DE19906763B4 - Arrangement for calibrating a laser scanning microscope - Google Patents

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Abstract

Anordnung zum Kalibrieren eines Laserscanmikroskops, wobei ein Objekt (1) von einem Scanstrahl (2) abtastbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass in einer Zwischenbildebene (1) außerhalb oder in dem das Bildfeld (13) begrenzenden Randbereich Kalibriermittel (12) angeordnet sind, die zum Kalibrieren einzelner oder mehrerer Systemparameter des Laserscanmikroskops ebenfalls von dem Scanstrahl (2) abtastbar sind.Arrangement for calibrating a laser scanning microscope, wherein an object (1) can be scanned by a scan beam (2), characterized in that calibration means (12) are arranged in an intermediate image plane (1) outside or in the edge area delimiting the image field (13) to calibrate individual or multiple system parameters of the laser scanning microscope can also be scanned by the scanning beam (2).

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Figure 00000001

Description

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zum Kalibrieren eines Laserscanmikroskops, wobei ein Objekt von einem Scanstrahl abtastbar ist.The invention relates to an arrangement for calibrating a laser scanning microscope, an object from a scan beam can be scanned.

Zur Darstellung mikroskopischer Objekte kommen Laserscanmikroskope, insbesondere aber auch konfokale Laserscanmikroskope, immer mehr zur Anwendung. Aufgrund der konfokalen Anordnung eignen sich solche Systeme besonders gut zur dreidimensionalen Abbildung von Strukturen und führen insbesondere bei Fluoreszenzaufnahmen dicker Proben zu ungewohnt guten Bildqualitäten. Bei der Nutzung solcher Systeme zu quantitativen Analysen treten jedoch ganz erhebliche Schwierigkeiten in der Kalibrierung der Systeme auf, und zwar meist dann, wenn absolute Intensitäten zu messen sind.To represent microscopic objects Laser scanning microscopes, but in particular also confocal laser scanning microscopes, more and more to use. Suitable due to the confocal arrangement such systems are particularly good for three-dimensional imaging of structures and lead in particular with fluorescence images of thick samples to unusually good image quality. at however, the use of such systems for quantitative analysis occurs very considerable difficulties in the calibration of the systems mostly when absolute intensities are to be measured.

Die Intensität eines Lasers lässt sich üblicherweise durch Einstellung des Röhrenstroms über einen gewissen Bereich modifizieren. Bei Multiline-Lasern und Mischgaslasern können sich obendrein die Intensitätsverhältnisse der Linien zueinander verändern. Letztendlich treten bei allen Lasern langsame Veränderungen in der Intensität (Driften) und schnelle Veränderungen in der Intensität (Rauschen, Brummen, Modenschwankungen) auf. Eine automatische Lichtregelung des Lasers führt in der Regel zu verkürzten Lebensdauern, wenn nämlich intern Dejustagen auftreten, die wiederum durch einen höheren Strom kompensiert werden.The intensity of a laser can usually be adjusted by adjusting the tube current via a modify certain area. For multiline lasers and mixed gas lasers can on top of that the intensity ratios the lines change to each other. Ultimately, slow changes occur with all lasers in intensity (Drifting) and rapid changes in intensity (Noise, hum, fluctuations in mode). An automatic light control of the laser leads usually shortened Lifetimes, namely if Internal misalignments occur, which in turn are caused by a higher current be compensated.

Ein weiteres Problem ergibt sich wie folgt: Die Pupillenöffnung von Objektiven ist unterschiedlich groß. Da diese jedoch durch den Strahl überleuchtet werden muss, um eine beugungsbegrenzte hohe Auflösung des Mikroskops zu erreichen, gelangen in Abhängigkeit vom Objektiv unterschiedlich große Lichtmengen des aufgeweiteten Lasers zur Probe.Another problem arises as follows: The pupil opening of lenses is different in size. However, since this through the Beam overlit in order to achieve a diffraction-limited high resolution of the microscope, get dependent Different amounts of light from the lens of the expanded Lasers to test.

Das konfokale Pinhole vor dem Detektor bzw. vor den Detektoren ist üblicherweise mikromechanisch ausgeführt und bedarf einer Größenkalibrierung. Die Wirkung des Pinholes beim „Ausschneiden" eines Teils der Pointspread-Funktion ist jedoch wiederum von der jeweiligen Vergrößerung abhängig.The confocal pinhole in front of the detector or in front of the detectors is common micromechanically executed and requires a size calibration. The effect of the pinhole when "cutting out" part of the However, the pointspread function depends on the magnification.

Bei konfokalen Laserscanmikroskopen werden üblicherweise Photomultiplier als Detektoren verwendet. Wegen der hohen Dynamik der zu messenden Signale wird üblicherweise die Hochspannung über die Dynoden des Photomultipliers zur Verstärkungseinstellung verwendet. Während für eine bestimmte Hochspannung das Ausgangssignal eines PMT's sich linear zur Eingangsintensität verhält, ist die Verstärkung im PMT nichtlinear abhängig von der Hochspannung und variiert individuell stark.With confocal laser scanning microscopes are common Photomultiplier used as detectors. Because of the high dynamic of the signals to be measured is common the high voltage over the dynodes of the photomultiplier are used for gain adjustment. While for a certain High voltage the output signal of a PMT is linear to the input intensity is the reinforcement non-linearly dependent in the PMT of high voltage and varies individually.

Ein weiteres Problem liegt darin, dass eine monomode Lichtleitfaser unterschiedliche Lasermoden selektieren kann und dadurch Modenschwankungen des Lasers zu Intensitätsschwankungen führen können. Rückreflexe in den Lasern können die laserinternen Regelmechanismen stören und damit zu Intensitätsschwankungen. führen.Another problem is that a single mode optical fiber select different laser modes can and thereby mode fluctuations of the laser to intensity fluctuations to lead can. retroreflections in the lasers the laser internal control mechanisms interfere and thus lead to fluctuations in intensity. to lead.

Auch treten beim schnellen Scannen des Strahls mit Spiegeln durch Trägheitskräfte und Reglerunvollkommenheiten Abweichungen des Scanstrahls von der Sollbahn auf, und zwar insbesondere für die am schnellsten gescannte Koordinate.Also occur when scanning quickly of the beam with mirrors due to inertial forces and regulator imperfections Deviations of the scan beam from the target path, especially for the fastest scanned coordinate.

Aus praktischen Gründen ist es äußerst aufwendig, die beteiligten Komponenten des Systems einzeln zu korrigieren und zu kalibrieren.For practical reasons it is extremely expensive correct the components of the system involved individually and to calibrate.

Aus der DE 197 32 668 A1 ist für sich gesehen eine Vorrichtung zur Kalibrierung von Strahläbtastvorrichtungen bekannt. Dort ist vorgesehen, dass eine Oberfläche mit definierten Markierungen an vorgegebenen Positionen mittels eines Strahls abgetastet wird. Bei dieser Oberfläche bzw. bei diesen Markierungen handelt es sich um Kalibriermittel, wobei diese gemäß 1 in oder geringfügig über oder unter der Arbeitsebene und parallel zu dieser angeordnet sind. Bei der Arbeitsebene handelt es sich um die Objektebene, in der üblicherweise ein Werkstück eingebracht wird, das mit der Strahlabtastvorrichtung bearbeitet wird.From the DE 197 32 668 A1 a device for calibrating beam scanning devices is known per se. It is provided there that a surface with defined markings is scanned at predetermined positions by means of a beam. This surface or these markings are calibration means, and these are in accordance with 1 are arranged in or slightly above or below the working level and parallel to it. The working plane is the object plane in which a workpiece is usually introduced, which is processed with the beam scanning device.

Aus der US 50 27 132 ist eine Kalibriervorrichtung für einen Objekttisch bekannt. Im Konkreten zeigt diese Druckschrift ein Inspektions-/Belichtungssystem, wie es beispielsweise in der Halbleiterindustrie eingesetzt wird. Bei solchen Systemen ist eine präzise und akkurate Positionierung des dort vorgesehenen Objekttischs unabdingbar. Folglich werden die, Kalibriermittel auf dem Tisch zur reproduzierbaren Scaneinstellung verwendet. Da die Positionierung dieses Objekttischs relativ zum Belichtungssystem zu kalibrieren ist, sind entsprechende Kalibriermittel demgemäß zwangsweise am Objekttisch, d.h. in der unmittelbaren Umgebung der Objektebene, angeordnet.From the US 50 27 132 a calibration device for an object table is known. Specifically, this document shows an inspection / exposure system, such as that used in the semiconductor industry. With such systems, a precise and accurate positioning of the object table provided there is essential. As a result, the calibration means on the table are used for reproducible scan setting. Since the positioning of this object table is to be calibrated relative to the exposure system, corresponding calibration means are accordingly forcibly arranged on the object table, ie in the immediate vicinity of the object plane.

Aus der US 54 99 097 ist ein Kalibriermittel eines automatisierten Analysemikroskops für biologische Untersuchungen bekannt. Das Kalibriermittel kann gemäß 2 auf dem Mikroskoptisch angeordnet werden. Weiterhin kann das Kalibriermittel mit Hilfe eines Auslegerarms bzw. eines Hebezugs gehandhabt werden.From the US 54 99 097 a calibration means of an automated analysis microscope for biological examinations is known. The calibration means can be according to 2 be placed on the microscope stage. Furthermore, the calibration means can be handled with the aid of a cantilever arm or a hoist.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, eine Anordnung zum Kalibrieren eines Laserscanmikroskops anzugeben, welche eine Kalibrierung sämtlicher Komponenten mit, einfachen Mitteln zulässt, wobei ein automatisches Kalibrieren möglich sein soll.The object of the invention is now based on an arrangement for calibrating a laser scanning microscope specify which calibration of all components with, simple Allows funds an automatic calibration should be possible.

Die erfindungsgemäße Anordnung der gattungsgemäßen Art löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruches 1. Danach ist die gat- tungsgemäße Anordnung zum Kalibrieren eines Laserscanmikroskops dadurch gekennzeichnet, dass in einer Zwischenbildebene außerhalb oder in dem das Bildfeld begrenzenden Randbereich Kalibriermittel angeordnet sind, die zum Kalibrieren einzelner oder mehrerer Systemparameter des Laserscanmikroskops ebenfalls von dem Scanstrahl abtastbar sind.The arrangement of the generic type according to the invention achieves the above object by means of the features of patent claim 1. Thereafter, the generic arrangement is a potash brier a laser scanning microscope, characterized in that calibration means are arranged in an intermediate image plane outside or in the edge area delimiting the image field, which are also scanned by the scan beam for calibrating individual or more system parameters of the laser scanning microscope.

Erfindungsgemäß ist erkannt worden, dass es keinen Sinn macht, sämtliche Komponenten des. Systems einzeln zu korrigieren und zu kalibrieren. Vielmehr ist es mit einfachen Mitteln möglich, das System insgesamt bzw. eine Mehrzahl der Komponenten gleichzeitig kalibrieren zu können, wobei Helligkeitsschwankungen der Lichtquelle bei der Detektion berücksichtigbar sind. Ein solches Kalibrieren ist dadurch möglich, dass in einer Zwischenbildebene entsprechende Kalibriermittel angeordnet sind, die – wie das Objekt – ebenfalls von dem Scanstrahl anfahrbar bzw. abtastbar sind. Dadurch ist eine Kalibrierung während der eigentlichen Aufnahme bzw. vor und/oder nach dem Scannen des Objekts möglich.According to the invention, it has been recognized that it makes no sense, everyone Correct and calibrate components of the system individually. Much more it is possible with simple means the system as a whole or a plurality of the components simultaneously to be able to calibrate taking brightness fluctuations of the light source during detection berücksichtigbar are. Such a calibration is possible if there are corresponding ones in an intermediate image plane Calibration means are arranged, which - like the object - also can be approached or scanned by the scan beam. This is one Calibration during the actual recording or before and / or after scanning the Possible.

Die Kalibriermittel können in der Ebene der Zwischenabbildung in den Bereich des eigentlichen Bildfeldes einschwenkbar sein. Insoweit werden die Kalibriermittel an die Stelle des Zwischenbilds – in das Bildfeld – gesetzt.The calibration means can be in the level of the intermediate image in the area of the actual image field be pivotable. In this respect, the calibration means are in place of the intermediate image - into that Image field - set.

Bei den Kalibriermitteln kann es sich einerseits um Messmittel und andererseits um Referenzstrukturen handeln, je nach dem, welche Komponenten zu kalibrieren sind. Als Messmittel kommen wiederum Detektionsmittel in Frage, die zur Laserleistungsmessung und Laserkalibrierung dienen. Im Konkreten kann es sich bei den Detektionsmitteln um Photodioden handeln.With the calibration means it can on the one hand measuring equipment and on the other hand reference structures act depending on which components are to be calibrated. As Measuring means are in turn detection means in question for laser power measurement and laser calibration. In concrete terms, it can be with the Detection means are photodiodes.

Sofern es sich bei den Kalibriermitteln um Referenzstrukturen handelt, steht – je nach der zu kalibrierenden Komponente – eine Vielzahl unterschiedlicher Strukturen zur Verfügung. So können die Referenzstrukturen bspw. als Gitter ausgeführt sein, die zur Bildgrößenkalibrierung und/oder zur Linearitätskalibrierung dienen.If it is with the calibration means are reference structures, depending on the one to be calibrated Component - one Many different structures are available. So the reference structures For example, designed as a grid be used for image size calibration and / or for linearity calibration serve.

Ebenso ist es denkbar, dass die Referenzstrukturen als Striche ausgeführt sind, die wiederum zur Bildpositionskalibrierung dienen können.It is also conceivable that the reference structures executed as lines which in turn can be used for image position calibration.

Grundsätzlich können die Referenzstrukturen im Rahmen einer weiteren Ausführungsform als vorzugsweise flächige Muster ausgeführt sein, die zur Phasenkalibrierung von Hin- und Rücklauf des Scanners bzw. Scanstrahls dienen.Basically, the reference structures in the context of a further embodiment as preferably flat Pattern executed be used for the phase calibration of the return and return of the scanner or scan beam serve.

Bei den Referenzstrukturen kann es sich ebenso um dreidimensionale Strukturen handeln, die zur Kalibrierung der Optik, bspw. der Pinhole-Position, dienen. Bei den dreidimensionalen Strukturen (3-D-Strukturen) kann es sich um Stufen, Ausnehmungen oder dgl. handeln.With reference structures it can are also three-dimensional structures that are used for calibration the optics, for example the pinhole position. With the three-dimensional Structures (3-D structures) can be steps, recesses or the like.

Im Rahmen einer weiteren Ausführungsform der Referenzstrukturen ist es möglich, diese aktiv auszugestalten, so bspw. als Leuchtmittel, die zur Kalibrierung der Detektoren dienen. Die Leuchtmittel können wiederum unterschiedliche Spektren aufweisen, wobei es sich bei den Leuchtmitteln im Konkreten um Leuchtdioden handeln kann.In a further embodiment of the Reference structures it is possible to actively design these, for example as illuminants, for calibration serve the detectors. The lamps can in turn be different Have spectra, with the illuminants in the concrete can be light emitting diodes.

Schließlich ist es möglich, dass die Referenzstrukturen als Wechselwirkungen mit dem Scanstrahl aufzeigende Mittel ausgeführt sind, wobei es sich dabei vorzugsweise um bekannt reflektierende, absorbierende, fluoreszierende oder polarisierende Mittel handeln kann.After all, it is possible that showing the reference structures as interactions with the scan beam Means executed are, which are preferably known reflecting, absorbing, fluorescent or polarizing agents can act.

Hinsichtlich der Anordnung der Kalibriermittel – Messmittel und/oder Referenzstrukturen – ist es von Vorteil, diese rasterförmig oder mäanderförmig anzuordnen. Dazu könnten die Kalibriermittel auf einer Kalibrierschablone angeordnet bzw. ausgebildet sein. Bei der Kalibrierschablone könnte es sich um eine Präzisionsplatine mit geätzten Strukturen handeln. Die Platine selbst könnte wiederum als Epoxidharzplatte ausgeführt sein, und zwar vorzugsweise mit einer Goldbeschichtung, um Langzeitänderungen vorzubeugen.With regard to the arrangement of the calibration means - measuring means and / or reference structures - is it is beneficial to grid this or meandering. To do this the calibration means arranged on a calibration template or be trained. The calibration template could be a precision board with etched Act structures. The board itself could in turn be used as an epoxy resin board accomplished preferably with a gold coating to prevent long-term changes.

Insbesondere im Hinblick auf eine stationäre Anordnung der Kalibrierschablone ist es von weiterem Vorteil, wenn diese eine der Größe des Bildfeldes entsprechende Ausnehmung aufweist, durch die der abtastende Scanstrahl ungehindert zur normalen Abbildung hindurchtreten kann. Die Kalibriermittel sind dabei entsprechend am Rand der Kalibrierschablone angeordnet. Die Ausnehmung könnte rund oder quadratisch ausgeführt sein. Entsprechend könnte die Kalibrierschablone eine die Kalibriermittel tragende, vorzugsweise feststehende Kreisringfläche oder – im Rahmen einer quadratischen Ausgestaltung der Kalibrierschablone – eine rahmenähnliche Fläche aufweisen, wobei die Kalibriermittel von den Rahmenschenkeln getragen sind.Especially with regard to a stationary arrangement the calibration template, it is of further advantage if this one the size of the image field has corresponding recess through which the scanning scan beam can freely pass through to normal imaging. The calibration means are arranged accordingly on the edge of the calibration template. The Recess could round or square his. Accordingly, could the calibration template preferably carries the calibration means fixed circular surface or - in the frame a square design of the calibration template - have a frame-like surface, the calibration means being carried by the frame legs.

Ebenso ist es denkbar, die Kalibrierschablone als in den Strahlengang des Scanstrahls einschwenkbare Scheibe auszuführen, wobei eine solche Ausgestaltung eine entsprechende Mechanik zum Verschwenken der Kalibrierschablone erforderlich macht.It is also conceivable to use the calibration template to be designed as a disk which can be swiveled into the beam path of the scanning beam, wherein such an embodiment a corresponding mechanism for pivoting the calibration template is required.

Zur optimalen Kalibrierung der Komponenten sollte die Kalibrierschablone möglichst nahe an dem zu scannenden Objekt angeordnet sein. In ganz besonders vorteilhafter Weise ist die Kalibrierschablone unmittelbar an bzw. vor dem zu scannenden Objekt angeordnet.For optimal calibration of the components the calibration template should be as possible be placed close to the object to be scanned. In a very special way The calibration template is advantageously directly on or arranged in front of the object to be scanned.

Die Kalibrierung kann manuell oder automatisch erfolgen. Dabei ist es denkbar, die Kalibrierung unmittelbar nach dem Einschalten der Laserlichtquelle vorzunehmen. Ebenso ist es jedoch auch möglich, die Kalibrierung, vor und/oder nach der Objektabtastung bzw. Bildaufnahme durchzuführen, und zwar ebenfalls manuell oder automatisch.The calibration can be done manually or done automatically. It is conceivable to do the calibration immediately after switching on the laser light source. Likewise however, it is also possible to Calibration, before and / or after object scanning or image acquisition perform, also manually or automatically.

Auch könnte man die Kalibrierung zur automatischen Datenkorrektur nutzen, wobei einerseits die Kalibrierdaten und andererseits die Messwerte einem Rechner zuzuführen und dort zu verarbeiten sind.You could also use the calibration for use automatic data correction, whereby on the one hand the calibration data and on the other hand to supply the measured values to a computer and are to be processed there.

Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigt die einzige Figur in einer schematischen Darstellung die prinzipielle Anordnung eines konfokalen Laserscanmikroskops mit angedeutetem Zwischenbild.Now there are different ways to design the teaching of the present invention in an advantageous manner and educate. On the one hand, this is based on the claim 1 subordinate claims, on the other hand to the following explanation of an embodiment to refer to the invention with reference to the drawing. Combined with the explanation of the preferred embodiment The invention also generally becomes preferred embodiments and further training of teaching explained. In the drawing, the only figure in a schematic representation of the principle Arrangement of a confocal laser scanning microscope with indicated Intermediate image.

Die einzige Figur zeigt in schematischer Darstellung eine Anordnung zum Kalibrieren eines konfokalen Laserscanmikroskops, wobei ein Objekt 1 von einem Scanstrahl 2 abtastbar ist. Zum besseren Verständnis der erfindungsgemäßen Lehre zeigt die Figur nicht nur den das Objekt 1 abtastenden Scanstrahl 2, sondern auch den Scanner 3, die Laserlichtquelle 4 und den Detektor 5. Der Laserstrahl 6 wird von der Lichtquelle 4 ausgesandt und gelangt über einen Strahlteiler 7 über eine geeignete Optik 8 zum Scanner 3. Von dort aus wird der Scanstrahl 2 über ein Okular 9 und ein Objektiv 10 zum Objekt 1 gelenkt. Zwischen dem Okular 9 und dem Objektiv 10 befindet sich eine Zwischenbildebene 11, in der die Kalibriermittel 12 angeordnet sind.The single figure shows a schematic representation of an arrangement for calibrating a confocal laser scanning microscope, an object 1 from a scan beam 2 is palpable. For a better understanding of the teaching according to the invention, the figure shows not only the object 1 scanning scan beam 2 , but also the scanner 3 , the laser light source 4 and the detector 5 , The laser beam 6 is from the light source 4 sent out and passed through a beam splitter 7 about a suitable optics 8th to the scanner 3 , From there, the scan beam 2 through an eyepiece 9 and a lens 10 to the object 1 directed. Between the eyepiece 9 and the lens 10 there is an intermediate image layer 11 in which the calibration means 12 are arranged.

Bei dem hier gewählten Ausführungsbeispiel sind die Kalibriermittel 12 am Rande der Zwischenbildebene 11 außerhalb des eigentlichen Bildfeldes 13 angeordnet. Dazu ist eine Kalibrierschablone 14 vorgesehen, die eine der Größe des Bildfeldes 13 entsprechende Ausnehmung 15 aufweist. Die Kalibriermittel 12 sind am Rand der Kalibrierschablone 14 angeordnet, wobei hier durch unterschiedliche Symbole unterschiedliche Kalibriermittel 12 schematisch angedeutet sind. Hinsichtlich der in Frage kommenden Kalibriermittel 12 – Messmittel und Referenzstrukturen – wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung verwiesen. Wesentlich ist jedenfalls, dass es sich bei den Kalibriermitteln 12 um passive oder aktive Kalibriermittel 12 handeln kann, wobei die passiven Kalibriermittel 12 flächig oder dreidimensional ausgebildet sein können.In the exemplary embodiment selected here, the calibration means 12 are on the edge of the intermediate image plane 11 outside the actual image field 13 arranged. There is a calibration template for this 14 provided one of the size of the image field 13 corresponding recess 15 having. The calibration means 12 are on the edge of the calibration template 14 arranged, different calibration means by different symbols 12 are indicated schematically. With regard to the calibration means in question 12 - Measuring equipment and reference structures - reference is made to the general part of the description to avoid repetition. In any case, it is essential that the calibration means 12 passive or active calibration means 12 can act, the passive calibration 12 can be flat or three-dimensional.

Hinsichtlich weiterer vorteilhafter Ausgestaltungen wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung verwiesen.More advantageous in terms of Refinements are made to avoid repetitions on the general Part of the description referenced.

Claims (26)

Anordnung zum Kalibrieren eines Laserscanmikroskops, wobei ein Objekt (1) von einem Scanstrahl (2) abtastbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass in einer Zwischenbildebene (1) außerhalb oder in dem das Bildfeld (13) begrenzenden Randbereich Kalibriermittel (12) angeordnet sind, die zum Kalibrieren einzelner oder mehrerer Systemparameter des Laserscanmikroskops ebenfalls von dem Scanstrahl (2) abtastbar sind.Arrangement for calibrating a laser scanning microscope, an object ( 1 ) from a scan beam ( 2 ) can be scanned, characterized in that in an intermediate image plane ( 1 ) outside or in which the image field ( 13 ) boundary area of calibration medium ( 12 ) are arranged, which are also used to calibrate one or more system parameters of the laser scanning microscope from the scanning beam ( 2 ) are palpable. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibriermittel (12) in der Zwischenbildebene (11) in den Bereich des Bildfeldes (13) einschwenkbar sind.Arrangement according to claim 1, characterized in that the calibration means ( 12 ) in the intermediate image level ( 11 ) in the area of the image field ( 13 ) can be swiveled in. Anordnung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Kalibriermitteln (12) um Messmittel handelt.Arrangement according to claim 1 or 2, characterized in that the calibration means ( 12 ) is measuring equipment. Anordnung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Messmittel als Detektionsmittel ausgeführt sind, die zur Laserleistungsmessung und Laserkalibrierung dienen.Arrangement according to claim 3, characterized in that the measuring means are designed as detection means for laser power measurement and laser calibration. Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Detektionsmitteln um Photodioden handelt.Arrangement according to claim 4, characterized in that the detection means are photodiodes. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Kalibriermitteln (12) um Referenzstrukturen handelt.Arrangement according to one of claims 1 to 5, characterized in that the calibration means ( 12 ) are reference structures. Anordnung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzstrukturen als Gitter ausgeführt sind, die zur Bildgrößenkalibrierung und/oder zur Linearitätskalibrierung dienen.Arrangement according to claim 6, characterized in that the reference structures are designed as grids, for image size calibration and / or for linearity calibration serve. Anordnung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzstrukturen als Striche ausgeführt sind, die zur Bildpositionskalibrierung dienen.Arrangement according to claim 6, characterized in that the reference structures are designed as lines that are used for image position calibration serve. Anordnung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzstrukturen als vorzugsweise flächige Muster ausgeführt sind, die zur Phasenkalibrierung von Hin- und Rücklauf des Scanners (3) dienen.Arrangement according to claim 6, characterized in that the reference structures are designed as preferably flat patterns which are used for phase calibration of the scanner's outward and return runs ( 3 ) serve. Anordnung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzstrukturen als 3-D-Strukturen ausgeführt sind, die zur Kalibrierung der Optik, beispielsweise der Pinhole-Position, dienen.Arrangement according to claim 6, characterized in that the reference structures are designed as 3-D structures, those for calibrating the optics, for example the pinhole position, serve. Anordnung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den 3-D-Strukturen um Stufen, Ausnehmungen oder dergleichen handelt.Arrangement according to claim 10, characterized in that the 3-D structures are steps, recesses or the like. Anordnung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzstrukturen als Leuchtmittel ausgeführt sind, die zur Kalibrierung des Detektors (5) dienen.Arrangement according to claim 6, characterized in that the reference structures are designed as lamps which are used to calibrate the detector ( 5 ) serve. Anordnung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Leuchtmittel unterschiedliche Spektren umfassen.Arrangement according to claim 12, characterized ge indicates that the illuminants comprise different spectra. Anordnung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Leuchtmitteln um Leuchtdioden handelt.Arrangement according to claim 12 or 13, characterized in that the light sources are light emitting diodes. Anordnung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzstrukturen als Wechselwirkungen mit dem Scanstrahl (2) aufzeigende Mittel ausgeführt sind.Arrangement according to claim 6, characterized in that the reference structures as interactions with the scan beam ( 2 ) indicating means are executed. Anordnung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Wechselwirkungen mit dem Scanstrahl (2) aufzeigenden Mitteln um bekannt reflektierende, absorbierende, fluoreszierende oder polarisierende Mittel handelt.Arrangement according to claim 15, characterized in that the interactions with the scanning beam ( 2 ) pointing means are known reflective, absorbent, fluorescent or polarizing means. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibriermittel (12) – Messmittel und/oder Referenzstrukturen – rasterförmig angeordnet sind.Arrangement according to one of claims 1 to 16, characterized in that the calibration means ( 12 ) - measuring equipment and / or reference structures - are arranged in a grid pattern. Anordnung nach einem der Ansprüche 6 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibriermittel (12) – Messmittel und/oder Referenzstrukturen – mäanderförmig angeordnet sind.Arrangement according to one of claims 6 to 16, characterized in that the calibration means ( 12 ) - Measuring equipment and / or reference structures - are arranged in a meandering shape. Anordnung nach einem der Ansprüche 6 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibriermittel (12) – Messmittel und/oder Referenzstrukturen – auf einer Kalibrierschablone (14) angeordnet bzw. ausgebildet sind.Arrangement according to one of claims 6 to 18, characterized in that the calibration means ( 12 ) - measuring equipment and / or reference structures - on a calibration template ( 14 ) are arranged or formed. Anordnung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Kalibrierschablone (14) um eine Präzisionsplatine mit geätzten Strukturen handelt.Arrangement according to claim 19, characterized in that the calibration template ( 14 ) is a precision board with etched structures. Anordnung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Platine als vorzugsweise vergoldete Epoxidharzplatte ausgeführt ist.Arrangement according to claim 20, characterized in that the board is designed as a preferably gold-plated epoxy resin plate. Anordnung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibrierschablone (14) eine der Größe des Bildfeldes (13) entsprechende Ausnehmung (15) aufweist.Arrangement according to one of claims 19 to 21, characterized in that the calibration template ( 14 ) one of the size of the image field ( 13 ) corresponding recess ( 15 ) having. Anordnung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibrierschablone (14) eine die Kalibriermittel (12) tragende, vorzugsweise feststehende Kreisringfläche umfasst.Arrangement according to one of claims 19 to 21, characterized in that the calibration template ( 14 ) the calibration means ( 12 ) supporting, preferably fixed circular ring surface. Anordnung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibrierschablone (14) als in den Strahlengang des Scanstrahls (2) einschwenkbare Scheibe ausgeführt ist.Arrangement according to one of claims 19 to 21, characterized in that the calibration template ( 14 ) than in the beam path of the scan beam ( 2 ) swiveling disc is executed. Anordnung nach einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibrierschablone (14) nahe dem zu scannenden Objekt (1) angeordnet ist.Arrangement according to one of claims 19 to 24, characterized in that the calibration template ( 14 ) near the object to be scanned ( 1 ) is arranged. Anordnung nach einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibrierschablone (14) unmittelbar an bzw. vor dem zu scannenden Objekt (1) angeordnet ist.Arrangement according to one of claims 19 to 24, characterized in that the calibration template ( 14 ) directly on or in front of the object to be scanned ( 1 ) is arranged.
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