DE19851413C2 - Procedure for selecting mutants of tTA or rtTA - Google Patents
Procedure for selecting mutants of tTA or rtTAInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auswahl von Mutanten von Transaktivatoren. Sie betrifft ferner die Verwendung eines bestimmten Nukleinsäuremoleküls zum Prüfen der Eigenschaften mutierter Transaktivatoren.The invention relates to a method for selecting mutants of transactivators. It also concerns the use of a particular one Nucleic acid molecule for testing the properties of mutated transactivators.
Es ist allgemein bekannt, dass der Tn10-codierte Tet- Repressor TetR die Expression von Tetrazyklin-Resistenzgenen in Bakterien, wie E.coli, in Abhängigkeit der Tetrazyklinkon zentration reguliert: In Abwesenheit von Tetrazyklin Tc bin det TetR an zwei Operatorsequenzen TetO. TetR reprimiert im gebundenen Zustand die Expression des Tetrazyklin- Resistenzgens. Bei Anwesenheit von Tc wird dieses an TetR ge bunden, wodurch die Bindung von TetR an tetO gelöst wird. Es kommt dann zur Expression des Tetrazyklin-Resistenzgens.It is well known that the Tn10 encoded Tet- Repressor TetR the expression of tetracycline resistance genes in bacteria, such as E. coli, depending on the tetracycline cone concentration regulated: In the absence of tetracycline Tc bin det TetR on two operator sequences TetO. TetR repressed in bound state the expression of the tetracycline Resistance gene. If Tc is present, it is sent to TetR bound, whereby the binding of TetR to tetO is released. It the tetracycline resistance gene is then expressed.
Zum Einsatz von TetR zum Regulieren der Expression von Ziel genen in Säugerzellen hat sich ein Konstrukt aus TetR und der viralen Transkriptionsaktivatordomäne des Virusproteins 16 VP16 aus Herpes simplex bewährt. Dieses Konstrukt wird als hybrider Transaktivator tTA bezeichnet. tTA hat die Eigen schaft bei Abwesenheit von Tc die Expression von Genen zu stimulieren, die stromabwärts eines die tetO enthaltenden Mi nimalpromotors sich befinden. Bei Anwesenheit von Tc wird da gegen die Expression blockiert (Gossen, M. & Bujard, H. 1992: Tight control of gene expression in mammalian cells by te tracycline responsive promotors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551).Use TetR to regulate target expression genes in mammalian cells has a construct from TetR and the viral transcription activator domain of virus protein 16 VP16 from herpes simplex proven. This construct is called hybrid transactivator called tTA. tTA has its own in the absence of Tc expression of genes stimulate the downstream of a Mi containing the tetO nimalpromotors. In the presence of Tc there will be blocked against expression (Gossen, M. & Bujard, H. 1992: Tight control of gene expression in mammalian cells by te tracycline responsive promotors, Proc. Natl. Acad. Sci. United States 89, 5547-5551).
Ein weiteres solches Konstrukt ist der reverse tTA (= rtTA). Er hat die umgekehrte Eigenschaft: Bei Abwesenheit von Tc wird die Expression blockiert, während bei Anwesenheit von Tc die Expression stimuliert wird (Gossen, M., Freudenlieb, S., Bender, G., Müller, G., Hillen, W. & Bujard, H., 1995: Tran scriptional activation by tetracyclines in mammalian cells; Science 268, 1766-1769.Another such construct is the reverse tTA (= rtTA). It has the opposite property: in the absence of Tc expression is blocked while in the presence of Tc expression is stimulated (Gossen, M., Freudenlieb, S., Bender, G., Müller, G., Hillen, W. & Bujard, H., 1995: Tran scriptional activation by tetracyclines in mammalian cells; Science 268, 1766-1769.
In der WO 96/40892 werden Tetrazyklin-regulierte Modulatoren der Transkription offenbart. Es handelt sich dabei um Fusi onsproteine mit einem mutierten TetR und einem Polypeptid, das die Transkription in eukaryotischen Zellen reguliert. Es wird eine Nukleinsäure beschrieben, die für ein solches Fusi onsprotein codiert. Diese Nukleinsäure enthält eine zu expri mierende Nukleotidsequenz, die wirksam mit einer tetO-Sequenz verbunden ist. Ferner werden Nukleinsäuren mit einem Marker offenbart, welcher der Auswahl exprimierender Zellen und der Kontrolle der Expression der Nukleotidsequenz dient.WO 96/40892 describes tetracycline-regulated modulators of the transcription revealed. It is Fusi onproteins with a mutated TetR and a polypeptide, that regulates transcription in eukaryotic cells. It describes a nucleic acid that is suitable for such a fusi encoded onprotein. This nucleic acid contains one too expri Nucleotide sequence that is effective with a tetO sequence connected is. Furthermore, nucleic acids with a marker which of the selection of expressing cells and the Control of the expression of the nucleotide sequence is used.
Zum Auffinden von für eine vorgegebene Anwendung geeigneten neuen Mutanten von tTA oder rtTA werden in E.coli TetR- Varianten erzeugt. Aus den TetR-Varianten werden anschließend die korrespondierenden tTA bzw. rtTA hergestellt. Die Eigen schaften der so hergestellten tTA bzw. rtTA werden dann in Eukaryoten geprüft.To find suitable ones for a given application new mutants of tTA or rtTA are identified in E.coli TetR- Variants created. The TetR variants then become the corresponding tTA and rtTA are produced. The own The tTA or rtTA produced in this way are then in Eukaryotes tested.
Das bekannte Verfahren ist nachteilig, weil die unter Verwen dung von Prokaryoten hergestellten tTA bzw. rtTA nicht ohne weiteres zum Einsatz in Eukaryoten geeignet sind: z. B. wirkt Tc schon in geringen Konzentrationen toxisch auf Prokaryoten, nicht jedoch Eukaryoten.The known method is disadvantageous because the use tTA or rtTA produced by prokaryotes not without other suitable for use in eukaryotes: z. B. acts Tc toxic to prokaryotes even in low concentrations, but not eukaryotes.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein möglichst einfaches und effizientes Verfahren zur Auswahl von Mutanten von Transaktivatoren angegeben werden. Weiteres Ziel der Er findung ist die Verwendung eines geeigneten Nukleinsäuremoleküls zum Prüfen der Eigenschaften mutierter Transaktivatoren.The object of the invention is to overcome the disadvantages of the prior art of technology to eliminate. In particular, it should be as possible simple and efficient process for selecting mutants be specified by transactivators. Another goal of the Er invention is the use of a suitable nucleic acid molecule to test the properties of mutated transactivators.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 17 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2-16 und 18-23.This object is achieved by the features of claims 1 and 17 solved. Appropriate configurations result from the Features of claims 2-16 and 18-23.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Auswahl von
Mutanten von Transaktivatoren mit folgenden Schritten vorge
sehen:
According to the invention, a method for selecting mutants of transactivators is provided with the following steps:
-
a) Herstellung eines Nukleinsäuremoleküls, das
- 1. ein mutiertes Transaktivator-Gen sowie
- 2. ein Indikator-Gen aufweist, das in Abhängigkeit der Konzentration eines niedermolekularen Effektors in einem Eukaryoten exprimierbar ist
- 1. a mutated transactivator gene as well
- 2. has an indicator gene which can be expressed in a eukaryote as a function of the concentration of a low molecular weight effector
- b) Transformation des Nukleinsäuremoleküls in einen Eurka ryoten.b) Transformation of the nucleic acid molecule into a Eurka ryoten.
Von den Eukaryoten sind menschliche embryonale Stammzellen und menschliche Keimbahnzellen aus geschlossen. Aus diesem Ausschluß können Rechte nicht hergeleitet werden.Of the eukaryotes, human are embryonic Stem cells and human germline cells closed. From this exclusion can Rights are not derived.
Das ermöglicht auf einfache und effiziente Weise die eigen schaftsspezifische Auswahl von Mutanten von Transaktivatoren.This enables the own in a simple and efficient way Company-specific selection of mutants of transactivators.
Das Transaktivator-Gen kann ein tTA- oder rtTA-Gen sein. Das Nukleinsäuremolekül ist vorteilhafterweise ein Plasmid, das vom Plasmid pCM190 abgeleitet sein kann. Das Indikator-Gen kann mehrere tet-Operatoren aufweisen. Als besonders vorteil haft hat es sich erwiesen, dass das Indikator-Gen das grün fluoreszierende Protein GFP aus Aequorea victoria codiert. The transactivator gene can be a tTA or rtTA gene. The The nucleic acid molecule is advantageously a plasmid which may be derived from plasmid pCM190. The indicator gene can have multiple tet operators. As a special advantage It has been found that the indicator gene turns green encoded fluorescent protein GFP from Aequorea victoria.
Das GFP-Gen wird zweckmäßigerweise in die singuläre BamHI- Schnittstelle von pCM190 ligiert. Ein solches Plasmid erlaubt eine besonders einfache und effiziente Verfahrensführung.The GFP gene is conveniently inserted into the singular BamHI Interface of pCM190 ligated. Such a plasmid allows a particularly simple and efficient procedure.
Das Nukleinsäuremolekül kann außerdem einen Selektionsmarker aufweisen, wobei als Selektionsmarker das URA3-Gen verwendet werden kann. Das erleichtert die Selektion der entsprechend beladenen eukaryotischen Zellen.The nucleic acid molecule can also be a selection marker have, the URA3 gene being used as the selection marker can be. This facilitates the selection of the corresponding loaded eukaryotic cells.
Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal kann das Nuklein säuremolekül eine 2 µ-Sequenz aufweisen. Das gewährleistet ei ne hohe Anzahl von Kopien des Nukleinsäuremoleküls im Euka ryoten. Ferner kann eine multiple Klonungsstelle vorgesehen sein.According to a further design feature, the nucleus acid molecule have a 2 µ sequence. This ensures ne high number of copies of the nucleic acid molecule in the Euka ryoten. A multiple cloning site can also be provided his.
Die Verwendung von GFP ermöglicht eine qualitative und quan titative Auswertung auf optischem Weg durch Analyse der Fluo reszenz. Eine solche Auswertung ist besonders schnell und einfach durchführbar.The use of GFP enables a qualitative and quan titative evaluation by optical means by analysis of the fluo reszenz. Such an evaluation is particularly quick and easy to do.
Zur Vereinfachung der Herstellung des Nukleinsäuremoleküls hat es sich als zweckmäßig erwiesen, beim Schritt lit. a den tetR oder rtetR-Anteil eines konstitutiv exprimierten tTA oder rtTA gegen mutierte tetR bzw. rtetR zu ersetzen.To simplify the production of the nucleic acid molecule it has proven to be useful to use step lit. a den tetR or rtetR portion of a constitutively expressed tTA or to replace rtTA with mutated tetR or rtetR.
Der mutierte tTA oder rtTA kann durch Amplifizierung des tetR-Gens, eines davon abgeleiteten Fusions-Gens oder einer Mutanten von TetR mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) un ter Zugabe von Manganchlorid hergestellt werden. Dadurch kann schnell und einfach eine große Anzahl an Mutanten bereitge stellt werden. The mutated tTA or rtTA can be amplified by tetR gene, a fusion gene derived therefrom or one Mutants of TetR using polymerase chain reaction (PCR) and ter addition of manganese chloride. This can ready a large number of mutants quickly and easily be put.
Die konstitutiv exprimierte tTA oder rtTA kann ein VP16 auf weisendes Konstrukt sein. Der Effektor ist zweckmäßigerweise Tetrazyklin oder ein Derivat davon.The constitutively expressed tTA or rtTA can have a VP16 be a pointing construct. The effector is convenient Tetracycline or a derivative thereof.
Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, dass der Eu karyot Hefe, vorzugsweise Saccaromyces cerevisiae, ist. Ein solcher Eukaryot ist unproblematisch zu handhaben und billig verfügbar.It has proven particularly advantageous that the Eu karyot yeast, preferably Saccaromyces cerevisiae. On such eukaryote is easy to handle and inexpensive available.
Nach weiterer Maßgabe der Erfindung ist ein Nukleinsäuremole kül zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorge sehen, das ein mutiertes Transaktivator-Gen sowie ein Indika tor-Gen aufweist, das in Abhängigkeit der Konzentration eines Effektors in einem Eukaryoten exprimierbar ist, wobei das In dikator-Gen das GFP-Gen aus Aequorea victoria enthält. - Ein sol ches Nukleinsäuremolekül ermöglicht eine einfache und effizi ente Auswahl von in Eukaryoten benutzbaren Mutanten von tTA bzw. rtTA.According to another aspect of the invention is a nucleic acid mole cool for performing the method according to the invention see that a mutated transactivator gene as well as an indica Tor gene which, depending on the concentration of a Effector is expressible in a eukaryote, the In dikator gene containing the GFP gene from Aequorea victoria. - A sol The nucleic acid molecule enables simple and efficient ent selection of mutants of tTA that can be used in eukaryotes or rtTA.
Das Transaktivator-Gen kann ein tTA- oder rtTA-Gen sein. Das Nukleinsäuremolekül ist zweckmäßigerweise ein Plasmid, wobei das Plasmid von pCM190 abgeleitet sein kann.The transactivator gene can be a tTA or rtTA gene. The The nucleic acid molecule is expediently a plasmid, where the plasmid can be derived from pCM190.
Das Indikator-Gen weist mehrere tet-Operatoren auf und ent hält das GFP-Gen aus Aequorea victoria. GFP ermöglicht eine optische Auswahl der geeigneten Mutanten. Eine solche Auswahl ist einfach und schnell durchzuführen.The indicator gene has several tet operators and ent holds the GFP gene from Aequorea victoria. GFP enables one optical selection of suitable mutants. Such a choice is easy and quick to do.
Das GFP-Gen kann in die singuläre BamHI-Schnittstelle von pCM190 ligiert sein. Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerk mal ist ein Selektionsmarker vorgesehen, wobei der Selekti onsmarker das URA3-Gen sein kann. Eine zweckmäßigerweise vor gesehene 2 µ-Sequenz gewährleistet eine hohe Kopienzahl des Plasmids in einem geeigneten Eukaryoten. Bei dem Eukaryoten handelt es sich vorteilhafterweise um Hefe, vorzugsweise um Saccaromyces cerevisiae.The GFP gene can be inserted into the unique BamHI site of pCM190 be ligated. After another design feature sometimes a selection marker is provided, the Selekti onsmarker the URA3 gene can be. An expediently before seen 2 µ sequence ensures a high number of copies of Plasmids in a suitable eukaryote. With the eukaryote it is advantageously yeast, preferably Saccaromyces cerevisiae.
Nach weiterer Maßgabe der Erfindung ist die Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls mit einem Indikator-Gen, das für ein Protein mit fluoreszenten Eigenschaften kodiert, in Hefe zum Prüfen der Eigenschaften mutierter Transaktivatoren vorgese hen. - Das ermöglicht eine besonders effiziente und kosten günstige Auswahl mutierter Transaktivatoren.According to another aspect of the invention, the use of a Nucleic acid molecule with an indicator gene that is responsible for a Protein encoded with fluorescent properties, in yeast for Check the properties of mutant transactivators hen. - This enables a particularly efficient and cost inexpensive selection of mutated transactivators.
Das Indikator-Gen ist zweckmäßigerweise das GFP-Gen aus Aequ orea victoria. Bei dem Nukleinsäuremolekül handelt es sichge eigneterweise um ein Plasmid, das von pCM190 abgeleitet sein kann.The indicator gene is expediently the GFP gene from Aequ orea victoria. The nucleic acid molecule is suitably a plasmid derived from pCM190 can.
Das Plasmid kann ein mutiertes tTA- oder rtTA-Gen aufweisen. Als Hefe wird zweckmäßigerweise Saccharomyces cerevisiae ver wendet.The plasmid can have a mutated tTA or rtTA gene. As a yeast, Saccharomyces cerevisiae is advantageously used applies.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand mehrerer Ausführungs beispiele erläutert. Dabei zeigen:The invention is based on several embodiments examples explained. Show:
Fig. 1 eine Karte des Plasmids pCM190-GFP+, Fig. 1 is a map of the plasmid pCM190-GFP +,
Fig. 2 die Fluoreszenzintensität verschiedener Transakti vatoren in Saccharomyces cerevisiae und Fig. 2 shows the fluorescence intensity of various Transakti vators in Saccharomyces cerevisiae and
Fig. 3 die Luciferaseaktivität verschiedener Transaktiva toren in HeLa-Zellen. Fig. 3 shows the luciferase activity of various Transaktiva gates in HeLa cells.
Fig. 1 zeigt beispielhaft ein erfindungsgemäßes Nukleinsäure molekül, nämlich den Vektor pCM190-GFP+. Der Vektor enthält eine konstitutiv exprimierte TetR-VP16-Fusion als Transakti vator tTA. Stromabwärts schliesst sich daran ein durch Tc re gulierbarer Promotor, z. B. ein CMV Promotor an. Der hier ge wählte Promotor umfasst 7 tet-Operatoren tetO7, die stromauf wärts der CYC TATA-Region der Bäckerhefe angeordnet sind. In der Nähe der CYC TATA-Region ist das grün fluoreszierende Protein GFP aus Aequorea victoria über glatte Enden in die singuläre BamHI-Schnittstelle von pCM190 ligiert. Der Vektor enthält ferner ein URA3-Gen sowie eine 2 µ-Sequenz. Fig. 1 shows an example of an inventive nucleic acid molecule, namely the vector pCM190-GFP +. The vector contains a constitutively expressed TetR-VP16 fusion as a transaction tTA. This is followed downstream by a promoter which can be regulated by Tc, e.g. B. a CMV promoter. The promoter chosen here comprises 7 tet operators tetO7, which are arranged upstream of the CYC TATA region of the baker's yeast. In the vicinity of the CYC TATA region, the green fluorescent protein GFP from Aequorea victoria is ligated into the unique BamHI site of pCM190 via blunt ends. The vector also contains a URA3 gene and a 2 μ sequence.
Die Funktion der vorgenannten Bestandteile des Vektors ist
folgende:
Aus dem tTA bzw. rtTA kann über geeignete Restriktions
schnittstellen der tetR-Anteil entfernt und durch eine korre
spondierende mutagenisierte tetR-Sequenz ersetzt werden.The function of the aforementioned components of the vector is as follows:
The tetR portion can be removed from the tTA or rtTA via suitable restriction interfaces and replaced by a corresponding mutagenized tetR sequence.
Die Herstellung mutagenisierter TetR kann vorteilhafterweise mittels PCR erfolgen. Dazu wird TetR mittels der Taq-DNA- Polymerase amplifiziert. Ein Zusatz von z. B. Manganchlorid sowie die Einstellung eines Ungleichgewichts der Nukleotide bewirkt eine hohe Fehlerrate dieser Polymerase: Etwa 90% der gebildeten PCR-Produkte weisen einzelne oder mehrere Punktmu tationen auf.The production of mutagenized TetR can advantageously using PCR. For this, TetR is using the Taq DNA Polymerase amplified. An addition of e.g. B. manganese chloride and the establishment of an imbalance in the nucleotides causes a high error rate of this polymerase: about 90% of the PCR products formed have single or multiple Punktmu tations on.
Das GFP-Gen dient als Indikator- bzw. Reportergen. Es eignet sich insbesondere als Reporter in der Bäckerhefe. Das URA3- Gen dient als Selektionsmarker in der Bäckerhefe. Die 2 µ- Sequenz gewährleistet eine besonders hohe Kopienzahl des Vek tors in den Bäckerhefe-Zellen.The GFP gene serves as an indicator or reporter gene. It is suitable particularly as a reporter in the baker's yeast. The URA3- Gen serves as a selection marker in baker's yeast. The 2 µ Sequence ensures a particularly high number of copies of the Vek tors in the baker's yeast cells.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Auswahl- bzw. Scree ningverfahrens wird ein zufällig generiertes tetR-Mutanten enthaltendes pCM190-GFP+ Gemisch mittels Transformation in Saccharomyces cerevisiae eingebracht. Anschließend wird mit tels Uracil-Prototropie der Transformanden auf die Anwesen heit des Vektors selektioniert.To carry out the selection or scree according to the invention ting process is a randomly generated tetR mutant containing pCM190-GFP + mixture by transformation in Saccharomyces cerevisiae introduced. Then with Uracil prototropy of the transformants on the property selected of the vector.
Auf geeigneten Agarplatten kann nun die Induktion von tTA- oder rtTA-Mutanten unter verschiedenen Bedingungen geprüft werden. Es kann z. B. der die Induktion von tTA- oder rtTA- Mutanten bewirkende Effektor variiert werden. Als Effektoren kommen z. B. Tc-Derivate oder andere chemische Verbindungen in Frage. Es ist gleichfalls möglich, die Konstruktion neuer rtTAs zu prüfen. Selbstverständlich ist es auch möglich, neue effiziente TetR/Aktivator- bzw. TetR/Repressor-Funktionen zu identifizieren. Ferner ist es möglich, Konstrukte zu testen, bei denen ganze Genbanken anstelle von VP16 kloniert sind.The induction of tTA- or rtTA mutants tested under different conditions become. It can e.g. B. the induction of tTA- or rtTA- Mutant effectors can be varied. As effectors come z. B. Tc derivatives or other chemical compounds in Question. It is also possible to design new ones check rtTAs. Of course, it is also possible to create new ones efficient TetR / activator or TetR / repressor functions identify. It is also possible to test constructs where whole gene banks are cloned instead of VP16.
Die Fig. 2 und Fig. 3 zeigen die Eigenschaften von unter Ver
wendung des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgefundenen Mutan
ten. Dabei wurde wie folgt vorgegangen:
Der TetR-Anteil von tTA wurde mit dem Vektor pCM190 als Ma
trize und zwei entsprechenden Oligonukleotiden
(5'-GACCGATCCAGCCTCCGCGG und 5'-CGTGTGTCCCGCGGGGAGAA) nach der
Methode von Leung et al. (Leung, D. W., Chen, E. & Goeddel,
D. V. 1989: A method for randon mutagenesis of a defined DNA
segment using a modified polymerase chain reaction, Technique
1, 11-15) amplifiziert. Die enthaltenen, mutagenisierten
PCR-Fragmente (= mutagenisierte TetR-Gene) und PCM190-GFP+
wurden mit Xbal und BsiWI verdaut und aufgereinigt. Anschlie
ßend wurden die PCR-Fragmente in den geschnittenen Vektor li
giert und in E.coli DH5α transformiert. Jeweils mehrere 1000
E.coli-Klone wurde zusammen kultiviert und deren Plasmid-DNA
präpariert. Diese Plasmidpools wurden sodann mittels der
LiAc-Methode in Saccharomyces cerevisiae transformiert (Ito
et al., H., Fukada, Y., Murata, K. & Kimura 1983: Transforma
tion of intact yeast cells treated with alkali cations, J.
Bact. 153, 163-168). . Figs. 2 and 3 show by Ver application of the method, discovered the properties of Mutan th This procedure was as follows.:
The TetR portion of tTA was with the vector pCM190 as template and two corresponding oligonucleotides (5'-GACCGATCCAGCCTCCGCGG and 5'-CGTGTGTCCCGCGGGGAGAA) according to the method of Leung et al. (Leung, DW, Chen, E. & Goeddel, DV 1989: A method for randon mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction, Technique 1, 11-15). The contained, mutagenized PCR fragments (= mutagenized TetR genes) and PCM190-GFP + were digested and purified with Xbal and BsiWI. The PCR fragments were then ligated into the cut vector and transformed into E.coli DH5α. Several 1000 E. coli clones were cultivated together and their plasmid DNA was prepared. These plasmid pools were then transformed into Saccharomyces cerevisiae using the LiAc method (Ito et al., H., Fukada, Y., Murata, K. & Kimura 1983: Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations, J. Bact. 153, 163-168).
Die erhaltenen Uracil-prototrophen Hefeklone wurden auf Mini malmedium-Platten ohne Uracil, aber mit jeweils 10 µg/ml Te trazyklin bzw. Doxyzyklin oder ohne Tc-Derivat replikaplat tiert und nach zwei bis drei Tagen Wachstum bei 30°C unter langwelligem UV-Licht kontrolliert. Dabei konnten Mutanten identifiziert werden, die einen reversen Phänotyp aufweisen, d. h. sie induzieren im Gegensatz zu tTA in Anwesenheit von Tetrazyklin-Derivaten.The uracil-prototrophic yeast clones obtained were mini malmedium plates without uracil, but each with 10 µg / ml Te trazyklin or doxycycline or without Tc derivative replikaplat animals and after two to three days of growth at 30 ° C below controlled long-wave UV light. Mutants could identified that have a reverse phenotype, d. H. in contrast to tTA, they induce in the presence of Tetracycline derivatives.
Die Mutanten rtTA-34R und -44R wurden zusammen mit einem GFP- freien Kontrollstamm, dem tTA- und dem rtTA-enthaltenden Stamm über Nacht in Minimalmedium kultiviert. Die Zellen wur den geerntet und je eine OD600 wurde mit PBS gewaschen und in 2 ml PBS resuspendiert. Die Lichtemission der Zellen bei 512 mm wurde im Fluorimeter bei einer Anregungswellenlänge von 490 nm vermessen. Dabei erwies sich die Basalaktivität der Mutante rtTA-34R in Hefe als deutlich erniedrigt im Vergleich zu dem bisher bekannten rtTA (Belli et al. 1998: An activa tor/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast, Nucleic Acids Res. 26, 942-947). Wie aus Fig. 1 ersichtlicht ist, liegt die Aktivierung etwa im Bereich des rtTA bzw. des tTA. Es werden hierbei In duktionsfaktoren von 100-300 gemessen. Also ist rtTA-34R für den Einsatz zur regulierbaren Genexpression in Hefe wesent lich besser geeignet als rtTA, dessen Induktionsraten maximal 40-fach sind.The mutants rtTA-34R and -44R were cultured overnight in minimal medium together with a GFP-free control strain, the tTA- and the rtTA-containing strain. The cells were harvested and one OD600 each was washed with PBS and resuspended in 2 ml PBS. The light emission of the cells at 512 mm was measured in the fluorimeter at an excitation wavelength of 490 nm. The basal activity of the mutant rtTA-34R in yeast was found to be significantly reduced compared to the previously known rtTA (Belli et al. 1998: An activator / repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast, Nucleic Acids Res 26, 942-947). As can be seen from FIG. 1, the activation lies approximately in the region of the rtTA or the tTA. Induction factors of 100-300 are measured here. RtTA-34R is therefore much more suitable for use in regulating gene expression in yeast than rtTA, whose induction rates are a maximum of 40 times.
Nach Isolation der entsprechenden Vektoren aus der Bäckerhefe wurden die mutagenisierten tTA-Bereiche sequenziert, um die für den reversen Phänotyp verantwortlichen Aminosäureaus tausch zu bestimmen. Anschließend wurden sowohl rtTA-34R als auch -44R in den Vektor pUHD15-1 (Gossen & Bujard, 1992: Tight control of gene expression in mammalian cells by te tracycline responsive promoters, Proc., Natl., Acad. Sci. USA 89, 5547-5551) umkloniert, wobei die mutagenisierten Transak tivatoren tTA ersetzten. Durch transiente Transfektionen zu sammen mit dem Luciferase-kodierenden Vektor pUHC13-3 wurden die Aktivitäten der Konstrukte in HeLa-Zellen überprüft.After isolation of the corresponding vectors from the baker's yeast the mutagenized tTA regions were sequenced to obtain the amino acid responsible for the reverse phenotype to determine exchange. Then both rtTA-34R and also -44R in the vector pUHD15-1 (Gossen & Bujard, 1992: Tight control of gene expression in mammalian cells by te tracycline responsive promoters, Proc., Natl., Acad. Sci. United States 89, 5547-5551), the mutagenized Transak replace tivators. Through transient transfections too together with the vector pUHC13-3 encoding luciferase checked the activities of the constructs in HeLa cells.
Aus Fig. 3 ist ersichtlich, dass rtTA-34R auch in Humanzellen eine mehrfach höhere Induktion des Reportergens bewirkt als bisher verwendete rtTA. Dieser Effekt kommt zum einen wie in Saccharomyces cerevisiae durch erniedrigtes Basalniveau zu stande. Zum anderen dadurch, dass die Aktivierung der Expres sion deutlich erhöht ist.From Fig. 3 it can be seen that rtTA-34R also causes a higher induction of the reporter gene in human cells than rtTA previously used. On the one hand, this effect comes about, as in Saccharomyces cerevisiae, through a lower basal level. On the other hand, because the activation of the expression is significantly increased.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren konnte u. a. die TetR- Mutante rtTA-34R identifiziert werden, welche die Transkrip tion von Reportergenen nach Gabe von Doxyzyklin aktiviert und die Anwendungsmöglichkeiten durch erhöhte Induktionsraten in Hefen und Säugerzellen verbessert. Die in Hefe mittels GFP bestimmten Aktivitäten von tTA bzw. rtTA und den jeweiligen Mutanten können auf Humanzellen übertragen werden.With the method according to the invention u. a. the TetR Mutant rtTA-34R can be identified which is the transcript tion of reporter genes activated after administration of doxycycline and the application possibilities through increased induction rates in Yeast and mammalian cells improved. The in yeast using GFP certain activities of tTA or rtTA and the respective Mutants can be transferred to human cells.
Das erfindungsgemäße Screening-Verfahren ist besonders geeig net zum Auffinden von tTA-Mutanten, die unterschiedlich sen sitiv auf die verschiedenen Induktoren reagieren: Es wurden elf Mutanten des gewünschten Phänotyps identifiziert. Durch die Sequenzierung dieser tTA-Varianten konnte festgestellt werden, dass alle durch Aminosäureaustausche betroffenen Po sitionen entweder in der Tetrazyklin-Bindetasche oder in In duktionsbereichen lagen. Nach der Klonierung der tTA-Mutanten in den Vektor pUHD15-1 wurden fünf der Klone, die in Hefe ei nen sehr ausgeprägten Phänotyp zeigten, mittels transienter Transfektionen in humanen Epithelzellen getestet. Diese Mes sungen bestätigten die in Hefe beobachteten Induktionsunter schiede.The screening method according to the invention is particularly suitable net to find mutant tTA mutations Sitiv react to the different inductors: There have been eleven mutants of the desired phenotype were identified. By the sequencing of these tTA variants could be determined that all Po affected by amino acid exchanges sitions either in the tetracycline binding pocket or in production areas. After cloning the tTA mutants In the vector pUHD15-1, five of the clones that were found in yeast showed a very pronounced phenotype by means of transient Transfections tested in human epithelial cells. This Mes solutions confirmed the induction effects observed in yeast differences.
Als Beispiel sei die Mutante 45 näher ausgeführt, die einen
Aminosäureaustausch an Position 170 von TetR trägt (L170V):
Durch Transfektion der entsprechenden Plasmide in HeLa-Zellen
und Verabreichung steigender Mengen an Tetrazyklin bzw. Doxy
zyklin wurde die jeweilige Induktorenkonzentration bestimmt,
die zu 50% Repression der Luciferaseaktivität führt (IC50).
Die nachfolgende Tabelle zeigt einen Vergleich der Induktion
von tTA und tTA-45 mittels Tetrazyklin und Doxyzyklin:
Mutant 45, which carries an amino acid exchange at position 170 of TetR (L170V), is elaborated as an example: by transfection of the corresponding plasmids in HeLa cells and administration of increasing amounts of tetracycline or doxycycline, the respective inducer concentration was determined, which was 50 % Repression of luciferase activity leads (IC 50 ). The following table shows a comparison of the induction of tTA and tTA-45 using tetracycline and doxycycline:
Es zeigt sich, dass tTA-45 durch den Austausch an Position 170 im Vergleich mit tTA etwa 100-fach unempfindlicher auf Tetraxzyklin, aber nur etwa 10-fach unempfindlicher auf Doxy zyklin reagiert. Das beschriebene System ist also nicht nur zur Selektion reversen tTA-Phänotypen geeignet, sondern kann auch zur Auswahl von tTAs mit anderen Eigenschaften genutzt werden. It turns out that tTA-45 by exchanging in position 170 compared to tTA about 100 times less sensitive Tetraxcycline, but only about 10 times less sensitive to doxy cyclin responds. So the system described is not only suitable for selection of reverse tTA phenotypes, but can also used to select tTAs with other properties become.
Claims (23)
- a) Herstellung eines Nukleinsäuremoleküls, das
- 1. ein mutiertes Transaktivator-Gen sowie
- 2. ein Indikator-Gen aufweist, das in Abhängigkeit der Konzentration eines niedermolekularen Effektors in einem Eukaryoten exprimierbar ist
- b) Transformation des Nukleinsäuremoleküls in einen Eukaryoten.
- a) Preparation of a nucleic acid molecule, the
- 1. a mutated transactivator gene as well
- 2. has an indicator gene which can be expressed in a eukaryote as a function of the concentration of a low molecular weight effector
- b) transformation of the nucleic acid molecule into a eukaryote.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| DE1998151413 DE19851413C2 (en) | 1998-11-07 | 1998-11-07 | Procedure for selecting mutants of tTA or rtTA |
| US10/108,524 US20050037335A1 (en) | 1998-11-07 | 2002-03-27 | Method for identifying novel transcriptional regulatory proteins |
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|---|---|---|---|
| DE1998151413 DE19851413C2 (en) | 1998-11-07 | 1998-11-07 | Procedure for selecting mutants of tTA or rtTA |
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| DE19851413A1 DE19851413A1 (en) | 2000-05-11 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996040892A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Basf Ag | Tetracycline regulated transcriptional modulators with altered dna binding specificities |
-
1998
- 1998-11-07 DE DE1998151413 patent/DE19851413C2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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