DE19909115A1 - Use of ceramides to treat cystic fibrosis - Google Patents
Use of ceramides to treat cystic fibrosisInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Ceramiden, Deriva ten von Ceramiden und/oder Vorläufern von Ceramiden. Insbe sondere betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Stoffe im Zusammenhang mit der Behandlung von cystischer Fibrose.The invention relates to the use of ceramides, deriva ceramides and / or precursors of ceramides. In particular in particular, the invention relates to the use of these substances related to the treatment of cystic fibrosis.
Die cystische Fibrose ist die häufigste angeborene Stoffwech selkrankheit und mit weltweit mehreren Hunderttausend Todes fällen pro Jahr die häufigste letale genetische Erkrankung. Die Häufigkeit des Auftretens dieser Erkrankung ist regional unterschiedlich. In Europa ist eines von 2000 Neugeborenen betroffen.Cystic fibrosis is the most common innate metabolism disease and with hundreds of thousands of deaths worldwide are the most common lethal genetic disease per year. The incidence of this disease is regional differently. In Europe there is one in 2000 newborns affected.
Bei der cystischen Fibrose handelt es sich um eine autosomal rezessive Stoffwechselstörung, welche mit einer generalisier ten Fehlfunktion exokriner Drüsen einhergeht. Durch einen er höhten Elektrolytgehalt des Sekrets von Schweißdrüsen kommt es zu Flüssigkeits- und Elektrolytverlusten. Weiterhin ist die Viskosität von Sekreten erhöht, so daß es zu schweren Komplikationen im Bereich der Atemwege und des Verdauungs traktes mit sekundärer Cystenbildung kommt. Die Erkrankung bedingt eine erhebliche Verkürzung der Lebenserwartung. Einer der pathophysiologischen Mechanismen bei cystischer Fibrose (CF) ist eine gestörte Regulation vorwiegend epithe lialer Cl--, Na+- und K+-Kanäle. Insbesondere sind Cloridka näle betroffen, die Cl--Ionen aus der Zelle hinaustranspor tieren, die sog. auswärts rektifizierenden Chloridkanäle (outwardly rectifying chloride channels - ORCC).Cystic fibrosis is an autosomal recessive metabolic disorder that is associated with a generalized malfunction of exocrine glands. An increased electrolyte content in the secretion of sweat glands leads to loss of fluid and electrolyte. Furthermore, the viscosity of secretions is increased, so that there are serious complications in the area of the respiratory tract and digestive tract with secondary cyst formation. The disease causes a significant reduction in life expectancy. One of the pathophysiological mechanisms in cystic fibrosis (CF) is a disturbed regulation predominantly epithe lialer Cl - -, Na + - and K + channels. Clorid channels which transport Cl - ions out of the cell, the so-called outwardly rectifying chloride channels (ORCC), are particularly affected.
Die krankheitsbedingte fehlende Aktivierbarkeit dieser Chlo ridkanäle und die gestörte Regulation von Na+- und Wasser resorbierenden Transportprozessen führt zu einer verminderten epithelialen Sekretion von Flüssigkeiten und Bicarbonat. Dies bedingt die zähen Sekrete in Lunge, Pankreas und Darm in be troffenen Patienten, welche zu einer Verlegung von Atemwegen, Pankreasgängen und Darm führen. Hierdurch werden pulmonale Infektionen begünstigt und eine Malabsorption hervorgerufen.The disease-related lack of activability of these chloride channels and the impaired regulation of Na + and water-absorbing transport processes lead to a reduced epithelial secretion of liquids and bicarbonate. This causes the viscous secretions in the lungs, pancreas and intestine in affected patients, which lead to obstruction of the airways, pancreatic ducts and intestine. This promotes pulmonary infections and causes malabsorption.
Die cystische Fibrose wird durch eine Vielzahl unterschied licher Mutationen des CFTR-Gens hervorgerufen, welches für Chloridkanäle und/oder Regulatoren von Chloridkanälen, Na+- Kanälen und K+-Kanälen kodiert. Die Mutationen führen zu einem gestörten transepithelialen Transport mit herabgesetz ter Cl-- und HCO3 --Sekretion und gesteigerter Na+-Resorp tion.Cystic fibrosis is caused by a large number of different mutations in the CFTR gene, which codes for chloride channels and / or regulators of chloride channels, Na + channels and K + channels. The mutations lead to a disturbed transepithelial transport with reduced Act ter Cl - - and HCO 3 - secretion and increased Na + -Resorp tion.
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, Substanzen und Verfah ren bereitzustellen, die die geschilderten, bei CF-Patienten gestörten Prozesse positiv beeinflussen. Beispielsweise soll die Flüssigkeitssekretion in den Epithelien von CF-Patienten angeregt und so der Krankheitsverlauf zumindest gelindert werden. The object of the invention is to provide substances and processes to provide the described in CF patients influence disrupted processes positively. For example, should the fluid secretion in the epithelia of CF patients stimulated and at least alleviated the course of the disease become.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von Ceramiden und/oder Substanzen mit Ceramid-Baustein gemäß dem Anspruch 1 und den abhängigen Ansprüchen 2 bis 4. Die Aufgabe wird eben falls gelöst durch die Verwendung von biologischen Vorläufer molekülen gemäß Anspruch 5 und Aktivatoren gemäß Anspruch 6. Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche mindestens einen dieser wirksamen Stoffe beinhalten, sind in den Ansprüchen 7 bis 12 beansprucht. Die Ansprüche 13 bis 17 betreffen allge mein die Verwendung der genannten Stoffe bei der Behandlung von Krankheiten, die mit gestörten Transportprozessen in Zu sammenhang stehen. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung ge macht.This task is solved by using ceramides and / or substances with a ceramide building block according to claim 1 and dependent claims 2 to 4. The task becomes even if solved by using biological precursors molecules according to claim 5 and activators according to claim 6. Pharmaceutical compositions comprising at least one these contain effective substances are in claims 7 claimed to 12. The claims 13 to 17 relate generally my the use of the substances mentioned in the treatment of diseases associated with disrupted transport processes in Zu stand together. The wording of all claims will hereby by reference to the content of this description makes.
Chloridkanäle in Zellen von gesunden Menschen, nicht aber in Zellen von CF-Patienten, können durch cAMP (zyklisches Adeno sinmonophosphat) aktiviert werden [Rich et al. Nature 347: 358-363, 1990]. Nach dem Stand der Technik war dementspre chend davon auszugehen, daß die Chloridkanäle in Zellen von CF-Patienten nicht zu aktivieren sind. Dieser Defekt bedingt aber gerade die fehlende Flüssigkeitssekretion der Zellen, welche eine wichtige Ursache für die Symptome der cystischen Fibrose ist. Vor kurzem konnte gezeigt werden, daß die aus wärts gleichrichtende Chloridkanäle (ORCC-Kanäle) in Zellen aus gesunden Patienten durch Ceramide aktiviert werden können [Szabo et al. Acad. Sci. USA, 95(11): 6169-6174, 1998].Chloride channels in healthy human cells, but not in Cells from CF patients can be isolated by cAMP (cyclic adeno sinmonophosphate) can be activated [Rich et al. Nature 347: 358-363, 1990]. Accordingly, according to the state of the art assuming that the chloride channels in cells of CF patients cannot be activated. This defect is due but precisely the lack of fluid secretion of the cells, which is a major cause of the symptoms of cystic Fibrosis is. It was recently shown that the out rectifying chloride channels (ORCC channels) in cells can be activated from healthy patients by ceramides [Szabo et al. Acad. Sci. USA, 95 (11): 6169-6174, 1998].
Überraschende Ergebnisse, die die Basis für die vorliegende Erfindung darstellen, zeigen nun, daß auch die Chloridkanäle in Lymphozyten von CF-Patienten durch Ceramide aktiviert wer den können, obwohl die reguläre Aktivierbarkeit durch cAMP (zyklisches Adenosinmonophosphat) gestört ist. Die durch Ceramide aktivierten Kanäle bewirken eine Flüssigkeitssekre tion der Zellen aus CF-Patienten, weshalb durch die Verwen dung von Ceramiden die Symptome der cystischen Fibrose gebes sert werden. Surprising results that are the basis for the present Represent invention, show now that the chloride channels in lymphocytes of CF patients activated by ceramides can, although the regular activation by cAMP (cyclic adenosine monophosphate) is disturbed. By Ceramide activated channels cause a fluid secretion tion of cells from CF patients, which is why by the use of ceramides the symptoms of cystic fibrosis be tested.
Als Ceramide werden bekanntlich körpereigene Stoffe bezeich net, die insbesondere in der Gehirnsubstanz und im Myelin des Zentralnervensystems vorkommen. Es handelt sich um lipophile Amide. Im Organismus liegen die Ceramide als Cholinphosphat ester oder als Glykoside vor. Die Ceramide bilden dabei die Bausteine der auch als Sphingomyeline bezeichneten Cholin phosphatester oder der als sog. Cerebroside, Ganglioside und Sulfatide vorkommenden Glykoside. Die beiden genannten Grup pen von Stoffen mit Ceramiden als Bausteinen werden Sphingo lipide genannt. Chemisch handelt es sich hier um Lipide, die an Stelle von Glycerin (bei Fetten und Ölen) als Alkohol-Kom ponente das in der Natur nicht frei vorkommende Sphingosin (4-Sphingenin) enthalten.As is well known, the body's own substances are known as ceramides net, which in particular in the brain substance and in the myelin of Central nervous system occur. It is lipophilic Amides. The ceramides are found in the organism as choline phosphate ester or as glycosides. The ceramides form the Building blocks of choline, also known as sphingomyeline phosphate ester or as so-called cerebrosides, gangliosides and Sulfatide occurring glycosides. The two groups mentioned Pen of substances with ceramides as building blocks become Sphingo called lipids. Chemically, these are lipids that instead of glycerin (for fats and oils) as an alcohol com component of sphingosine, which is not freely found in nature (4-sphinx) included.
Die Erfindung beinhaltet die Verwendung von Ceramiden und/ oder den anderen genannten Stoffen zur Behandlung der cysti schen Fibrose. Durch Verabreichung einer wirksamen Menge der artiger Stoffe kann vorzugsweise die Flüssigkeitssekretion in Epithelien von Patienten stimuliert werden. Insbesondere die Lungen-, Pankreas- und Darmepithelien von CF-Patienten sind hier zu nennen. Weiterhin umfaßt die Erfindung die Be handlung von cystischer Fibrose durch Verabreichung von Cera miden und/oder den anderen genannten Stoffen sowie die Ver wendung aller dieser Stoffe zur Herstellung von Arzneimit teln, insbesondere von Arzneimitteln zur Behandlung der cy stischen Fibrose.The invention includes the use of ceramides and / or the other substances mentioned for the treatment of cysti fibrosis. By administering an effective amount of the Like substances can preferably the liquid secretion stimulated in epithelia by patients. In particular the lung, pancreas and intestinal epithelia of CF patients are to be mentioned here. Furthermore, the invention includes the Be act of cystic fibrosis by administering cera miden and / or the other substances mentioned and the ver use of all of these substances in the manufacture of pharmaceuticals agents, in particular drugs for the treatment of cy fibrosis.
Die erfindungsgemäß verwendeten Ceramide oder Substanzen mit Ceramid-Baustein sind in einer bevorzugten Ausführungsform längerkettige Ceramide, wie beispielsweise das C12-Ceramid, bzw. deren Derivate, die als häufig natürlich vorkommende Stoffe direkt aus Zellmaterial isoliert werden können. Die eingesetzten Ceramide/Substanzen können auch durch enzymati sche Behandlung von entsprechenden Vorstufen, die aus Zellma terial isolierbar sind, gewonnen werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Ceramide/Substanzen, die mit Hilfe von dem Fachmann bekannten molekularbiologischen Methoden gewonnen sind, verwendet. In einer besonders bevor zugten Ausführungsform werden entsprechende, auf syntheti schem Weg hergestellte Ceramide/Substanzen erfindungsgemäß eingesetzt. Eingesetzt werden hier insbesondere die C2- oder C6-Ceramide bzw. Substanzen mit diesen Ceramiden als Bau stein.In a preferred embodiment, the ceramides or substances with a ceramide building block used according to the invention are longer-chain ceramides, such as C 12 ceramide, or their derivatives, which can be isolated directly from cell material as frequently occurring substances. The ceramides / substances used can also be obtained by enzymatic treatment of corresponding precursors which can be isolated from cell material. In a further embodiment of the invention, ceramides / substances which are obtained with the aid of molecular biological methods known to the person skilled in the art are used. In a particularly preferred embodiment, corresponding ceramides / substances produced by a synthetic route are used according to the invention. In particular, the C 2 - or C 6 -ceramides or substances with these ceramides are used as building blocks.
Erfindungsgemäß können auch Derivate von Ceramiden eingesetzt werden, die in ihren Ceramid-Bausteinen chemisch oder biolo gisch modifiziert sind. Diese Derivate entfalten hinsichtlich der cystischen Fibrose eine ähnliche, bevorzugt bessere, Wir kung als Ceramide und/oder weisen ähnliche oder bessere phar mazeutische Eigenschaften auf. Hierbei kann es sich bei spielsweise um langsamere Abbauraten des Wirkstoffes im Kör per oder um bessere Aufnahmeraten in die Zellen handeln.Derivatives of ceramides can also be used according to the invention that are chemically or biolo in their ceramide building blocks are genetically modified. These derivatives unfold in terms of a similar, preferably better, cystic fibrosis, we kung as ceramides and / or have similar or better phar pharmaceutical properties. This can be for example, slower breakdown rates of the active ingredient in the body act by or at better rates of uptake into the cells.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäß eingesetzten Stoffe biologische Vorläufermoleküle von Cerami den oder von Substanzen mit Ceramid-Baustein, die, beispiels weise durch eine enzymatische Spaltung durch Sphingomyelina sen, in der Zelle in die aktiven Ceramide umgewandelt werden.In a preferred embodiment, they are according to the invention biological precursors from Cerami the or of substances with a ceramide building block which, for example by an enzymatic cleavage by Sphingomyelina sen, are converted into the active ceramides in the cell.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wirken die erfindungsgemäß verwendeten Stoffe auf Stoffwech selwege, die zur Bildung von Ceramiden führen. Insbesondere werden Aktivatoren von Sphingomyelinasen, welche die Spaltung von Vorläufermolekülen zu den aktiven Ceramiden bewirken, eingesetzt.In a further preferred embodiment of the invention the substances used according to the invention act on metabolism pathways that lead to the formation of ceramides. In particular are activators of sphingomyelinases, which are responsible for the cleavage from precursor molecules to the active ceramides, used.
Weiterer möglicher Angriffspunkt für Aktivatoren sind Zell komponenten, vorzugsweise Enzyme, die den Ceramiden in der Signalkette nachgeschaltet sind. Insbesondere kommen hierfür Kinasen in Betracht, die durch Ceramide aktiviert werden. Another possible point of attack for activators is cells components, preferably enzymes, which the ceramides in the Signal chain are connected downstream. In particular come for this Kinases that are activated by ceramides.
Neben der direkten Verabreichung der oben aufgeführten wirk samen Stoffe wird das Einbringen von Nukleinsäuren, welche für diese Substanzen kodieren, ebenfalls von der Erfindung umfaßt.In addition to the direct administration of the above listed seed substances is the introduction of nucleic acids, which code for these substances, also from the invention includes.
Die Erfindung umfaßt weiterhin pharmazeutische Zusammenset zungen, welche mindestens ein Ceramid und/oder die anderen genannten Stoffe sowie vorzugsweise zusätzlich einen pharma zeutisch akzeptablen Träger enthalten. Ob ein und ggf. wel cher pharmazeutische Träger verwendet wird, ist von der Applikationsform des Arzneimittels abhängig.The invention further comprises pharmaceutical compositions tongues, which at least one ceramide and / or the other mentioned substances and preferably additionally a pharma contain acceptable carrier. Whether one and possibly which cher pharmaceutical carrier is used is from the Application form of the drug depends.
Die Verabreichung aller genannten Stoffe bzw. der erfin dungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen kann syste misch erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die pharmazeutische Zusammensetzung über den Verdauungstrakt verabreicht. Besonders bevorzugt ist auch eine Applikation durch Inhalation, wobei der Wirkstoff schnell und direkt in die Lunge eingebracht wird. Diese Verabreichungsform ist insbesondere bei der Behandlung von cystischer Fibrose sinn voll, da es bei dieser Krankheit zu schweren Komplikationen im Bereich der Atmungsorgane kommt.The administration of all the substances mentioned or the inventions Pharmaceutical compositions according to the invention can syste mixed. In a preferred embodiment the pharmaceutical composition via the digestive tract administered. An application is also particularly preferred by inhalation, the active ingredient quickly and directly in the lungs are inserted. This form of administration is especially useful in the treatment of cystic fibrosis full, as there are serious complications with this disease comes in the area of the respiratory system.
Auch bei anderen Krankheiten, die mit einer gestörten Regula tion von molekularen Transportprozessen vorzugsweise an Mem branen einhergehen, kann eine Behandlung mit Ceramiden und/ oder den anderen genannten Stoffen positive Ergebnisse erzie len. Deshalb wird die Verwendung aller dieser Stoffe bei der Behandlung solcher Krankheiten mit von der Erfindung umfaßt. Vorzugsweise sollen die Transportprozesse bei der Erfindung an Ionenkanälen stattfinden, insbesondere an nach außen (aus einer Zelle oder Zellorganelle heraus) gerichteten, Ionen kanälen, vorzugsweise Chloridkanälen. Also with other diseases with a disturbed regulation tion of molecular transport processes preferably on Mem treatment with ceramides and / or bring positive results to the other substances mentioned len. Therefore, the use of all of these substances in the Treatment of such diseases with the invention. The transport processes in the invention are preferably intended take place on ion channels, especially on the outside (from a cell or cell organelle), ions channels, preferably chloride channels.
Die beschriebenen Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzug ten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen und dem Beispiel. Hierbei können die einzelnen Merkmale je weils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.The described features and other features of the invention result from the following description of preferred th embodiments in connection with the subclaims and the example. Here, the individual characteristics can because alone or in combination with each other be realized.
In den Abbildungen zeigen:The pictures show:
Fig. 1 Beeinflussung der Chloridkanäle in normalen Lymphocyten (A, B) und in CF-Lymphocyten (C, D) durch cAMP, Fig. 1 influencing the chloride channels in normal lymphocytes (A, B) and CF-lymphocytes (C, D) by cAMP,
Fig. 2 Beeinflussung der Chloridkanäle in CF-Lympho cyten durch Ceramid, FIG. 2 influencing the chloride channels in CF Lympho cyten by ceramide,
Fig. 3 Beeinflussung der Chloridkanäle in normalen Lymphocyten (A, B) und CF-Lymphocyten (C, D) durch die Tyrosinkinase Lck56. Fig. 3 influencing the chloride channels in normal lymphocytes (A, B) and CF-lymphocytes (C, D) by the tyrosine kinase Lck 56th
Die überraschend stimulierende Wirkung von C2/C6-Ceramid auf Chloridkanäle konnte in den folgenden Experimenten nachge wiesen werden. In diesen Versuchen wurde die dem Fachmann be kannte Patch-Clamp-Technik eingesetzt. Mit dieser Methode kann die Leitfähigkeit an biologischen Membranen nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang wird auch auf die bereits ge nannte Schrift von Szabo et al. Acad. Sci. USA, 95(11): 6169-6174, 1998, verwiesen, deren Inhalt diesbezüglich zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht wird.The surprisingly stimulating effect of C 2 / C 6 ceramide on chloride channels could be demonstrated in the following experiments. In these experiments, the patch clamp technique known to the person skilled in the art was used. This method can be used to demonstrate the conductivity on biological membranes. In this context, reference is also made to the above-mentioned document by Szabo et al. Acad. Sci. USA, 95 (11): 6169-6174, 1998, the content of which in this regard is made the content of this description.
Hierbei wird bekanntermaßen mit einer Mikropipette eine Mem bran angesaugt und durch Unterdruck an dem Rand der Mikropi pette versiegelt. Die auf diese Weise fixierte Membran als Teil einer intakten Zelle oder als isoliertes Membranstück wird in ein geeignetes Elektrolytbad getaucht und die Leitfä higkeit zwischen diesem und der Elektrolytlösung innerhalb der Pipette (Patch-Clamp-Elektrode) gemessen. Durch Zugabe verschiedener Agenzien in die Elektrolytlösungen kann der Öffnungszustand von Ionenkanälen der Membran beeinflußt wer den. Eine solche Beeinflussung ist durch eine sprunghafte Änderung der Leitfähigkeit nachweisbar.As is known, a mem bran sucked in and by vacuum on the edge of the micropi pette sealed. The membrane fixed in this way as Part of an intact cell or as an isolated piece of membrane is immersed in a suitable electrolyte bath and the guide ability between this and the electrolyte solution inside the pipette (patch clamp electrode). By encore various agents in the electrolyte solutions Opening state of ion channels of the membrane affected who the. Such an influence is by a leap Change in conductivity is detectable.
Im vorliegenden Fall wurden T-Lymphocyten von normalen und von an cystischer Fibrose (CF) erkrankten Patienten isoliert, in eine Perfusionskammer eingebracht und mit einer Elektro lytlösung überströmt (145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM Glucose, 10 mM Hepes/NaOH, pH 7,4). Unter dem inversen Mikroskop wurden Patch-Clamp-Elektroden (gefüllt mit 160 mM C5-Glutamat, 2 mM MgCl2, 0,1 mM CaCl2, 1,1 mM EGTA, 4 Na2ATP, 10 mM Hepes/NaOH, pH 7,2) an die Zellmembran ge bracht und durch Einsaugen der Zellmembran eine Verbindung zum Intrazellulärraum hergestellt (whole cell patch clamp) oder die Leitfähigkeit des angesaugten Membranflecks gemessen (cell attached patch clamp). Damit wurde eine kontinuier liche Registrierung der Zellmembranleitfähigkeit möglich. Nach einer Kontrollperiode wurden die Zellen entweder extra zellulär mit cAMP (200 µM), extrazellulär mit C2-Ceramid (50 µM) oder intrazellulär mit der Tyrosinkinase Lck56 (10 U/ml) stimuliert und die Leitfähigkeit kontinuierlich gemessen.In the present case, T-lymphocytes were isolated from normal and from patients suffering from cystic fibrosis (CF), placed in a perfusion chamber and flooded with an electrolyte solution (145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 2 mM CaCl 2 , 10 mM glucose, 10 mM Hepes / NaOH, pH 7.4). Patch clamp electrodes (filled with 160 mM C 5 glutamate, 2 mM MgCl 2 , 0.1 mM CaCl 2 , 1.1 mM EGTA, 4 Na 2 ATP, 10 mM Hepes / NaOH, pH 7.2) is brought to the cell membrane and a connection to the intracellular space is established by sucking in the cell membrane (whole cell patch clamp) or the conductivity of the aspirated membrane spot is measured (cell attached patch clamp). This made it possible to continuously register the cell membrane conductivity. After a control period, the cells were either stimulated extra-cellularly with cAMP (200 µM), extracellularly with C 2 ceramide (50 µM) or intracellularly with the tyrosine kinase Lck 56 (10 U / ml) and the conductivity was continuously measured.
Die Elektroden wurden über geeignete Vorverstärker mit einem Patch-Clamp-Verstärker verbunden (EPC-9), mit dessen Hilfe das Potential zwischen Patch-Clamp-Elektrode und einer Refe renzelektrode im Bad von -100 mV bis +100 mV variiert wurde. Die jeweiligen Ströme über die Zellmembran zwischen Patch- Clamp-Elektrode und Referenzelektrode wurden mit Hilfe des Patch-Clamp-Verstärkers aufgezeichnet. Die Wahl der Lösungen ermöglichte eine ausschließliche Analyse von Strömen durch Chloridkanäle. The electrodes were covered with a suitable preamplifier Patch clamp amplifier connected (EPC-9), with its help the potential between the patch clamp electrode and a ref reference electrode in the bathroom was varied from -100 mV to +100 mV. The respective currents across the cell membrane between patch Clamp electrode and reference electrode were removed using the Patch clamp amplifier recorded. The choice of solutions allowed an exclusive analysis of flows through Chloride channels.
Die in den einzelnen Teilen der Fig. 1 und 3 dargestellten Kurvenverläufe spiegeln die Veränderung der Leitfähigkeit (whole cell) innerhalb eines mehrminütigen Zeitraums nach der Applikation der jeweiligen Substanzen wider. Die in Fig. 2 dargestellten Daten zeigen die Leitfähigkeit vor Applikation von Ceramid (cell attached) und 7 Minuten nach Applikation von Ceramid. Die Applikation von cAMP und Lck56 erfolgte in die Pipette, so daß sich aus den in Fig. 1 und 3 dargestell ten Kurven, die zu verschiedenen Zeiten aufgenommen wurden, die Kinetik der Aktivierung der Chloridkanäle nicht direkt ableiten läßt. Vielmehr ist diese Zeitabhängigkeit auf die Diffusion der zugeführten Substanzen innerhalb der Pipette zurückzuführen und also von der gewählten Methodik abhängig. Für die Interpretation ist hauptsächlich der Endpunkt der Leitfähigkeitsveränderung entscheidend, d. h. die jeweils oberste Kurve.The curve profiles shown in the individual parts of FIGS. 1 and 3 reflect the change in conductivity (whole cell) within a period of several minutes after the application of the respective substances. The data shown in FIG. 2 show the conductivity before application of ceramide (cell attached) and 7 minutes after application of ceramide. The application of cAMP and Lck 56 was carried out in the pipette, so that the kinetics of the activation of the chloride channels cannot be derived directly from the curves shown in FIGS. 1 and 3, which were recorded at different times. Rather, this time dependency is due to the diffusion of the substances supplied within the pipette and is therefore dependent on the method chosen. The end point of the change in conductivity, ie the top curve in each case, is decisive for the interpretation.
Ceramid wurde außerhalb der Pipette appliziert. Daher spielte bei dem Versuch, dessen Ergebnisse in Fig. 2 dargestellt sind, eine Diffusion keine Rolle. In der gewählten Darstel lung ist deshalb nur der Kontrollwert (ohne Ceramid) und die veränderte Leitfähigkeit nach 7 Minuten Inkubation mit Cera mid aufgetragen.Ceramide was applied outside the pipette. Therefore, diffusion was of no importance in the experiment, the results of which are shown in FIG. 2. In the selected illustration, therefore, only the control value (without ceramide) and the changed conductivity after 7 minutes of incubation with cera mid are shown.
Wie Fig. 1 zeigt, führte die Applikation von cAMP erwartungs gemäß zu einer Aktivierung des Cl--Stromes in normalen Lym phocyten (Fig. 1A, 1B), nicht aber in CF-Lymphocyten (Fig. 1C, 1D). Dementsprechend liegen bei den Fig. 1A, 1C, 1D die im zeitlichen Abstand bestimmten Meßkurven jeweils übereinander, bei Fig. 1B jedoch nicht. Im Gegensatz dazu und überraschen derweise führte Ceramid in CF-Lymphocyten (Fig. 2) zu einer Aktivierung der Chloridkanäle. (Vergleich Kurve (vor Applika tion) - Kurve (nach Applikation)). Weiterhin führte die Zu gabe der Tyrosinkinase Lck56, die bekanntermaßen durch Cera mide aktivierbar ist, zu einer Aktivierung von Chloridkanälen in normalen (Fig. 3A, 3B) sowie in CF-Lymphocyten (Fig. 3C, 3D). Die Kurven liegen bei Fig. 3A und 3C übereinander, bei den Fig. 3B und 3D nicht. Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen mit cAMP.As shown in FIG. 1, the application of cAMP, as expected, led to an activation of the Cl - current in normal lymphocytes (FIGS . 1A, 1B), but not in CF lymphocytes ( FIGS. 1C, 1D). Accordingly, in FIGS. 1A, 1C, 1D, the measurement curves determined at intervals are each one above the other, but not in FIG. 1B. In contrast and surprisingly, ceramide in CF lymphocytes ( FIG. 2) led to an activation of the chloride channels. (Comparison curve (before application) - curve (after application)). Furthermore, the addition of tyrosine kinase Lck 56 , which is known to be activated by ceramides, led to the activation of chloride channels in normal ( FIGS. 3A, 3B) and in CF lymphocytes ( FIGS. 3C, 3D). The curves lie one above the other in FIGS. 3A and 3C, but not in FIGS. 3B and 3D. This is in contrast to the results with cAMP.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß der Defekt in CF-Zel len, also die gestörte Aktivierbarkeit von Chloridkanälen, durch die erfindungsgemäße Verwendung von Ceramiden positiv beeinflußt werden kann.These results clearly show that the defect in CF cell len, i.e. the disturbed activation of chloride channels, positive by the use of ceramides according to the invention can be influenced.
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