DE10155518A1 - Detection of apoptosis induction, useful for testing cytostatic agents, comprises staining cells with a fluorochrome compound and measuring the cells by flow cytometry while stimulating the fluorochrome compound - Google Patents

Detection of apoptosis induction, useful for testing cytostatic agents, comprises staining cells with a fluorochrome compound and measuring the cells by flow cytometry while stimulating the fluorochrome compound

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DE10155518A1 DE2001155518 DE10155518A DE10155518A1 DE 10155518 A1 DE10155518 A1 DE 10155518A1 DE 2001155518 DE2001155518 DE 2001155518 DE 10155518 A DE10155518 A DE 10155518A DE 10155518 A1 DE10155518 A1 DE 10155518A1
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Abstract

Detection of apoptosis induction, comprising: (a) fixing cells to be studied; (b) permeabilizing the outer membrane to maintain organelle structure; (c) staining cells with a fluorochrome compound; (d) measuring individual cells by flow cytometry while stimulating the compound; and (e) determining the fluorescent strength of the cells, is new. Detection of apoptosis induction by measuring the release of substances from cell organelles mitochondria and/or endoplasmic reticulum by flow cytometry, comprising: (a) fixing the cells to be studied; (b) permeabilizing the outer membrane to maintain organelle structure; (c) staining the cells with fluorochrome compound that binds specifically to substance(s) to be detected in mitochondria and/or endoplasmic reticulum; (d) measuring individual cells by flow cytometry while stimulating the compound; and (e) determining the fluorescent strength of the cells, is new.

Description

Die vorliegende Erfindung ist auf einen gezielten Nachweis der Freisetzung von Substanzen aus Organellen von Zellen mittels Fluoreszenzdurchflußzytometrie gerichtet. The present invention is based on a targeted detection of Release of substances from organelles by means of cells Fluorescence flow cytometry directed.

Durchflußzytometrie ist ein Verfahren, mit dessen Hilfe die Fluoreszenz einzelner, mit einem Fluorochrom markierter Zellen gemessen werden kann. Ein Durchflußzytometer umfasst einen Vorratsbehälter mit einer Zellsuspension markierter Zellen, eine Fallstrecke, die ein dünner Tröpfchenfaden, der aus einer Öffnung des Vorratsbehälters ausfließt, durchqueren muß, einen Laser, welcher den Tröpfchenfaden bestrahlt, sowie einen oder mehrere Meßkanäle, welche die Emissions-Fluoreszenz des Tröpfchenfadens messen können. Die Herstellung des Tröpfchenfadens ist hierbei kritisch, da erreicht werden soll, daß sich einzelne Tröpfchen bilden, die jeweils nur eine Zelle enthalten. Auf diese Weise kann erreicht werden, daß der Laser auch nur jeweils eine Zelle bestrahlt, so daß von den Meßkanälen die Fluoreszenz einer einzelnen Zelle gemessen wird. Eine angeschlossene Datenverarbeitungsanlage speichert die einzelnen Messungen und kann eine statistische Auswertung durchführen. Flow cytometry is a procedure that helps the Fluorescence of individual cells marked with a fluorochrome can be measured. A flow cytometer includes one Storage container with a cell suspension of marked cells, a falling distance, which is a thin droplet of droplets made up of a Opening of the reservoir flows out, has to cross one Laser, which irradiates the droplet thread, as well as one or several measuring channels, which the emission fluorescence of the Droplet thread can measure. The production of the Droplet thread is critical here because that individual droplets form, each only one cell contain. In this way it can be achieved that the laser irradiated only one cell at a time, so that of the Measurement channels measured the fluorescence of a single cell becomes. A connected data processing system saves the individual measurements and can do a statistical evaluation carry out.

Ein Prinzip der Durchflußzytometrie ist die Messung relativer Fluoreszenzen mittels spannungsgesteuerter Photomultiplier- Röhren (PMTs) als Meßkanäle. Dabei wird das Fluoreszenzsignal auf einer logarithmischen Skala von 100 (Beginn der 1. Dekade) bis 104 (Ende der 4. Dekade) dargestellt. Eine Kalibrierung auf diesen Wertebereich erfolgt anhand von negativen und positiven Kontrollstandards, welche im einen Fall nur Hintergrundfluoreszenz und im anderen Fall die maximal erwartbare, zu bestimmende Fluoreszenz aufweisen sollen. Die dabei verwendeten PMT-Spannungen sind vom eingesetzten Durchflußzytometer abhängig und werden anhand der jeweils verwendeten Kontrollstandards eingestellt. One principle of flow cytometry is the measurement of relative fluorescence using voltage-controlled photomultiplier tubes (PMTs) as measuring channels. The fluorescence signal is displayed on a logarithmic scale from 100 (beginning of the 1st decade) to 10 4 (end of the 4th decade). A calibration to this range of values takes place on the basis of negative and positive control standards, which in one case only have background fluorescence and in the other case the maximum expected fluorescence to be determined. The PMT voltages used depend on the flow cytometer used and are set based on the control standards used.

Zusätzlich kann eine elektronische Kompensation der Messwerte vorgenommen werden. Die elektronische Kompensation ist ein Standardverfahren in der Mehrfarbendurchflußzytometrie. Werden Zellen mit zwei oder mehr Fluorochromen markiert, entsteht manchmal das Problem, daß aufgrund der Überlappung der Emissions-Fluoreszenzspektren bei starken Fluoreszenzsignalen eine Einstrahlung in den benachbarten Fluoreszenzkanal auftritt und dort zu einem falsch positiven Signal führt. Dieses wird im Rahmen der elektronischen Kompensation durch elektronische Subtraktion für jedes einzelne Meßereignis korrigiert, indem von der falsch positiven Fluoreszenz ein Prozentsatz der Ausgangsfluoreszenz abgezogen wird. In addition, electronic compensation of the measured values be made. Electronic compensation is on Standard procedure in multicolor flow cytometry. Become Cells marked with two or more fluorochromes are formed sometimes the problem that due to the overlap of the Emission fluorescence spectra with strong fluorescence signals radiation into the neighboring fluorescence channel occurs and there leads to a false positive signal. This is done in the context of electronic compensation electronic subtraction for each individual measurement event corrected by the false positive fluorescence Percentage of the starting fluorescence is subtracted.

Apoptose ist ein biologischer Prozeß, bei dem eine Kette von genetisch kontrollierten Ereignissen in Zellen ausgelöst wird, die den gesteuerten Tod und die effiziente Beseitigung der betroffenen Zellen bewirken. Ein Nachweis von Apoptose und Apoptose-regulierender Moleküle ist entscheidend für Diagnose und Therapie verschiedener Erkrankungen, wie Autoimmunerkrankungen, Virusinfektionen, neurodegenerative Erkrankungen, Knochenmarkinsuffizienzsyndromen, Leukämien und soliden Tumoren. Apoptosis is a biological process in which a chain of genetically controlled events are triggered in cells which controlled death and the efficient elimination of affected cells. Evidence of apoptosis and Apoptosis-regulating molecules are crucial for diagnosis and therapy of various diseases, such as Autoimmune diseases, viral infections, neurodegenerative Diseases, bone marrow insufficiency, leukemia and solid Tumors.

Im Rahmen des Apoptose-Nachweises geht es häufig um die Testung potentiell wirksamer Zytostatika. Zytostatika induzieren Apoptose, indem sie wesentliche Elemente des Apoptoseprogramms aktivieren. Die Effektivität von Zytostatika hängt davon ab, in welchem Ausmaß die molekularen Apoptoseregulatoren aktiviert werden, insbesondere, in welchem Ausmaß Mitochondrien zur Freisetzung von pro-apoptotischen Signalmolekülen aktiviert werden. Insbesondere die Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien von Zellen, die apoptotisch werden, ist ein wichtiger Schritt in der Signalabfolge des Zelltodprogramms, die bei den meisten Formen von Zelltod beteiligt ist. Apoptosis detection is often about Testing potentially effective cytostatics. cytostatics induce apoptosis by showing essential elements of the Activate the apoptosis program. The effectiveness of cytostatics depends on the extent to which the molecular Apoptosis regulators are activated, especially in which Extent mitochondria for the release of pro-apoptotic Signal molecules are activated. In particular, the release of cytochrome c from the mitochondria of cells that Becoming apoptotic is an important step in Signal sequence of the cell death program that is used in most forms involved in cell death.

Im Stand der Technik sind hauptsächlich zwei Verfahren bekannt die mitochondriale Cytochrom c Freisetzung nachzuweisen. Zum einen kann eine Trennung von Cytosol und Mitochondrien in einem Trennverfahren und eine anschließende Detektion mittels Immunoblot vorgenommen werden. Die Zunahme eines Meßsignals in der cytosolischen Fraktion und die Abnahme des Meßsignals in der Mitochondrienfraktion wird dabei als eine Freisetzung des Cytochrom c aus den Mitochondrien interpretiert. Dieses Verfahren ist aufwendig, störanfällig und benötigt zudem eine große Menge (ca. 50 Mio.) Zellen. Eine solche Lösung ist damit praktisch nur in der Grundlagenforschung anwendbar, um das Prinzip mitochondrialer Freisetzung zu belegen. Ein weiterer Nachteil dieses vorbekannten Verfahrens liegt darin, daß die verwendeten Zellen nur gemeinsam untersucht werden können, so daß es nicht möglich ist, eine Cytochrom c Freisetzung in nur einem Teil bzw. einer Subpopulation der verwendeten Zellen nachzuweisen. Damit ist es auch nicht möglich, die bei Zytostatikaresistenz fehlende Cytochrom c Freisetzung nur einer Teilpopulation der untersuchten Zellen nachzuweisen. Two methods are mainly known in the prior art detect the mitochondrial cytochrome c release. To the separation of cytosol and mitochondria in one a separation process and subsequent detection using Immunoblot can be made. The increase in a measurement signal in the cytosolic fraction and the decrease in the measurement signal in the mitochondrial fraction is considered a release of the Cytochrome c interpreted from the mitochondria. This The process is complex, prone to failure and also requires one large amount (approx. 50 million) cells. So there is such a solution practically only applicable in basic research in order to To demonstrate the principle of mitochondrial release. Another The disadvantage of this known method is that the used cells can only be examined together, so that it is not possible to release cytochrome c in only a part or a subpopulation of the cells used demonstrated. It is also not possible with that Cytostatic resistance lacking cytochrome c release only to demonstrate a subpopulation of the cells examined.

Das andere bekannte Verfahren besteht in einem immunhistochemischen Nachweis der Freisetzung durch Anfärbung von Cytochrom c in der Zelle mittels geeignet markierter Antikörper und fluoreszenzmikroskopischer Auswertung. Auch dieses Verfahren ist zeitaufwendig, zudem erfordert die mikroskopische Auswertung viel Erfahrung und ist vom Untersucher abhängig. Im Gegensatz zum oben vorgestellten Verfahren ist die Analyse einzelner Zellen möglich, wobei die Menge analysierter Zellen durch die mikroskopische Beobachtung und die begrenzte Zellzahl auf einem Objektträger stark limitiert ist. The other known method is one immunohistochemical detection of release by staining of cytochrome c in the cell by means of suitably labeled Antibodies and fluorescence microscopic evaluation. Also this process is time consuming and also requires microscopic evaluation a lot of experience and is from Examiner dependent. In contrast to the one presented above Individual cells can be analyzed using the method Amount of cells analyzed by microscopic observation and the limited cell count on a slide strongly is limited.

Eine Testung der Resistenz gegen Zytostatika wird konventionell durch den Nachweis von Wachstumshemmung, Zelltod oder Abnahme metabolischer Funktionen (beispielsweise der Reduktion von MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid) in Zytostatika-behandelten Zellkulturen durchgeführt. Die Zytostatika-Resistenztestung mittels eines MTT Assays zeigt zwar grobe Korrelationen mit dem Ansprechen einer Chemotherapie, ist aber nicht geeignet, für den einzelnen Patienten individuelle Vorhersagen über die Wirksamkeit einzelner Medikamente zu machen. Resistance to cytostatics is tested conventional through the detection of growth inhibition, cell death or decrease in metabolic functions (e.g. the Reduction of MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5- diphenyltetrazolium bromide) in cytostatics-treated Cell cultures performed. Cytostatics resistance testing using an MTT assay shows rough correlations response to chemotherapy, but is not suitable individual predictions for the individual patient To make single drugs effective.

Ein Nachweis der Cytochrom c Freisetzung in primären humanen Zellen zum Zwecke des Nachweises einer Zytostatika-Wirkung ist aus dem Stand der Technik nicht bekannt, was auf methodische Schwierigkeiten mit den oben skizzierten Verfahren zurückzuführen ist. Die einzige Möglichkeit, mitochondriale Veränderungen nach Apoptose-Induktion in Patientenzellen ex vivo nachzuweisen, ist die Messung des Mitochondrienmembranpotentials, welches allerdings nur bei einem Teil der Apoptoseformen und nicht in allen Zelltypen verändert ist. Evidence of cytochrome c release in primary human Cells for the purpose of demonstrating cytostatic activity not known from the prior art as to methodological Difficulties with the procedures outlined above is due. The only way to mitochondrial Changes after apoptosis induction in patient cells ex Evidence in vivo is the measurement of the Mitochondrial membrane potential, which, however, only applies to a part of the Forms of apoptosis and not changed in all cell types.

Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem ein zuverlässigerer und differenzierter Nachweis von Apoptosesignalmolekülen in Zellen mit aktiviertem Zelltodprogramm in einfacher Weise möglich wird. The present invention was therefore based on the object to provide a method by which a more reliable and differentiated detection of apoptosis signaling molecules in cells possible with activated cell death program becomes.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung des Verfahrens gemäß dem unabhängigen Patentanspruch 1. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen, Aspekte und Details der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Patentansprüchen und der Beschreibung. This task is solved by providing the Method according to independent claim 1. Other advantageous configurations, aspects and details of the present invention result from the dependent Claims and the description.

Der Erfindung liegt das Prinzip zugrunde, durch geeignete Vorbehandlung von Zellen Stoffe spezifisch in Zellorganellen durchflußzytometrisch nachweisen zu können. Das Verfahren ist damit nicht nur zum Nachweis von Apoptose geeignet, sondern kann ganz allgemein dort eingesetzt werden, wo Substanzen in Organellen nachgewiesen werden sollen, die auch im Cytoplasma vorkommen oder vorkommen können und daher ansonsten mitgemessen würden. The principle of the invention is based on suitable ones Pretreatment of cells Specific substances in cell organelles to be able to demonstrate flow cytometry. The procedure is not only suitable for the detection of apoptosis, but also can be used in general where substances in Organelles to be detected, which are also in the cytoplasm can occur or can occur and therefore otherwise would be measured.

Die Erfindung ist daher gerichtet auf ein Verfahren zum durchflußzytometrischen Nachweis von Stoffen, die aus Zellorganellen freigesetzt werden, aufweisend die folgenden Schritte:

  • - Fixieren von zu untersuchenden Zellen
  • - Permeabilisieren der äußeren Membran unter Erhalt der Organellenstruktur;
  • - Färben der Zellen mit einer Fluorochrom-Verbindung, welche spezifisch an zumindest einen nachzuweisenden Stoff bindet; und
  • - durchflußzytometrische Messung der einzelnen Zellen unter Anregung der Fluorochrom-Verbindung; und
  • - Feststellen der Fluroreszenzstärke der Zellen.
The invention is therefore directed to a method for the flow cytometric detection of substances which are released from cell organelles, comprising the following steps:
  • - Fixing cells to be examined
  • - Permeabilize the outer membrane while maintaining the organelle structure;
  • - Staining the cells with a fluorochrome compound, which binds specifically to at least one substance to be detected; and
  • - Flow cytometric measurement of the individual cells with excitation of the fluorochrome compound; and
  • - Determine the fluorescence intensity of the cells.

Durch dieses Verfahren ist es möglich, die aufzufindenden Stoffe zwar aus dem Cytosol zu entfernen, sofern sie dort vorhanden waren, da die äußere Zellmembran permeabel gemacht ist, jedoch in den Zellorganellen zu belassen, da sie dort an Organellenstrukturen gebunden sind und die Zelle daher nicht verlassen können. Noch in den Organellen vorhandener Stoff kann dann durch Anlagerung einer Fluorochrom-Verbindung durchflußzytometrisch bestimmt werden. With this method it is possible to find the Remove substances from the cytosol provided they are there were present because the outer cell membrane was made permeable is, however, to be left in the cell organelles, since it is there Organelle structures are bound and therefore the cell is not being able to leave. Substance still present in the organelles can then by adding a fluorochrome compound be determined by flow cytometry.

Unter Zellen sind erfindungsgemäß alle tierischen oder menschlichen Zellen zu verstehen, bei denen das Zelltodprogramm aktiviert ist. Dies sind bevorzugt primäre Tumor- oder Leukämiezellen. According to the invention, all animal cells or understand human cells where that Cell death program is activated. These are preferred primary Tumor or leukemia cells.

Unter einem nachzuweisenden Stoff ist im Sinne der vorliegenden Erfindung jede in der Zelle vorhandene chemische Substanz zu verstehen, die mittels einer Fluoreszenzverbindung nachgewiesen werden kann, sei dies durch direkte oder indirekte Bindung etc. Es kann sich hierbei um Nukleinsäuren wie DNA, RNA, t-RNA, als genomische oder Plasmid-DNA, mRNA, mitochondriale DNA etc. handeln, oder um Proteine, Peptide und Proteinkomplexe, oder um andere Moleküle wie Stoffwechselprodukte, Strukturkomponenten der Zelle aus Kohlenhydratpolymeren, Membrankomponenten oder sonstige Bestandteile der Zellen. Under a substance to be detected is in the sense of present invention any chemical present in the cell To understand substance by means of a fluorescent compound can be demonstrated, either by direct or indirect binding etc. These can be nucleic acids such as DNA, RNA, t-RNA, as genomic or plasmid DNA, mRNA, mitochondrial DNA etc., or proteins, peptides and Protein complexes, or around other molecules like Metabolic products, structural components of the cell Carbohydrate polymers, membrane components or others Components of the cells.

Keinesfalls soll die Erfindung auf Cytochrom c beschränkt sein, auch wenn der Wunsch nach dessen einfachem Nachweis als Ausgangsbasis der Erfindung beschrieben ist. Vielmehr kann der Fachmann dem Studium der Erfindungsbeschreibung entnehmen, daß die Erfindung auf zahlreiche Verbindungsklassen anwendbar ist, und eine Vielzahl von Anwendungsfeldern erschließt. Eine derartige Anwendung ist beispielsweise der Freisetzungsnachweis anderer Apoptosesignalmoleküle aus Mitochondrien, wie z. B. Smac oder AIF (apoptosis inducing factor), oder aus dem endoplasmatischen Retikulum, wie z. B. Caspase 12. The invention is in no way intended to be limited to cytochrome c be, even if the desire for its simple verification as Starting basis of the invention is described. Rather, the Specialist from studying the description of the invention that the invention is applicable to numerous classes of compounds, and opens up a variety of fields of application. A such application is, for example Release detection of other apoptosis signal molecules from mitochondria, such as z. B. Smac or AIF (apoptosis inducing factor), or from the endoplasmic reticulum, such as B. Caspase 12.

Nach der Durchflußzytometrie, die stets rechnergestützt erfolgt, steht ein Datensatz über die einzelnen, gemessenen Zellen zur Verfügung, der in üblicher Weise und mit Hilfe entsprechender Auswerteprogramme verarbeitet und ausgewertet werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise den weiteren Schritt aufweisen:

  • - Berechnen eines Anteils an Zellen, der über und/oder unter einem vorgegebenen Fluoreszenzgrenzwert liegt.
After the flow cytometry, which is always carried out with the aid of a computer, a data record is available about the individual, measured cells, which can be processed and evaluated in the usual way and with the aid of corresponding evaluation programs. The method according to the invention can have the further step, for example:
  • - Calculating a proportion of cells that is above and / or below a predetermined fluorescence limit.

Durch diese Ausführungsform lässt sich mittels Grenzwertfestsetzung das erhaltene, primäre Datenmaterial auf eine einfachere Ja/Nein Entscheidung reduzieren, d. h. auf die Beantwortung der Frage, ob sich der gesuchte Stoff in einer Organelle aufhält oder im Cytoplasma. Entsprechende Grenzwertfestsetzungen sind dem Fachmann geläufig und können in Vorversuchen festgelegt werden. This embodiment can be used The primary data obtained is based on limit values reduce an easier yes / no decision, d. H. on the Answering the question of whether the substance you are looking for is in a Organelle stops or in the cytoplasm. Appropriate The skilled worker is familiar with and can set limit values be determined in preliminary tests.

Um das Diffundieren von Stoffen, namentlich des zu untersuchenden Stoffs, aus dem Cytoplasma der fixierten Zellen zu beschleunigen, kann es weiterhin vorteilhaft sein, wenn die Zellen nach dem Permeabilisieren mit einer Waschlösung gewaschen werden, um den nachzuweisenden Stoff aus dem Cytoplasma der Zellen zu entfernen. Beispiele für geeignete Waschpuffer sind Saponin (0,1%), Digitonin (0,1%), Triton X100 (0,01%). Weiterhin kann es vorteilhaft sein, die Bindung des Stoffes an die Waschlösung durch Zugabe von Proteinen und Auswahl eines geeigneten pH-Wertes zu erhöhen. In order to diffuse substances, especially that of investigating substance, from the cytoplasm of the fixed cells to accelerate, it may still be advantageous if the Cells after permeabilizing with a wash solution washed to remove the substance to be detected from the Remove cytoplasm from the cells. Examples of suitable ones Wash buffers are saponin (0.1%), digitonin (0.1%), Triton X100 (0.01%). Furthermore, it can be advantageous to bind the Substance to the washing solution by adding proteins and Selection of a suitable pH value to increase.

Unter einer Zellorganelle sind im Sinne der vorliegenden Erfindung alle Kompartimentierungen innerhalb von Zellen zu verstehen, welche durch ihre Doppelschichtmembran von anderen Kompartimenten der Zelle so getrennt sind, daß der zu untersuchende Stoff ohne eine Permeabilisierung der Kompartiment-Membran nicht in das Cytosol gelangen kann. Beispielsweise können die Zellorganellen Mitochondrien, Chloroplasten, Golgisysteme, endoplasmatisches Retikulum oder Zellkerne sein. Je nach Durchlässigkeit der betrachteten Organellenmembran können ggfs. unterschiedliche Stoffe untersucht werden, beispielsweise nur Stoffe, die mehr als eine Grenzmolekularmasse für den Durchtritt durch die Organellenmembran aufweisen. Under a cell organelle are in the sense of the present Invention to compartmentalize all within cells understand which by their double layer membrane from others Compartments of the cell are separated so that the too investigating substance without permeabilization of the Compartment membrane cannot get into the cytosol. For example, the cell organelles can mitochondria, Chloroplasts, Golgi systems, endoplasmic reticulum or Be cell nuclei. Depending on the permeability of the considered Organelle membrane can possibly different substances are examined, for example only substances that are more than a molecular weight limit for the passage through the Show organelle membrane.

Der erste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Fixieren der zu untersuchenden Zellen. Hierdurch werden diese in ihrer Form stabilisiert und sind den nachfolgenden Verfahrensschritten leichter zugänglich. Das Fixieren kann beispielsweise in üblicher Weise mit bekannten Fixationsmitteln in üblichen Verfahren durchgeführt werden. Bevorzugterweise wird die Fixierung mit Paraformaldehyd, Glutaraldehyd oder Methanol erfolgen. The first step of the method according to the invention is that Fix the cells to be examined. This will make this stabilized in shape and are the following Process steps more easily accessible. The fixing can for example in the usual way with known Fixation agents can be carried out in customary procedures. The fixation with paraformaldehyde is preferably Glutaraldehyde or methanol take place.

Ein zentraler Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Permeabilisieren der äußeren Zellmembran, um einen Austritt des zu untersuchenden Stoffs aus dem Cytosol zu ermöglichen. Erst durch das Permeabilisieren kann eine Unterscheidung bezüglich der Lokalisierung des nachzuweisenden Stoffs getroffen werden. Sofern sich der zu untersuchende Stoff in einer der Organellen aufhält, ist ein Auswaschen nach Permeabilisierung der äußeren Zellwand nicht möglich, so daß der Stoff nach Fluorochrom-Bindung durchflußzytometrisch nachweisbar bleibt. Ist andererseits der Stoff im Cytoplasma auffindbar, wird er durch das Permeabilisieren zum Hinausdiffundieren aus der Zelle gebracht werden, so daß kein durchflußzytometrischer Nachweis mehr möglich ist bzw. das gemessene Signal erheblich kleiner ist. Vorzugsweise wird das Permeabilisieren der äußeren Zellmembran mit einem Detergens erfolgen. Es ist jedoch auch möglich, andere Techniken der Permeabilisierung zu verwenden, beispielsweise eine Behandlung mit hypotonen Lösungen. Das verwendete Detergens kann ausgewählt sein aus Saponin (0,1%), Digitonin (0,1%) oder Triton X100 (0,01%). This is a central step of the method according to the invention Permeabilize the outer cell membrane to leak to enable the substance to be investigated from the cytosol. A distinction can only be made by permeabilizing regarding the location of the substance to be detected to be hit. If the substance to be examined is in one of the organelles stops washing out after Permeabilization of the outer cell wall not possible, so that the substance after fluorochrome binding by flow cytometry remains detectable. On the other hand, is the substance in the cytoplasm can be found, it becomes permeable through permeabilization Diffusion out of the cell so that no flow cytometric detection is more possible or that measured signal is significantly smaller. Preferably that is Permeabilize the outer cell membrane with a detergent respectively. However, it is also possible to use other techniques To use permeabilization, for example a treatment with hypotonic solutions. The detergent used can be selected from saponin (0.1%), digitonin (0.1%) or Triton X100 (0.01%).

Die verwendete Fluorochrom-Verbindung sollte über zwei Funktionalitäten verfügen, um für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet zu sein. Zum einen sollte sie ein eigentliches Fluorochrom enthalten, das nach Anregung im Durchflußzytometer eine Fluoreszenz-Emission erzeugt. Zum anderen sollte die Fluorochrom-Verbindung eine mit dem eigentlichen Fluorochrom gekoppelte Substanz enthalten, welche spezifisch an den zu untersuchenden Stoff bindet. Das verwendete Fluorochrom richtet sich nach der jeweils konkreten Fragestellung und den verfügbaren Fluorochromen. Bevorzugte Fluorochrome sind Fluoresceinisothiocyanat (FITC), R- Phycoerythrin, Allophycocyanin oder Peridinchlorophyll. Dem Fachmann ist die Durchführung geeigneter intracellulärer Fluoreszenzfärbungen geläufig. Auch bei der spezifischen bindenden Komponente steht ein großes Spektrum an Verbindungen zur Verfügung, die aus dem Stand der Technik für eine Vielzahl von Stoffen bekannt sind. Als besonders flexibel im Einsatz haben sich hierbei Nukleinsäuren und Proteine herausgestellt, da sie einer Vielzahl von zu untersuchenden Stoffen angepasst werden können. Nukleinsäuren sind insbesondere geeignet zur Bindung an andere Nukleinsäuren durch eine komplementäre Abfolge der Nukleotide. Insbesondere wird bevorzugt, daß die Fluorochrom-Verbindung einen Farbstoff-Anteil und einen Proteinanteil aufweist, wobei der Proteinanteil vorzugsweise ein Antikörper, Antikörperderivat oder Antikörperfragment ist. Durch die Verwendung von Antikörpern lässt sich eine große Zahl von zu untersuchenden Stoffen mit hoher Spezifität nachweisen, seien dies andere Proteine, Nukleinsäuren oder Strukturelemente innerhalb der Zelle. The fluorochrome compound used should have two Functionalities in order for the invention Process to be suitable. For one, it should be one contain actual fluorochrome, which after excitation in Flow cytometer produces a fluorescence emission. To the another, the fluorochrome compound should be one with that actual fluorochrome-coupled substance, which binds specifically to the substance to be examined. The Fluorochrome used depends on the specific one Research question and the available fluorochromes. preferred Fluorochromes are fluorescein isothiocyanate (FITC), R- Phycoerythrin, allophycocyanin or peridine chlorophyll. the The person skilled in the art is carrying out suitable intracellular Fluorescent stains common. Even with the specific binding component is a wide range of compounds available from the state of the art for a variety of substances are known. As particularly flexible in use nucleic acids and proteins have emerged, because they are adapted to a variety of substances to be examined can be. Nucleic acids are particularly suitable for Binding to other nucleic acids through a complementary Sequence of nucleotides. In particular, it is preferred that the Fluorochrome compound a dye portion and one Has protein content, the protein content preferably is an antibody, antibody derivative or antibody fragment. By using antibodies, a large one can Number of substances to be examined with high specificity demonstrate whether these are other proteins, nucleic acids or Structural elements within the cell.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders vorteilhaft anwendbar, wenn der nachzuweisende Stoff ein Protein ist. The method according to the invention is particularly advantageous applicable if the substance to be detected is a protein.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der nachzuweisende Stoff Cytochrom c, so daß dieses Verfahren sich unerwarteterweise sogar zum Nachweis der Apoptose und der Zytostatika-Wirksamkeit bzw. -Resistenz einsetzen lässt. In a particularly preferred embodiment, the substance to be detected cytochrome c, so that this method unexpectedly even for the detection of apoptosis and Can use cytostatics effectiveness or resistance.

Es ist ganz besonders bevorzugt das Vorhandensein von Cytochrom c durch Bindung an einen anti-Cytochrom c-Antikörper (Fa. BD Pharmingen), der wiederum durch einen FITC-markierten anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper nachgewiesen wird, nachzuweisen. The presence of is very particularly preferred Cytochrome c by binding to an anti-cytochrome c antibody (BD Pharmingen), which in turn was marked by a FITC anti-mouse immunoglobulin antibody is detected demonstrated.

Wie bereits erläutert, ist ein besonders interessantes Einsatzgebiet der vorliegenden Erfindung die Beobachtung dynamischer Vorgänge in der Zelle, beispielsweise die Wirkung von Zytostatika auf eine Zellpopulation. Es wird daher insbesondere bevorzugt, daß die Zellen vor der Fixierung mit einem Wirkstoff inkubiert werden, um auf diese Weise eine zu untersuchende Reaktion zu provozieren. As already explained, is a particularly interesting one Field of application of the present invention is observation dynamic processes in the cell, for example the effect from cytostatics to a cell population. It will therefore particularly preferred that the cells with be incubated with an active ingredient in order to obtain a provoking investigative response.

Ein solcher Wirkstoff ist vorzugsweise ein potentielles Zytostatikum, dessen apoptose-auslösende Eigenschaften bestimmt werden sollen. Such an active ingredient is preferably a potential one Cytostatic, its apoptosis-inducing properties should be determined.

Es ist aber auch möglich, ein bekanntes Zytostatikum mit Tumor- oder Leukämiezellen eines Patienten zu inkubieren, um über das erfindungsgemäße Verfahren die Sensitivität der malignen Zellen für verschiedene Zytostatika zu bestimmen. Es besteht ferner die Möglichkeit Zellen eines Patienten, der unter Zytostatikatherapie steht, zu untersuchen, um herauszufinden, ob dieser auf die Therapie anspricht (ex vivo Monitoring von Zytostatikatherapie). But it is also possible to use a known cytostatic To incubate a patient's tumor or leukemia cells to the sensitivity of the to determine malignant cells for various cytostatics. It there is also the possibility of cells of a patient who under cytostatic therapy, to investigate to find out whether this responds to the therapy (ex vivo Monitoring of cytostatic therapy).

Bislang ist das erfindungsgemäße Verfahren im Hinblick auf seine isolierte Ausführung beschrieben worden. Es ist jedoch auch möglich, mehr als eine Messung mit einem Durchflußzytometer gleichzeitig durchzuführen. Das einfachste Vorgehen dabei ist die Verwendung eines Durchflußzytometers mit zwei oder mehr Lasern, die jeweils in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen Licht emittieren und damit in der Lage sind, verschiedene Fluorochrome zur Fluoreszenz anzuregen. So far, the method according to the invention is with regard to its isolated execution has been described. However, it is also possible more than one measurement with one Flow cytometer to be performed simultaneously. The easiest way here is the use of a flow cytometer with two or more lasers, each in different Wavelength ranges emit light and thus capable are to excite different fluorochromes for fluorescence.

Es wird daher erfindungsgemäß bevorzugt, daß gleichzeitig eine zweite Eigenschaft der zu untersuchenden Zellen mit Hilfe einer zweiten Fluorochrom-Verbindung festgestellt wird. It is therefore preferred according to the invention that a second property of the cells to be examined with the help a second fluorochrome compound is detected.

Es ist allerdings auch möglich, ein Ein-Laser Durchflußzytometer zu verwenden, um zwei verschiedene Fluorochrom-Verbindungen gleichzeitig zu messen. In dieser bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mit einem Ein-Laser- Durchflußzytometer mit zwei Fluoreszenzkanälen durchgeführt wird, wobei das zweite Fluorochrom einen mit dem ersten Fluorochrom überlappenden Emissionswellenlängenbereich aufweist und die Photomultiplier-Röhrenspannung des zum Messen des zweiten Fluorochroms vorgesehenen Fluoreszenzkanals so eingestellt wird, daß kein vom ersten Fluorochrom in diesem Fluoreszenzkanal erzeugtes Fluoreszenz-Emissionssignal detektiert wird. However, it is also possible to use a one-laser Flow cytometer to use two different Measure fluorochrome compounds simultaneously. In this preferred embodiment is the invention characterized in that the method with a one-laser Flow cytometer performed with two fluorescence channels , the second fluorochrome one with the first Fluorochrome overlapping emission wavelength range and the photomultiplier tube voltage for measuring of the second fluorochrome provided fluorescence channel is set that none of the first fluorochrome in this Fluorescence channel generated fluorescence emission signal is detected.

Diese bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in der deutschen Patentanmeldung DE 100 53 747.2 detailliert beschrieben, so daß hier auf eine ausführliche Darstellung verzichtet werden kann. This preferred embodiment of the present invention is in the German patent application DE 100 53 747.2 described in detail, so here is a detailed Representation can be dispensed with.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erlaubt die erfindungsgemäße Methode beispielsweise auf einfache und kostensparende Weise die Messung des wichtigsten Apoptose-induzierenden mitochondrialen Signalvorgangs in Kombination mit dem gleichzeitigen Nachweis von Caspasenaktivierung mittels konventioneller Durchflußzytometrie. Damit ist es erstmals möglich, zwei Apoptosesignalwege in einer Zelle durchflußzytometrisch zu untersuchen. In a preferred embodiment of the present Invention allows the method of the invention, for example the measurement of the major apoptosis-inducing mitochondrial Signaling process in combination with the simultaneous detection of caspase activation using conventional Flow cytometry. This makes it possible for the first time to have two Apoptosis signaling pathways in a cell flow cytometrically investigate.

Durch die etablierte Methode der Durchflußzytometrie kann damit der mitochondriale Apoptosesignalweg im Zusammenhang weiterer biologischer Parameter wie der Zelldifferenzierung, dem Zellzyklus, der Zellaktivierung usw. untersucht werden. Die kombinierte durchflußzytometrische Untersuchung mit anderen apoptoseregulierenden Molekülen ermöglicht eine weitere Charakterisierung von Signalwegen und deren Abhängigkeiten. Weiterhin ermöglicht die erfindungsgemäße Methode durch die Verbindung mit der Detektion von Phosphatidylserinexternalisierung mittels Annexin-V. ein umfassendes Monitoring von den frühen Apoptose-Schritten der Mitochondrienaktivierung bis zu einem späten Schritt der Membranveränderung. Dieser Detektion liegt das Prinzip zugrunde, daß sich Phosphatidylserin in lebenden Zellen ausschließlich auf der Innenseite der Zellmembran befindet. Nach Membranveränderungen durch den Apoptoseprozeß erscheint Phosphatidylserin auf der Membranaußenseite. Annexin V bindet spezifisch an Phosphatidylserin, so daß sich mittels (FITC)- markiertem Annexin V die apoptotischen Membranveränderungen nachweisen lassen. Through the established method of flow cytometry related to the mitochondrial apoptosis signaling pathway other biological parameters such as cell differentiation, the cell cycle, cell activation, etc. are examined. The combined flow cytometric examination with other apoptosis regulating molecules enables one further characterization of signaling pathways and their Dependencies. Furthermore, the invention enables Method by connecting with the detection of Phosphatidylserine externalization using Annexin-V. on comprehensive monitoring of the early apoptosis steps of the Mitochondrial activation up to a late step Membrane change. The principle lies in this detection based on the fact that phosphatidylserine is found in living cells located only on the inside of the cell membrane. After membrane changes through the apoptosis process appears Phosphatidylserine on the outside of the membrane. Annexin V binds specific to phosphatidylserine, so that (FITC) - marked Annexin V the apoptotic membrane changes have it proven.

Für die Fortentwicklung von Zytostatika ist es entscheidend, Substanzen zu identifizieren, die effektiv mitochondriale Signalwege aktivieren, da nur dann von einer sicheren Apoptoseinduktion ausgegangen werden kann. Durch die Anwendung der Durchflußzytometrie ist die erfindungsgemäße Methode besonders geeignet für die präklinische Testung der Wirksamkeit von neu entwickelten Zytostatika an etablierten Zellkultursystemen im Hochdurchsatzverfahren. It is crucial for the further development of cytostatics that Identify substances that are effective mitochondrial Activate signal paths, because only then from a safe Apoptosis induction can be assumed. Through the application Flow cytometry is the method of the invention particularly suitable for preclinical testing of Effectiveness of newly developed cytostatics on established ones Cell culture systems using the high-throughput process.

Weiterhin erlaubt es das erfindungsgemäße Verfahren es, die mitochondriale Cytochrom c Freisetzung gemeinsam mit der Expression von Oberflächenepitopen zu messen. Damit ist es beispielsweise möglich, Leukämiezellen in heterogenen Zellpopulationen, wie peripherem Blut, zu identifizieren und deren Chemosensitivität zu untersuchen. Zusätzlich können resistente Subpopulationen nach ihrem Differenzierungsgrad weiter charakterisiert werden. Furthermore, the method according to the invention allows the mitochondrial cytochrome c release along with the Measure expression of surface epitopes. So that's it for example possible leukemia cells in heterogeneous Identify and identify cell populations such as peripheral blood to investigate their chemosensitivity. In addition, you can resistant subpopulations according to their degree of differentiation be further characterized.

Der entscheidende Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der geringe Kostenaufwand, eine einfache und schnelle Durchführbarkeit sowie die Möglichkeit, derzeit verfügbare Routine-Durchflußzytometer für die Messung zu verwenden. Damit ist gewährleistet, daß die Methode als diagnostische Anwendung beispielsweise zur Chemosensitivitätsmessung bei Leukämien und Tumoren rasche Verbreitung finden wird. The decisive advantage of the method according to the invention is the low cost, simple and quick Feasibility as well as the possibility of currently available Use routine flow cytometer for measurement. In order to ensures that the method is used as a diagnostic for example for chemosensitivity measurement in leukemia and Tumors will spread rapidly.

Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen: The invention is further described with reference to the figures, which show:

Fig. 1 Analyse der mitochondrialen Cytochrom c-Freisetzung in CD95 und Etoposid-induzierter Apoptose durch Durchflußzytometrie
Jurkatzellen wurden mit Medium allein (A, D), mit Zelltodtriggerndem anti-APO-1 Antikörper für 3 Stunden (B) und 6 Stunden (C) oder mit Etoposid für 4 Stunden (E) und 8 Stunden (F) kultiviert. Das intrazelluläre Cytochrom c wurde durch Durchflußzytometrie in fixierten (4% PFA) und permeabilisierten (Saponin 0,2%) Zellen nachgwiesen. Das Fluoreszenzprofil des Cytochrom c-Signals ist im Histogramm gezeigt. Die Prozentsätze geben den Anteil von Zellen mit verringertem Cytochrom c-Gehalt wieder. Fig. 1 Analysis of mitochondrial cytochrome c release in CD95 and etoposide-induced apoptosis by flow cytometry
Jurkat cells were cultured with medium alone (A, D), with cell death-triggering anti-APO-1 antibody for 3 hours (B) and 6 hours (C) or with etoposide for 4 hours (E) and 8 hours (F). The intracellular cytochrome c was detected by flow cytometry in fixed (4% PFA) and permeabilized (saponin 0.2%) cells. The fluorescence profile of the cytochrome c signal is shown in the histogram. The percentages represent the proportion of cells with a reduced cytochrome c content.

Fig. 2 Identifizierung von mangelnder Cytochrom c-Freisetzung und Caspase-3 Aktivierung in Zellen, die mit Bcl-2 transfiziert sind
Jurkat-Zellen (A-C) und Jurkat-Zellen, die mit Bcl-2 (D-F) transfiziert worden waren, wurden mit Medium allein (A, F), mit anti-APO-1 (B, E) und mit anti-APO-1 sowie dem Caspase- Inhibitor z-VAD-fmk (C, F) für 6 Stunden (A-C) oder 24 Stunden (D-F) inkubiert. Lebende Zellen wurden im "Forward/Side Scatter Plot" identifiziert und auf Cytochrom c und aktives Caspase-3-Fragment analysiert. In der Figur ist Cytochrom c gegenüber Caspase-3 gezeigt. Figure 2 Identification of lack of cytochrome c release and caspase-3 activation in cells transfected with Bcl-2
Jurkat cells (AC) and Jurkat cells transfected with Bcl-2 (DF) were treated with medium alone (A, F), with anti-APO-1 (B, E) and with anti-APO- 1 and the caspase inhibitor z-VAD-fmk (C, F) for 6 hours (AC) or 24 hours (DF). Living cells were identified in the "Forward / Side Scatter Plot" and analyzed for cytochrome c and active caspase-3 fragment. In the figure, cytochrome c is shown compared to caspase-3.

Fig. 3 Analyse der Cytochrom c-Freisetzung und Caspase-3 Aktivierung in primären Leukämiezellen eines Patienten mit resistentem Krankheitsverlauf
Leukämiezellen eines Patienten mit gegenüber Chemotherapie resistenter myeloischer Leukämie (FAB MO) wurden in RPMI 1640- Medium allein (A), Etoposid 10 µg/ml (B) und OH- Cyclophosphamid 3 µg/ml (C) für 24 Stunden inkubiert. Lebende Zellen wurden im "Forward/side scatter plot" identifiziert und auf Cytochrom c und aktives Caspase-3 Fragment analysiert. In der Figur ist Cytochrom c gegenüber Caspase-3 gezeigt. Man beachte die Caspase-Aktivierung in Abwesenheit der Cytochrom c-Freisetzung in dieser Leukämieprobe. Fig. 3 Analysis of the cytochrome c release and caspase-3 activation in primary leukemia cells from a patient with resistant disease
Leukemia cells from a patient with chemotherapy-resistant myeloid leukemia (FAB MO) were incubated for 24 hours in RPMI 1640 medium alone (A), etoposide 10 µg / ml (B) and OH-cyclophosphamide 3 µg / ml (C). Living cells were identified in the "forward / side scatter plot" and analyzed for cytochrome c and active caspase-3 fragment. In the figure, cytochrome c is shown compared to caspase-3. Note the caspase activation in the absence of cytochrome c release in this leukemia sample.

Im folgenden soll die Erfindung an Hand von konkreten Ausführungsbeispielen weiter erläutert werden. In the following, the invention will be described on the basis of concrete Embodiments are further explained.

Beispiel 1example 1 AllgemeinesGeneral Zellkulturencell cultures

Die menschliche Jurkat T-Lymphozyten-Zellinie wurde in RPMI 1640 (Life Technologie, Inc., Eggenstein, Deutschland) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS, Sigma Chemicals, Deisenhofen, Deutschland) zusammen mit Penicillin, Streptomycin und Glutamin (Biochrom KG, Berlin, Deutschland) bei 37% in befeuchteter Luft/5% CO2 kultiviert. Die Vektorkontrolle oder SKW-Zellinien, die Bcl-2 überexprimieren, wurden in RPMI 1640 (Life Technologies) enthaltend 0,5 mg/ml Geneticin (Life Technologies) gehalten. 0,5 × 105 Zellen/ml wurden in 24- Lochplatten zur Bestimmung der Apoptose oder in 75-cm2 Gefäßen (Falcon, Heidelberg, Deutschland) für die Proteinisolierung, Mikroskopie oder Durchflußzytometrie kultiviert. The human Jurkat T lymphocyte cell line was developed in RPMI 1640 (Life Technologie, Inc., Eggenstein, Germany) with 10% fetal calf serum (FCS, Sigma Chemicals, Deisenhofen, Germany) together with penicillin, streptomycin and glutamine (Biochrom KG, Berlin , Germany) at 37% in humidified air / 5% CO 2 . The vector control or SKW cell lines that overexpress Bcl-2 were maintained in RPMI 1640 (Life Technologies) containing 0.5 mg / ml Geneticin (Life Technologies). 0.5 × 10 5 cells / ml were cultivated in 24-well plates for the determination of apoptosis or in 75 cm 2 vessels (Falcon, Heidelberg, Germany) for protein isolation, microscopy or flow cytometry.

Probenrehearse

Aus Knochenmarkaspiraten von Leukämiepatienten wurden Leukämische Blasten durch Ficoll-Hypaque Dichtegradientenzentrifugation (Ficoll, Dichte 1,077 g/l, Biochrom KG) bei 300 × g für 25 Min. bei 20°C isoliert, zweimal mit Hanks- Salzlösung ergänzt mit 2% fötalem Kalbsserum (HBSS/FCS) bei 4°C gewaschen und auf 107 Zellen/ml eingestellt. 1 × 106 Zellen/ml wurden in 24-Lochplatten zur Bestimmung der Apoptose für die Durchflußzytometrie kultiviert. Leukemic blasts were isolated from bone marrow aspirates from leukemia patients by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation (Ficoll, density 1.077 g / l, Biochrom KG) at 300 × g for 25 min at 20 ° C, twice with Hanks saline solution supplemented with 2% fetal calf serum ( HBSS / FCS) washed at 4 ° C and adjusted to 10 7 cells / ml. 1 × 10 6 cells / ml were cultivated in 24-well plates to determine the apoptosis for the flow cytometry.

Beispiel 2Example 2 Analyse der LeukämiezellpopulationAnalysis of the leukemia cell population

Zellanalysen wurden mittels Durchflußzytometrie an einem FACSCalibur Cytometer (Fa. Becton Dickinson) ausgestattet mit einem 488 nm Argon- und einem 650 nm Rotdiodenlaser durchgeführt. 0,5-1 × 106 Zellen pro Test wurden für 25 Minuten bei 4°C mit einer Kombination von Fluorochrom CD34PerCP, CD33APC, CD19APC konjugiert an monoklonale Antikörper für CD34, CD33 im Fall von AML, und CD34, CD19 im Fall von ALL angefärbt. Die Antikörper CD34 PerCp, CD33 APC wurden von der Firma Pharmingen erworben, CD19 wurde von der Firma Coulter/Immunotech (Krefeld, Deutschland) erhalten. Für jeden Antikörper wurde ein Isotyp-angepaßtes Immunglobulin in allen Experimenten als Kontrolle verwendet. Cell analyzes were carried out using flow cytometry on a FACSCalibur cytometer (from Becton Dickinson) equipped with a 488 nm argon and a 650 nm red diode laser. 0.5-1 × 10 6 cells per test were conjugated for 25 minutes at 4 ° C with a combination of fluorochrome CD34PerCP, CD33APC, CD19APC to monoclonal antibodies for CD34, CD33 in the case of AML, and CD34, CD19 in the case of ALL stained. The antibodies CD34 PerCp, CD33 APC were purchased from Pharmingen, CD19 from Coulter / Immunotech (Krefeld, Germany). For each antibody, an isotype matched immunoglobulin was used as a control in all experiments.

Die Proben wurden mit HANKS-Salzlösung ergänzt mit 2% Rinderserumalbumin (Fa. Serva) und 0,2% Azid (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland) gewaschen. Nach Fixierung mit 2% Paraformaldehyd wurden die Proben sofort auf einem FACSCalibur-Cytometer analysiert. Ein Minimum von 50000 Ereignissen pro Probe wurde erfaßt, in Listenmodus-Dateien gespeichert und nachfolgend mit "Cellquest"-Software (Fa. Becton Dickinson) analysiert. Leukämiezellen, identifiziert durch CD34 CD33 Koexpression wurden auf Cytochrom c- Freisetzung und Caspasenaktivierung untersucht. The samples were supplemented with HANKS saline with 2% Bovine serum albumin (from Serva) and 0.2% azide (from Merck, Darmstadt, Germany) washed. After fixation with 2% The samples were immediately placed on a paraformaldehyde FACSCalibur cytometer analyzed. A minimum of 50,000 Events per sample were recorded in list mode files saved and subsequently with "Cellquest" software (Fa. Becton Dickinson). Leukemia cells by CD34 CD33 coexpression were c- Release and caspase activation examined.

Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. The results are shown in FIG. 3.

Beispiel 3Example 3 Analyse der Cytochrom c-FreisetzungAnalysis of cytochrome c release

Die Zellanalyse wurde mittels Durchflußzytometrie an einem FACSCalibur Cytometer (Becton Dickinson) ausgestattet mit einem 488 nm Argon- und einem 650 nm Rotdiodenlaser durchgeführt. 1 × 106 Zellen pro Test wurden mit HANKS- Salzlösung ergänzt mit 2% Rinderserumalbumin (Fa. Serva) und 0,2% Azid (Fa. Merck) gewaschen, gefolgt von einem 20 minütigen PFA-Lösung (4%) Fixierungsschritt. Die Zellen wurden mit 0,2% Saponin für 5 Minuten bei Raumtemperatur permeabilisiert. Unspezifische Bindung des anti-Cytochrom c- Antikörpers wurde mit 5 µg Maus-IgG1 (Fa. Sigma) geblockt. Anti-Cytochrom c-Antikörper (7H8.2C12, Fa. Pharmingen) und anti-Caspase-3-Antikörper (Fa. Becton Dickinson) wurden für weitere 20 Minuten bei 4°C zugefügt. Für die Cytochrom c- Anfärbung wurden die Zellen mit Ziege-anti-Maus IgG2b FITC (1 : 20, Fa. Southern Biotechnology Assoc., Birmingham, AL, USA) inkubiert. Für jeden Antikörper wurde ein Isotyp-angepaßtes Immunoglobulin als Kontrolle in allen Experimenten verwendet. Nach Fixierung mit 2% Paraformaldehyd wurden die Proben sofort auf einem FACSCalibur Cytometer analysiert. Ein Minimum von 50000 Ereignissen pro Probe wurde erfaßt, in Listenmodus- Dateien gespeichert und nachfolgend mit "Cellquest"-Software (Fa. Becton Dickinson) analysiert. The cell analysis was carried out by means of flow cytometry on a FACSCalibur cytometer (Becton Dickinson) equipped with a 488 nm argon and a 650 nm red diode laser. 1 × 10 6 cells per test were washed with HANKS saline solution supplemented with 2% bovine serum albumin (from Serva) and 0.2% azide (from Merck), followed by a 20 minute PFA solution (4%) fixation step. The cells were permeabilized with 0.2% saponin for 5 minutes at room temperature. Unspecific binding of the anti-cytochrome c antibody was blocked with 5 µg mouse IgG1 (Sigma). Anti-cytochrome c antibodies (7H8.2C12, Pharmingen) and anti-Caspase-3 antibodies (Becton Dickinson) were added for a further 20 minutes at 4 ° C. For the cytochrome c staining, the cells were incubated with goat anti-mouse IgG2b FITC (1:20, from Southern Biotechnology Assoc., Birmingham, AL, USA). For each antibody, an isotype matched immunoglobulin was used as a control in all experiments. After fixation with 2% paraformaldehyde, the samples were immediately analyzed on a FACSCalibur cytometer. A minimum of 50,000 events per sample were recorded, stored in list mode files and subsequently analyzed using "Cellquest" software (Becton Dickinson).

Die Ergebnisse sind in den Fig. 1, 2 und 3 gezeigt. The results are shown in Figs. 1, 2 and 3.

Claims (17)

1. Verfahren zum durchflußzytometrischen Nachweis der Freisetzung von Stoffen aus Zellorganellen, aufweisend die folgenden Schritte: - Fixieren von zu untersuchenden Zellen; - Permeabilisieren der äußeren Membran unter Erhalt der Organellenstruktur; - Färben der Zellen mit einer Fluorochrom-Verbindung, welche spezifisch an zumindest einen nachzuweisenden Stoff bindet; - durchflußzytometrische Messung der einzelnen Zellen unter Anregung der Fluorochrom-Verbindung; und - Feststellen der Fluroreszenzstärke der Zellen. 1. A method for flow cytometric detection of the release of substances from cell organelles, comprising the following steps: - Fixing cells to be examined; - Permeabilize the outer membrane while maintaining the organelle structure; - Staining the cells with a fluorochrome compound, which binds specifically to at least one substance to be detected; - Flow cytometric measurement of the individual cells with excitation of the fluorochrome compound; and - Determine the fluorescence intensity of the cells. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es den weiteren Schritt aufweist: - Berechnen eines Anteils an Zellen, der über und/oder unter einem vorgegebenen Fluoreszenzgrenzwert liegt. 2. The method according to claim 1, characterized in that it has the further step: - Calculating a proportion of cells that is above and / or below a predetermined fluorescence limit. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Permeabilisieren die Zellen mit einer Waschlösung gewaschen werden, um den nachzuweisenden Stoff aus dem Cytoplasma der Zellen zu entfernen. 3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that after permeabilizing the cells with a wash solution washed to remove the substance to be detected from the Remove cytoplasm from the cells. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellorganellen Mitochondrien, Chloroplasten, Golgisysteme, endoplasmatisches Retikulum oder Zellkerne sind. 4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized characterized in that the cell organelles mitochondria, Chloroplasts, Golgi systems, endoplasmic reticulum or Are cell nuclei. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Fixieren durch Paraformaldehyd, Glutaraldehyd oder Methanol erfolgt. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized characterized in that fixation by paraformaldehyde, Glutaraldehyde or methanol takes place. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Permeabilisieren der äußeren Zellmembran mit einem Detergens erfolgt. 6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized characterized in that the permeabilization of the outer Cell membrane is made with a detergent. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergens ausgewählt ist aus Triton X-100, Digitonin oder Saponin. 7. The method according to claim 6, characterized in that the Detergent is selected from Triton X-100, Digitonin or Saponin. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluorochrom-Verbindung einen Farbstoff-Anteil und einen Proteinanteil aufweist. 8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized characterized in that the fluorochrome compound Dye portion and a protein portion. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Proteinanteil ein Antikörper, Antikörperderivat oder Antikörperfragment ist. 9. The method according to claim 8, characterized in that the Protein portion an antibody, antibody derivative or Antibody fragment is. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der nachzuweisende Stoff ein Protein ist. 10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized characterized in that the substance to be detected is a protein. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der nachzuweisende Stoff Cytochrom c ist. 11. The method according to claim 10, characterized in that the substance to be detected is cytochrome c. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen vor der Fixierung mit einem Wirkstoff inkubiert werden. 12. The method according to any one of claims 1 to 11, characterized characterized in that the cells with a Drug to be incubated. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein potentielles Zytostatikum ist, dessen apoptose-auslösende Eigenschaften bestimmt werden sollen. 13. The method according to claim 12, characterized in that the active substance is a potential cytostatic, the properties that trigger apoptosis are to be determined. 14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein bekanntes Zytostatikum ist, dessen Resistenzpotential in Zellen bestimmt werden soll. 14. The method according to claim 12, characterized in that the active substance is a known cytostatic, the Resistance potential in cells should be determined. 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß gleichzeitig eine zweite Eigenschaft der zu untersuchenden Zellen mit Hilfe einer zweiten Fluorochrom- Verbindung festgestellt wird. 15. The method according to any one of claims 1 to 14, characterized characterized in that at the same time a second property of cells to be examined using a second fluorochrome Connection is established. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mit einem Ein-Laser-Durchflußzytometer mit zwei Fluoreszenzkanälen durchgeführt wird, wobei das zweite Fluorochrom einen mit dem ersten Fluorochrom überlappenden Emissionswellenlängenbereich aufweist und die Photomultiplier- Röhrenspannung des zum Messen des zweiten Fluorochroms vorgesehenen Fluoreszenzkanals so eingestellt wird, daß kein vom ersten Fluorochrom in diesem Fluoreszenzkanal erzeugtes Fluoreszenz-Emissionssignal detektiert wird. 16. The method according to claim 15, characterized in that the procedure with a single laser flow cytometer with two Fluorescence channels is performed, the second Fluorochrome one overlapping with the first fluorochrome Emission wavelength range and the photomultiplier Tube voltage for measuring the second fluorochrome provided fluorescence channel is set so that no generated by the first fluorochrome in this fluorescence channel Fluorescence emission signal is detected. 17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Zellen primäre Tumor- oder Leukämiezellen sind. 17. The method according to any one of claims 1 to 15, wherein the Cells are primary tumor or leukemia cells.
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