DE19916638A1 - Preparing a device with a functional hydrogel surface for detecting analyte molecules, comprises binding organic molecules with a terminal rest and the terminal rest with a receptor group - Google Patents

Preparing a device with a functional hydrogel surface for detecting analyte molecules, comprises binding organic molecules with a terminal rest and the terminal rest with a receptor group

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Abstract

Preparing a device (I) with a functional hydrogel surface comprises binding organic molecules of 8 atoms in length with a terminal rest (A) that is an amine rest, carbonic acid group or their derivatives, and reacting the terminal rest with a receptor group of three similar rests (B) that are an amine rest carbonic acid group, a sulfonic acid rest, a phosphoric acid rest or their derivatives. Independent claims are also included for the following: (1) preparing (I) comprising: (a) providing a device with a hydrogel on its surface; (b) binding (A) to the hydrogel; and (c) reacting the terminal groups of (A) with receptor molecules; and (2) using (I).

Description

Während der letzten zehn Jahre hat sich die Technologie der optischen Biosensoren auf der Basis von Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie (SPR) stark entwickelt, so daß heutzutage eine Reihe solcher Geräte einen festen Platz auf dem Markt erobert haben (Biacore, Texas Instruments, Intersens, BioTuL). Die Sensoroberflächen dieser und anderer Biosensoren, die für die Transduktion einer biospezifischen Erkennungsreaktion eines Analyten verantwortlich sind, sind häufig mit einer funktionalisierten Polysaccharidschicht oder einer Schicht eines anderen hydrophilen Polymeren versehen, die zum einen über funktionelle Gruppen die kovalente Bindung von Rezeptormolekülen ermöglichen (B. Johnsson, S. Löfås & G. Lindquist, Anal. Biochem. 198 (1991), 268), zum anderen die Aufgabe erfüllen, unspezifische Adsorption von Probenbestandteilen zu verhindern (EP-B-589 867 bzw. Deutsche Patentanmeldung 198 17 180.3). Die hydrophile Polymerschicht an der Oberfläche besitzt den Charakter eines Hydrogels, ist also quellbar und zudem flexibel. Beide Eigenschaften sind für die Funktion dieser Schicht erwünscht, da auf und in ihr Rezeptormoleküle fixiert werden, die so flexibel angebunden sein müssen, daß sie nach der Immobilisierung noch zur Bindung von Analytmolekülen in der Lage sind.Over the past decade, the technology of optical Biosensors based on surface plasmon resonance spectroscopy (SPR) is strongly developed, so that today a number of such devices have a fixed Have captured space on the market (Biacore, Texas Instruments, Intersens, BioTuL). The sensor surfaces of this and other biosensors used for transduction are responsible for a biospecific recognition reaction of an analyte often with a functionalized polysaccharide layer or a layer of one other hydrophilic polymers provided, on the one hand via functional groups enable covalent binding of receptor molecules (B. Johnsson, S. Löfås & G. Lindquist, Anal. Biochem. 198 (1991), 268), on the other hand fulfill the task, to prevent non-specific adsorption of sample components (EP-B-589 867  or German patent application 198 17 180.3). The hydrophilic polymer layer on the surface has the character of a hydrogel, so it is swellable and also flexible. Both properties are desirable for the function of this layer because of and are fixed in it receptor molecules that have to be connected so flexibly, that after immobilization they still bind analyte molecules in the Location.

Neben der Verwendung von Hydrogelen ist es ebenfalls üblich, Rezeptormoleküle über flexible Moleküle - sogenannte Spacer - direkt kovalent an Sensoroberflächen zu binden. Von Bindungsexperimenten an Monoschichtsystemen, die aufgrund ihres Aufbauprinzips wesentlich unflexibler sind als Hydrogele, ist bekannt, daß die Spacerlänge sowohl für die Reaktivität funktioneller Gruppen als auch für das spezifische Bindungsverhalten maßgeblich ist (D. D. Schlereth, J. Electroanal. Chem. 425 (1997), 77; L. Bertilsson, H. J. Butt, G. Nelles, D. D. Schlereth, Biosensors & Bioelectronics 12 (1997), 839; T. Wink, S. J. van Zuilen, A. Bult, W. P. von Bennekom, Analyst 122, 43R (1997)).In addition to using hydrogels, it is also common to have receptor molecules via flexible molecules - so-called spacers - directly covalently on sensor surfaces to tie. From binding experiments on monolayer systems, which due to their Construction principles are much more inflexible than hydrogels, it is known that the Spacer length for the reactivity of functional groups as well as for the specific binding behavior is decisive (D. D. Schlereth, J. Electroanal. Chem. 425 (1997), 77; L. Bertilsson, H.J. Butt, G. Nelles, D.D. Schlereth, Biosensors & Bioelectronics 12 (1997), 839; T. Wink, S. J. van Zuilen, A. Bult, W. P. by Bennekom, Analyst 122, 43R (1997)).

Anders als bei solchen unquellbaren und nur moderat flexiblen Monoschicht­ systemen wurde der Spacerlänge zwischen Hydrogel und Rezeptoren bisher keine Beachtung geschenkt. Ein Einfluß der Kettenlänge auf das Bindungsverhalten der Ligandmoleküle an den Rezeptor wurde nicht vermutet, da das Hydrogel an sich ohnehin flexibel ist. Die bisher bekannten Hydrogele auf Biosensoroberflächen haben daher den in Fig. 1 gezeigten schematischen Aufbau. Die Oberfläche des Sensors umfaßt eine Metallschicht 14, auf die ggf. eine oder mehrere Zwischen­ schichten 13 aufgebracht sind. Der Rezeptor 11 ist über einen kurzen, unflexiblen Spacer an das Hydrogel 12 gebunden.In contrast to such swellable and only moderately flexible monolayer systems, no attention has been paid to the spacer length between the hydrogel and receptors. An influence of the chain length on the binding behavior of the ligand molecules to the receptor was not suspected, since the hydrogel itself is flexible in any case. The previously known hydrogels on biosensor surfaces therefore have the schematic structure shown in FIG. 1. The surface of the sensor comprises a metal layer 14, on which one or more intermediate layers 13 are optionally applied. The receptor 11 is bound to the hydrogel 12 via a short, inflexible spacer.

Die Anbindung von Rezeptormolekülen an die Hydrogelschicht kann entweder gerichtet oder ungerichtet erfolgen. Bei einer gerichteten Anbindung weist das Rezeptormolekül meistens nur einen Rest oder evtl. nur wenige (z. B. weniger als drei) gleichartige Reste auf, die mit dem ggf. derivatisiertem Hydrogel umgesetzt werden können. Die entstehende gerichtete Bindung ist folglich räumlich genau definiert. Häufig müssen die Rezeptormoleküle vor der Umsetzung derivatisiert werden, damit sie einen geeigneten, reaktiven Rest aufweisen. Bei einer ungerichteten Anbindung dagegen weist das Rezeptormolekül eine Vielzahl (z. B. mindestens drei) gleichartiger Reste auf, die mit dem ggf. derivatisierten Hydrogel umgesetzt werden können. Da nur einer dieser Reste mit dem Hydrogel reagiert, ist die Lage der Bindung räumlich nicht vorhersehbar. Als Konsequenz befindet sich die Bindungsstelle bzw. die Bindungsstellen des Rezeptors in einer undefinierten sterischen Anordnung zum Hydrogel, was wiederum die Zugänglichkeit dieser Bindungsstellen für Analytmoleküle beeinträchtigt und dementsprechend die Bindungskinetik der Analyt/Rezeptorwechselwirkungen beeinflussen kann.The binding of receptor molecules to the hydrogel layer can either directed or undirected. With a directional connection, this shows Receptor molecule mostly only a residue or possibly only a few (e.g. less than three) similar residues, which are reacted with the optionally derivatized hydrogel can be. The resulting directional bond is therefore spatially accurate Are defined. Often the receptor molecules have to be derivatized before implementation  so that they have a suitable reactive residue. At a on the other hand, the receptor molecule exhibits a large number (e.g. at least three) similar residues with the optionally derivatized hydrogel can be implemented. Since only one of these residues reacts with the hydrogel the location of the binding cannot be predicted spatially. The consequence is that Binding site or the binding sites of the receptor in an undefined steric arrangement to the hydrogel, which in turn makes this accessible Binding sites for analyte molecules are impaired and accordingly Binding kinetics of analyte / receptor interactions can affect.

In der US-Patentschrift US-A-5,395,587 werden zur Anbindung von Biotin als Rezeptormolekül kurz- und langkettige Spacer verwendet. Es wird jedoch kein Einfluß der Länge des Spacers beschrieben. Es wird zudem ausschließlich die gerichteten Anbindung von Rezeptormolekülen und nicht die ungerichtete Anbindung untersucht.In the US patent US-A-5,395,587 to bind biotin as Receptor molecule short and long chain spacers used. However, it won't Influence of the length of the spacer described. It will also be exclusively the directed binding of receptor molecules and not the undirected Connection examined.

Ziel der Erfindung war es, einen Gegenstand, bevorzugt einen Biosensor, bereitzustellen, an den eine Vielzahl von Rezeptormolekülen angebunden werden können. Vorzugsweise sollte keine Vorbehandlung der Rezeptormoleküle nötig sein.The aim of the invention was to provide an object, preferably a biosensor, provide to which a variety of receptor molecules are bound can. Pre-treatment of the receptor molecules should preferably not be necessary.

Überraschenderweise zeigte sich, daß bei Gegenständen mit einer Hydrogelschicht die Länge des Spacers zwischen Hydrogel und Rezeptor für das Bindungsverhalten von Analytmolekülen bei ungerichteten Bindungen eine Rolle spielt. Dies eröffnet die Möglichkeit, Gegenstände bereitzustellen, die ein an bestimmte Problem­ stellungen verbessertes Bindungsverhalten ermöglichen. Durch verbesserte Zugänglichkeit auf Grund erhöhter Flexibilität wird das Bindungsverhalten der Analytmoleküle trotz ungerichteter Bindung der Rezeptoren einheitlicher und dem Verhalten der beiden freien Spezies in Lösung ähnlicher.Surprisingly, it was found that objects with a hydrogel layer the length of the spacer between the hydrogel and the receptor for the binding behavior of analyte molecules plays a role in undirected bonds. This opens up the ability to provide items that address a particular problem positions enable improved binding behavior. Through improved Accessibility due to increased flexibility becomes the binding behavior of the Analyte molecules, despite undirected binding of the receptors, more uniform and that Behavior of the two free species in solution more similar.

Die Erfindung betrifft somit einen Gegenstand mit einer Oberfläche, umfassend ein Hydrogel, erhältlich durch:
The invention thus relates to an object with a surface, comprising a hydrogel, obtainable by:

  • a) Anbinden von organischen Molekülen an das Hydrogel, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe oder deren Derivate, aufweisen; unda) binding of organic molecules to the hydrogel, the bound organic molecules each have a chain length of at least 8 atoms  have and a terminal residue A selected from the amine residue, Carboxylic acid group or derivatives thereof; and
  • b) Umsetzen des terminalen Restes mit einem Rezeptormolekül mit mindestens drei gleichartigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsäurerest, Phosphonsäurerest und deren Derivate.b) reacting the terminal residue with a receptor molecule with at least three identical radicals B, selected from the amine radical, carboxylic acid group, Sulfonic acid residue, phosphoric acid residue, phosphonic acid residue and their derivatives.

In Fig. 2 ist eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Gegenstandes gezeigt. Er unterscheidet sich von dem herkömmlichen in Fig. 1 gezeigten Gegenstand, dadurch daß der Rezeptor über einen langkettige Spacer an das Hydrogel gebunden ist.In Fig. 2 is a schematic representation is shown of an article according to the invention. It differs from the conventional object shown in FIG. 1 in that the receptor is bound to the hydrogel via a long-chain spacer.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Gegenstandes mit einer funktionalisierten Hydrogeloberfläche, umfassend die Schritte:
The invention further relates to a method for producing an article with a functionalized hydrogel surface, comprising the steps:

  • a) Anbinden von organischen Molekülen an das Hydrogel, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe oder deren Derivate, aufweisen; unda) binding of organic molecules to the hydrogel, the bound organic molecules each have a chain length of at least 8 atoms have and a terminal residue A selected from the amine residue, Carboxylic acid group or derivatives thereof; and
  • b) Umsetzen des terminalen Restes A mit einem Rezeptormolekül mit mindestens drei gleichartigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsäurerest, Phosphonsäurerest und deren Derivate.b) reacting the terminal residue A with a receptor molecule with at least three identical radicals B, selected from the amine radical, carboxylic acid group, Sulfonic acid residue, phosphoric acid residue, phosphonic acid residue and their derivatives.

Die Erfindung beschreibt weiter die Verwendung eines erfindungsgemäßen Gegen­ standes bei der Detektion von Analytmolekülen.The invention further describes the use of a counter according to the invention stood in the detection of analyte molecules.

Desweiteren wird die Verwendung eines Gegenstandes mit einer funktionalisierten Hydrogeloberfläche umfassend an das Hydrogel gebundene organische Moleküle, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe oder und deren Derivate, aufweisen, zur ungerichteten Anbindung eines Rezeptormoleküls mit mindestens drei gleichartigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsäurerest, Phosphonsäurerest und deren Derivate, beschrieben. Furthermore, the use of an object with a functionalized Hydrogel surface comprising organic molecules bound to the hydrogel, where the bound organic molecules each have a chain length of have at least 8 atoms and a terminal radical A selected from Amine residue, carboxylic acid group or and their derivatives, for undirected connection of a receptor molecule with at least three of the same type Residues B selected from amine residue, carboxylic acid group, sulfonic acid residue, Phosphoric acid residue, phosphonic acid residue and their derivatives.  

Verzeichnis der FigurenList of figures

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines herkömmlichen Gegenstandes mit einer Hydrogeloberfläche, bei dem die Rezeptoren durch kurze Spacer an das Hydrogel gebunden sind. Fig. 1 shows a schematic representation of a conventional object with a hydrogel surface, in which the receptors are bound to the hydrogel by short spacers.

Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Gegen­ standes mit einer Hydrogeloberfläche, bei dem die Rezeptoren durch flexible, langkettige Spacer an das Hydrogel gebunden sind. Fig. 2 shows a schematic representation of an object according to the invention with a hydrogel surface, in which the receptors are bound to the hydrogel by flexible, long-chain spacers.

Fig. 3 zeigt den zeitlichen Verlauf der kovalenten Bindung von Lysozym bei dem erfindungsgemäßen Sensor (b) und dem Vergleichssensor (a) des Beispiels 1. FIG. 3 shows the time course of the covalent binding of lysozyme in the sensor (b) according to the invention and the comparison sensor (a) in example 1.

Fig. 4 zeigt den zeitlichen Verlauf der Assoziationsreaktion eines Einzelketten­ fragmentantikörpers an Lysozym bei dem erfindungsgemäßen Sensor (b) und dem Vergleichssensor (a) des Beispiels 1. FIG. 4 shows the time course of the association reaction of a single chain fragment antibody to lysozyme in the sensor (b) according to the invention and the comparison sensor (a) of example 1.

Um eine klarere Darstellung des relevanten Effektes zu ermöglichen, ist in den Fig. 1 und 2 der Effekt durch den veränderten Bulk-Brechungsindex bei Zugabe des Analyten rechnerisch entfernt. Die Effekte durch veränderte Brechungsindices wurden an inerten, nicht funktionalisierten Oberflächen (d. h. Hydrogel ohne funk­ tionelle Gruppen und Rezeptoren) gemessen und subtrahiert.In order to enable a clearer representation of the relevant effect, the effect in FIGS. 1 and 2 is removed by calculation due to the changed bulk refractive index when the analyte is added. The effects of changed refractive indices were measured and subtracted on inert, non-functionalized surfaces (ie hydrogel without functional groups and receptors).

Die erfindungsgemäßen Gegenstände finden z. B. als Sensoren, vor allem Biosensoren, bei den verschiedensten analytischen Meßverfahren Verwendung. Beispiele für geeignete Einsatzgebiete der Gegenstände sind in der affinitäts­ basierenden Sensorik, wie die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) und Quarzwaagen sowie bei interferometrischen Meßmethoden, z. B. Reflektions­ interferenzkontrastmikroskopie und Reflektionsinterferenzspektroskopie. Besonders eignen sie sich zum Einsatz in der SPR. Der Aufbau der nicht funktionalisierten Oberfläche richtet sich nach dem analytischen Verfahren, in dem der erfindungs­ gemäße Gegenstand angewendet werden soll, und ist dem Fachmann bekannt (Journal of Biomedical Materials Research, 18 (953-959) (1984) und J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1990, 1526). Im Rahmen der Erfindung wird der Begriff "nicht funktionalisierte Oberfläche" verwendet, um die Oberfläche eines Gegenstandes mit der Hydrogelschicht vor der Anbindung der organischen Moleküle mit dem Rest A zu bezeichnen. Der Begriff "funktionalisierte Oberfläche" wird verwendet, um die Oberfläche eines Gegenstandes mit der Hydrogelschicht nach der Anbindung der organischen Moleküle mit dem Rest A zu bezeichnen. Der erfindungsgemäße Gegenstand besitzt eine Grundoberfläche, umfassend z. B. eine Glas-, Halbleiter- oder Metallschicht. Bevorzugt sind Metallschichten vor allem Edelmetallschichten z. B. aus Gold oder Silber wie sie z. B. in der SPR Verwendung finden.The objects of the invention are found, for. B. as sensors, especially Biosensors, used in a wide variety of analytical measuring methods. Examples of suitable areas of application for the objects are in the affinity based sensors, such as surface plasmon resonance spectroscopy (SPR) and quartz scales as well as in interferometric measuring methods, e.g. B. reflection interference contrast microscopy and reflection interference spectroscopy. Especially they are suitable for use in the SPR. The structure of the non-functionalized Surface depends on the analytical method in which the fiction appropriate subject is to be applied, and is known to the person skilled in the art  (Journal of Biomedical Materials Research, 18 (953-959) (1984) and J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1990, 1526). In the context of the invention, the term "is not functionalized surface "used to cover the surface of an object the hydrogel layer before the organic molecules bind to residue A. describe. The term "functionalized surface" is used to refer to the Surface of an object with the hydrogel layer after the attachment of the to denote organic molecules with the residue A. The invention Object has a base surface, comprising e.g. B. a glass, semiconductor or metal layer. Metal layers are preferred, especially noble metal layers e.g. B. of gold or silver such as. B. find use in the SPR.

Der nicht funktionalisierte Gegenstand weist eine Hydrogelschicht an der Oberfläche auf. Diese Schicht dient zur Verhinderung unspezifischer Adsorptionen, die das Meßsignal verfälschen. Hydrogele sind mit Wasser quellbare Polymere. Bei den Hydrogelen kann es sich z. B. um ein Polysaccharid, ein Derivat davon oder um ein quellbares organisches Polymer wie Poly{N-[tris-(hydroxymethyl)-methyl]-acrylsäure­ amid}, Polyvinylalkohol oder Polyethylenglykol handeln. Bevorzugt sind Poly­ saccharide. Als Derivate sind Aminoderivate oder Carboxyalkylderivate zu nennen, wobei der Alkylrest bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist. Beispiele für Polysaccharide sind Amylose, Inulin, Pullulan oder Dextran. Bevorzugt sind Pullulan oder Dextran und deren Derivate. Besonders bevorzugt ist Dextran und dessen Derivate. Bevorzugt wird Carboxymethyldextran verwendet.The non-functionalized object has a hydrogel layer on the surface on. This layer serves to prevent unspecific adsorption, which the Falsify measurement signal. Hydrogels are water-swellable polymers. Both Hydrogels can e.g. B. a polysaccharide, a derivative thereof or a swellable organic polymer such as poly {N- [tris (hydroxymethyl) methyl] acrylic acid amide}, polyvinyl alcohol or polyethylene glycol. Poly are preferred saccharide. Amino derivatives or carboxyalkyl derivatives are to be mentioned as derivatives, the alkyl radical preferably having 1 to 4 carbon atoms. examples for Polysaccharides are amylose, inulin, pullulan or dextran. Pullulan is preferred or dextran and their derivatives. Dextran and its is particularly preferred Derivatives. Carboxymethyldextran is preferably used.

Die Hydrogelschicht sollte trocken mehrere Nanometer dick sein und quillt im wäßrigen Milieu zu einer Dicke von ca. 100 nm auf, wodurch die Oberfläche vollständig bedeckt wird. Die gequollene Polymerschicht ahmt die natürliche Umgebung von Biomolekülen nach und ist geeignet, eine Denaturierung und somit Inaktivierung der Biomoleküle zu verhindern. Zusätzlich wird die Adsorption von anderen als den zu analysierenden Molekülen wirksam unterdrückt. Außerdem ist die gequollene Hydrogelschicht in der Lage, Unregelmäßigkeiten der Oberfläche auszugleichen. Die Anbindung von Biomolekülen findet auch in der gequollenen Matrix und nicht nur unmittelbar an der Oberfläche statt. Hierdurch verringert sich die Bedeutung von Oberflächenunebenheiten, die sonst zu einer schlecht definierten Oberfläche und dadurch zu schlecht quantifizierbaren Meßergebnissen beitragen.The hydrogel layer should be several nanometers thick when dry and swells in aqueous milieu to a thickness of approximately 100 nm, creating the surface is completely covered. The swollen polymer layer mimics the natural one Environment of biomolecules and is suitable for denaturation and thus To prevent inactivation of the biomolecules. In addition, the adsorption of effectively suppressed other than the molecules to be analyzed. Besides, is the swollen hydrogel layer is able to surface irregularities balance. The binding of biomolecules also takes place in the swollen Matrix and not just held directly on the surface. This will reduce  the importance of surface irregularities that would otherwise result in a poorly defined Surface and thereby contribute to poorly quantifiable measurement results.

Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen mit Hydrogelen sind bekannt (J. of Biomedical Materials Research, 18, 953 (1984), DE-A 198 17 180). Beispielsweise wird eine entsprechend vorbereitete Oberfläche (DE-A 198 17 180, EP-B-0 589 867) zwischen 1 h und 5 h, typischerweise 3 h, in eine entsprechende, frisch bereitete wäßrige Hydrogellösung hergestellt aus Hydroxypolymer gegeben. Die Konzentration des Hydroxypolymers in der Lösung liegt zwischen 10 und 500 mg.m-1.Methods for coating surfaces with hydrogels are known (J. of Biomedical Materials Research, 18, 953 (1984), DE-A 198 17 180). For example, an appropriately prepared surface (DE-A 198 17 180, EP-B-0 589 867) is placed between 1 h and 5 h, typically 3 h, in a corresponding, freshly prepared aqueous hydrogel solution made from hydroxypolymer. The concentration of the hydroxypolymer in the solution is between 10 and 500 mg.m -1 .

An diese nicht funktionalisierte Hydrogelschicht werden organische Moleküle, die einen Rest A aufweisen, gebunden. Die gebundenen organischen Moleküle weisen einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe und deren Derivate, auf. Obwohl primäre Aminreste bevorzugt sind, können sekundäre Aminreste mit einem C1-4-Kohlenwasserstoffrest ebenfalls verwendet werden. Neben Carbonsäuregruppen können z. B. Anhydride und Carbonsäurehalogenide, wie Carbonsäurechloride, verwendet werden. Bevorzugt ist der terminale Rest A eine Carbonsäuregruppe.Organic molecules which have a radical A are bound to this non-functionalized hydrogel layer. The bound organic molecules have a terminal radical A, selected from the amine radical, carboxylic acid group and their derivatives. Although primary amine residues are preferred, secondary amine residues with a C 1-4 hydrocarbon residue can also be used. In addition to carboxylic acid groups such. B. anhydrides and carboxylic acid halides, such as carboxylic acid chlorides, can be used. The terminal radical A is preferably a carboxylic acid group.

Die gebundenen organischen Moleküle besitzen jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen. Über die Länge der Kette kann das Bindungsverhalten von Analytmolekülen beeinflußt werden. Bevorzugt hat die Kette 8 bis 40 Atome, stärker bevorzugt 10 bis 20 Atome. Die Kette kann eine substituierte oder nicht substituierte verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffkette sein. Die Kette ist bevorzugt linear. Bevorzugt sind diese Ketten ihrerseits hydrophil. Lange Alkylketten oder aromatische Reste in der Kette oder als Substituenten daran sind weniger geeignet, da diese über hydrophobe Wechselwirkungen auch unspezifische Adsorption verursachen könnten. Der hydrophile Charakter der Spacer kann durch den Einbau von Oligoethylenoxideinheiten (K. L. Prime & G. M. Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 115 (1993), 10714, A. J. Pertsin, M. Grunze & I. A. Garbuzova, J. Phys. Chem. B 102 (1998), 4843) oder durch die Integration von hydrophilen Resten wie Amidgruppen eingestellt werden. So können z. B. bis zu 70% der Kohlenstoffatome zur Erhöhung der Hydrophilie der Kette durch N, S oder nicht peroxidischem O, bevorzugt N oder nicht peroxidischem O, ersetzt sein. Bevorzugt sind 10 bis 50% der Kohlenstoffatome durch die genannten Heteroatome ersetzt. Mögliche Substituenten sind C1-4-Kohlenwasserstoffreste, wie Alkyl- oder Alkylenreste, und bekannte hydrophile Substituenten wie Hydroxygruppen und carbonylisch gebundene Sauerstoffatome, vorzugsweise sind die Substituenten hydrophil. Sofern sie nicht als terminale Reste A verwendet werden können Aminreste, Carbon­ säuregruppen und deren Derivate ebenfalls als Substituenten verwendet werden. Die im Rahmen der Erfindung verwendeten Substituenten dürfen weder in Art noch Zahl so ausgewählt werden, daß sie die erfindungsgemäß wichtige Flexibilität der organischen Moleküle beeinträchtigen.The bound organic molecules each have a chain length of at least 8 atoms. The binding behavior of analyte molecules can be influenced over the length of the chain. Preferably the chain has 8 to 40 atoms, more preferably 10 to 20 atoms. The chain can be a substituted or unsubstituted branched or unbranched hydrocarbon chain. The chain is preferably linear. For their part, these chains are preferably hydrophilic. Long alkyl chains or aromatic residues in the chain or as substituents thereon are less suitable, since these could also cause non-specific adsorption via hydrophobic interactions. The hydrophilic character of the spacers can be determined by the incorporation of oligoethylene oxide units (KL Prime & GM Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 115 (1993), 10714, AJ Pertsin, M. Grunze & IA Garbuzova, J. Phys. Chem. B 102 (1998), 4843) or by integrating hydrophilic residues such as amide groups. So z. B. up to 70% of the carbon atoms to increase the hydrophilicity of the chain by N, S or non-peroxidic O, preferably N or non-peroxidic O, may be replaced. 10 to 50% of the carbon atoms are preferably replaced by the heteroatoms mentioned. Possible substituents are C 1-4 hydrocarbon radicals, such as alkyl or alkylene radicals, and known hydrophilic substituents such as hydroxyl groups and carbonyl-bonded oxygen atoms; the substituents are preferably hydrophilic. If they are not used as terminal residues A, amine residues, carboxylic acid groups and their derivatives can also be used as substituents. The substituents used in the context of the invention may neither be selected in terms of type nor number such that they impair the flexibility of the organic molecules which is important according to the invention.

Die Kettenlänge ist die Anzahl der C, N, O und S Atome ab dem Hydrogel in der Hauptkette bis zum terminalen Rest, wobei dieser eingeschlossen ist. Wird ein Teil des terminalen Restes bei der Anbindung des Rezeptormoleküls abgespalten, so werden die abgespaltenen Atome nicht mitgezählt. Bei der Zählung werden nur die Atome der organischen Moleküle und die Atome, die z. B. durch die Derivatisierung des Hydrogels bedingt sind, mitgezählt.The chain length is the number of C, N, O and S atoms from the hydrogel in the Main chain to the terminal residue, which is included. Becomes part of the terminal residue when the receptor molecule is bound, see above the atoms that are split off are not counted. When counting, only those Atoms of organic molecules and the atoms that e.g. B. by derivatization of hydrogel are included.

Die Reaktionsbedingungen zur Kopplung der organischen Moleküle an die Hydrogelschicht variieren in Abhängigkeit von der gewählten Verbindung. Beispiele für diese Reaktionsbedingungen werden nachstehend in den bevorzugten Ausführungsformen und den Beispielen beschrieben.The reaction conditions for coupling the organic molecules to the Hydrogel layer vary depending on the compound chosen. Examples for these reaction conditions are given below in the preferred ones Embodiments and the examples described.

Das Rezeptormolekül dient zur spezifischen Anbindung des Analytmoleküls. Deshalb ist es in der Regel ein Biomolekül. Beispiele geeigneter Rezeptormoleküle sind Proteine, Nucleinsäuren und biologisch aktive Oligo- oder Polysaccharide. Bevorzugt sind Proteine. Die Erfindung betrifft die ungerichtete Anbindung von Rezeptoren an eine Hydrogeloberfläche. Folglich weisen die Rezeptormoleküle mindestens 3, bevorzugt mindestens 5, stärker bevorzugt mindestens 10 gleich­ artige Reste B auf. Die maximale Anzahl der Reste B ist nicht beschränkt, das Rezeptormolekül sollte jedoch in dem verwendeten Lösungsmittel löslich sein. Bevorzugt weist das Rezeptormolekül höchstens 10000, stärker bevorzugt höchstens 1000 Reste B auf. Die Reaktivität der gleichartigen Reste muß nicht identisch sein, liegt aber in derselben Größenordnung. Die Reste B werden aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsäurerest, Phosphon­ säurerest und deren Derivate ausgewählt. Mögliche Derivate dürfen die Reaktion mit dem terminalen Rest A der organischen Moleküle nicht behindern, Geeignete Derivate sind z. B. Esterderivate der genannten Säuren mit mindestens einer -OH Gruppe, um die Reaktion mit dem Rest A zu ermöglichen. Es ist selbstverständlich, daß aktivierte Formen, die z. B. aus der Umsetzung von Aminresten mit Ethyl-3,3'- dimethylaminopropylcarbodiimid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) erhalten werden, ebenfalls verwendet werden können.The receptor molecule is used for the specific binding of the analyte molecule. That's why it's usually a biomolecule. Examples of suitable receptor molecules are proteins, nucleic acids and biologically active oligosaccharides or polysaccharides. Proteins are preferred. The invention relates to the non-directional connection of Receptors on a hydrogel surface. Consequently, the receptor molecules point at least 3, preferably at least 5, more preferably at least 10 are the same like residues B on. The maximum number of residues B is not limited to that However, the receptor molecule should be soluble in the solvent used. The receptor molecule preferably has at most 10,000, more preferably  at most 1000 residues B. The reactivity of the like residues does not have to be be identical, but is of the same order of magnitude. The residues B are made Amine residue, carboxylic acid group, sulfonic acid residue, phosphoric acid residue, phosphone acid residue and their derivatives selected. Possible derivatives are allowed to react with do not hinder the terminal residue A of the organic molecules, suitable ones Derivatives are e.g. B. ester derivatives of the acids mentioned with at least one -OH Group to allow reaction with residue A. It goes without saying that activated forms, the z. B. from the reaction of amine residues with ethyl 3,3'- Dimethylaminopropylcarbodiimid (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) obtained can also be used.

Analytmoleküle reagieren selektiv mit den verwendeten Rezeptoren. Sie sind deshalb ebenfalls meistens Biomoleküle. Geeignete Analytmoleküle sind Proteine, Nucleinsäuren und biologisch aktive Oligo- oder Polysaccharide. Bevorzugt sind Proteine.Analyte molecules react selectively with the receptors used. they are therefore also mostly biomolecules. Suitable analyte molecules are proteins, Nucleic acids and biologically active oligosaccharides or polysaccharides. Are preferred Proteins.

Die Bedingungen, bei der die kovalente Anbindung des Analytmoleküls an den Rezeptor erfolgt, variieren in Abhängigkeit von dem gewählten System. Typischer­ weise erfolgt die Anbindung bei Raumtemperatur und in gepufferten, wässrigen Lösungen, die eine Analytkonzentration im Bereich von 0,5 bis 200 µg/ml und eine etwa 100 mM Pufferkonzentration, z. B. eines Phosphatpuffers, aufweisen. Typischerweise beträgt die Dauer der Umsetzung 10 Minuten bis 2 Stunden.The conditions under which the covalent attachment of the analyte molecule to the Receptor takes place vary depending on the chosen system. More typical the connection is made at room temperature and in buffered, aqueous Solutions that have an analyte concentration in the range of 0.5 to 200 µg / ml and a about 100 mM buffer concentration, e.g. B. a phosphate buffer. The duration of the reaction is typically 10 minutes to 2 hours.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist in dem folgenden Schema gegeben (siehe auch das Beispiel).
A preferred embodiment is given in the following scheme (see also the example).

Zunächst wird die Edelmetalloberfläche (z. B. Gold) mit einer Monoschicht aus Cysteamin belegt, in dem die Edelmetalloberfläche 12 bis 36 h in eine wässrige Lösung von 10-3 bis 5.10-2 mol.I-1 Cysteaminiumhydrochlorid gegeben wird. First, the noble metal surface (e.g. gold) is coated with a monolayer of cysteamine, in which the noble metal surface is placed in an aqueous solution of 10 -3 to 5.10 -2 mol.I -1 cysteaminium hydrochloride for 12 to 36 h.

Anschließend wird die Monoschicht mit Polyacrylsäure umgesetzt und diese mit EDC und NHS aktiviert. Typischerweise erfolgt diese Umsetzung mit einer Lösung bestehend aus 10-2 bis 10-1 mol.I-1 Polyacrylsäure mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von 20 000 bis 500 000 und entsprechende Mengen EDC und NHS, die äquimolar zu den COOH-Gruppen des Polymers sind. Als Lösungsmittel dient vorzugsweise ein polares Lösungsmittel, wie DMSO und/oder Wasser. Die Reaktionsdauer beträgt in der Regel 30 min bis 2 h.The monolayer is then reacted with polyacrylic acid and this is activated with EDC and NHS. Typically, this reaction takes place with a solution consisting of 10 -2 to 10 -1 mol.I -1 polyacrylic acid with a number average molecular weight of 20,000 to 500,000 and corresponding amounts of EDC and NHS, which are equimolar to the COOH groups of the polymer . A polar solvent such as DMSO and / or water is preferably used as the solvent. The reaction time is usually 30 minutes to 2 hours.

In einem Folgeschritt wird die Polyacrylsäure typischerweise 15 min bis 2 h mit einer wäßrigen Lösung eines Hydrogels umgesetzt. In dem Schema ist als Beispiel für das Hydrogel Carboxymethyldextran gezeigt. In dieser Ausführungsform werden die organischen Moleküle in zwei Reaktionsschritten aufgebaut. Zunächst werden vor der Anbindung des Carboxymethyldextrans an die Oberfläche die Carboxygruppen mit 1,2-Diaminoethan umgesetzt. Anschließend wird nach der Anbindung des Hydrogels an die Oberfläche die terminale Carbonsäure-Endgruppe durch Umsetzung der Aminogruppe mit Bromessigsäure eingeführt. Üblicherweise dient eine 0,5 mol.I-1 bis 3 mol.I-1 Bromessigsaurelösung mit einem pH-Wert von etwa 14 zur Derivatisierung Die Derivatisierung dauert in der Regel 10 bis 20 h. Es ist selbstverständlich möglich, die organischen Moleküle auch in einem einzigen Reaktionsschritt mit dem Hydrogel zu verknüpfen. Diese Funktionalisierung kann entweder vor oder nach der Anbindung des Hydrogels an die Oberfläche erfolgen. In dieser bevorzugten Ausführungsform beträgt die Länge des Spacers 8 Atome. Gezählt werden die C, N und O Atome des Spacers bestehend aus -CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CH2-CO-OH, wobei das O der -C(O)OH Gruppe nicht mitgezählt wird, da es bei der anschließenden Umsetzung z. B. mit einer Amingruppe des Analyten ersetzt wird. In a subsequent step, the polyacrylic acid is typically reacted for 15 minutes to 2 hours with an aqueous solution of a hydrogel. The diagram shows carboxymethyl dextran as an example of the hydrogel. In this embodiment, the organic molecules are built up in two reaction steps. First, the carboxy groups are reacted with 1,2-diaminoethane before the carboxymethyldextrans is attached to the surface. After the hydrogel has been bound to the surface, the terminal carboxylic acid end group is then introduced by reacting the amino group with bromoacetic acid. Usually a 0.5 mol.I -1 to 3 mol.I -1 bromoacetic acid solution with a pH of about 14 is used for derivatization. The derivatization usually takes 10 to 20 h. Of course, it is also possible to link the organic molecules to the hydrogel in a single reaction step. This functionalization can take place either before or after the attachment of the hydrogel to the surface. In this preferred embodiment, the length of the spacer is 8 atoms. The C, N and O atoms of the spacer consisting of -CH 2 -CO-NH-CH 2 -CH 2 -NH-CH 2 -CO-OH are counted, the O of the -C (O) OH group not being counted , because in the subsequent implementation z. B. is replaced with an amine group of the analyte.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist:
Another preferred embodiment is:

Die Umsetzung mit Bernsteinsäureanhydrid kann in einer 10-2 bis 10-1 mol.I-1 Bernsteinsäureanhydridlösung erfolgen. Die Reaktionsdauer beträgt üblicherweise 4 bis 24 h. Als Lösungsmittel dienen z. B. polare, aprotische Lösungsmittel, wie trockenes DMSO.The reaction with succinic anhydride can take place in a 10 -2 to 10 -1 mol.I -1 succinic anhydride solution. The reaction time is usually 4 to 24 hours. Z. B. polar, aprotic solvents such as dry DMSO.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist weiterhin:
A preferred embodiment is also:

Typischerweise erfolgt die Umsetzung mit Oligoethylenoxid in einer wässrigen Lösung mit einer Oligoethylenoxidkonzentration im Bereich von 10-2 bis 5.10-1 mol.I-1 und einer äquimolaren Menge EDC und NHS. Die Umsetzung kann 10 min bis 2 h dauern. Vorzugsweise besitzt das Oligoethylenoxid n = 4 bis 15 Wieder­ holungseinheiten.Typically, the reaction with oligoethylene oxide takes place in an aqueous solution with an oligoethylene oxide concentration in the range from 10 -2 to 5.10 -1 mol.I -1 and an equimolar amount of EDC and NHS. The reaction can take 10 minutes to 2 hours. Preferably, the oligoethylene oxide has n = 4 to 15 repeat units.

Beispielexample

Um den Effekt des längeren Spacers zu verdeutlichen, werden zwei Sensoren für die Oberflächenplasmonenresonanz hergestellt. Der erfindungsgemäße Sensor besitzt die in dem ersten Ausführungsbeispiel beschriebene Struktur. Als Vergleichs­ beispiel wird ein Sensor mit einem kurzen Spacer verwendet:
To clarify the effect of the longer spacer, two sensors for surface plasmon resonance are produced. The sensor according to the invention has the structure described in the first exemplary embodiment. A sensor with a short spacer is used as a comparison example:

Als Rezeptor wird in beiden Sensoren Lysozym verwendet, als Ligand dient ein Einzelkettenfragment eines korrespondierenden Antikörpers (HyHel 10-Antikörper). Lysozyme is used as a receptor in both sensors, a is used as a ligand Single chain fragment of a corresponding antibody (HyHel 10 antibody).  

Zunächst wird ein Glasträger mit einer Goldoberfläche 12 h in eine wässrige 2. 10-2 mol.I-1 Cysteaminiumhydrochloridlösung gegeben. Anschließend wird der Träger mit Reinstwasser gespült, 5 min mit 1 N NaOH inkubiert und wieder mit Reinstwasser gespült. Eine Inkubationslösung wird durch Mischen einer wässrigen 5.10-2 mol.I-1 Polyacrylsäurelösung (Molekulargewicht 30 000) mit Lösungen von 3,19 mg EDC bzw. 4,115 mg NHS, jeweils in 1 ml Reinstwasser, hergestellt. Der Träger wird 1 h in diese Lösung inkubiert und dann mit Reinstwasser gespült.First, a glass slide with a gold surface is placed in an aqueous 2. 10 -2 mol.I -1 cysteaminium hydrochloride solution for 12 h. The carrier is then rinsed with ultrapure water, incubated for 5 min with 1N NaOH and rinsed again with ultrapure water. An incubation solution is prepared by mixing an aqueous 5.10 -2 mol.I -1 polyacrylic acid solution (molecular weight 30,000) with solutions of 3.19 mg EDC or 4.115 mg NHS, each in 1 ml ultrapure water. The carrier is incubated in this solution for 1 h and then rinsed with ultrapure water.

Das Hydrogel Dextran wird zunächst nach dem folgenden Verfahren derivatisiert:
10,00 g (0,062 mol Wiederholungseinheit) Dextran werden mit 0,99 g NaOH (0,025 mol) und 1,71 g Bromessigsäure (0,012 mol) in 50 ml Reinstwasser gelöst und 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird der Ansatz 3 Tage gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei das Wasser mindestens fünfmal gewechselt wird. Zur weiteren Umsetzung wird der dialysierte Ansatz mit 2,40 g Ethyl-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimid (0,0125 mol) und 1,44 g N-Hydroxysuccinimid versetzt und 12 h bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird der Ansatz erneut 3 Tage gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei das Wasser mindestens fünfmal gewechselt wird. Anschließend wird 90% des Wasser mit einem Rotations­ verdampfer bei reduziertem Druck entfernt und das Polymer durch Eintragen in das 10fache Volumen Methanol gefällt. Die Ausbeute beträgt 9,06 g (81,5%).
The hydrogel dextran is first derivatized using the following procedure:
10.00 g (0.062 mol repeating unit) of dextran are dissolved in 50 ml of ultrapure water with 0.99 g of NaOH (0.025 mol) and 1.71 g of bromoacetic acid (0.012 mol) and the mixture is stirred at room temperature for 24 h. The mixture is then dialyzed against distilled water for 3 days, the water being changed at least five times. For further reaction, 2.40 g of ethyl (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (0.0125 mol) and 1.44 g of N-hydroxysuccinimide are added to the dialyzed batch and the mixture is stirred at room temperature for 12 h. The mixture is then dialyzed again against distilled water for 3 days, the water being changed at least five times. Then 90% of the water is removed using a rotary evaporator at reduced pressure and the polymer is precipitated by being introduced into 10 times the volume of methanol. The yield is 9.06 g (81.5%).

1H-NMR (D2O, 200 MHz), δ [ppm]: 3,25 (m,Hh); 3,35 (m, Hg) 3,5 bis 4,1 (mehrere m, Hb, Hc, Hd, He, Hb', Hc', Hd', He', 5,05 (d, Ha, Ha'), 5,2 und 5,4 (breite Signale, Hf). 1 H NMR (D 2 O, 200 MHz), δ [ppm]: 3.25 (m, H h ); 3.35 (m, H g ) 3.5 to 4.1 (several m, H b , H c , H d , H e , H b ' , H c' , H d ' , H e' , 5, 05 (d, H a , H a ' ), 5.2 and 5.4 (broad signals, H f ).

Anschließend wird das erhaltene Aminodextran in Wasser gelöst, so daß eine 10 Gew.-%ige Lösung resultiert. Der Träger wird 30 min in diese Lösung gegeben und im Anschluß wieder mit viel Reinstwasser gespült. Danach wird der Träger 12 h in eine Lösung von 1 mol.I-1 Bromessigsäure und 2 mol.I-1 NaOH gegeben.The aminodextran obtained is then dissolved in water, so that a 10% by weight solution results. The carrier is placed in this solution for 30 minutes and then rinsed again with plenty of ultrapure water. The carrier is then placed in a solution of 1 mol.I -1 bromoacetic acid and 2 mol.I -1 NaOH for 12 h.

Bei beiden Sensoren wird das Hydrogel 10 min in 10 mM 4'-(2-Hydroxyethyl)-1- piperazinethansulfonsäure-Puffer (Hepespuffer) und 150 mM NaCl bei pH 7,4 in Anwesenheit von 77 mg.ml-1 EDC und 12 mg.ml-1 NHS aktiviert. Anschließend wird eine 0,1 mg.ml-1 Lösung Lysozym in Acetatpuffer bei pH 4,7 mit dem Hydrogel kontaktiert, um das Lysozym durch Reaktion zwischen den freien Aminogruppen des Proteins und aktivierten Carboxylgruppen des Hydrogels kovalent an das Hydrogel zu binden.In both sensors, the hydrogel is 10 min in 10 mM 4 '- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethanesulfonic acid buffer (hepespuffer) and 150 mM NaCl at pH 7.4 in the presence of 77 mg.ml -1 EDC and 12 mg .ml -1 NHS activated. A 0.1 mg.ml -1 solution of lysozyme in acetate buffer at pH 4.7 is then contacted with the hydrogel in order to covalently bind the lysozyme to the hydrogel by reaction between the free amino groups of the protein and activated carboxyl groups of the hydrogel.

Der funktionalisierte Sensor wird in ein SPR-Gerät eingebaut. Bei dem verwendeten SPR-Gerät handelt es sich um einen Eigenbau mit θ/2θ-Aufbau (analog E. Kretschmann und H. Raether, "Radiative Decay of Non-Radiative Surface Plasmons Exicted by Light", Z. Naturforsch., Band 23a, S. 2135 (1968)), der über einen Infrarotlaser (Wellenlänge 784 nm) als Lichtquelle verfügt.The functionalized sensor is installed in an SPR device. When used SPR device is a self-made with θ / 2θ construction (analog E. Kretschmann and H. Raether, "Radiative Decay of Non-Radiative Surface Plasmons  Exicted by Light ", Z. Naturforsch., Volume 23a, p. 2135 (1968)), which about a Infrared laser (wavelength 784 nm) as a light source.

Fig. 3 zeigt den zeitlichen Verlauf der kovalenten Bindung von Lysozym bei dem Vergleichsbeispiel (a) und bei dem erfindungsgemäßen Sensor (b). Die Verschiebung des Minimums zu höheren Winkeln dient als Indikator für die Zunahme der Schichtdicke. Fig. 3 shows the time course of the covalent bond of lysozyme in the comparative example (a) and in the inventive sensor (b). The shift of the minimum to higher angles serves as an indicator of the increase in the layer thickness.

Die beobachtete Verschiebung in SPR-Minimumswinkel (ΔΘpl) zeigt, daß der erfindungsgemäße Sensor eine geringere maximale Funktionalisierungsdichte aufweist (ΔΘpl = 0,18°) als der Vergleichssensor (ΔΘpl = 0,31°). Wesentlich ist aber, daß die Geschwindigkeit beider Bindungssreaktionen sich voneinander unter­ scheiden. Bei dem erfindungsgemäßen Sensor ist die Bindungsreaktion nach etwa 20 Minuten abgeschlossen, während bei dem Vergleichssensor nach dieser Zeit erst 71% der möglichen Belegungskapazität erreicht ist. Dieses Verhalten läßt auf eine schlechtere Zugänglichkeit zumindest eines Teils der terminalen Reste bei dem Vergleichssensor schließen.The observed shift in the SPR minimum angle (ΔΘ pl ) shows that the sensor according to the invention has a lower maximum functionalization density (ΔΘ pl = 0.18 °) than the comparison sensor (ΔΘ pl = 0.31 °). It is essential, however, that the speed of the two binding reactions differ from one another. In the sensor according to the invention, the binding reaction is completed after about 20 minutes, while in the comparison sensor only 71% of the possible occupancy capacity is reached after this time. This behavior suggests that at least some of the terminal residues in the comparative sensor are less accessible.

Ein analoges Verhalten wird bei der Anbindung des Analyten beobachtet. In dem Beispiel wird ein Einzelkettenfragment eines Lysozymantikörpers verwendet. Der erfindungsgemäße Sensor zeigt wiederum eine geringere absolute Belegungsdichte (ΔΘpl = 0,08°) als der Vergleichssensor (ΔΘpl = 0,31°). Bei dem erfindungsgemäßen Sensor, bei dem die Rezeptormoleküle über flexible, langkettige Spacer gebunden sind, ist die Assoziationsreaktion nach ca. 15 Minuten abgeschlossen, während bei dem Vergleichssensor bis zum Erreichen der Sättigung etwa 60 Minuten vergehen (s. Fig. 4).An analogous behavior is observed when the analyte is bound. In the example, a single chain fragment of a lysozyme antibody is used. The sensor according to the invention in turn shows a lower absolute occupancy density (ΔΘ pl = 0.08 °) than the comparison sensor (ΔΘ pl = 0.31 °). In the sensor according to the invention, in which the receptor molecules are bound via flexible, long-chain spacers, the association reaction is completed after approximately 15 minutes, while in the comparative sensor it takes approximately 60 minutes to reach saturation (see FIG. 4).

Beide Ergebnisse deuten auf eine deutliche Verbesserung der Reaktivität bei den erfindungsgemäßen Sensoren hin. Die Zugänglichkeit terminaler Reste und kovalent gebundener Rezeptoren wird also durch flexible, langkettige Spacer merklich erhöht.Both results indicate a significant improvement in the reactivity of the sensors according to the invention. The accessibility of terminal residues and covalent bound receptors are thus significantly increased by flexible, long-chain spacers.

Claims (9)

1. Gegenstand mit einer Oberfläche, umfassend ein Hydrogel, erhältlich durch:
  • a) Anbinden von organischen Molekülen an das Hydrogel, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe und deren Derivate, aufweisen; und
  • b) Umsetzen des terminalen Restes mit einem Rezeptormolekül mit mindestens drei gleichartigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsäurerest, Phosphon­ säurerest und deren Derivate.
1. An article with a surface comprising a hydrogel obtainable by:
  • a) binding of organic molecules to the hydrogel, the bound organic molecules each having a chain length of at least 8 atoms and having a terminal radical A selected from the amine radical, carboxylic acid group and their derivatives; and
  • b) reacting the terminal residue with a receptor molecule with at least three identical residues B, selected from the amine residue, carboxylic acid group, sulfonic acid residue, phosphoric acid residue, phosphonic acid residue and their derivatives.
2. Gegenstand nach Anspruch 1, wobei die Kette eine substituierte oder nicht substituierte, verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffkette ist, in der bis zu 70% der Kohlenstoffatome durch N, S oder nicht peroxidischem O ersetzt sein können.2. The article of claim 1, wherein the chain is a substituted or not is substituted, branched or unbranched hydrocarbon chain in which up to 70% of the carbon atoms through N, S or non-peroxidic O can be replaced. 3. Gegenstand nach Anspruch 1 oder 2, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von 8 bis 40 Atome besitzen.3. The article of claim 1 or 2, wherein the bound organic Molecules each have a chain length of 8 to 40 atoms. 4. Gegenstand nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Rezeptormolekül mindestens 5 Reste B aufweist.4. Article according to one of claims 1 to 3, wherein the receptor molecule has at least 5 radicals B. 5. Gegenstand nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Gegenstand ein Biosensor ist.5. Object according to one of claims 1 to 4, wherein the object Is biosensor. 6. Verfahren zur Herstellung eines Gegenstandes mit einer funktionalisierten Hydrogeloberfläche, umfassend die Schritte:
  • a) Bereitstellen eines Gegenstandes mit einer Oberfläche, umfassend ein Hydrogel;
  • b) Anbinden von organischen Molekülen an das Hydrogel, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe oder deren Derivate, aufweisen; und
  • c) Umsetzen des terminalen Restes A mit einem Rezeptormolekül mit mindestens drei gleichartigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäurerest, Phosphorsäurerest, Phosphon­ säurerest und deren Derivate.
6. A method for producing an article with a functionalized hydrogel surface, comprising the steps:
  • a) providing an article with a surface comprising a hydrogel;
  • b) binding of organic molecules to the hydrogel, the bound organic molecules each having a chain length of at least 8 atoms and having a terminal radical A selected from the amine radical, carboxylic acid group or their derivatives; and
  • c) reacting the terminal residue A with a receptor molecule with at least three identical residues B, selected from the amine residue, carboxylic acid group, sulfonic acid residue, phosphoric acid residue, phosphonic acid residue and their derivatives.
7. Verwendung eines Gegenstandes mit einer funktionalisierten Hydrogelober­ fläche, umfassend an das Hydrogel gebundene organische Moleküle, wobei die gebundenen organischen Moleküle jeweils eine Kettenlänge von mindestens 8 Atomen besitzen und einen terminalen Rest A, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe oder deren Derivate, aufweisen, zur ungerichteten Anbindung eines Rezeptormoleküls mit mindestens drei gleich­ artigen Resten B, ausgewählt aus Aminrest, Carbonsäuregruppe, Sulfonsäure­ rest, Phosphorsäurerest, Phosphonsäurerest und deren Derivate.7. Using an item with a functionalized hydrogel top surface comprising organic molecules bound to the hydrogel, wherein the bound organic molecules each have a chain length of have at least 8 atoms and a terminal radical A selected from Amine residue, carboxylic acid group or derivatives thereof, for undirected attachment of a receptor molecule with at least three of the same like residues B, selected from amine residue, carboxylic acid group, sulfonic acid rest, phosphoric acid residue, phosphonic acid residue and their derivatives. 8. Verwendung eines Gegenstandes nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bei der Detektion von Analytmolekülen.8. Use of an object according to one of claims 1 to 5 in the Detection of analyte molecules. 9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Detektion mit einem Oberflächen­ resonanzspektrometer, Quarzwaage, Reflektionsinterferenzspektrometer oder Reflektionsinterferenzkontrastmikroskop durchgeführt wird.9. Use according to claim 8, wherein the detection with a surface resonance spectrometer, quartz balance, reflection interference spectrometer or Reflection interference contrast microscope is performed.
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