbumin or free GlcNAc as the acceptor. While such DNA sequences or the enzymes encoded by them are suitable, for example, for the synthesis and modification of glycoproteins, glycolipids and oligosaccharides, they cannot be used to generate sterol glycosides in transgenic organisms, since sterols from these glycosyltransferases are not special acceptor molecules be recognized.

Zwar offenbart die deutsche Offenlegungsschrift 197 44 873 die Isolierung von cDNA- Klonen aus Avena sativa und Arabidopsis thaliana sowie eines genomischen Klons aus Saccharomyces cerevisiae, die für ein Enzym mit der Aktivität einer Sterolglukosyltrans ferase kodieren sollen. Doch konnte jetzt erstmals erfolgreich gezeigt werden, daß Eukary onten, die mit für Sterolglykosyltransferase kodierenden DNA-Sequenzen transformiert worden sind, auch tatsächlich in vivo signifikant größere Mengen an Sterolglykosiden produzieren als Wildtyporganismen. Darüber hinaus konnte erst jetzt demonstriert werden, daß Sterolglykosyltransferasen in der Lage sind, auch Sterolderivate spezifisch zu glykosy lieren.German Offenlegungsschrift 197 44 873 does indeed disclose the isolation of cDNA- Cloning from Avena sativa and Arabidopsis thaliana as well as a genomic clone Saccharomyces cerevisiae, which is responsible for an enzyme with the activity of a sterol glucosyltrans encode ferase. But it has now been successfully shown for the first time that Eukary onten, which transforms with DNA sequences coding for sterol glycosyltransferase significantly larger amounts of sterol glycosides have actually been in vivo produce as wild type organisms. In addition, it was only now possible to demonstrate that sterol glycosyltransferases are able to also specifically sterol derivatives to glykosy lieren.

In verschiedenen Bereichen wie der Medizin, der Lebensmitteltechnologie, der Biotech nolgie und dem Pflanzenschutz bestehen Bedürfnisse für Organismen bzw. Zell- und Gewebekulturen mit hohen Sterolglykosid- bzw. Sterolderivat-Glykosid-Gehalten, sei es, daß der veränderte Organismus selbst Vorteile gegenüber dem Wildtyp-Organismus liefert oder daß der Organismus als Produktionsstätte für die anschließende Gewinnung großer Mengen an gewünschtem Glykosid dient.In various areas such as medicine, food technology and biotech nology and crop protection there are needs for organisms and cell and Tissue cultures with high sterol glycoside or sterol derivative glycoside contents, be it that the modified organism itself provides advantages over the wild-type organism or that the organism as a production site for the subsequent extraction of large Amounts of desired glycoside is used.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es demnach, ein Verfahren zur Erzeugung von transgenen Organismen und Zellen mit erhöhter Sterolglykosid- bzw. Sterolderivat- Glykosid-Produktion bereitzustellen, um die bestehenden Bedürfnisse in den erwähnten Bereichen zu befriedigen. The object of the present invention is therefore to provide a method for producing transgenic organisms and cells with increased sterol glycoside or sterol derivative Glycoside production to meet the existing needs mentioned in the Satisfy areas.

Zur Lösung dieser Aufgaben dienen die Merkmale der unabhängigen Schutzansprüche.The features of the independent protection claims serve to solve these tasks.

Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den jeweiligen Unteransprüchen definiert.Advantageous configurations are defined in the respective subclaims.

Es konnte jetzt erstmals ein Sterol in Eukaryonten als in vivo-Substrat für Sterolglukosyl transferasen aus verschiedenen Organismen identifiziert und eine erhöhte Sterolglykosid- Produktion in transgenen Eukaryonten gegenüber Wildtyp-Zellen gezeigt werden. Außer dem konnte jetzt erstmals ein neues Glykolipid in S. cerevisiae-Zellen, transformiert mit DNA-Sequenzen für Sterolglykosyltransferase aus einem anderen Hefe-Spezies, als in vivo-Produkt der heterolog exprimierten Sterolglykosyltransferase nachgewiesen werden. Damit ist es erstmals gelungen, die erfolgreiche Glykosylierung von Sterolderivaten, nämlich Steroiden, mittels heterologer Expression von Sterolglykosyltransferase- Sequenzen in transgenen Eukaryonten zu zeigen.It was now possible for the first time to use a sterol in eukaryotes as an in vivo substrate for sterol glucosyl transferases from different organisms identified and an increased sterol glycoside Production in transgenic eukaryotes versus wild type cells are shown. Except For the first time, a new glycolipid in S. cerevisiae cells, transformed with DNA sequences for sterol glycosyltransferase from a different yeast species than in vivo product of the heterologously expressed sterol glycosyltransferase can be detected. This is the first time that the successful glycosylation of sterol derivatives, namely steroids, by means of heterologous expression of sterol glycosyltransferase To show sequences in transgenic eukaryotes.

Zur Erzeugung von transgenen Organismen oder Zellen mit einem erhöhten Gehalt an Steroidglykosiden, Steroidalkaloidglykosiden und/oder Sterolglykosiden wird ein Verfahren bereitgestellt, daß folgende Schritte umfaßt:
A method is provided for producing transgenic organisms or cells with an increased content of steroid glycosides, steroid alkaloid glycosides and / or sterol glycosides, which comprises the following steps:

a) Preparation of a nucleic acid sequence comprising the following components, which are strung together in 5'-3 'orientation:
a promoter which is functional, optionally constitutive, tissue-specific, development-specific or inducible in the respective organism or cell,
at least one nucleic acid sequence which codes for a protein with the enzymatic activity of a sterol glycosyltransferase, in particular a sterolglucosyltransferase, or an active fragment thereof and
a termination signal for the termination of the transcription and the addition of a polyA tail to the corresponding transcript as well as any DNA sequences derived therefrom,
b) transfer of the nucleic acid sequence from a) to bacterial, fungal, vegetable or animal cells and possibly integration of the nucleic acid sequence into the genome of the Cells, and
c) if desired, regeneration of completely transformed organisms and possibly Propagation of these organisms.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens können beliebige Nukleinsäuresequenzen, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Sterolglykosyltransferase, insbesondere einer Sterolglukosyltransferase, oder ein aktives Fragment davon kodieren, eingesetzt werden. Dabei kann es sich um DNA-Fragmente, die in der deutschen Offenlegungsschrift 197 44 873 beschrieben sind, um Nukleinsäuresequenzen, die im Rahmen dieser Erfindung erstmals bereitgestellt werden oder um Allele und Derivate dieser für eine Sterolglykosyltransferase oder ein aktives Fragment davon kodierenden Sequenzen, die ebenfalls für ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Sterol glykosyltransferase kodieren, handeln. Bei den Allelen und Derivaten handelt es sich insbesondere um Sequenzen, die sich aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von den aus DE-A-197 44 873 bekannten und den im Rahmen dieser Erfindung offen barten Sequenzen unterscheiden und Dir ein Protein oder ein Fragment davon mit der enzymatischen Aktivität einer Sterolglykosyltransferase kodieren. Weiter können im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens Nukleinsäuremoleküle eingesetzt werden, die für Sterolglykosyltransferase kodierende DNA-Sequenzen enthalten oder durch natürlich vorkommende oder durch gentechnische oder chemische Prozesse und Syntheseverfahren aus diesen entstanden sind bzw. von diesen abgeleitet wurden. Hierbei kann es sich bspw. um DNA- oder RNA-Moleküle, cDNA, genomische DNA, mRNA etc. handeln.Any nucleic acid sequences, for a protein with the enzymatic activity of a sterol glycosyltransferase, in particular a sterol glucosyl transferase, or encode an active fragment thereof, be used. These can be DNA fragments that are found in German Patent Application 197 44 873 are described to nucleic acid sequences that in Within the scope of this invention can be provided for the first time or to alleles and derivatives this encoding a sterol glycosyl transferase or an active fragment thereof Sequences also for a protein with the biological activity of a sterol encode glycosyltransferase, act. The alleles and derivatives are especially to sequences that are due to the degeneration of the genetic code of those known from DE-A-197 44 873 and open in the context of this invention differentiate bartender sequences and you a protein or a fragment thereof with the Encode the enzymatic activity of a sterol glycosyl transferase. Further in Within the scope of the method according to the invention, nucleic acid molecules are used which contain DNA sequences coding for sterol glycosyltransferase or by natural occurring or through genetic engineering or chemical processes and synthetic processes arose from or were derived from these. This can, for example. are DNA or RNA molecules, cDNA, genomic DNA, mRNA etc.

Die für Sterolglykosyltransferase kodierenden Sequenzen werden in mit regulatorischen Elementen verknüpfter Form auf den jeweilig gewünschten Organismus bzw. die jeweilig gewünschten Zellen übertragen, wobei die regulatorischen Elemente die Transkription und Translation in der transformierten Zelle gewährleisten. Dabei können die kodierenden Sequenzen unter Kontrolle konstitutiver, aber auch induzierbarer oder gewebe- bzw. entwicklungsspezifischer Regulationselemente, insbesondere Promotoren, in der trans genen Zelle exprimiert werden. Während bspw. die Verwendung eines induzierbaren Promotors die gezielt ausgelöste Expression der Sterolglykosyltransferase-Sequenzen ermöglicht, wie sie u. U. im Falle einer Pilzinfektion (als biotischer Stimulus) in dank der Expression von Sterolglykosyltransferse-Sequenzen Pilz-resistenten Pflanzen erwünscht ist, bietet z. B. der Einsatz von gewebespezifischen oder entwicklungsspezifischen Promo toren die Möglichkeit, die erhöhte Synthese der gewünschten Glykoside auf bestimmte Organe einer Pflanze oder eines Tieres bzw. auf bestimmte Entwicklungsstadien und -zeiträume zu beschränken.The sequences coding for sterol glycosyltransferase are included in regulatory Elements linked form to the respective desired organism or the respective desired cells, the regulatory elements being transcriptional and Ensure translation in the transformed cell. The coding can Sequences under the control of constitutive, but also inducible or tissue or development-specific regulatory elements, especially promoters, in the trans gene can be expressed. For example, while using an inducible Promotors the specifically triggered expression of the sterol glycosyltransferase sequences enables how u. U. in the case of a fungal infection (as a biotic stimulus) in thanks Expression of sterol glycosyltransfere sequences fungal resistant plants desired is offers z. B. the use of tissue-specific or development-specific promo toren the possibility of the increased synthesis of the desired glycosides on certain Organs of a plant or an animal or at certain stages of development and -restrict periods.

Geeignete Promotoren sind dem Fachmann wohl bekannt. Falls allerdings solche Promo toren nicht bekannt sein oder nicht zur Verfügung stehen sollten, ist auf jeden Fall das Konzept zur Isolierung dem Fachmann bekannt. Im Falle eines gewebespezfischen Promotors beispielsweise wird in einem ersten Schritt aus dem gewünschten Gewebe die poly(A)⁺ RNA isoliert und eine cDNA-Bank angelegt. In einem zweiten Schritt werden mit Hilfe von cDNA-Klonen, die auf poly(A)⁺ RNA-Molekülen aus einem anderen Gewebe basieren, aus der ersten Bank mittels Hybridisierung diejenigen Klone identifiziert, deren korrespondierende poly(A)⁺ RNA-Moleküle nur im gewünschten Gewebe, nicht aber in dem anderen Gewebe, exprimiert werden. Anschließend werden mit Hilfe dieser so identifizierten cDNAs Promotoren isoliert, die sodann für die gewebespezifische Expres sion von Sterolglykosidtransferasen gemäß der Erfindung eingesetzt werden können. Analog können andere gewebespezifische, entwicklungsspezifische oder durch ablotische oder biotische Stimuli induziertbare Promotoren isoliert und eingesetzt werden. Alternativ kann erstrebenswert sein, daß der transgene Organimus in vielen Organen und Geweben aufgrund der Expression der Sterolglykosyltransferase-Sequenzen einen erhöhten Glykosid-Gehalt aufweist. In diesem Fall bietet sich die Verwendung eines konstitutiven Promotors, beispielsweise in Pflanzen die Verwendung des 35S RNA-Promotors aus CaMV oder des nos-Promotors aus A. tumefaciens an. Suitable promoters are well known to those skilled in the art. However, if such promoters are not known or should not be available, the concept of isolation is known to the person skilled in the art. In the case of a tissue-specific promoter, for example, the poly (A) ⁺ RNA is isolated from the desired tissue in a first step and a cDNA library is created. In a second step, with the help of cDNA clones based on poly (A) ⁺ RNA molecules from another tissue, those clones are identified from the first bank by hybridization whose corresponding poly (A) ⁺ RNA molecules are only in the desired tissue, but not in the other tissue. Promoters are then isolated with the help of these cDNAs identified in this way, which can then be used for the tissue-specific expression of sterol glycoside transferases according to the invention. Analogously, other tissue-specific, development-specific or inducible by ablotic or biotic stimuli promoters can be isolated and used. Alternatively, it may be desirable that the transgenic organism has an increased glycoside content in many organs and tissues due to the expression of the sterol glycosyltransferase sequences. In this case, the use of a constitutive promoter offers itself, for example in plants the use of the 35S RNA promoter from CaMV or the nos promoter from A. tumefaciens.

Die kodierenden Sequenzen können auch durch Enhancer-Sequenzen oder andere regulatorischen Sequenzen ergänzt sein. Diese regulatorischen Sequenzen beinhalten z. B. auch Signalsequenzen, die für den Transport des Genprodukts zu einem bestimmten Kompartiment sorgen.The coding sequences can also be by enhancer sequences or others regulatory sequences. These regulatory sequences include e.g. B. also signal sequences necessary for the transport of the gene product to a specific one Compartment.

Bei den Organismen bzw. Zellen, in denen Sterolglykosyltransferase-Sequenzen exprimiert werden, kann es sich um Mikroorganismen, Bakterien, Hefen, Pilze, Algen, Pflanzen, Tieren, insbesondere Säugern und Vögel, und Zell- und Gewebekulturen handeln. Die Übertragung der kodierenden Sequenzen in Kombination mit regulatorischen Elementen findet mittels konventioneller Methoden, die dem Fachuran wohl bekannt sind und. wie sie bspw. in Walkerpeach, C. R. and Velten, J. (1994) Plant Mol. Biol. Manual B1, 1-19; Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. (1993) Comptes Rendues de l'Academie des Sciences Serie III, Sciences de la Vie 316, 1194-1199; Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y.; Invitrogen Pichia pastoris Expression Kit Handbuch, Version F, beschrieben sind, statt.The organisms or cells in which sterol glycosyltransferase sequences are expressed can be microorganisms, bacteria, yeasts, fungi, algae, plants, animals, in particular mammals and birds, and cell and tissue cultures. The transmission of the coding sequences in combination with regulatory elements takes place by means of conventional methods which are well known to the expert. as described, for example, in Walkerpeach, CR and Velten, J. (1994) Plant Mol. Biol. Manual B1, 1-19; Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. (1993) Comptes Rendues de l'Academie des Sciences Serie III, Sciences de la Vie 316, 1194-1199; Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ^nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Invitrogen Pichia pastoris Expression Kit Manual, Version F, are being held.

Soweit das zu glykosylierende Sterol oder Sterolderivat nicht oder nicht in ausreichenden Mengen in der transgenen Zelle bzw. Zell/Gewebe-Kultur vorliegt, kann das Substrat an den Organismus bzw. die Kultur verfüttert bzw. das Nährmedium entsprechend angerei chert werden.To the extent that the sterol or sterol derivative to be glycosylated is insufficient or not sufficient The substrate can be present in amounts in the transgenic cell or cell / tissue culture feed the organism or culture or add the nutrient medium accordingly be saved.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Steroid glykosid, das in der transgenen Zelle in erhöhtem Mengen synthetisiert wird, um ein herzaktives Glykosid, also ein sog. Herzglykosid wie bspw. Digitoxin, Digoxin und Strophanthin. Diese Substanzen besitzen ein Steroidgerüst mit 21 C-Atomen, verknüpft mit einem Lactonring am C-17, wobei man bei einem Sgliedrigen, einfach -ungesättigtem γ- Lactonring von Cardenoliden und bei einme 6gliedrigen δ-Lactonring mit 2 Doppelbin dungen von Bufadienoliden spricht. Die biogenetischen Vorstufe beider Gruppen ist das Pregnenolon, das durch oxidativen Abbau der Seitenkette von Cholesterol entsteht. Die Hauptwirkung der Herzglykoside ist die Steigerung der Kontraktionskraft des Myokards (positiv-inotrope Wirkung) und Vermehrung des Schlagvolumens, weshalb sie bei allen Formen der Herzinsuffizienz und Störungen der Erregungsleitung indiziert sind. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet die Möglichkeit, große Mengen an Herzglykosiden auf einfache und kostengünstige Weise herzustellen. Die Gewinnung der Herzglykoside aus den transgenen Organismen, vorzugsweise Pilze oder Pflanzen, bzw. Zellkulturen, vorzugsweise pflanzliche Zellsuspensionskulturen oder Hefekulturen, erfolgt mittels herkömmlicher Methoden.In a preferred embodiment of the invention, the steroid is glycoside, which is synthesized in increased amounts in the transgenic cell cardiac active glycoside, i.e. a so-called cardiac glycoside such as digitoxin, digoxin and Strophanthin. These substances have a steroid structure with 21 C atoms linked to a lactone ring at C-17, where with a S-membered, simply unsaturated γ- Lactone ring of cardenolides and with a 6-membered δ-lactone ring with 2 double bins speaks of bufadienolides. This is the biogenetic precursor of both groups Pregnenolone, which is formed by the oxidative degradation of the side chain of cholesterol. The The main effect of cardiac glycosides is to increase the contraction force of the myocardium (positive inotropic effect) and increase in stroke volume, which is why they are common to all Forms of heart failure and disorders of conduction are indicated. The The inventive method offers the possibility of large amounts of cardiac glycosides simple and inexpensive way to manufacture. The extraction of cardiac glycosides from the transgenic organisms, preferably fungi or plants, or cell cultures, preferably vegetable cell suspension cultures or yeast cultures, is carried out using conventional methods.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weisen die gemäß dem Verfahren hergestellten Organismen bzw. Zellen einen erhöhten Gehalt eines Saponins auf. Hierbei handelt es sich um Glykoside, deren Terpenoidaglyka eine OH-Gruppe β-ständig am C₃ aufweisen, über die die Zucker gebunden werden. Eine der wichtigsten Eigenschaften der Saponine besteht in ihrer Fähigkeit, die reoten Blutkörperchen zu zerstören (Hämolyse). Daneben bilden sie mit Cholesterol schwer lösliche Molekülverbindungen. Als Beispiele für Saponine, die gemäß der Erfindung auf einfache Weise in großen Mengen hergestellt werden können, sind zu nennen Digitonin, Gitonin, Tigonin und Dioscin als Steroid saponin, Tigogenin, Gitogenin, Diosgenin, Digitogenin als Steroidsapogenine und die Ginseng-Saponine als Triterpensaponine.In a further preferred embodiment, the organisms or cells produced according to the method have an increased saponin content. These are glycosides, the terpenoid aglyka of which have an OH group in the β position at the C ₃ , via which the sugars are bound. One of the most important properties of saponins is their ability to destroy red blood cells (hemolysis). In addition, they form poorly soluble molecular compounds with cholesterol. Examples of saponins which can be easily prepared in large quantities according to the invention are digitonin, gitonin, tigonin and dioscin as steroid saponin, tigogenin, gitogenin, diosgenin, digitogenin as steroid sapogenins and the ginseng saponins as triterpene saponins.

Bevorzugt ist das in erhöhten Mengen synthetisierte Saponin Diosgenin. Bei Diosgenin handelt es sich um ein Steroidsapogenin, das ein wichtiges Ausgangsmaterial für die Partialsynthese der Steroidhormone (Nebennierenrindenhormone, Sexualhormone etc.) darstellt. Die Partialsynthese erfolgt durch ein kombiniertes chemisches und mikrobielles Verfahren.The saponin diosgenin synthesized in increased amounts is preferred. With diosgenin It is a steroid sapogenin that is an important raw material for the Partial synthesis of steroid hormones (adrenal cortex hormones, sex hormones etc.) represents. The partial synthesis takes place through a combined chemical and microbial Method.

Die gemäß der Erfindung hergestellten Organismen, bevorzugt Pflanzen, mit erhöhtem Gehalt an sog. Herzglykosiden stillen darüber hinaus das pflanzenzüchterische Bedürfnis nach insektentoleranten Pflanzen. So sind bspw. Pflanzen mit einem erhöhten Gehalt an Cardenoliden, z. B. Glykosiden des Calotropagenins, resistent gegenüber Insekten.The organisms produced according to the invention, preferably plants, with increased The so-called cardiac glycosides content also satisfy the need for plant breeding for insect-tolerant plants. For example, plants with an increased content of Cardenolides, e.g. B. Calotropagenin glycosides, resistant to insects.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erzeugen die transgenen Organismen, vorzugsweise Pflanzen, erhöhte Mengen an Solanum-Alkaloiden, insbesondere an Demissin und/oder Tomatin.In a further preferred embodiment, the transgenic organisms produce preferably plants, increased amounts of Solanum alkaloids, in particular Demissin and / or Tomatin.

Bei den Solanum-Alkaloide handelt es sich um glykosylierte Steroidalkaloide, die ebenfalls zu den Saponinen gehören und daher auch Molekülverbindungen mit Cholesterol bilden. Darüber hinaus stellen die Solanum-Alkaloide ebenfalls potentielle Ausgangs produkte für die Herstellung von Steroidhormonen dar. Eine wichtige Eigenschaft der Solanum-Alkaloide im Rahmen dieser Erfindung ist ihre antimykotische Wirkung. Die gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellten Organismen, insbesondere Pflanzen, weisen aufgrund ihres erhöhten Solanum-Alkaloid-Gehalts eine erhöhte Pilztoleranz auf.The Solanum alkaloids are glycosylated steroid alkaloids that also belong to the saponins and therefore also molecular compounds with cholesterol form. In addition, the Solanum alkaloids are also potential starting points products for the production of steroid hormones. An important property of Solanum alkaloids in the context of this invention is their antifungal activity. The Organisms, in particular plants, produced according to the method of the invention, have an increased mushroom tolerance due to their increased solanum alkaloid content.

Eine weitere Aufgabe besteht darin, nützliche Anwendungen für die transgenen Organis men und Zellen mit erhöhtem Sterolglykosid- bzw. Sterolderivat-Glykosid-Gehalt und die in diesen Organismen bzw. Zellen synthetisierten Glykoside aufzuzeigen.Another task is to find useful applications for the transgenic organ men and cells with increased sterol glycoside or sterol derivative glycoside content and the to show glycosides synthesized in these organisms or cells.

Diese Aufgabe wird u. a. durch die Verwendung des transgenen Organismus oder Zelle mit einem erhöhten Gehalt an Herzglykosiden zur Gewinnung des/der jeweiligen Herzglyko sids zwecks Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Herzerkrankungen gelöst.This task is u. a. by using the transgenic organism or cell an increased content of cardiac glycosides to obtain the respective cardiac glyco sids solved for the manufacture of a medicament for the treatment of heart diseases.

Des weiteren wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung des transgenen Organismus oder Zelle mit einem erhöhten Gehalt an Saponinen zur Gewinnung des/der Saponins bzw. Saponine zwecks Herstellung eines Arzneimittels mit Cholesterolspiegel-senkender und/ oder hämolytischer Wirkung. Furthermore, the task is solved by using the transgenic organism or cell with an increased content of saponins for obtaining the saponin or Saponins for the manufacture of a medicament with cholesterol-lowering and / or hemolytic effect.

Eine weitere Lösung der Aufgabe liegt in der Verwendung des transgenen Organismus oder Zelle mit erhöhtem Saponin-, insbesondere Diosgenin-, Gehalt zur Gewinnung desAnother solution to the problem lies in the use of the transgenic organism or cell with increased saponin, especially diosgenin, content to obtain the

Saponins als Ausgangsverbindung für die Synthese von Steroidhormonen, insbesondere von Cortison und Progesteron.Saponins as a starting compound for the synthesis of steroid hormones, in particular of cortisone and progesterone.

Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung eines nach dem erfindungs gemäßen Verfahren hergestellten Saccharomyces-Stammes als Backhefe. Es wurde jetzt gefunden, daß transgene Hefe-Stämme mit erhöhtem Gehalt an Sterolglykosiden und/oder Sterolderivatglykosiden bessere Eigenschaften beim Backen von Teigwaren aufweisen als herkömmliche Hefen. Ebenso betrifft die Erfindung die Pflanzen mit erhöhtem Phyto sterolglycosid-Gehalt und dadurch verändertem Glykolipidanteil in der Lecithinfraktion von Pflanzenfetten- und ölen.Furthermore, the object is achieved by using an according to the invention Saccharomyces strain produced according to the method as baker's yeast. It was now found that transgenic yeast strains with increased levels of sterol glycosides and / or Sterol derivative glycosides have better properties when baking pasta than conventional yeasts. The invention also relates to plants with increased phyto Sterol glycoside content and thereby changed glycolipid content in the lecithin fraction of vegetable fats and oils.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäß synthetisierten Steroidglykoside, Steroidalkaloidglykoside und/oder Sterolglykoside als Emulgatoren, beispeilsweise in der pharmzeutischen Technolgie, als Zusätze zu Waschmitteln oder als Dispergier- und Netzmittel, z. B. in kosmetischen Produkten.The invention further relates to the use of those synthesized according to the invention Steroid glycosides, steroid alkaloid glycosides and / or sterol glycosides as emulsifiers, for example in pharmaceutical technology, as additives to detergents or as Dispersing and wetting agents, e.g. B. in cosmetic products.

Eine Lösung der Aufgabe liegt des weiteren in der Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erzeugung von Milch in transgenen Säugern, insbesondere Kuhmilch, mit verringertem Cholesterol-Gehalt. Durch Expression von Sterolglykosyltransferasen können in Säugern erhöhte Mengen an Cholesterolglykosid, insbesondere Cholesterolglukosid, synthetisiert werden, wodurch z. B. der Kuhmilch Cholesterol entzogen und durch das Glykosid des Cholsterols ersetzt wird. Diese Cholesterol-arme und Cholesterol-Glykosid reiche Milch hat einen positiven Effekt auf die Blutplasmafettwerte der Milchkonsu menten. Another solution to the problem lies in the use of the invention Process for the production of milk in transgenic mammals, in particular cow's milk, with reduced cholesterol. By expressing sterol glycosyltransferases increased amounts of cholesterol glycoside in mammals, especially cholesterol glucoside, are synthesized, whereby z. B. deprived of cholesterol from cow's milk and by that Glycoside of cholsterol is replaced. This low cholesterol and cholesterol glycoside Rich milk has a positive effect on blood plasma fat levels in milk consumption ment.

Auf ähnliche Weise kann der Cholesterol-Gehalt in Hühnereiern durch Expression von Sterolglykosidtransferase-Sequenzen in transgenen Hühnern gesenkt werden, was ebenfalls den Blutplasmagehalt an Cholesterol in den Konsumenten der Hühnereier positiv beein flussen würde.Similarly, the cholesterol level in chicken eggs can be expressed by expression of Sterol glycoside transferase sequences in transgenic chickens are decreased, which also has a positive effect on the blood plasma cholesterol content in the hen's egg consumers would flow.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der Aktivität einer Sterolglykosyltransferase kodiert, oder eines Proteins mit der Aktivität einer Sterolglykosyltransferase oder eines aktiven Fragments davon, insbe sondere einer pilzlichen Sterolglykosyltransferase, zur Auffindung von Effektoren, insbe sondere Inhibitoren, pilzlicher Sterolglykosyltransferase.The invention further relates to the use of a nucleic acid sequence which is suitable for a Protein encoded with the activity of a sterol glycosyltransferase, or a protein with the activity of a sterol glycosyl transferase or an active fragment thereof, in particular in particular a fungal sterol glycosyltransferase, for finding effectors, in particular special inhibitors, fungal sterol glycosyltransferase.

Es wurde gefunden, daß bestimmte Pilze wesentlich höhere Sterolglykosid-Gehalte aufweisen als Saccharomyces und daß unter Streßbedingungen eine verstärke Glykosid- Produktion beobachten werden kann. Darüber hinaus konnte eine Insertionsmutation von Magnaporthe grisea, die mit einer reduzierten Pathogenität des Pilzes einhergeht, mittels Sequenzvergleich (GenBank Accession No. AF027983) mit Sterolglukosyltransferase- Sequenzen aus Hefen einer Sterolglukosyltransferase zugeordnet werden. Diese Beobachtungen deuten stark darauf hin, daß Sterolglykoside bei der Pathogenität von Pilzen eine wichtige Rolle spielen.It has been found that certain fungi have much higher levels of sterol glycoside have as Saccharomyces and that under stress conditions an increased glycoside Production can be observed. In addition, an insertion mutation of Magnaporthe grisea, which is associated with a reduced pathogenicity of the fungus, by means of Sequence comparison (GenBank Accession No. AF027983) with sterol glucosyl transferase Sequences from yeast are assigned to a sterol glucosyl transferase. This Observations strongly suggest that sterol glycosides are responsible for the pathogenicity of Mushrooms play an important role.

Daher bietet die Kenntnis über Sterolglykosyltransferase-Sequenzen und die von diesen kodierten Sequenzen die Möglichkeit, neue fungizide Wirkstoffe für den Pflanzenschutz aufzufinden. So können beispielsweise pilzliche Proteine mit der enzymatischen Aktivität von Sterolglykosyltransferasen für die Röntgenstrukturanalyse, NMR-Spektroskopie, molecular modeling, und drug design eingesetzt werden, um auf der Basis der aus diesen Verfahren gewonnenen Erkenntnisse Inhibitoren der Sterolglykosyltransferase und somit potentielle Fungizide zu identifizieren oder synthetisieren. Therefore, knowledge of and of sterol glycosyltransferase sequences is available coded sequences the possibility of new fungicidal agents for crop protection to find. For example, fungal proteins with enzymatic activity of sterol glycosyltransferases for X-ray structure analysis, NMR spectroscopy, molecular modeling, and drug design to be used on the basis of these Insights gained from the process inhibitors of sterol glycosyltransferase and thus identify or synthesize potential fungicides.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der Aktivität einer Sterolglykosyltransferase kodiert, oder eines Proteins mit der Aktivität einer Sterolglykosyltransferase oder eines aktiven Fragments davon zur in vitro- Glykosylierung von Steroidhormonen. Die in vitro hergestellten Steroidhormon-Glykoside können bspw. als Depotarzneimittel verabreicht werden, da das jeweilig in vitro glykosy lierte Steroidhormon im Körper durch die Aktivität von Glykosidasen, insbesondere Hydrolasen, aus dem Glykosid nach und nach freigesetzt wird.The invention also relates to the use of a nucleic acid sequence necessary for a protein encoded with the activity of a sterol glycosyl transferase, or a protein with the Activity of a sterol glycosyl transferase or an active fragment thereof for in vitro Glycosylation of steroid hormones. The steroid hormone glycosides produced in vitro can, for example, be administered as a depot drug, since the respective in vitro glycosy gated steroid hormone in the body through the activity of glycosidases, in particular Hydrolases, from which glycoside is gradually released.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung und stellen keine Einschränkung auf bestimmte Ausführungsformen bzw. Anwendungsbereiche dar. Vielmehr kann man sich eine Vielzahl weiterer Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung vorstellen.The following examples serve to illustrate the invention and represent no restriction to certain embodiments or areas of application. Rather, you can look at a variety of other applications present invention.

Examples Cloning of the DNA sequences for sterol glucosyl transferase from Candida albicans, Pichia pastoris and Dictyostellum discoideum

Für die Klonierung von Sterolglukosyltransferase-Sequenzen aus C. albicans wurde eine PCR mit genomischen DNA von C. albicans mit den Primern
For the cloning of sterolglucosyltransferase sequences from C. albicans, a PCR with genomic DNA from C. albicans with the primers was carried out

5'-GSI WCI VGI GGI GAY GTH CAR CC-3' und
5'-GTI GTI CCI SHI CCI SCR TGR TG-3'
5'-GSI WCI VGI GGI GAY GTH CAR CC-3 'and
5'-GTI GTI CCI SHI CCI SCR TGR TG-3 '

durchgeführt. Das hieraus resultierende PCR-Fragment wurde anschließend für die Herstellung einer DIG-markierten Sonde für das Screenen einer Fosmid-Library von genomischer DNA aus dem C. albicans-Stamm 1161 eingesetzt. Drei positive Fosmid- Klone wurden isoliert: 2H6, 3E6 und 8C12. Ein 8,2 kB HindIII-Fragment von 2H6 wurde mittels Auftrennung der Restriktionsfragmente im Agarosegel und Hybridisierung der aufgetrennten Fragmente mit der DIG-markierten Sonde identifiziert. Dieses 8,2 kB Fragment enthielt den ORF UGT51C1 (UGT steht für UDP-Glykosyltransferase; ORF für open reading frame) und wurde in HindIII-linearisierten pUC18 ligiert. Das hieraus entstandene Plasmid wurde mit pUGT51C1g bezeichnet. Ein dem ORF UGT51C1 entsprechendes PCR-Fragment wurde in den Expressionsvektor für E. coli pBAD TOPO (Invitrogen) kloniert und der hieraus resultierende Vektor pUGT51C1x genannt.carried out. The resulting PCR fragment was then used for the Preparation of a DIG-labeled probe for screening a fosmid library from genomic DNA from the C. albicans strain 1161 used. Three positive fosmid Clones were isolated: 2H6, 3E6 and 8C12. An 8.2 kB HindIII fragment of 2H6 was generated by separating the restriction fragments in the agarose gel and hybridizing the separated fragments identified with the DIG-labeled probe. This 8.2 kB Fragment contained the ORF UGT51C1 (UGT stands for UDP-Glycosyltransferase; ORF for open reading frame) and was ligated into HindIII linearized pUC18. This from here The resulting plasmid was designated pUGT51C1g. A the ORF UGT51C1 the corresponding PCR fragment was inserted into the expression vector for E. coli pBAD TOPO (Invitrogen) cloned and the resulting vector called pUGT51C1x.

Für die Klonierung des Sterolglykosyltransferasegens aus P. pastoris wurde eine PCR mit genomischer DNA von P. pastoris mit den Primern
For the cloning of the sterol glycosyltransferase gene from P. pastoris, a PCR with genomic DNA from P. pastoris with the primers was carried out

5'-TTY ACI ATG CCI TGG ACI MSI AC-3' und
5'-YKI GRI SHI GCI SCI GTI GTN CC-3'
5'-TTY ACI ATG CCI TGG ACI MSI AC-3 'and
5'-YKI GRI SHI GCI SCI GTI GTN CC-3 '

durchgeführt. Das erhaltene PCR-Fragment wurde für die Synthese einer DIG-gelabelten Sonde zum Screenen einer Library von genomischer DNA aus dem P. pastoris-Stamm GS115 (Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376-3385; Liu et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 10940-10951) verwendet. Ein SphI/EcoRV-Fragment eines positiven Klons wurde entsprechend der oben für C. albicans beschriebenen Methode isoliert. Dieses 6,8 kB Fragment enthielt den ORF UGT51B1 und wurde in mit SphI und SmaI verdauten pUC 19- Vektor ligiert. Das entstandene pUC-Plasmid wurde pUGT51B1g genannt. Ein dem ORF UGTS1B1 entsprechendes PCR-Fragment wurde in Expressionsvektoren für E. coli (pBAD TOPO → pUGT51B1x) und für S. cerevisiae (pYES2 (Invitrogen) → pUGT51B1xy) kloniert.carried out. The PCR fragment obtained was used for the synthesis of a DIG-labeled Probe for screening a library of genomic DNA from the P. pastoris strain GS115 (Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376-3385; Liu et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 10940-10951) is used. A SphI / EcoRV fragment of a positive clone was created isolated according to the method described above for C. albicans. This 6.8 kB Fragment contained the ORF UGT51B1 and was in pUC 19- digested with SphI and SmaI Vector ligated. The resulting pUC plasmid was named pUGT51B1g. An ORF PCR fragment corresponding to UGTS1B1 was expressed in expression vectors for E. coli (pBAD TOPO → pUGT51B1x) and for S. cerevisiae (pYES2 (Invitrogen) → pUGT51B1xy) cloned.

Für die Isolierung eines UGT-Klons aus D. discoideum wurde der cDNA-Klon FC-AZ07 (GenBank Accession Nos. C25752 und C25753) aus der cDNA-Bank des D. discoideum- Stamms CAX3 für die PCR-Synthese einer DIG-gelabelten Sonde verwendet. Mit dieser Sonde wurde eine λ-ZAP cDNA-Bank des D. discoideum-Stamms AX4 gescreent. In vivo- Excision eines positiven Klons resultierte in dem Plasmid pUGT52c, welches ein 3,3 kB cDNA-Insert in dem Vektor pBluescript I SK (Stratagene, La Jolla, CA) trägt. Ein dem ORF ugt52 entsprechendes PCR-Fragment wurde in einen Expressionsvektor für E. coli kloniert (pBAD-TOPO → pUGT52x).For the isolation of a UGT clone from D. discoideum, the cDNA clone FC-AZ07 (GenBank Accession Nos. C25752 and C25753) from the cDNA bank of the D. discoideum- Strain CAX3 used for the PCR synthesis of a DIG-labeled probe. With this A λ-ZAP cDNA library of the D. discoideum strain AX4 was screened. In vivo Excision of a positive clone resulted in plasmid pUGT52c, which was a 3.3 kB cDNA insert in the vector pBluescript I SK (Stratagene, La Jolla, CA) carries. One of those A PCR fragment corresponding to ORF ugt52 was inserted into an expression vector for E. coli cloned (pBAD-TOPO → pUGT52x).

Die klonierten Fragmente wurden mit herkömmlichen Methoden sequenziert. Die DNA- Sequenzen und daraus abgeleiteten Aminosäuresequenzen der isolierten UGT-Gene sind weiter unten angegeben.The cloned fragments were sequenced using conventional methods. The DNA Sequences and derived amino acid sequences of the isolated UGT genes are specified below.

Das oben erwähnte 8,2 kB-Fragment aus C. albicans trägt eine ORF von 4548 bp, als UGT51C1 bezeichnet, der für ein Polypeptid von 1516 Aminosäuren mit einem kalkulierten Molekulargewicht von 171 kDa kodiert.The 8.2 kb fragment from C. albicans mentioned above has an ORF of 4548 bp as UGT51C1 designated for a polypeptide of 1516 amino acids with a calculated molecular weight of 171 kDa.

Das genomische Fragment von P. pastoris von 6777 bp enthält einen ORF (UGT51B1) von 3633 bp, die für ein Polypeptid von 1211 Aminosäuren mit einem kalkulierten Molekulargewicht von 136 kDa kodieren.The P. pastoris genomic fragment of 6777 bp contains an ORF (UGT51B1) of 3633 bp, calculated for a polypeptide of 1211 amino acids with a Encode molecular weight of 136 kDa.

Der mittels einer BLAST-Recherche (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410) anhand von Sequenzhomologien mit Ugt51 (Y1r189c, PIR: locus S51434, beschrieben als hypothetisches Protein von S. cerevisiae mit unbekannter Funktion) aufgefundene cDNA- Klon von D. discoldeum CAX3 wurde, wie oben beschrieben, zur Isolierung eines längeren Fragments aus einer D. discoideum AX4 cDNA-Library eingesetzt. Der längste Klon (pUGT52c) wies ein Insert von 3331 bp auf, das einen ORF von bp 244-3312 (ugt52) enthielt, der für ein Polypeptid von 1023 Aminosäuren und einem kalkulierten Molekulargewicht von 114 kDa kodiert. Using BLAST research (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410) using sequence homologies with Ugt51 (Y1r189c, PIR: locus S51434, described as hypothetical protein of S. cerevisiae with unknown function) found cDNA- Clone of D. discoldeum CAX3 was used to isolate a longer one as described above Fragments from a D. discoideum AX4 cDNA library used. The longest clone (pUGT52c) had an insert of 3331 bp that had an ORF of bp 244-3312 (ugt52) contained that for a polypeptide of 1023 amino acids and a calculated Coded molecular weight of 114 kDa.

Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigte zwischen den Hefen S. cerevisiae, P. pastoris und C. albicans eine Identität von 69%, zwischen den drei Hefen und Dictyostellum eine Identität von 36-39%, zwischen den Hefen und den Pflanzen A. thaliana und A. sativa zwischen 34-37% und zwischen Dictyostelium und den Pflanzen A. thaliana und A. sativa 33%.A comparison of the deduced amino acid sequences showed between the yeasts S. cerevisiae, P. pastoris and C. albicans have an identity of 69%, between the three yeasts and Dictyostellum an identity of 36-39%, between the yeast and the plants A. thaliana and A. sativa between 34-37% and between Dictyostelium and the plants A. thaliana and A. sativa 33%.

Expression of sterol glucosyl transferases in E. coli and S. cerevisiae

Zur Herstellung einer ugt51 Nullmutante von S. cerevisiae wurde der gesamte UGT51 ORF durch das kanMX4-Markergen (Wach et al. (1994) Yeast 10 : 1793-1808) ersetzt. Das durch PCR erhaltene Konstrukt zur Unterbrechung umfaßte das kanMX4-Gen, flankiert von 45 bp langen Regionen mit Homologie zu der UGT51 3'- und 5'-nichtkodierenden Region. Plasmid pFA6a-kanMX4 (Wach et al., supra) diente als Template, und die PCR- Primer waren wie folgt:
To produce a ugt51 zero mutant of S. cerevisiae, the entire UGT51 ORF was replaced by the kanMX4 marker gene (Wach et al. (1994) Yeast 10: 1793-1808). The interruption construct obtained by PCR comprised the kanMX4 gene flanked by 45 bp regions with homology to the UGT51 3 'and 5' non-coding region. Plasmid pFA6a-kanMX4 (Wach et al., Supra) served as a template and the PCR primers were as follows:

5'-TTGCACTTTATGCTTTGGTGAAAATCCGTA
TAACTTAAAAGAATGCGTACGCTGCAGGTCGAC-3' (S1/ham1) und
5'-TTACGCTTTTTTATAAAAGTGAGAGTGATA
CTCGGTTTAAATCATATCGATGAATTCGAGCTCG-3' (S2/ham1).5'-TTGCACTTTATGCTTTGGTGAAAATCCGTA
TAACTTAAAAGAATGCGTACGCTGCAGGTCGAC-3 '(S1 / ham1) and
5'-TTACGCTTTTTTATAAAAGTGAGAGTGATA
CTCGGTTTAAATCATATCGATGAATTCGAGCTCG-3 '(S2 / ham1).

Das resultierende Amplifikationskonstrukt wurde in S. cerevisiae Wildtyp UTL-7A eingeführt. Geneticin-resistente Klone wurde durch Wachstum auf YPD-Platten mit 200 mg/l G418 (Wach et al., supra) selektiert. Der korrekte Austausch von UGT51 durch das kanMX4-Gen wurde durch PCR bestätigt.The resulting amplification construct was found in S. cerevisiae wild-type UTL-7A introduced. Geneticin resistant clones were grown by growth on 200 YPD plates mg / l G418 (Wach et al., supra). The correct exchange of UGT51 by the kanMX4 gene was confirmed by PCR.

Für die Expression von Sterolglukosyltransferase aus S cerevisiae wurde ein genomisches 6,4 kb NdeI/SpeI-DNA-Fragment, enthaltend das Gen UGT51 (YLR189, GenBank Accession Nr. U17246), lokalisiert auf Chromosom XII von S. cerevisiae, durch Restriktionsverdau von Cosmid 9470-DNA (von der American Type Culture Collection) isoliert. Dieses Fragment wurde in pBluescript II KS kloniert, wodurch das Plasmid pUGT51g erhalten wurde. Dieses Plasmid wurde zur Klonierung des ORF UGT51 in einen E. coli-Expressionsvektor (pET19b (Novagen) → pUGT51x) und in einen S. cerevisiae- Expressionsvektor (pGAL4 → pUGT51xy) verwendet.For the expression of sterolglucosyltransferase from S cerevisiae a genomic was 6.4 kb NdeI / SpeI DNA fragment containing the gene UGT51 (YLR189, GenBank Accession No. U17246), located on chromosome XII of S. cerevisiae Restriction digestion of Cosmid 9470 DNA (from the American Type Culture Collection) isolated. This fragment was cloned into pBluescript II KS, making the plasmid pUGT51g was obtained. This plasmid was used to clone the ORF UGT51 into a E. coli expression vector (pET19b (Novagen) → pUGT51x) and into a S. cerevisiae- Expression vector (pGAL4 → pUGT51xy) was used.

UGT51 enthält einen ORF von 3594 bp, der für ein Polypeptid von 1198 Aminosäuren mit einem kalkulierten Molekulargewicht von 136 kDa kodiert.UGT51 contains an ORF of 3594 bp, which is responsible for a polypeptide of 1198 amino acids encoded a calculated molecular weight of 136 kDa.

Für die Konstruktion von pGAL4 wurde das XbaI/BamHI-Fragment von pTerm1 (Erdmann (1994) Yeast 10: 935-944), welches den CYC1-Terminator (Zaret and Sherman (1982) Cell 28: 563-573) enthält, in Plasmid pRS316 (Sikorski and Hieter (1989) Genetics 122: 19-27) subkloniert, wodurch pRS316t entstand. Das 0,5 kb SpeI/HindIII-Fragment von pYES2.0 (Invitrogen), welches den GAL1-Promotor (Lorch and Kornberg (1985) J. Mol. Biol. 186: 821-824) enthält, wurde in pBluescript KS+ (Stratagene) subkloniert, wodurch pGAL 1 entstand. Der GAL1- wurde mit XbaI/PvuII herausgeschnitten und in Xbal/HincII verdauten pBluescript KS+ subkloniert. Das resultierende Plasmid wurde als pGAL2 bezeichnet. Die Subklonierung des XhoI/SacI-Fragments aus pGAL2 in pYES2.0 resul tierte in pGAL3. Das KpnI/XhoI-Fragment aus pGAL3 umfaßt den GAL1-Promotor und wurde vor den CYC1-Terminator von pRS316t subkloniert, wodurch pGAL4 entstand.For the construction of pGAL4, the XbaI / BamHI fragment from pTerm1 (Erdmann (1994) Yeast 10: 935-944), which uses the CYC1 terminator (Zaret and Sherman (1982) Cell 28: 563-573) contains, in plasmid pRS316 (Sikorski and Hieter (1989) Genetics 122: 19-27) subcloned to give pRS316t. The 0.5 kb SpeI / HindIII fragment from pYES2.0 (Invitrogen), which uses the GAL1 promoter (Lorch and Kornberg (1985) J. Mol. Biol. 186: 821-824) was subcloned into pBluescript KS + (Stratagene), whereby pGAL 1 was created. The GAL1- was cut out with XbaI / PvuII and in Xbal / HincII digested pBluescript KS + subcloned. The resulting plasmid was called pGAL2 designated. The subcloning of the XhoI / SacI fragment from pGAL2 into pYES2.0 results pGAL3. The KpnI / XhoI fragment from pGAL3 comprises the GAL1 promoter and was subcloned from pRS316t in front of the CYC1 terminator, resulting in pGAL4.

Zusätzlich wurden PCR-Fragmente von UGT51, die Polypeptiden mit N-terminalen oder C-terminalen Deletionen von Aminosäuren entsprechen, in die folgenden Plasmide kloniert: pN690x (pET19b, das UGT51 von S. cerevisiae trägt, dem 690 N-terminale Aminosäuren fehlen), pN722x (pET19b, das UGT51 von S. cerevisiae trägt, dem 722 N terminale Aminosäuren fehlen), pN799x (pET19b, das UGT51 von S. cerevisiae trägt, dem 799 N-terminale Aminosäuren fehlen), pC1043x (pET19b, das UGT51 von S. cerevisiae trägt, dem 155 C-terminale Aminosäuren fehlen) und pN722xy (pGAL4, das UGT51 von S. cerevisiae trägt, dem 690 N-terminale Aminosäuren fehlen). In addition, PCR fragments of UGT51, the polypeptides with N-terminal or C-terminal deletions of amino acids correspond to the following plasmids cloned: pN690x (pET19b, which carries UGT51 from S. cerevisiae, the 690 N-terminal Amino acids are missing), pN722x (pET19b, which carries UGT51 from S. cerevisiae, the 722 N terminal amino acids are missing), pN799x (pET19b carrying UGT51 from S. cerevisiae, the 799 N-terminal amino acids are missing), pC1043x (pET19b, the UGT51 from S. cerevisiae carries 155 C-terminal amino acids missing) and pN722xy (pGAL4, the UGT51 of S. cerevisiae, which lacks 690 N-terminal amino acids).

Für die Expression von Sterolglukosyltransferasen in E. coli wurden Zellen von BL21 (DE3) (Novagen) und TOP 10 (Invitrogen) mit den von pET19b bzw. pBAD TOPO abgeleiteten Plasmiden transformiert. Zellen wurden bei 30°C in 25 ml Luria-Bertani- Medium (LB, Duchefa, Haarlem, Niederlande) mit 100 mg/l Ampicillin bis zu einer Dichte zwischen 0,5 und 0,8 bei 600 nm kultiviert. Die Induktion erfolgte durch Zugabe von 0,4 mM Isopropyl-1-thio-β-D-galaktopyranoside (für BL21(DE3) mit pET19b-Plasmiden) oder 0,1% Arabinose (für TOP 10 mit pBAD TOPO-Plasmiden) und weitere Inkubation für 2-4 h bei 30°C. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für 10 min. bei 2000 × g und 20°C geerntet, in 1-2 ml Puffer (100 mM Tris/HCl, pH 7,5, 15% Glycerin, SmM 1,4- Dithiothreitol, 200 µM Pefabloc (Serva), 0,5 mg/ml Lysozym) resuspendiert und für 5 min. bei 20°C inkubiert. Die Zellen wurden in einem Eisbad gekühlt und das Aufbrechen der Zellen erfolgte mittels Ultraschall (6 × 10 sec.). Falls erforderlich, wurde eine Rohmembranfraktion durch Zentrifugieren des Zellhomogenats bei 4°C für 20 min. bei 25.000 × g und Resuspendieren des Pellets mit Puffer hergestellt.For the expression of sterol glucosyltransferases in E. coli cells from BL21 (DE3) (Novagen) and TOP 10 (Invitrogen) with those from pET19b and pBAD TOPO derived plasmids transformed. Cells were grown at 30 ° C in 25 ml Luria Bertani Medium (LB, Duchefa, Haarlem, Netherlands) with 100 mg / l ampicillin to a density cultured between 0.5 and 0.8 at 600 nm. Induction was carried out by adding 0.4 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (for BL21 (DE3) with pET19b plasmids) or 0.1% arabinose (for TOP 10 with pBAD TOPO plasmids) and further incubation for 2-4 h at 30 ° C. The cells were centrifuged for 10 min. at 2000 × g and Harvested 20 ° C, in 1-2 ml buffer (100 mM Tris / HCl, pH 7.5, 15% glycerol, SmM 1.4- Dithiothreitol, 200 µM Pefabloc (Serva), 0.5 mg / ml lysozyme) resuspended and for 5 min. incubated at 20 ° C. The cells were cooled in an ice bath and the disruption of the Cells were made using ultrasound (6 × 10 sec.). If necessary, a Crude membrane fraction by centrifuging the cell homogenate at 4 ° C for 20 min. at 25,000 × g and resuspend the pellet with buffer.

Für die Expression in S. cerevisiae wurden Hefezellen bei 30°C in 100 ml SD-Medium (synthetische Dextrose; hergestellt nach Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York) bis zu einer Dichte von 2-6 (A₆₀₀) kultiviert. Das Medium wurde mit 2% RafFmose und 1% Galaktose (anstelle von Glukose) supplementiert, wenn die Vektoren pGAL4 oder pYES2 verwendet wurden. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für 10 min., 2000 × g und 20°C geerntet, in 2 ml Puffer (100 mM Tris/HCl, pH 7,5, 15% Glycerin, SmM 1,4-Dithiothreitol, 200 µM Pefabloc (Serva), 0,5 mg/ml Lytikase von Sigma) resuspendiert und für 30 min. bei 25°C inkubiert. 2-3 g Glasbeads (Innendurchmesser 0,4 mm) wurden hinzugegeben und die Zellen wurden durch Vortexen für 16 × 30 sec. aufgebrochen. For expression in S. cerevisiae, yeast cells at 30 ° C in 100 ml SD medium (synthetic dextrose; manufactured according to Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York) to cultivated to a density of 2-6 (A ₆₀₀ ). The medium was supplemented with 2% RafFmose and 1% galactose (instead of glucose) when the vectors pGAL4 or pYES2 were used. The cells were harvested by centrifugation for 10 min., 2000 × g and 20 ° C., in 2 ml buffer (100 mM Tris / HCl, pH 7.5, 15% glycerol, SmM 1,4-dithiothreitol, 200 μM Pefabloc ( Serva), 0.5 mg / ml Lytikase from Sigma) and resuspended for 30 min. incubated at 25 ° C. 2-3 g of glass beads (inner diameter 0.4 mm) were added and the cells were broken up by vortexing for 16 × 30 seconds.

Sterol glucosyl transferase enzyme test

Das Testgemisch enthielt in einem Gesamtvolumen von 100 µl folgende Bestandteile: 80 µl E. coli- oder S. cerevisiae-Zellhomogenat bzw. Membranfraktion, entweder 10 µl einer Lösung von 4 mM Cholesterol in Ethanol (400 µM Endkonzentration) oder 8 µl 500.000 dpm [4-¹⁴C]Cholesterol in Ethanol (Endkonzentration 45 µM, spezifische Aktivität 1,85 GBq/mmol) und entweder 100.000 dpm UDP-[U-¹⁴C]Glukose (End konzentration 1,5 µM, spezifische Aktivität 10,8 GBq/mmol) oder 360 µM ungelabelte UDP-Glukose. Nach der Inkubation für 2 h bei 30°C wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,9 ml 0,45%ige NaCl-Lösung und 4 ml Chloroform/Methanol 2 : 1 gestoppt. Die extrahierten Lipide wurden durch Dünnschichtchromatographie mit Chloroform/Methanol (85 : 15, v/v) aufgetrennt. Die Radioaktivität auf der Kieselsäuregelplatte wurde durch Radioscannen mit einem BAS-1000 BioImaging Analyzer (Raytest, Straubenhardt) detektiert.The test mixture contained the following components in a total volume of 100 µl: 80 µl E. coli or S. cerevisiae cell homogenate or membrane fraction, either 10 µl of a solution of 4 mM cholesterol in ethanol (400 µM final concentration) or 8 µl 500,000 dpm [ 4- ¹⁴ C] cholesterol in ethanol (final concentration 45 µM, specific activity 1.85 GBq / mmol) and either 100,000 dpm UDP- [U- ¹⁴ C] glucose (final concentration 1.5 µM, specific activity 10.8 GBq / mmol) or 360 µM unlabeled UDP-glucose. After incubation for 2 h at 30 ° C., the reaction was stopped by adding 0.9 ml of 0.45% NaCl solution and 4 ml of chloroform / methanol 2: 1. The extracted lipids were separated by thin layer chromatography with chloroform / methanol (85:15, v / v). The radioactivity on the silica gel plate was detected by radio scanning with a BAS-1000 BioImaging Analyzer (Raytest, Straubenhardt).

Lipid extraction and analysis

S. cerevisiae-Zellen wurden bei 30°C auf dem oben beschriebenen, lipidfreien Medium kultiviert. Nach dem Ernten der Zellen durch Zentrifugation wurden die Lipide mit Chloroform/Methanol, 1 : 2, und Chloroform/Methanol 2 : 1, extrahiert. Die extrahierten Lipide wurden auf einem Kieselsäuregel 60 (Merck, Darmstadt) mit Chloroform/Methanol, 85 : 15 aufgetrennt. Glykolipide wurden mit einem Spray eines α-Naphthol/Schwefelsäure- Gemisches sichtbar gemacht. Für NMR-Spektroskopie und Massenspektrometrie wurde das neue Glykolipid durch Säulenchromatographie auf einem Kieselsäuregel durch Elution mit Aceton gereinigt. Das Lipid wurde mit Essigsäureanhydrid in Pyridin acetyliert und einer präparativen Dünnschichtchromatographie in Diethylether unterzogen. S. cerevisiae cells were grown at 30 ° C on the lipid-free medium described above cultured. After harvesting the cells by centrifugation, the lipids were added Chloroform / methanol, 1: 2, and chloroform / methanol 2: 1, extracted. The extracted Lipids were on a silica gel 60 (Merck, Darmstadt) with chloroform / methanol, 85: 15 separated. Glycolipids were sprayed with an α-naphthol / sulfuric acid Mixtures made visible. For NMR spectroscopy and mass spectrometry the new glycolipid by column chromatography on a silica gel by elution cleaned with acetone. The lipid was acetylated with acetic anhydride in pyridine and subjected to preparative thin layer chromatography in diethyl ether.

Mass spectrometry

Massenspektrometrieanalysen des peracetylierten Sterolglykosids wurde mit einem Hewlett-Packard-Modell 5989-Spektrometer unter Verwendung des direct insert probe- Modus durchgeführt. Die Temperatur wurde von 80 auf 325°C mit einer Geschwindigkeit von 30°C/min. erhöht. EI-Massenspektren wurden bei 70 eV mit einer Ionenquellen temperatur von 200°C aufgenommen.Mass spectrometric analysis of the peracetylated sterol glycoside was carried out with a Hewlett-Packard Model 5989 spectrometer using the direct insert probe Mode performed. The temperature was raised from 80 to 325 ° C at a rate from 30 ° C / min. elevated. EI mass spectra were at 70 eV with an ion source temperature of 200 ° C recorded.

NMR spectroscopy

NMR-Spektren des peracetylierten Glykosids (200 µg) wurden bei 300 K in CDCl₃ (99,96%, Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA) für ¹H NMR bei 600 MHz (Avance DRX-600-Spektrometer) und für ¹³C NMR bei 90,6 MHz (DPX 360) (Bruker). Signale wurden zu internem TMS (δ_H = δ_C = 0,000) in Bezug gesetzt. Ein- und zweidimensionale Homonuklear (¹H, ¹H COSY, weiterübertragenes COSY)- und ¹H detektierte Heteronuklear ¹H, ¹³C-multiple quantum coherence (HMQC)-Experimente wurden unter Verwendung von Standard-Bruker-Software (XWINNMR, Version 1.3) durchgeführt.NMR spectra of the peracetylated glycoside (200 µg) were at 300 K in CDCl ₃ (99.96%, Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA) for ¹ H NMR at 600 MHz (Avance DRX-600 spectrometer) and for ¹³ C NMR at 90.6 MHz (DPX 360) (Bruker). Signals were related to internal TMS (δ _H = δ _C = 0.000). One and two dimensional homonuclear ( ¹ H, ¹ H COZY, retransmitted COZY) and ¹ H detected heteronuclear ¹ H, ¹³ C multiple quantum coherence (HMQC) experiments were performed using standard Bruker software (XWINNMR, version 1.3 ) carried out.

Die ORFs der nach den oben beschriebenen Protokollen klonierten DNA-Fragmente wurden in E. coli exprimiert, um die Funktion der Expressionsprodukte zu untersuchen, was durch in vitro-Bestimmung der Sterolglykosyltransferaseaktivität in zellfreien Extrakten unter Einsatz radioaktiv markierter Substrate erfolgte. E. coli ist für solche Experimente geeignet, da Wildtyp-Zellen keine Sterolglykosyltransferaseaktivität aufweisen. The ORFs of the DNA fragments cloned according to the protocols described above were expressed in E. coli to investigate the function of the expression products, what by in vitro determination of sterol glycosyltransferase activity in cell-free Extracts were carried out using radioactively labeled substrates. E. coli is for such Experiments are suitable because wild-type cells have no sterol glycosyltransferase activity exhibit.

Transformierte und induzierte E. coli-Zellen wurden wie oben aufgebrochen und die Homogenate oder Rohmembranfraktionen wurden für in vitro-Enzymtests eingesetzt. Membranfraktionen hatten den Vorteil, daß das meiste der intrazellulären UDP-Glukose eliminiert war. Es zeigte sich, daß mehr als 50% des exprimierten Proteins nicht in der löslichen Fraktion war, sondern im Pellet von Membranen und Inklusionbodies gefunden wurde.Transformed and induced E. coli cells were broken up as above and the Homogenates or raw membrane fractions were used for in vitro enzyme tests. Membrane fractions had the advantage that most of the intracellular UDP-glucose was eliminated. It was shown that more than 50% of the expressed protein was not in the soluble fraction, but was found in the pellet of membranes and inclusion bodies has been.

Für die Messung der Sterolglykosyltransferaseaktivität wurden in vitro-Assays mit verschiedenen radioaktiv markierte Zuckerdonoren (NPD-Zucker) und -Akzeptoren (Sterole) durchgeführt. Nach der Dünnschichtchromatographie wurde die Radioaktivität in den lipophilen Reaktionsprodukten bestimmt. Die untenstehende Tabelle I zeigt einen Vergleich der Substratspezifitäten der rekombinanten Enzyme von S. cerevisiae, C. albicans, P. pastoris, D. discoideum und Avena sativa.In vitro assays were used to measure sterol glycosyl transferase activity various radioactive labeled sugar donors (NPD sugar) and acceptors (Sterols) performed. After thin layer chromatography, the radioactivity in the lipophilic reaction products. Table I below shows one Comparison of the substrate specificities of the recombinant enzymes from S. cerevisiae, C. albicans, P. pastoris, D. discoideum and Avena sativa.

Die Reaktionsgemische enthielten in einem Gesamtvolumen von 100 µl: 80 µl zellfreies Homogenat oder Membranpräparation, NDP-U-¹⁴C-Zucker oder unmarkierten NPD- Zuckerund unmarkierten Akzeptor oder [4-¹⁴C]Cholesterol. Die E. coli-Zellen exprimierten die Sterolglukosyltransferasen von A. sativa (A. s.), C. albicans (C. a.), D. discodeum (D. d.), P. pastoris (P. p.) oder S. cerevisiae (S. c.). Der Einbau mit UDP-Glukose und Cholesterol wurde gleich 100% gesetzt. ND = nicht bestimmt.
The reaction mixtures contained in a total volume of 100 ul: 80 ul cell free homogenate or a membrane preparation, NDP-U- ¹⁴ C-glucose or unlabeled NPD sugar and unlabeled acceptor or [4- ¹⁴ C] cholesterol. The E. coli cells expressed the sterolglucosyltransferases from A. sativa (A. s.), C. albicans (C. a.), D. discodeum (D. d.), P. pastoris (P. p.) Or S. cerevisiae (S. c.). The incorporation with UDP-glucose and cholesterol was set to 100%. ND = not determined.

Diese Daten sollten allerdings nicht als quantitative Bestimmung der Substrataffinitäten betrachtet werden, da die Tests nicht unter linearisierten Bedingungen durchgeführt wurden. Diese Ergebnisse zeigen vielmehr welche Substrate durch die heterolog exprimierten Proteine akzeptiert oder nicht bzw. weniger akzeptiert wurden. Mit UDP- [U-¹⁴C]Glukose als Donor verwendeten sämtliche exprimierten Ugts verschiedene Sterole als Zuckerakzeptor, während keine Hintergrund-Sterolglykosidsynthese im Kontroll homogenat von E. coli festgestellt werden konnte. Die Proteine glukosylierten Sterole mit einem planaren Backbone wie Cholesterol, Ergosterol, β-Sitosterol, Stigmasterol und auch Sterolalkaloide wie Tomatidin.However, this data should not be viewed as a quantitative determination of substrate affinities since the tests were not performed under linearized conditions. Rather, these results show which substrates were accepted or not or less accepted by the heterologously expressed proteins. With UDP- [U- ¹⁴ C] glucose as the donor, all expressed Ugts used different sterols as sugar acceptors, while no background sterol glycoside synthesis could be found in the control homogenate of E. coli. The proteins glucosylated sterols with a planar backbone like cholesterol, ergosterol, β-sitosterol, stigmasterol and also sterol alkaloids like tomatidine.

Expressionsstudien mit den verschiedenen oben beschriebenen Deletionsmutanten des Sterolglucosyltransferasegens aus S. cerevisiae zeigte, daß Ugt51-Fragmente mit N- terminalen Deletionen von 690 oder 722 Aminosäuren Sterolglukosyide synthetisierten, während die Deletion von 799 N-terminalen oder von 155 C-terminalen Aminosäuren in einem vollständigen Verlust der Enzymaktivität in E. coli resultierte. Diese Daten deuten darauf hin, daß mindestens 722 N-terminale Aminosäuren des Hefegens nicht für in vitro- Aktivität erforderlich sind, während die stark konservierten Bereiche in Richtung C- Terminus unbedingt erforderlich zu sein scheinen.Expression studies with the various deletion mutants described above Sterolglucosyltransferase gene from S. cerevisiae showed that Ugt51 fragments with N- synthesized terminal deletions of 690 or 722 amino acids sterol glucosides, while the deletion of 799 N-terminal or 155 C-terminal amino acids in a complete loss of enzyme activity in E. coli resulted. These data indicate indicates that at least 722 N-terminal amino acids of the yeast gene are not suitable for in vitro Activity is required while the highly conserved areas towards C- Terminus seem to be absolutely necessary.

Bei Expressionsstudien mit transformierten Hefezellen konnte gezeigt werden, daß zelifreies Homogenat des Stamms UTL7A geringe Mengen an Sterolglykosid in vitro synthetisierte (1700 dpm radioaktiv markiertes Produkt), während die Nullmutante mit der UGT51-Deletion absolut keine Enzymaktivität mehr aufwies. Nach Transformation der Nullmutante mit einem Plasmid, das den vollständigen UGT51 ORF unter Kontrolle eines Galaktose-induzierten Promotors trägt, war die in vitro Sterolglykosyidsynthese wiederhergestellt und betrug mehr als das 10-fache im Vergleich zu UTL7A-Zellen, nämlich 22.000 dpm gelabeltes Produkt. Diese Daten beweisen, daß die Expression von UGT51 in S. cerevisiae zu der Biosynthese einer enzymatisch aktiven Sterolglukosyl transferase führte. Die Expression des N722-Fragments in der Nullmutante führte ebenfalls zu nachweisbarer Enzymaktivität, wobei diese allerdings wesentlich geringer war als in Zellen, die das Wildtyp-Enzym exprimierten.Expression studies with transformed yeast cells have shown that cell-free homogenate of the strain UTL7A small amounts of sterol glycoside in vitro synthesized (1700 dpm radioactively labeled product), while the zero mutant with the UGT51 deletion showed absolutely no enzyme activity. After transforming the Zero mutant with a plasmid that controls the complete UGT51 ORF Carrying galactose-induced promoter was the in vitro sterol glycosyl synthesis restored and was more than 10 times compared to UTL7A cells, namely 22,000 dpm labeled product. These data demonstrate that the expression of UGT51 in S. cerevisiae on the biosynthesis of an enzymatically active sterol glucosyl transferase led. Expression of the N722 fragment in the null mutant also resulted to detectable enzyme activity, although this was considerably lower than in Cells that expressed the wild-type enzyme.

Um zu analysieren, ob Sterolglykoside in vivo akkumuliert wurden, wurden die Lipide von S. cerevisiae extrahiert und mittels Dünnschichtchromatographie aufgetrennt. Die gesamten Lipidextrakte von Hefe-Wildtyp- und Nullmutante-Zellen enthielten keine detektierbaren Mengen an Sterolglykosid. Auch die Expression des N722-Fragments resultierte nicht in der Biosynthese bedeutsamer Mengen an Sterolglykosid, während Zellen, die das komplette UGT51-Gen enthielten ein neues Glykolipid, daß mi einem autentischen Sterolglykosid-Standard co-chromatographierte.In order to analyze whether sterol glycosides were accumulated in vivo, the lipids from S. cerevisiae extracted and separated by thin layer chromatography. The total lipid extracts from yeast wild-type and zero mutant cells contained none detectable levels of sterol glycoside. Also the expression of the N722 fragment did not result in significant amounts of sterol glycoside during the biosynthesis Cells that contained the complete UGT51 gene contained a new glycolipid that mi Authentic sterol glycoside standard co-chromatographed.

Es konnte gezeigt werden, daß eine heterologe Expression von UGT51B1 aus P. pastoris in der S. cerevisiae-Knockout-Mutante im Vergleich zur homologen Expression von UGT51 zur Akkumulation großer Mengen des neuen Glykolipids führte. Diese großen Mengen des Glykolipids wurden für die Aufreinigung aus Lipidextrakten von S. cerevisiae mittels Säulenchromatographie auf Kieselsäuregel, Acetylierung des isolierten Glykolipids und anschließende Dünnschichtchromatographie genutzt. Das peracetylierte Glykolipid wurde anschließend mittels Massenspektrometrie und NMR-Spektroskopie untersucht. Die Massenspektrometrieanalyse ergab zwei charakteristische Fragmente, eines von einem terminalen einzelnen tetra-O-acetylierten Hexosylrest und das andere von dem Steroid, und ließ auf tetra-O-acetylhexosy1-Ergosterol (C₄₂H₆₂O₁₀; M, = 726,94) schließen. Die Struktur des gereinigten tetra-O-acetylhexosyl-Ergosterol wurde weiter durch ¹H NMR-Spektros kopie bei 600 MHz untersucht. Auch die hierbei erhaltenen Daten waren in absoluter Übereinstimmung mit einer terminalen tetra-O-acetyl-β-glucopyranose (Jorasch et al. (1998) Mol. Microbiol. 29: 419-430). Die charakteristischen Signale bestätigten das konjugierte Dien-System im Ring B (H-6 und H-7) von Ergosterol (Kirk et al. (1990) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 1567-1594). Im HMYC-Spektrum wiesen die Positionen der Signale für Zuckerkohlenstoffe auf 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid und auf Ergosterol als Aglykon in dem Glykolipid hin. Mittels der Daten der EI-Massenspektro metrie und ¹H- und ¹³C-NMR-Spektroskopie konnte das per-O-acetylierte Produkt der UDP-Glukose: Sterolglukosyltransferase Ugt51B1 von P. pastoris eindeutig als 3β-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyloxy)ergosta-5,7,22E-trien identifiziert werden, wodurch erstmals gezeigt wurde, daß das Enzym eine β-Glukosyltransferase mit Ergosterol als Akzeptor ist. It could be shown that heterologous expression of UGT51B1 from P. pastoris in the S. cerevisiae knockout mutant compared to homologous expression of UGT51 led to the accumulation of large amounts of the new glycolipid. These large amounts of the glycolipid were used for the purification from lipid extracts of S. cerevisiae by means of column chromatography on silica gel, acetylation of the isolated glycolipid and subsequent thin layer chromatography. The peracetylated glycolipid was then examined using mass spectrometry and NMR spectroscopy. Mass spectrometric analysis revealed two characteristic fragments, one from a terminal single tetra-O-acetylated hexosyl residue and the other from the steroid, and left on tetra-O-acetylhexosy1-ergosterol (C ₄₂ H ₆₂ O ₁₀ ; M, = 726.94) conclude. The structure of the purified tetra-O-acetylhexosyl-ergosterol was further examined by ¹ H NMR spectroscopy at 600 MHz. The data obtained here were also in absolute agreement with a terminal tetra-O-acetyl-β-glucopyranose (Jorasch et al. (1998) Mol. Microbiol. 29: 419-430). The characteristic signals confirmed the conjugated diene system in ring B (H-6 and H-7) of Ergosterol (Kirk et al. (1990) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 1567-1594). In the HMYC spectrum, the positions of the signals for sugar carbons indicated 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside and ergosterol as aglycone in the glycolipid. Using data from EI mass spectrometry and ¹ H and ¹³ C NMR spectroscopy, the per-O-acetylated product of UDP-glucose: sterol glucosyltransferase Ugt51B1 from P. pastoris was clearly identified as 3β- (2,3,4,6 -tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyloxy) ergosta-5,7,22E-triene, whereby it was shown for the first time that the enzyme is a β-glucosyltransferase with ergosterol as the acceptor.

DNA and amino acid sequences for glycosyltransferase (in 5 '→ 3' direction or from N-terminus to the C-terminus)

1) aus Pichia pastoris 1) from Pichia pastoris

a) DNA-Sequenz a) DNA sequence

b) Aminosäuresequenz b) amino acid sequence

2) Candida albicans 2) Candida albicans

a) DNA-Sequenz a) DNA sequence

b) Aminosäuresequenz b) amino acid sequence

3) Dictyostellum discoideum 3) Dictyostellum discoideum

a) DNA-Sequenz a) DNA sequence

b) Aminosäuresequenz b) amino acid sequence

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims

1. A method for producing transgenic organisms or cells with an increased content of steroid glycosides, steroid alkaloid glycosides and / or sterol glycosides, comprising the steps:

a) Preparation of a nucleic acid sequence comprising the following components, which are strung together in 5'-3 'orientation:
a promoter which is functional, optionally constitutive, tissue-specific, development-specific or inducible in the respective organism or cell,
at least one nucleic acid sequence which codes for a protein with the enzymatic activity of a sterol glycosyl transferase, in particular a sterol glucosyl transferase, or an active fragment thereof and
a termination signal for the termination of the transcription and the addition of a polyA tail to the corresponding transcript as well as any DNA sequences derived therefrom,
b) transfer of the nucleic acid sequence from a) to bacterial, fungal, plant or animal cells and optionally integration of the nucleic acid sequence into the genome of the cells, and
c) if desired, regeneration of completely transformed organisms and, if appropriate, multiplication of these organisms.

2. The method of claim 1, wherein the transgenic organisms or cells one increased content of a cardiac active steroid glycoside, in particular digitoxin or Digoxin.

3. The method according to claim 1, wherein the transgenic organisms or cells, preferably of vegetable origin, have an increased content of a saponin.

4. The method of claim 3, wherein the saponin is diosgenin.

5. The method according to claim 1, wherein the transgenic organisms or cells, preferably of vegetable origin, an increased content of solanum alkaloids, in particular on demissin and / or tomatin.

6. Use of the transgenic organism or cell according to one of claims 1 as Production facility for steroid glycosides, steroid alkaloid glycosides and / or Sterol glycosides.

7. Use of the transgenic organism or cell according to claim 2 for the production of steroid glycoside and manufacture of a medicament for the treatment of Heart disease.

8. Use of the method according to claim 2 for the production of insect-resistant Plants.

9. Use of the method according to claim 3 for the production of fungus-resistant plants.

10. Use of the transgenic organism or cell according to claim 3 for the production of saponin and manufacture of a drug with a cholesterol-lowering and / or hemolytic effect.

11. Use of the transgenic organism or cell according to claim 4 for the production of diosgenin for the synthesis of steroid hormones, especially cortisone and Progesterone.

12. Use of the method according to claim 5 for the production of fungus-resistant plants.

13. Use of a by a method according to any one of claims 1 to 5 produced Saccharomyces strain as baker's yeast.

14. Use of the synthesized in a method according to claim 1 Steroid glycoside, steroid alkaloid glycoside and / or sterol glycoside as emulsifier, Detergent additive or as a dispersing and wetting agent.

15. Use of the method according to claim 1 in plants to increase the Glycolipid content in the lecithin fraction of vegetable oils.

16. Use of the method according to claim 1 for the production of milk in transgenic mammals, especially cow's milk, with reduced cholesterol.

17. Use of the method according to claim 1 for the production of chicken eggs in transgenic chickens with reduced cholesterol.

18. Use of a nucleic acid sequence, which is for a protein with the activity of a Encoded sterol glycosyltransferase, or a protein with the activity of a Sterol glycosyl transferase or an active fragment thereof, especially one fungal sterol glycosyltransferase, for finding effectors, in particular Inhibitors of fungal sterol glycosyl transferase.

19. Use of a nucleic acid sequence, which is for a protein with the activity of a Encoded sterol glycosyltransferase, or a protein with the activity of a Sterol glycosyl transferase or an active fragment thereof for in vitro Glycosylation of steroid hormones.

20. Use of the steroid hormone glycoside prepared in vitro according to claim 19 for the production of a medicinal product for depot.