DE19850049A1 - Flow cytometry assay for intracellular cytokine levels of immune cells includes fixing and permeabilizing the cells with PermeaFix (TM) reagent - Google Patents

Flow cytometry assay for intracellular cytokine levels of immune cells includes fixing and permeabilizing the cells with PermeaFix (TM) reagent

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Abstract

Method for determining the intracellular cytokine levels of immune cells in body fluid, organ or tissue samples comprises: (a) isolating mononuclear cells; (b) restimulating the mononuclear cells in vitro; (c) fixing and permeabilizing the cells with PermeaFix (TM) reagent; (d) staining cell-surface antigens and intracellular cytokines; and (e) analyzing the cells by flow cytometry. Method for determining the intracellular cytokine levels of immune cells in body fluid, organ or tissue samples comprises: (a) isolating mononuclear cells by density gradient centrifugation; (b) restimulating the mononuclear cells in vitro; (c) fixing and permeabilizing the cells with PermeaFix (TM) reagent; (d) staining cell-surface antigens and intracellular cytokines with dye-labeled monoclonal antibodies; and (e) analyzing the cells by flow cytometry.

Description

Die Erfindung umfaßt ein effektives Verfahren zur Bestimmung diagnostisch und pathogenetisch relevanter Zytokine in menschlichen und tierischen Immunzellen aus dem Probengut des peripheren Blutes, anderer biologischer Körperflüssigkeiten und Organ- und Gewebeproben auf Einzelzellebene mit Hilfe der Durchflußzytometrie und kommt als Labormethode bei der medizinischen Immundiagnostik und beim Immunmonitoring zur Anwendung.The invention includes an effective method for diagnostic and determination pathogenetically relevant cytokines in human and animal immune cells the sample of peripheral blood, other biological body fluids and Organ and tissue samples at the single cell level using flow cytometry and comes as a laboratory method in medical immunodiagnostics and in Immune monitoring for use.

Zytokine werden vorzugsweise von den Zellen des Immunsystems gebildet. Da die Zytokine eine Schlüsselrolle bei der Regulation der Immunantwort einnehmen, stellen Verschiebungen der Zytokinbalance einen wesentlichen Faktor bei der Immunpathogenese einer Reihe von Erkrankungen dar. Dazu zählen u. a. die systemischen und organspezifischen Autoimmunerkrankungen, die atopischen Erkrankungen sowie die Transplantat-Abstoßungsreaktion.Cytokines are preferably produced by the cells of the immune system. Since the Cytokines play a key role in regulating the immune response, shifts in cytokine balance are a major factor in the Immunopathogenesis of a number of diseases. a. the systemic and organ-specific autoimmune diseases, the atopic Diseases as well as the graft rejection reaction.

Zu den häufig angewendeten Zytokin-Bestimmungsmethoden gehören der Zytokin- ELISA zur Quantifizierung sezernierter Zytokine in Zellkulturüberständen, die Polymerasekettenreaktion nach reverser Transkription der RNS und der Zytokin- ELISPOT-Assay. Neben dem hohen Zeitbedarf, großem Arbeitsaufwand und hohen Kosten weisen diese Methoden eine Reihe weiterer Nachteile auf.Commonly used cytokine determination methods include cytokine ELISA for the quantification of secreted cytokines in cell culture supernatants Polymerase chain reaction after reverse transcription of the RNA and the cytokine ELISPOT assay. In addition to the high time requirement, large workload and high These methods have a number of other disadvantages in terms of cost.

Beim Zytokin-ELISA können die Ergebnisse durch Abbau eines Teils der sezernierten Zytokine während der 3-10 Tage dauernden Zellkultur erheblich beeinflußt werden.In the cytokine ELISA the results can be broken down by part of the secreted cytokines significantly during the 3-10 day cell culture to be influenced.

Beim Nachweis von Zytokin-mRNS bleibt ungeklärt, ob die genetische Information in biologisch und damit immunregulatorisch wirksames Zytokin umgesetzt wird.When cytokine mRNA is detected, it remains unclear whether the genetic information in biological and thus immunoregulatory cytokine is implemented.

Darüber hinaus gibt keines dieser Verfahren Auskunft über den zellulären Ursprung der sezernierten Zytokine. Stattdessen werden lediglich Summeneffekte von Mischzellpopulationen erfaßt.In addition, none of these methods provide information about the cellular origin of the secreted cytokines. Instead, only sum effects of Mixed cell populations recorded.

Bei der durchflußzytometrischen Methode sind mehrere Vorteile bekannt. So gestattet nur dieses Verfahren, die Zytokin-produzierenden Zellen auf Einzellebene zu detektieren. Bei gleichzeitiger Anfärbung der CD-Oberflächenmarker ist eine Zuordnung Zytokin-produzierender Zellen zu spezifischen Monozyten- bzw. Lymphozytensubpopulationen möglich. Mehrere Zytokine pro Zelle können erfaßt und über die Fluoreszenzintensität des Zytokinsignals quantitative Aussagen zur Menge der pro Zelle gebildeten Zytokine getroffen werden. Normalerweise liegen die intrazellulären Zytokinkonzentrationen jedoch unterhalb der Nachweisgrenze der durchflußzytometrischen Methode. Auch durch Stimulation der Zytokinsynthese wird die Nachweisgrenze nicht überschritten, da die synthetisierten Zytokine sehr schnell in das umgebende Medium sezemiert werden.Several advantages are known in the flow cytometric method. So only this method allows the cytokine-producing cells to be isolated at the individual level to detect. With simultaneous staining of the CD surface marker is a Assignment of cytokine-producing cells to specific monocyte or Lymphocyte subpopulations possible. Several cytokines per cell can be detected and quantitative statements about the fluorescence intensity of the cytokine signal  Amount of cytokines formed per cell can be hit. Usually they are intracellular cytokine concentrations however below the detection limit of flow cytometric method. Also by stimulating cytokine synthesis the detection limit is not exceeded, since the synthesized cytokines very quickly be dissected into the surrounding medium.

Durch Jung, T., et al.: Detection of intracellular cytokines by flow cytometry, in J. Immunol. Methods 1993, 159, S. 197-207, ist erstmals eine geeignete intrazelluläre Zytokinfärbung für die Durchflußzytometrie beschrieben worden. Das Problem der zu geringen intrazellulären Zytokinkonzentrationen wurde dadurch überwunden, daß während der Restimulation der mononukleären Zellen durch kombinierte Behand­ lung mit Phorbot 12-myristat 13-azetat und Ionomycin der Proteintransportinhibitor Monensin zugesetzt wurde. Bei dieser Vorbehandlung steigen die intrazellulären Zytokinkonzentrationen durch Akkumulation auf solche Werte an, die eine Detektion über die Durchflußzytometrie zulassen.By Jung, T., et al .: Detection of intracellular cytokines by flow cytometry, in J. Immunol. Methods 1993, 159, pp. 197-207, is a suitable intracellular for the first time Cytokine staining for flow cytometry has been described. The problem of too low intracellular cytokine concentrations were overcome by the fact that during the restimulation of the mononuclear cells by combined treatment with Phorbot 12-myristat 13-acetate and ionomycin the protein transport inhibitor Monensin was added. With this pretreatment, the intracellular increase Cytokine levels by accumulation to those values that require detection Allow via flow cytometry.

Durch Jung, T. et al.: Interleukin-13 is produced by activated human CD45RA+ and CD45RO+ T cells: modulation by interleukin-4 and interleukin-12, in Eur. J. ImmunoL 1996, 26, S. 571-207, ist die Verwendung von Brefeldin A als Protein­ transportinhibitor bekannt, eine Substanz, die den intrazellulären Proteintransport noch wirksamer hemmt und dabei eine geringere Zytotoxizität als Monensin zeigt. Nach Prussin, C. und Metcalfe, D. D.: Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies, in J. Immunol. Methods 1995, 188, S. 117-128, erweisen sich direkt mit Fluorochromen konjugier­ te monoklonale Zytokin-Antikörper bei der intrazetlulären Zytokinfärbung für die Durchflußzytometrie als am besten geeignet. Auf Grund der Undurchlässigkeit der Zellmembranen für solche Antikörper müssen die restimulierten Zellen vor der Anfärbung in einem kritischen Verfahrensschritt fixiert und permeabilisiert werden. Während die bekannten Formaldehyd- und Paraformaldehydmethoden bei der Zellfixierung sehr zuverlässig sind, resultieren die erheblichen Probleme bei den meisten der bisher angewendeten intrazellulären Protokolle aus der Verwendung Saponin enthaltender Permeabilisierunsreagenzien.By Jung, T. et al .: Interleukin-13 is produced by activated human CD45RA + and CD45RO + T cells: modulation by interleukin-4 and interleukin-12, in Eur. J. ImmunoL 1996, 26, pp. 571-207 , Brefeldin A is known to be used as a protein transport inhibitor, a substance that inhibits intracellular protein transport even more effectively and shows a lower cytotoxicity than monensin. According to Prussin, C. and Metcalfe, DD: Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies, in J. Immunol. Methods 1995, 188, pp. 117-128, prove to be the most suitable for fluorocroms conjugated monoclonal cytokine antibodies in intracetlular cytokine staining for flow cytometry. Due to the impermeability of the cell membranes to such antibodies, the restimulated cells must be fixed and permeabilized in a critical process step before staining. While the known formaldehyde and paraformaldehyde methods are very reliable in cell fixation, the considerable problems with most of the intracellular protocols used hitherto result from the use of permeabilization reagents containing saponin.

Nach Fast Immune Cytokine System, Applikation von Becton Dickinson Immunocytometry Systems, 1996, S. 5, wird Saponin aus Pflanzen gewonnen und führt auf Grund seiner heterogenen Zusammensetzung und der Verwendung unterschiedlicher Ausgangsmaterialien zu einer erbeblichen Variabilität bei der intrazellulären Zytokinfärbung.According to Fast Immune Cytokine System, application by Becton Dickinson Immunocytometry Systems, 1996, p. 5, saponin is obtained from plants and leads due to its heterogeneous composition and use  different starting materials to a considerable variability in intracellular cytokine staining.

Durch IC ScreenTM lntracellular Staining Kit, Applikation von BioSource International, Inc., S. 4-19, sind Kits zur intrazellulären Zytokinfärbung bekannt, die deshalb eine Permeabilisierungskontrolle zur Überprüfung des Saponin-Effektes enthalten.IC Screen ™ Intracellular Staining Kit, application from BioSource International, Inc., pp. 4-19, discloses kits for intracellular cytokine staining, which therefore contain a permeabilization control to check the saponin effect.

Dieses bedeutet, daß bei nachgewiesener erfolgloser oder partieller Saponin-Perme­ abilisierung mit diesem Test-Kit zum intrazellulären Zytokinnachweis erhobene Befunde nicht verwertbar sind. Darüber hinaus ist die Membranpermeabilisierung mit Saponin reversibel, so daß dieses Reagens zusätzlich zum eigentlichen Perme­ abilisierungsschritt bei der nachfolgenden Inkubation der Zellen mit monoklonalen Zytokin-Antikörpern und den Waschschritten zur Eliminierung nicht gebundener Antikörper ebenfalls zugegen sein muß. Ein weiterer Nachteil nahezu aller bekannten Verfahren besteht darin, daß die Fixierung und Permeabilisierung nacheinander in zwei getrennten Arbeitsschritten durchgeführt werden.This means that if proven unsuccessful or partial saponin perme abilization with this test kit for intracellular cytokine detection Findings cannot be used. In addition, membrane permeabilization is included Saponin reversible, so that this reagent in addition to the actual perme Abilization step in the subsequent incubation of the cells with monoclonal Cytokine antibodies and the washing steps to eliminate unbound Antibody must also be present. Another disadvantage of almost everyone known method is that the fixation and permeabilization be carried out successively in two separate steps.

Als geeignete Produkte zur Fixierung und Permeabilisierung nach dem Zweistufen­ verfahren sind Fix & Perm®, Applikation der Caltag Laboratories, Inc., 1998, S. 12; Cytodetect Reagent E und F, Cytodetect™ Kit, Applikation von lmmuno Quality Products, 1997, S. 1-11; IC-Fix™ und IC-PERM™ der Bio-Source GmbH; IntraStain, Applikation der DAKO Diagnostika GmbH, 1998, S. 1-4; sowie lntra- Prep™ Permeabilization Reagent, Applikation der Coulter Immunotech Inc., 1998, S. 1-4 bekannt geworden.As suitable products for fixation and permeabilization after the two-stage Fix & Perm®, application by Caltag Laboratories, Inc., 1998, p. 12; Cytodetect Reagent E and F, Cytodetect ™ Kit, application by lmmuno Quality Products, 1997, pp. 1-11; IC-Fix ™ and IC-PERM ™ from Bio-Source GmbH; IntraStain, application by DAKO Diagnostika GmbH, 1998, pp. 1-4; as well as intra- Prep ™ Permeabilization Reagent, application by Coulter Immunotech Inc., 1998, Pp. 1-4 became known.

Das einzige Reagens, mit dem bisher Fixierung und Permeabilisierung beim intrazellulären Zytokinnachweis in einem Schritt durchgeführt worden sind, ist das Kit Cytofix/Cytoperm™, welches in Research Products Catalog von Pharingern, 1998, S. 744-749 beschrieben ist. Die Verwendung von Cytofix/Cytoperm™ ist jedoch an die Bedingung geknüpft, daß die nachfolgende Anfärbung der intrazellulären Zytokine in dem zur Aufrechterhaltung der Membranpermeabilisierung mitgelieferten Perm/Wash™-Puffer erfolgt. Es ist erforderlich, die Anfärbung der Zelloberflächen­ marker in einem zusätzlichen Arbeitsschritt vor der Umsetzung mit Cytofix/Cytoperm™ vorzunehmen.The only reagent with which fixation and permeabilization have been used so far intracellular cytokine detection in one step is the kit Cytofix / Cytoperm ™, which is described in Research Products Catalog by Pharingern, 1998, Pp. 744-749. However, the use of Cytofix / Cytoperm ™ is on the condition that the subsequent staining of the intracellular Cytokines in the one supplied to maintain membrane permeabilization Perm / Wash ™ buffer is made. It is necessary to stain the cell surfaces marker in an additional step before implementation Cytofix / Cytoperm ™.

Bei allen bisher bekannten Fixierungs- und Permeabilisierunsverfahren für den intrazellulären Zytokinnachweis wird in der Regel die Bindung der Zelloberflächen- Antiköper beeinflußt, so daß sich insgesamt vier Arbeitsschritte in folgender Reihenfolge ergeben: Fluoreszenzmarkierung der Zelloberflächenantigene mit Fluorochrom-konjugierten monoklonalen Antikörpern, Zellfixierung, Zellpermeabili­ sierung und Anfärbung der intrazellulären Zytokine mit Fluorochrom-konjugierten monoklonalen Zytokin-Antikörpern.In all previously known fixation and permeabilization processes for the intracellular cytokine detection is usually the binding of the cell surface Antibodies influenced, so that there are a total of four steps in the following Order results: fluorescence labeling of the cell surface antigens with  Fluorochrome-conjugated monoclonal antibodies, cell fixation, cell permeabili staining and staining of the intracellular cytokines with fluorochrome-conjugated monoclonal cytokine antibodies.

Die Erhebung diagnostisch relevanter Befunde setzt die Bestimmung mehrerer proinflammatorischer und antünflamatorischer Zytokine voraus, die sowohl in der Population der CD4+ T-Helferzellen als auch in den CD8+ zytotoxischen/T- Suppressorzellen erfolgen sollte. Bei der bisherigen Verfahrensweise müssen die vom Probanden oder vom Versuchstier gewonnenen Zellproben schon nach der Restimulation auf eine Vielzahl von Testansätzen verteilt werden, die in den nachfolgenden Schritten einzeln zu handhaben sind. Daraus ergeben sich ein entsprechend hoher Arbeitsaufwand und ein großer Reagenzienverbrauch bei der Fixierung und Permeabilisierung.The collection of diagnostically relevant findings requires the determination of several pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines, which should be carried out both in the population of the CD4 + T helper cells and in the CD8 + cytotoxic / T suppressor cells. With the previous procedure, the cell samples obtained from the test subject or from the test animal have to be distributed to a large number of test batches after the restimulation, which are to be handled individually in the subsequent steps. This results in a correspondingly high workload and a large consumption of reagents in the fixing and permeabilization.

Die Aufgabe der Erfindung ist ein effektives Verfahren, mit dem unter der Anwendung der Durchflußzytometrie in den Immunzellen pathogenetisch und diagnostisch relevanter Zytokine auf Einzelzellebene qualitativ und quantitativ nachgewiesen werden können. Durch einen wesentlich verringerten technischen Aufwand, einer höheren Testempfindlichkeit im Vergleich zu den bekannten Verfahren und eine dadurch bedingte verbesserte Diskriminierung zwischen Zytokin­ positiven und Zytokin-negativen Immunzellen soll erreicht werden, daß das erfindungsgemäße Verfahren zum intrazellulären Zytokinnachweis als Routine- Labormethode bei der Immundiagnostik und beim Immunmonitoring Anwendung findet.The object of the invention is an effective method with which Use of flow cytometry in the immune cells and pathogenetic diagnostically relevant cytokines at the single cell level qualitatively and quantitatively can be demonstrated. Due to a significantly reduced technical Effort, a higher test sensitivity compared to the known Procedures and the resulting improved discrimination between cytokines positive and cytokine negative immune cells should be achieved that the Method according to the invention for intracellular cytokine detection as a routine Laboratory method in immunodiagnostics and immune monitoring application finds.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß zur durchflußzytometrischen Analyse Zytokin-produzierender Immunzellen aus dem Probengut des peripheren Blutes, anderer Körperflüssigkeiten und der Organe und Gewebe sowohl die Zellfixierung und Permeabilisierung als auch die Anfärbung von Zellober­ flächenantigenen und intrazellulären Zytokinen unter Verwendung Fluorochrom­ konjugierter monoklonaler Antikörper in zwei aufeinander folgenden Einschritt­ verfahren erfolgen, wobei die Zellfixierung und Permeabilisierung sowie die nachfolgende Fluoreszenzmarkierung von Zelloberflächenantigenen und intrazellulären Zytokinen jeweils in einem einzigen Verfahrensschritt durchführbar sind.According to the invention the object is achieved in that for flow cytometric Analysis of cytokine-producing immune cells from the peripheral sample Blood, other body fluids and the organs and tissues both the Cell fixation and permeabilization as well as the staining of cell top surface antigenic and intracellular cytokines using fluorochrome conjugated monoclonal antibody in two consecutive one step procedures take place, the cell fixation and permeabilization as well as the subsequent fluorescent labeling of cell surface antigens and intracellular cytokines can be carried out in a single process step are.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht im einzelnen darin, daß zunächst durch Dichtegradientenzentrifugation über Histopaque-1077, FicoII/Urografin oder CellSep Lymphocytes aus dem Probengut die mononukleären Zeilen nach bekannten Standardverfahren gewonnen werden. Die mononukleären Zellen werden anschließend in Kulturmedium RPMI 1640 mit 10% fetalem Kälberserum durch Behandlung mit dem Proteinkinase C-Liganden Phorbol 12-myristat 13-azetat und dem Antibiotikum Ionomycin in Gegenwart des Proteintransport-Inhibitors Brefeldin A über 4 Stunden unter Kulturbedingungen restimuliert. Die dabei verwendeten Substanzen und Konzentrationen sind mit denen bekannter Verfahren identisch. Die Nachteile bei der bekannten Verfahrenstechnik zum intrazellulären Zytokinnachweis werden erfindungsgemäß durch die Anwendung von ORTHO PermeaFix™ bei der Fixierung und Permeabilisierung der restimulierten mononukleären Zellen ausgeschlossen.The method according to the invention consists in the fact that initially by Density gradient centrifugation via Histopaque-1077, FicoII / Urografin or CellSep  Lymphocytes from the sample follow the known mononuclear lines Standard procedures can be obtained. The mononuclear cells will then in culture medium RPMI 1640 with 10% fetal calf serum Treatment with the protein kinase C ligand phorbol 12-myristat 13-acetate and the antibiotic ionomycin in the presence of the protein transport inhibitor brefeldin A. restimulated over 4 hours under culture conditions. The used here Substances and concentrations are identical to those of known methods. The Disadvantages with the known process technology for intracellular cytokine detection are according to the invention by using ORTHO PermeaFix ™ in the Fixation and permeabilization of the restimulated mononuclear cells locked out.

Erfindungsgemäß erfolgt bei der gesamten Probe der restmulierten Zelle mit dem ORTHO PermeaFix™-Reagens die Fixierung und Permeabilisierung in einem Einschrittverfahren, wobei dieses Reagens die Expression lymphozytärer Oberflächenmarker wie CD2, CD3, CD4, CD8, CD16 und CD19 nicht beeinträchtigt. Deshalb ist es möglich, nach Behandlung der Zellen mit ORTHO PermeaFix™ Zelloberflächenmarker und intrazelluläre Antigene ebenfalls in einem Einschritt­ verfahren anzufärben. Dies führt zu einer höheren Empfindlichkeit des Tests, da bei vorgeschalteter Oberflächenmarkierung die Zytokine auf Grund der reversiblen Wirkung des Proteintransportinhibitors Brefeldin A teilweise aus den Zellen austreten.According to the invention, the rest of the mulched cell is used for the entire sample ORTHO PermeaFix ™ reagent fixation and permeabilization in one One step method, this reagent expressing lymphocytic expression Surface markers such as CD2, CD3, CD4, CD8, CD16 and CD19 are not affected. It is therefore possible to treat the cells with ORTHO PermeaFix ™ Cell surface markers and intracellular antigens also in one step staining procedure. This leads to a higher sensitivity of the test since upstream surface marking the cytokines due to the reversible Effect of the protein transport inhibitor brefeldin A partially from the cells emerge.

Unvollständige Permeabilisierungen, die bei der Verwendung konventioneller Saponin enthaltender Reagenzien beobachtet werden und in bekannter Weise zum Abfall der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) bei der durchflußzytometrischen Zytokinbestimmung führen können, treten durch Behandlung der Zellen mit ORTHO PermeaFix™ nicht auf. Nach der Umsetzung mit ORTHO PermeaFix™ werden die Zellen gewaschen, in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit 1% Rinderserum­ albumin und 10% Dimethylsulfoxid eingefroren und bei -70°C gelagert. Verfahrensgemäß muß die restimulierte mononukleäre Zellprobe erst nach raschem Auftauen bei 37°C auf die einzelnen Testansätze verteilt werden. In diesen Einzelproben lassen sich Zelloberflächenantigene und intrazelluläre Zytokine ebenfalls in einem Einschrittverfahren mit konjugierten monoklonalen Antikörpern anfärben, wobei das zur Permeabilisierung verwendete Reagens nicht zugegen sein muß. Da ORTHO PermeaFix™ die Antikörperbindung an lymphozytären Oberflächenmarkem wie CD3, CD4 und CD8 nicht beeinträchtigt, wird mit diesem Reagens die aufwendige separate Markierung der Oberflächenantigene vor der Fixierung oder Permeabilisierung umgangen. Bei gleichzeitiger Senkung des Reagenzien-Verbrauchs entfällt dadurch die vorzeitige Aufteilung des Untersuchungsgutes auf die einzeln zu handhabenden Testansätze. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Zellproben sind zur durchfluß­ zytometrischen Bestimmung Zytokin-produzierender Zellen geeignet. Bei erhöhter Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit wird verfahrensgemäß der technische Aufwand beim intrazellulären Zytokinnachweis soweit verringert, daß das Verfahren als Routine-Labormethode bei der Immundiagnostik und beim Immunmonitoring angewendbar ist.Incomplete permeabilizations when using conventional Reagents containing saponin are observed and used in a known manner Decrease in mean fluorescence intensity (MFI) in flow cytometric Cytokine determination can occur by treating the cells with ORTHO PermeaFix ™ does not open. After implementation with ORTHO PermeaFix ™, the Washed cells in phosphate buffered saline with 1% bovine serum frozen albumin and 10% dimethyl sulfoxide and stored at -70 ° C. According to the method, the restimulated mononuclear cell sample only needs to be rapidly Thaw at 37 ° C on the individual test batches. In these Individual samples can be taken of cell surface antigens and intracellular cytokines also in a one-step process with conjugated monoclonal antibodies stain with the reagent used for permeabilization not present got to. Because ORTHO PermeaFix ™ antibody binding to lymphocytic  Surface markers such as CD3, CD4 and CD8 are not affected by this Reagent the complex separate labeling of the surface antigens before Bypassed fixation or permeabilization. While lowering the Reagent consumption eliminates the premature division of the Good to be examined for the test approaches to be handled individually. The after Cell samples treated according to the method of the invention are for flow cytometric determination of cytokine-producing cells. With increased According to the method, sensitivity and reliability become the technical effort in intracellular cytokine detection reduced so far that the method as Routine laboratory method in immunodiagnostics and immune monitoring is applicable.

Nachstehend soll das erfindungsgemäße Verfahren zum intrazellulären Zytokinnach­ weis anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert werden.The method according to the invention for intracellular cytokine is as follows be explained in more detail using an exemplary embodiment.

In dem Beispiel wird die Bestimmung der Tumor Nekrose Faktor alpha (TNF-α), lnterleukin(IL)-2, Interferon gamma (IFN-γ) und IL-4 produzierenden CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten im peripheren Blut eines Probanden mit Autoimmun-Typ 1- Diabetes beschrieben.In the example, the determination of tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin (IL) -2, interferon gamma (IFN-γ) and IL-4 producing CD4 + and CD8 + T lymphocytes in peripheral blood Subjects with autoimmune type 1 diabetes are described.

In konischen 15 ml Zentrifugenröhrchen werden zunächst 3 ml einer 1 : 1 mit Hank'scher Lösung verdünnten Blutprobe über 3 ml Histopaque-1077 in einer Zeitdauer von 30 Minuten mit 400 xg zentrifugiert und die mononukleären Zellen PBMC aus der lnterphase gewonnen.In conical 15 ml centrifuge tubes, 3 ml of a 1: 1 are first mixed with Hank's solution diluted blood sample over 3 ml Histopaque-1077 in one Centrifuged for 30 minutes at 400 xg and the mononuclear cells PBMC obtained from the interphase.

Nach dem Waschen werden die mononukleären Zellen PBMC in Kulturmedium RPMI 1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FCS), 100 U/ml Penicillin und 100 µgg/ml Streptomycin in einer Konzentration von 2 × 106 Zellen/ml resuspendiert. In die Vertiefungen einer 24-Lochplatte in Flachbodenausführung werden jeweils 1.5 × 106 Zellen in 750 µl komplettem Kulturmedium pipettiert und nochmals 750 µl Kulturmedium mit der doppelten Konzentration der zur Restimulation der mononukleären Zellen PBMC verwendeten Substanzen zugegeben. Durch Mischen der beiden 750 µl Aliquote werden die Endkonzentrationen von 10 ng/ml Phorbol 12-myristat 13-azetat, 1 µg/ml Ionomycin und 10 µg/ml Brefeldin A erreicht. Ein parallel mitgeführter Kontrollansatz enthält 10 µg/ml Brefeldin A ohne Phorbol 12- myristat 13-azetat und Ionomycin. After washing, the mononuclear cells PBMC are resuspended in culture medium RPMI 1640 with 10% fetal calf serum (FCS), 100 U / ml penicillin and 100 μgg / ml streptomycin in a concentration of 2 × 10 6 cells / ml. 1.5 × 10 6 cells in 750 μl of complete culture medium are pipetted into the wells of a 24-hole plate with a flat bottom, and another 750 μl of culture medium with twice the concentration of the substances used for restimulating the mononuclear cells PBMC are added. The final concentrations of 10 ng / ml phorbol 12-myristat 13-acetate, 1 µg / ml ionomycin and 10 µg / ml Brefeldin A are reached by mixing the two 750 µl aliquots. A control batch carried in parallel contains 10 µg / ml Brefeldin A without Phorbol 12-myristat 13-acetate and ionomycin.

Nach 4-stündiger Restimulation unter Kulturbedingungen bei 37°C und 5% CO2- Atmosphäre werden die Zellen in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt, zweimal in Kulturmedium RPMI 1640 mit 10% fetalem Kälberserum gewaschen und in 50 µl Kulturmedium RPMI 1640 resuspendiert.After 4 hours of restimulation under culture conditions at 37 ° C. and 5% CO 2 atmosphere, the cells are transferred to 1.5 ml Eppendorf reaction vessels, washed twice in culture medium RPMI 1640 with 10% fetal calf serum and resuspended in 50 μl culture medium RPMI 1640 .

Zur Fixierung und Permeabilisierung werden die ZeHproben in 1 ml ORTHO- PermeaFix™ aufgenommen, gründlich durchmischt und über 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.To fixate and permeabilize the ZeH samples in 1 ml ORTHO- PermeaFix ™ absorbed, mixed thoroughly and added over 40 minutes Incubated at room temperature.

Nach dem Waschen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 5% letalem Kälberserum (FCS), 1,5% Rinderserumalbumin und 0,0055% EDTA (PBS- Waschpuffer) sind die Zellproben in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit 1,0% Rinderserumalbumin und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) eingefroren und bei -70°C lagerfähig.After washing with phosphate buffered saline (PBS) with 5% lethal Calf Serum (FCS), 1.5% Bovine Serum Albumin and 0.0055% EDTA (PBS- Wash buffer) are the cell samples in phosphate-buffered saline with 1.0% Bovine serum albumin and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) frozen and at -70 ° C storable.

Nach raschem Auftauen bei 37°C im Wasserbad werden die Zellproben in PBS- Waschpuffer gewaschen und bei der Überführung in 1 ml Micronic-Röhrchen auf die einzelnen Testansätze verteilt. Zu jeweils 5 × 104 Zellen in 50 µl PBS-Waschpuffer werden 5 µl des 1 : 10 verdünnten PE-konjugierten anti-Human IFN-γ-Antikörpers sowie 2,5 µl FITC-konjugierter anti-CD4- oder 2,5 µl FITC-markierter anti-CD8- Antikörper gegeben und über 30 Minuten bei 4°C im Dunkeln inkubiert.After quick thawing at 37 ° C in a water bath, the cell samples are washed in PBS wash buffer and transferred to the individual test batches when transferred to 1 ml Micronic tubes. 5 μl of the 1:10 diluted PE-conjugated anti-human IFN-γ antibody and 2.5 μl of FITC-conjugated anti-CD4 or 2.5 μl of FITC are added to 5 × 10 4 cells in 50 μl of PBS wash buffer -labelled anti-CD8 antibody and incubated for 30 minutes at 4 ° C in the dark.

Nach Entfernung nichtgebundener Fluorochrom-markierter Antikörper durch zweimaliges Waschen werden die Zellen zur Analyse, die vorzugsweise am COULTER EPiCS XL-Durchflußzytometer erfolgt, in 350 µl PBS-Waschpuffer resuspendiert und in 12 × 75 mm Probenröhrchen überführt.After removal of unbound fluorochrome-labeled antibodies by Wash the cells twice for analysis, preferably on COULTER EPiCS XL flow cytometer is done in 350 µl PBS wash buffer resuspended and transferred to 12 × 75 mm sample tubes.

Zur Analyse TNF-α-, IL-2-, IFN-γ- und IL-4- produzierender Zellen in den CD4+- und CD8+ T-Lymphozyten-Populationen haben sich folgende Geräteeinstellungen als geeignet erwiesen:
For the analysis of TNF-α, IL-2, IFN-γ and IL-4 producing cells in the CD4 + and CD8 + T lymphocyte populations, the following device settings have proven to be suitable:

Als Kontrollen eignen sich mit Phorbol 12-myristat 13-azetat und Ionomycin in Gegenwart von Brefeldin A stimulierte Zellen, die
Cells stimulated with phorbol 12-myristat 13-acetate and ionomycin in the presence of Brefeldin A are suitable as controls

  • a) entweder mit PE- und FITC-konjugierten isotypischen Kontrollantikörpern odera) either with PE and FITC conjugated isotypic control antibodies or
  • b) vor der Anfärbung mit PE-markiertem Zytokin-Antikörper mit einem 20-fachen Überschuß des gleichen nicht markierten Zytokin-Antiköpers vorinkubiert wurden. Die Ergebnisse dieser Kontrollen entsprechen der intrazellulären Zytokin-Färbung bei weiter monukleären Kontroll-Zellen, dieb) 20 times before staining with PE-labeled cytokine antibody Excess of the same unlabelled cytokine antibody were preincubated. The results of these controls correspond to the intracellular cytokine staining in the case of further monuclear control cells which
  • c) in Gegenwart von Brefeldin A ohne Zusatz von Phorbol 12-myristat 13-azetat und Ionomycin kultiviert wurden.c) in the presence of Brefeldin A without the addition of phorbol 12-myristat 13-acetate and Ionomycin were cultured.

In Analogie zu diesem erläuterten Beispiel können nach dem gleichen erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung PE- und FITC-markierter Zytokin- Antikörper bei gleichzeitiger Anfärbung der Zelloberflächenmarker mit PE-Cy5- konjugierten monoklonalen Antikörpern zwei der vorgenannten Zytokine pro CD4+- bzw. pro CD8+-T-Zelle nachgewiesen werden.In analogy to this illustrated example, two of the aforementioned cytokines per CD4 + - or per CD8 + - T cell can be detected.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit umfaßt den Nachweis Zytokin-produzierender Zellen in spezifischen Lymphozyten(sub)populationen, wie z. B. den CD4+ Gedächtniszellen, wobei neben intrazellulärem Zytokin zwei CD-Zellober­ flächenmarker, in diesem Fall CD4 und CD45RO, anzufärben sind.Another application includes the detection of cytokine-producing cells in specific lymphocyte (sub) populations, such as. B. the CD4 + memory cells, in addition to intracellular cytokine two CD cell surface markers, in this case CD4 and CD45RO, to be stained.

Claims (5)

1. Verfahren zur Bestimmung intrazellulärer Zytokine der Immunzellen in biologischen Körperflüssigkeiten und Organ- oder Gewebeproben mittels Durch­ flußzytometrie, dadurch gekennzeichnet, daß in vitro nach Restimulation der mononukleären Zellenfraktion, die durch Dichtegradientenzentrifugation gewon­ nen werden können, vor der durchflußzytometrischen Analyse zuerst die Fixierung und Permeabilisierung der Immunzellen unter Verwendung von ORTHO PermeaFix™-Reagens und daran anschließend die Anfärbung von Zelloberflächenantigen und intrazellulärem Zytokin mit Farbstoff-konjugierten monoklonalen Antikörpern erfolgen.1. A method for the determination of intracellular cytokines of the immune cells in biological body fluids and organ or tissue samples by means of flow cytometry, characterized in that in vitro after restimulation of the mononuclear cell fraction, which can be obtained by density gradient centrifugation, the fixation and permeabilization first before the flow cytometric analysis of the immune cells using ORTHO PermeaFix ™ reagent and then the staining of cell surface antigen and intracellular cytokine with dye-conjugated monoclonal antibodies. 2. Verfahren zur Bestimmung intrazellulärer Zytokine der Immunzellen in biologischen Körperflüssigkeiten und Organ- oder Gewebeproben mittels Durchflußzytometrie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl Fixierung und Permeabilisierung der Immunzellen unter Verwendung von ORTHO PermeaFix™-Reagens als auch die Anfärbung von Zelloberflächen­ antigen und intrazellulärem Zytokin mit Farbstoff-konjugierten monoklonalen Antikörpern in einem Einschrittverfahren erfolgen können.2. Method for the determination of intracellular cytokines of the immune cells in biological body fluids and organ or tissue samples Flow cytometry according to claim 1, characterized in that both Fixation and permeabilization of the immune cells using ORTHO PermeaFix ™ reagents as well as the staining of cell surfaces antigenic and intracellular cytokine with dye-conjugated monoclonal Antibodies can be done in a one-step process. 3. Verfahren zur Bestimmung intrazellulärer Zytokine der Immunzellen in biologischen Körperflüssigkeiten und Organ- oder Gewebeproben mittels Durchflußzytometrie nach Anspruch 1 und 2 gekennzeichnet dadurch, daß die mit ORTHO PermeaFix™ fixierten und permeabilisierten mononuklearen Immun­ zellen in einer Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit Rinderserumalbumin (RSA) und Dimethylsulfoxid (DMSO) oder anderen geeigneten Medien eingefroren und bei etwa -70°C oder -193°C lagerbar sind und erst unmittelbar vor der durchflußzytometrischen Analyse nach dem Auftauen mit Farbstoff­ konjugierten monoklonalen Antikörpern gegen Zelloberflächenantigen und intrazelluläres Zytokin in einem Einschrittverfahren umgesetzt werden.3. Method for the determination of intracellular cytokines of the immune cells in biological body fluids and organ or tissue samples Flow cytometry according to claim 1 and 2, characterized in that the with ORTHO PermeaFix ™ fixed and permeabilized mononuclear immune cells in a phosphate buffered saline with bovine serum albumin (RSA) and dimethyl sulfoxide (DMSO) or other suitable media frozen and storable at around -70 ° C or -193 ° C and only immediately before flow cytometric analysis after thawing with dye conjugated monoclonal antibodies against cell surface antigen and intracellular cytokine can be implemented in a one-step process. 4. Verfahren zur Bestimmung intrazellulärer Zytokine der Immunzellen in biologischen Körperflüssigkeiten und Organ- oder Gewebeproben mittels Durchflußzytometrie nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung über eine adaptierte Vollblutmethode unter Verwendung von ORTHO PermeaFix™ als Fixierungs-, Permeabilisierungs- und Erythrozyten- Lyse-Reagens erfolgt.4. Procedure for the determination of intracellular cytokines of the immune cells in biological body fluids and organ or tissue samples Flow cytometry according to claim 1 and 3, characterized in that the Determination via an adapted whole blood method using  ORTHO PermeaFix ™ as fixation, permeabilization and erythrocyte Lysis reagent takes place. 5. Verfahren zur Bestimmung intrazellulärer Zytokine der Immunzellen in biologischen Körperflüssigkeiten und Organ- oder Gewebeproben mittels Durchflußzytometrie nach Anspruch 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß es zum Nachweis von Monokinen und Lymphokinen in Monozyten- bzw. Lymphozyten(sub)populationen und auch bei anderen Species anwendbar ist.5. Method for the determination of intracellular cytokines of the immune cells in biological body fluids and organ or tissue samples Flow cytometry according to claim 1 and 4, characterized in that it for the detection of monokines and lymphokines in monocyte or Lymphocyte (sub) populations and also applicable to other species.
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