DE19847628C2 - Helicobacter pylori vaccine - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein äußeres Membranprotein von Helicobacter pylori mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 und die nachstehend beschriebenen Varianten dieses Proteins sowie diese Proteine codierende DNA-Sequenzen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner gegen dieses Protein gerichtete Antikörper oder Fragmente davon, sowie Impfstoffe bzw. Arzneimittel, die dieses Membranprotein bzw. die dagegen gerichteten Antikörper enthalten und zur aktiven oder passiven Immunisierung verwendet werden können. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Diagnoseverfahren zum Nachweis einer Helicobacter pylori-Infektion unter Verwendung des erfindungsgemäßen Membranproteins oder des erfindungsgemäßen Antikörpers sowie einen Kit zur Durchführung dieses Verfahrens.The present invention relates to an outer membrane protein of Helicobacter pylori the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the variants described below this protein as well as DNA sequences encoding these proteins. The present The invention further relates to antibodies directed against this protein or fragments thereof, as well as vaccines or drugs that this membrane protein or against contain directed antibodies and used for active or passive immunization can be. Finally, the present invention relates to a diagnostic method for Detection of a Helicobacter pylori infection using the invention Membrane protein or the antibody of the invention and a kit for Performing this procedure.
Helicobacter pylori ist ein gramnegatives, mikroaerophiles und spiralförmiges Bakterium, das die Mukosa des menschlichen Darms besiedelt. Dieses Bakterium verursacht chronische aktive Gastritis sowie peptischen Ulkus, insbesondere Ulkus duodeni, und spielt auch eine Rolle bei der Entstehung von Magenkarzinomen. Somit ist Helicobacter pylori ein wichtiger humanpathogener Erreger. Die Schraubenform und Mobilität durch vier bis sechs Flagellen ermöglicht dem Bakterium ein Durchwandern des Magenschleims, um dann die nahezu pH-neutrale Grenzschicht zwischen Schleim und Mukosa zu erreichen. Ammoniumionen, die bei der enzymatischen Spaltung von Harnstoff durch bakterielle Urease entstehen, schützen den Erreger vor der aggressiven Magensäure. Das Bakterium adhäriert an den Endothelzellen des Magens unter Verwendung spezifischer Adhäsine. Eine Folge der chronischen Schleimhautbesiedlung mit Helicobacter pylori kann eine entzündliche granulozytäre, später monozytäre Infiltration des Epithels sein, die über Entzündungsmediatoren wiederum zur Gewebedestruktion beiträgt. Die Infektion stimuliert sowohl eine lokale als auch eine systemische humorale Immunantwort, ohne dabei jedoch eine wirksame Eliminierung des Erregers bewirken zu können.Helicobacter pylori is a gram-negative, microaerophilic and spiral bacterium, that colonizes the mucosa of the human gut. This bacteria causes chronic active gastritis and peptic ulcer, especially duodenal ulcer, and plays also a role in the development of gastric cancer. Thus Helicobacter pylori is one important human pathogen. The screw shape and mobility through four to six Flagella allows the bacterium to migrate through the gastric mucus, then to to achieve an almost pH-neutral boundary layer between mucus and mucosa. Ammonium ions involved in the enzymatic breakdown of urea by bacterial Urease arise, protect the pathogen from the aggressive stomach acid. The bacterium adheres to the endothelial cells of the stomach using specific adhesins. One consequence of chronic mucosal colonization with Helicobacter pylori can be inflammatory granulocytic, later monocytic infiltration of the epithelium, which is about Inflammation mediators in turn contribute to tissue destruction. The infection stimulates both a local and a systemic humoral immune response, but without to be able to effect an effective elimination of the pathogen.
Eine Impfung ist der klassische Weg, um Infektionskrankheiten zu verhindern. Dabei beinhaltet die Entwicklung eines Impfstoffs die Identifikation von Faktoren, die für die Virulenz ausschlaggebend sind, bzw. von Strukturen, die für das menschliche Immunsystem zur Eliminierung eines Erregers zugänglich sind. Solche Antigene sind in der Regel in der äußeren Membran des Erregers zu finden. So sind in der äußeren Membran von Helicobacter pylori Adhäsine von 19,6 kD (Doig et al. (1992)) und 20 kD (Evans et al. (1993)) lokalisiert, die mögliche Kandidaten für einen experimentellen Impfstoff sind, mit dem Ziel, Antikörper zu induzieren, die die bakterielle Adhäsion an der mukosalen Oberfläche verhindern. Außerdem verfügt die äußere Membran von Helicobacter pylori über Porine mit Molekulargewichten von 30 kD (Tufano et al. (1994)), 48 kD, 49 kD, 50 kD, 67 kD (Exner et al. (1995)) und 31 kD (Doig et al. (1995)), sowie über Eisen-regulierte äußere Membranproteine mit den Molekulargewichten 48 kD, 50 kD und 77 kD (Worst et al. (1995)), Erythrocyten-bindende Antigene mit den Molekulargewichten 25 kD und 59 kD (Huang et al. (1992)) und Bindungsproteine für Laminin, Kollagen I und IV, Fibronektin und Vitronektin (Kondo et al. (1993)). Weiterhin sind Proteine mit Molekulargewichten von 19 kD (Drouet et al. (1991)), 50 kD (Exner et al., (1995)) und 30 kD (Bölin et al. (1995)) sowie ein Lipoprotein mit 20 kD (Kostrzynska et al. (1994)) und stammspezifische, oberflächenlokalisierte Antigene von 51 kD, 60 kD und 80 kD (Doig und Trust (1994)) beschrieben worden. Die Gene für die Proteine mit den Molekulargewichten von 20 kD (HpaA; Evans et al. (1993)) und 20 kD (Ipp20; Kostrzynska et al. (1994)) sind inzwischen isoliert worden. Die N-terminalen Proteinsequenzen für das Adhäsin mit den Molekulargewichten von 19,6 kD (Doig et al. (1992)), für die Porine mit den Molekulargewichten von 48 kD, 49 kD, 50 kD, 67 kD (Exner et al. (1995)), 30 kD (Tufano (1994)) und 31 kD (Doig et al. (1993)) und für das 50 kD-Protein (Exner et al. (1995)) wurden inzwischen bestimmt. Die Porine mit den Molekulargewichten von 48 kD, 49 kD, 50 kD, 67 kD (Exner et al., (1995)) und 31 kD (Doig et al., (1995)) wurden als Hop A, Hop B, Hop C, Hop D und Hop E bezeichnet. Diese gehören zu einer Familie von 32 hoch homologen äußeren Membranproteinen (Tomb et al. (1997)). Ein weiteres Mitglied dieser Familie wurde von Ilver et al. (1998) als ein Blutgruppenantigen-bindendes Antigen, Bab A, identifiziert. Allerdings konnte mit den bisher aus Helicobacter pylori isolierten und charakterisierten Proteinen kein zufriedenstellend wirksamer Impfstoff entwickelt werden.Vaccination is the classic way to prevent infectious diseases. Here Developing a vaccine involves identifying factors that are relevant to the Virulence are decisive, or of structures that are relevant to humans Immune system to eliminate a pathogen. Such antigens are in the Usually found in the outer membrane of the pathogen. So are in the outer membrane of Helicobacter pylori adhesins of 19.6 kD (Doig et al. (1992)) and 20 kD (Evans et al. (1993)) who are potential candidates for an experimental vaccine aiming to induce antibodies that promote bacterial adhesion to the mucosal Prevent surface. The outer membrane of Helicobacter pylori also has Porins with molecular weights of 30 kD (Tufano et al. (1994)), 48 kD, 49 kD, 50 kD, 67 kD (Exner et al. (1995)) and 31 kD (Doig et al. (1995)), as well as iron-regulated external ones Membrane proteins with the molecular weights 48 kD, 50 kD and 77 kD (Worst et al. (1995)), Erythrocyte-binding antigens with the molecular weights 25 kD and 59 kD (Huang et al. (1992)) and binding proteins for laminin, collagen I and IV, fibronectin and Vitronectin (Kondo et al. (1993)). Proteins with molecular weights of 19 kD are also (Drouet et al. (1991)), 50 kD (Exner et al., (1995)) and 30 kD (Bölin et al. (1995)) and a 20 kD lipoprotein (Kostrzynska et al. (1994)) and strain-specific, 51 kD, 60 kD and 80 kD surface-localized antigens (Doig and Trust (1994)) have been described. The genes for the proteins with the molecular weights of 20 kD (HpaA; Evans et al. (1993)) and 20 kD (Ipp20; Kostrzynska et al. (1994)) are meanwhile been isolated. The N-terminal protein sequences for the adhesin with the Molecular weights of 19.6 kD (Doig et al. (1992)), for the porins with the Molecular weights of 48 kD, 49 kD, 50 kD, 67 kD (Exner et al. (1995)), 30 kD (Tufano (1994)) and 31 kD (Doig et al. (1993)) and for the 50 kD protein (Exner et al. (1995)) have now been determined. The porins with the molecular weights of 48 kD, 49 kD, 50 kD, 67 kD (Exner et al., (1995)) and 31 kD (Doig et al., (1995)) were used as Hop A, Hop B, Hop C, Hop D and Hop E designated. These belong to a family of 32 tall homologous outer membrane proteins (Tomb et al. (1997)). Another member of this Family was designed by Ilver et al. (1998) as a blood group antigen binding antigen, Bab A, identified. However, with the previously isolated from Helicobacter pylori and characterized satisfactorily effective vaccine characterized proteins.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, einen wirksamen Impfstoff gegen Helicobacter pylori bereitzustellen.Thus, the present invention addresses the technical problem of being an effective one Provide vaccine against Helicobacter pylori.
Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt. Das erfindungsgemäße Antigen ermöglicht die Entwicklung eines Impfstoffs, der die Induktion einer Immunantwort gegen Helicobacter pylori in einem mit diesem Impfstoff geimpften Wirt auslöst. Es konnte ein von Helicobacter pylori stammendes äußeres (wahrscheinlich Eisen-reguliertes) Membranprotein mit einem Molekulargewicht von 97 kD charakterisiert werden, das sich überraschenderweise als einen ausgezeichneten Impfschutz bewirkend herausstellte. The solution to this technical problem is provided by the Characterized claims achieved embodiments. The invention Antigen enables the development of a vaccine that induces an immune response against Helicobacter pylori in a host vaccinated with this vaccine. It could an exterior (probably iron-regulated) originating from Helicobacter pylori Membrane protein with a molecular weight of 97 kD can be characterized surprisingly turned out to provide excellent vaccination protection.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine DNA-Sequenz, die ein äußeres Membranprotein von Helicobacter pylori mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 codiert oder die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 umfaßt.The present invention thus relates to a DNA sequence that contains an outer membrane protein of Helicobacter pylori with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the Nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit den immunogenen Eigenschaften des äußeren Membranproteins von Helicobacter pylori codiert, wobei sich die DNA-Sequenz von der DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 (1) in der Codonsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Code unterscheidet, (2) mit der DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder (1) hybridisiert, oder (3) ein Fragment, eine allelische Variante oder eine andere Variante der DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 ist.The present invention also relates to a DNA sequence that contains a protein with the immunogenic properties of Helicobacter pylori outer membrane protein encoded, the DNA sequence of the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 (1) in the Codon sequence differs due to the degeneration of the genetic code, (2) with the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 or (1) hybridizes, or (3) a fragment, an allelic Variant or another variant of the DNA sequence of SEQ ID NO: 1.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck "Protein mit den immunogenen Eigenschaften des äußeren Membranproteins von Helicobacter pylori bezieht sich auf jedes Protein, Polypeptid oder Peptid, das (1) als Antigen für Antikörper dienen kann, die an Helicobacter pyloris spezifisch binden oder (2) bei Verabreichung als Impfstoff eine Schutzwirkung gegenüber einer Infektion mit Helicobacter pylori hervorruft. Der Fachmann kann mittels üblicher Verfahren Proteine, Peptide oder Polypeptide bestimmen, die solche Eigenschaften aufweisen, beispielsweise mit den in den nachstehenden Beispielen offenbarten Verfahren. Beispielsweise besitzen diese Proteine, Polypeptide oder Peptide 50%, 60%, 70% oder 80%, vorzugsweise 90%, stärker bevorzugt 95% und am meisten bevorzugt 98% Homologie zu dem Membranprotein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, wobei diese Homologie beispielsweise durch den "Smith-Waterman"-Homologiesuche-Algorithmus, beispielsweise mit dem "MPSRCH"-Programm (Oxford Molecular), bestimmt werden kann, wobei eine "affinity gap search" (affine Lückensuche) mit den folgenden Parametern verwendet wird "gap open penalty 12, gap extension penalty 1".The term "protein with the immunogenic Properties of Helicobacter pylori outer membrane protein refers to each Protein, polypeptide or peptide which (1) can serve as an antigen for antibodies to the Bind Helicobacter pyloris specifically or (2) when administered as a vaccine Protective effect against infection with Helicobacter pylori. The specialist can using conventional methods to determine proteins, peptides or polypeptides that such Have properties such as those disclosed in the examples below Method. For example, these proteins, polypeptides or peptides have 50%, 60%, 70% or 80%, preferably 90%, more preferably 95% and most preferably 98% Homology to the membrane protein with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, whereby this Homology for example through the "Smith-Waterman" homology search algorithm, for example with the "MPSRCH" program (Oxford Molecular), using an "affinity gap search" with the following parameters becomes "gap open penalty 12, gap extension penalty 1".
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "hybridisieren" bezieht sich auf konventionelle Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridisierungsbedingungen, bei denen als Lösung 5 × SSPE, 1% SDS, 1 × Denhardts-Lösung verwendet werden und die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise zuerst mit 2 × SSC, 1% SDS und danach mit 0,2 × SSC bei Temperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C gewaschen (zur Definition von SSPE, SSC und Denhardts-Lösung siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)). The term "hybridize" as used in the present invention refers to conventional hybridization conditions, preferably on hybridization conditions which are used as a solution 5 × SSPE, 1% SDS, 1 × Denhardts solution and the Hybridization temperatures are between 35 ° C and 70 ° C, preferably 65 ° C. After Hybridization is preferably done first with 2 × SSC, 1% SDS and then with 0.2 × SSC Temperatures between 35 ° C and 70 ° C, preferably washed at 65 ° C (to define SSPE, SSC and Denhardts solution see Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)).
Besonders bevorzugt sind stringente Hybridisierungsbedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind.Stringent hybridization conditions, as described, for example, in Sambrook et al., Supra.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe "Varianten" oder "Fragment" umfassen DNA-Moleküle, die sich gegenüber der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Sequenz durch Deletion(en), Insertion(en), Austausch(e) und/oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen unterscheiden bzw. ein Fragment des ursprünglichen Nukleinsäuremoleküls umfassen, wobei das durch diese DNA-Moleküle codierte Protein noch die vorstehend erwähnten Eigenschaften aufweist. Dazu zählen auch Allelvarianten. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Nucleinsäuresequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., supra. Der Fachmann ist auch in der Lage, zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nukleinsäuresequenz codiertes Protein noch über die vorstehend erwähnten Eigenschaften verfügt, beispielsweise über die in den Beispielen beschriebenen Verfahren.The terms "variants" or "fragment" used in the present invention include DNA molecules that differ from the sequence given in SEQ ID NO: 1 Deletion (s), insertion (s), exchange (s) and / or other known in the art Differentiate modifications or a fragment of the original nucleic acid molecule comprise, wherein the protein encoded by these DNA molecules still the above features mentioned. This also includes allele variants. Production process the above changes in nucleic acid sequence are known to those skilled in the art and in Standard works of molecular biology described, for example in Sambrook et al., Supra. One skilled in the art will also be able to determine whether one of such changes Nucleic acid sequence encoded protein still on the properties mentioned above has, for example, the methods described in the examples.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch DNA- Sequenzen, die das äußere Membranprotein von Helicobacter pylori von der Aminosäure Nr. 17 bis 863 (aa17-863) von SEQ ID NO: 1 (d. h., das Protein ohne Signalsequenz) oder von der Aminosäure Nr. 254 bis 323 (aa254-323) von SEQ ID NO: 1 codieren.In a particularly preferred embodiment, the present invention also relates to DNA Sequences that the outer membrane protein of Helicobacter pylori from the amino acid Nos. 17 to 863 (aa17-863) of SEQ ID NO: 1 (i.e. the protein with no signal sequence) or encode from amino acid number 254 to 323 (aa254-323) of SEQ ID NO: 1.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch in einen Vektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese DNA-Sequenzen enthaltende Vektoren. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid (z. B. pUC18, pBR322, pBlueScript), auf ein Virus oder ein anderes geeignetes Vehikel. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNA-Molekül im Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E. coli, zählen der lac-trp-Promotor oder T7- Promotor, und für die Expression in Eukaryonten der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe, und der CMV-, SV40-, RVS-40-Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor. Zu geeigneten Vektoren zählen beispielsweise auf T7 basierende Expressionsvektoren für die Expression in Bakterien (Rosenberg et al. (1987)), pMSXND für die Expression in Säugerzellen (Lee und Nathans (1988)), und von Baculovirus abgeleitete Vektoren für die Expression in Insektenzellen. The DNA sequences according to the invention can also be inserted into a vector. Consequently the present invention also encompasses vectors containing these DNA sequences. The The term "vector" refers to a plasmid (e.g. pUC18, pBR322, pBlueScript) Virus or other suitable vehicle. In a preferred embodiment, this is DNA molecule according to the invention functionally linked in vector with regulatory elements, which allow its expression in prokaryotic or eukaryotic host cells. Such In addition to the regulatory elements, for example a promoter, vectors contain typically an origin of replication and specific genes that represent the phenotypic Allow selection of a transformed host cell. The regulatory elements for the Expression in prokaryotes, for example E. coli, include the lac trp promoter or T7 Promoter, and for expression in eukaryotes the AOX1 or GAL1 promoter in yeast, and the CMV, SV40, RVS-40 promoter, CMV or SV40 enhancer for expression in animal Cells. Further examples of suitable promoters are the metallothionein I and the Polyhedrin promoter. Suitable vectors include, for example, T7-based ones Expression vectors for expression in bacteria (Rosenberg et al. (1987)), pMSXND for the Expression in mammalian cells (Lee and Nathans (1988)), and derived from baculovirus Vectors for expression in insect cells.
Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind.General methods known in the art can be used to construct Expression vectors, the DNA sequences according to the invention and suitable Control sequences included can be used. These methods include, for example, in vitro recombination techniques, synthetic methods, as well as in vivo recombination methods, as described for example in Sambrook et al., supra.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien, Hefe, Insekten- und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen sind CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK, 293- und WI38-Zellen. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.The present invention also relates to the vectors described above Host cells. These host cells include bacteria, yeast, insect and animal cells, preferably mammalian cells. Preferred mammalian cells are CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293 and WI38 cells. Process for transforming these host cells phenotypic selection of transformants and for expression of the invention DNA molecules using the vectors described above are on the Known in the field.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codierten äußeren Membranproteins von Helicobacter pylori oder eines Fragments oder eines Proteins mit dessen immunogenen Eigenschaften, das die Kultivierung einer vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen umfaßt, die die Expression des Proteins erlauben (vorzugsweise stabile Expression), und die Gewinnung des Proteins aus der Kultur oder aus den Wirtszellen. Geeignete Verfahren zur rekombinanten Herstellung des Proteins sind allgemein bekannt (siehe beispielsweise Holmgren (1985); LaVallie et al. (1993); Wong (1995); Romanos (1995); Williams (1995); Davies (1995)). Auch geeignete Reinigungsverfahren (beispielsweise präparative Chromatographie, Affinitätschromatographie, beispielsweise Immunaffinitätschromatographie, HPLC etc.) sind allgemein bekannt.The present invention further relates to a method for producing one of the DNA sequences of Helicobacter encoded according to the invention DNA sequences pylori or a fragment or a protein with its immunogenic properties, the culturing a host cell as described above under conditions that Allow expression of the protein (preferably stable expression), and the recovery of the Proteins from culture or from host cells. Suitable recombinant methods Production of the protein is generally known (see, for example, Holmgren (1985); LaVallie et al. (1993); Wong (1995); Romanos (1995); Williams (1995); Davies (1995)). Also suitable purification processes (e.g. preparative chromatography, Affinity chromatography, for example immunoaffinity chromatography, HPLC etc.) well known.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung somit auch ein von den vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen codiertes oder nach dem vorstehenden Verfahren erhaltenes äußeres Membranprotein von Helicobacter pylori, ein Fragment davon oder Protein mit dessen immunogenen Eigenschaften. Die erfindungsgemäßen Proteine können außerdem gemäß üblicher, auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren modifiziert sein. Zu diesen Modifikationen zählen Austausche, Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren, die die Struktur des Proteins modifizieren, wobei seine immunologischen Eigenschaften im Wesentlichen erhalten bleiben. Zu den Austauschen zählen vorzugsweise "konservative" Austausche von Aminosäureresten, d. h. Austausche gegen biologisch ähnliche Reste, z. B. die Substitution eines hydrophoben Rests (z. B. Isoleucin, Valin, Leucin, Methionin) gegen einen anderen hydrophoben Rest oder die Substitution eines polaren Rests gegen einen anderen polaren Rest (z. B. Arginin gegen Lysin, Glutaminsäure gegen Asparaginsäure etc.). Deletionen können zur Erzeugung von Molekülen führen, die eine deutlich geringere Größe aufweisen, d. h., denen beispielsweise Aminosäuren am N- oder C-Terminus fehlen.In a further embodiment, the present invention thus also relates to one of the DNA sequences described above encoded or according to the above method Outer membrane protein obtained from Helicobacter pylori, a fragment thereof or Protein with its immunogenic properties. The proteins of the invention can also be modified according to conventional methods known in the art. To These modifications include exchanges, insertions, or deletions of amino acids that modify the structure of the protein, its immunological properties in the Mainly preserved. The exchanges preferably include "conservative" Exchanges of amino acid residues, i.e. H. Exchange for biologically similar residues, e.g. B. the Substitution of a hydrophobic residue (e.g. isoleucine, valine, leucine, methionine) against one another hydrophobic residue or the substitution of one polar residue for another polar residue (e.g. arginine against lysine, glutamic acid against aspartic acid etc.). Deletions can lead to the generation of molecules that are significantly smaller in size, i. H., which, for example, lack amino acids at the N or C terminus.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine immunogene Zusammensetzung, vorzugsweise einen Impfstoff, (die) der das vorstehend beschriebene äußere Membranprotein von Helicobacter pylori ein Fragment davon oder Protein mit dessen immunogenen Eigenschaften enthält. Der erfindungsgemäße Impfstoff enthält gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Impfstoffe sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung des Impfstoffs kann oral oder parenteral, beispielsweise intradermal, subkutan oder intramuskulär, erfolgen. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von der Art der Verabreichung, von dem Alter und Gewicht des Empfängers etc. Sie kann beispielweise im Bereich von 10 µg bis 40 µg pro Patient liegen. Bei Kindern erniedrigt sich die Dosis auf 5 µg und bei Hämodialyse- Patienten erhöht sich die Dosis auf 40 µg.The present invention also relates to an immunogenic composition, preferably a vaccine which is the one described above Membrane protein from Helicobacter pylori a fragment thereof or protein with it contains immunogenic properties. The vaccine according to the invention contains optionally additionally a pharmaceutically acceptable carrier. Suitable carriers and the Formulations of such vaccines are known to the person skilled in the art. Suitable carriers include for example phosphate-buffered saline solutions, water, emulsions, for example Oil / water emulsions, wetting agents, sterile solutions etc. The administration of the vaccine can be orally or parenterally, for example intradermally, subcutaneously or intramuscularly, respectively. The appropriate dosage is determined by the attending doctor and depends on various factors, for example on the type of administration, on the Age and weight of the recipient etc. It can range, for example, from 10 µg to 40 µg per patient. In children the dose is reduced to 5 µg and in hemodialysis Patients increase the dose to 40 µg.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch die Verwendung des vorstehend beschriebenen äußeren Membranproteins von Helicobacter pylori, eines Fragments davon oder eines Proteins mit dessen immunogenen Eigenschaften zur Herstellung eines Impfstoffes zur Induktion einer Immunantwort gegen Helicobacter pylori in einem mit dem Impfstoff geimpften Empfänger.The present invention thus also relates to the use of the above described outer membrane protein of Helicobacter pylori, a fragment thereof or a protein with its immunogenic properties for the production of a Vaccine for inducing an immune response against Helicobacter pylori in one with the Vaccine vaccinated recipient.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Antikörper gegen das vorstehend beschriebene äußere Membranprotein von Helicobacter pylori, ein Fragment davon oder Protein mit dessen immunogenen Eigenschaften. Diese Antikörper können monoclonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon, beispielsweise Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente. Vorzugsweise handelt es sich dabei um monoclonale Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei das von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codierte Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Verfahren zur Gewinnung monoclonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise als ersten Schritt die Herstellung von polyclonalen Antikörpern unter Verwendung des erfindungsgemäßen äußeren Membranproteins oder Fragmenten davon (beispielsweise synthetische Peptide) mit geeigneten Ligandensequenzen, beispielsweise die in den Beispielen beschriebenen Peptide oder Fragmente davon, als Immunogen zur Immunisierung geeigneter Tiere und die Gewinnung von gegen das definierte Antigen sensibilisierten B-Lymphozyten. Dann werden beispielsweise Zell-Hybride aus Antikörper produzierenden Zellen und Knochenmark-Tumorzellen hergestellt und cloniert. Anschließend wird ein Clon selektioniert, der einen Antikörper produziert, der für das verwendete Antigen spezifisch ist. Dieser Antikörper wird dann hergestellt. Beispiele von Zellen, die Antikörper produzieren, sind Milzzellen, Lymphknotenzellen, B-Lymphozyten etc.. Beispiele von Tieren, die zu diesem Zweck immunisiert werden können, sind Mäuse, Ratten, Pferde, Ziegen und Kaninchen. Die Myelomzellen lassen sich aus Mäusen, Ratten, Menschen oder anderen Quellen erhalten. Die Zellfusion kann man beispielsweise durch das allgemein bekannte Verfahren von Köhler und Milstein durchführen. Die durch Zellfusion erhaltenen Hybridome werden mittels dem Antigen nach dem Enzym-Antikörper- Verfahren oder nach einem ähnlichen Verfahren abgesucht. Clone werden beispielsweise mit dem Grenz-Verdünnungsverfahren erhalten. Die erhaltenen Clone werden beispielsweise BALB/c-Mäusen intraperitoneal implantiert, nach 10 bis 14 Tagen wird der Ascites der Maus entnommen, und der monoclonale Antikörper durch bekannte Verfahren (beispielsweise Ammoniumsulfatfraktionierung, PEG-Fraktionierung, Ionenaustausch chromatographie, Gelchromatographie oder Affinitätschromatographie) gereinigt.Another preferred embodiment of the present invention relates to antibodies against the outer membrane protein of Helicobacter pylori described above Fragment thereof or protein with its immunogenic properties. These antibodies can be monoclonal, polyclonal or synthetic antibodies or fragments thereof, for example Fab, Fv or scFv fragments. These are preferably monoclonal antibodies. The antibodies of the invention can according to standard procedures are produced, the protein encoded by the DNA sequences according to the invention or a synthetic fragment thereof serve as an immunogen. Extraction process monoclonal antibodies are known to the person skilled in the art and include, for example, as first step is the production of polyclonal antibodies using the outer membrane protein according to the invention or fragments thereof (for example synthetic peptides) with suitable ligand sequences, for example those in the Examples described peptides or fragments thereof, as immunogen for Immunization of suitable animals and the extraction of against the defined antigen sensitized B lymphocytes. Then, for example, cell hybrids become antibodies producing and cloned bone marrow tumor cells. A clone is then selected which produces an antibody which is suitable for the antigen used is specific. This antibody is then made. Examples of Cells that produce antibodies are spleen cells, lymph node cells, B lymphocytes etc. Examples of animals that can be immunized for this purpose are mice, Rats, horses, goats and rabbits. The myeloma cells can be derived from mice, rats, People or other sources. The cell fusion can be done, for example, by carry out the well-known Köhler and Milstein method. By Hybridomas obtained from cell fusion are isolated using the antigen following the enzyme-antibody Procedure or searched for a similar procedure. For example, clones obtained with the limit dilution method. The clones obtained are for example, BALB / c mice are implanted intraperitoneally, after 10 to 14 days the Ascites are taken from the mouse, and the monoclonal antibody by known methods (e.g. ammonium sulfate fractionation, PEG fractionation, ion exchange chromatography, gel chromatography or affinity chromatography).
Der gewonnene Antikörper kann direkt verwendet werden oder es kann ein Fragment davon verwendet werden. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoclonalen Antikörpers (z. B. Fab-, Fv- oder "single chain Fv"-Fragmente), welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt.The antibody obtained can be used directly or it can be a fragment of which are used. In this context, the term "fragment" means everyone Parts of the monoclonal antibody (eg Fab, Fv or "single chain Fv" fragments), which have the same epitope specificity as the complete antibody. The The production of such fragments is known to the person skilled in the art.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der genannte monoclonale Antikörper ein aus einem Tier (z. B. Maus) stammender Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein chimärer Antikörper oder ein Fragment davon. Chimäre, menschlichen Antikörper ähnelnde oder humanisierte Antikörper besitzen eine herabgesetzte potentielle Antigenität, jedoch ist ihre Affinität gegenüber dem Ziel nicht herabgesetzt. Die Herstellung von chimären und humanisierten Antikörpern bzw. von den menschlichen Antikörpern ähnelnden Antikörpern wurde ausführlich beschrieben (siehe beispielsweise Queen et al., 1989; Verhoeyan et al., 1988). Humanisierte Immunglobuline weisen variable Grundgerüstbereiche auf, die im wesentlichen von einem humanen Immunglobulin stammen (mit der Bezeichnung Akzeptor-Immunglobulin) und die Komplementarität der determinierenden Bereiche, die im wesentlichen von einem nicht-menschlichen Immunglobulin (z. B. von der Maus) stammen (mit der Bezeichnung Donor-Immunglobulin). Die (der) konstante(n) Bereich(e) stammt/stammen, falls vorhanden, auch im wesentlichen von einem menschlichen Immunglobulin. Bei der Verabreichung an menschliche Patienten bieten humanisierte (sowie die menschlichen) Antikörper eine Reihe von Vorteilen gegenüber Antikörpern von Mäusen oder anderen Spezies: (a) das menschliche Immunsystem sollte das Grundgerüst oder den konstanten Bereich des humanisierten Antikörpers nicht als fremd erkennen und daher sollte die Antikörper-Antwort gegen einen solchen injizierten Antikörper geringer ausfallen als gegen einen vollständig fremden Maus- Antikörper oder einen partiell fremden chimären Antikörper; (b) da der Effektorbereich des humanisierten Antikörpers menschlich ist, dürfte er mit anderen Teilen des menschlichen Immunsystems besser interagieren, und (c) injizierte humanisierte Antikörper weisen eine Halbwertszeit auf, die im wesentlichen zu der von natürlich vorkommenden menschlichen Antikörpern äquivalent ist, was es erlaubt, kleinere und weniger häufige Dosen im Vergleich zu Antikörpern anderer Spezies zu verabreichen.In a particularly preferred embodiment, the monoclonal antibody mentioned is an antibody derived from an animal (e.g. mouse), a humanized antibody or a chimeric antibody or a fragment thereof. Chimeric, human antibodies Similar or humanized antibodies have a reduced potential antigenicity, however, their affinity for the target is not reduced. The production of chimeric and humanized antibodies or from human antibodies similar antibodies have been described in detail (see for example Queen et al., 1989; Verhoeyan et al., 1988). Humanized immunoglobulins have variable Basic scaffold areas based essentially on a human immunoglobulin originate (called acceptor immunoglobulin) and the complementarity of determining areas essentially by a non-human Immunoglobulin (e.g. from the mouse) originate (with the name donor immunoglobulin). The constant region (s), if any, also originate essentially from a human immunoglobulin. When administered to human patients humanized (as well as human) antibodies offer a number of advantages to antibodies from mice or other species: (a) human The immune system should be the basic framework or the constant area of the humanized Do not recognize the antibody as foreign and therefore the antibody response against you such injected antibodies are lower than those against a completely foreign mouse Antibodies or a partially foreign chimeric antibody; (b) since the effector area of the humanized antibody is human, it is likely to be associated with other parts of the human Immune system interact better, and (c) injected humanized antibodies have a Half-life which is essentially that of naturally occurring human Antibody equivalent is what allows it to compare smaller and less common doses to give antibodies to other species.
Die vorstehend beschriebenen Antikörper oder Fragmente davon können beispielsweise zur Immunpräzipitation der vorstehend diskutierten Proteine oder zur Isolierung verwandter Proteine aus cDNA-Expressionsbanken verwendet werden. Die Antikörper können beispielsweise in Immunoassays in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebunden werden. Dabei können die Antikörper auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immunassays sind ELISA und RIA. Die vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Antikörper können auch für eine passive Immunisierung verwendet werden, d. h. zur Bekämpfung einer bereits bestehenden Infektion mit Helicobacter pylori, wobei hinsichtlich der Herstellung des, diesen Antikörper bzw. die vorstehend beschriebenen Fragmente etc. enthaltenden Arzneimittels, der Art der Verabreichung und der Dosierung im Prinzip die üblichen Kriterien zugrundegelegt werden, wie diese für andere passive Impfstoffe, beispielsweise für Tetagam® oder Beriglobin®, erfüllt werden.The antibodies or fragments thereof described above can be used, for example, for Immunoprecipitation of the proteins discussed above or for isolation of related proteins from cDNA expression banks can be used. The antibodies can, for example, in Immunoassays in liquid phase or bound to a solid support. You can the antibodies are labeled in different ways. Suitable markers and Marking methods are known in the art. Examples of immunoassays are ELISA and RIA. The antibodies according to the invention described above can also be used for passive immunization is used, d. H. to combat an already existing infection with Helicobacter pylori, with regard to the production of this Medicament or medicament containing the fragments etc. described above, the usual criteria for the type of administration and the dosage are used as a basis for other passive vaccines, e.g. for Tetagam® or Beriglobin®.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Arzneimittel, enthaltend die vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Antikörper bzw. ein Fragment davon, bzw. deren Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels zur passiven Immunisierung.Thus, the present invention also relates to a medicament containing the above Antibodies described according to the invention or a fragment thereof, or their Use for the manufacture of a medicament for passive immunization.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Hybridom, das den vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper erzeugt. The present invention also relates to a hybridoma that is described above produces monoclonal antibodies.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Diagnoseverfahren zum Nachweis einer akuten, chronischen oder früheren Infektion mit Helicobacter pylori, bei dem man gegen Helicobacter pylori gerichtete Antikörper aus einer Probe mit dem erfindungsgemäßen äußeren Membranprotein von Helicobacter pylori, einem Fragment davon oder Protein mit dessen immunogenen Eigenschaften in Berührung bringt und sodann bestimmt, ob diese an das Antigen gebunden sind. Dabei findet der Nachweis dadurch statt, daß in der Probe vom Wirt erzeugte Antikörper gegen Helicobacter pylori nachgewiesen werden (mittels des erfindungsgemäßen Antigens).Furthermore, the present invention also relates to a diagnostic method for the detection of a acute, chronic or previous infection with Helicobacter pylori, in which one against Helicobacter pylori directed antibodies from a sample with the invention outer membrane protein of Helicobacter pylori, a fragment thereof or protein with whose immunogenic properties come into contact and then determines whether these are bound to the antigen. The detection takes place in that in the sample Antibodies against Helicobacter pylori generated by the host are detected (by means of the antigen according to the invention).
Bei diesem Diagnoseverfahren wird eine Blutprobe entnommen, das Serum gewonnen und mit dem erfindungsgemäßen Antigen in Berührung gebracht und sodann bestimmt, ob Antikörper aus dem Serum an das Antigen gebunden sind. Das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren kann als ELISA, RIA oder ein anderes gängiges Nachweisverfahren ausgestaltet sein, bei dem beispielsweise der aus dem Serum gebundene Antikörper mit Hilfe eines Zweitantikörpers nachzuweisen ist. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens ist das Antigen oder ein Fragment davon immobilisiert, d. h. beispielsweise an der Wand einer Plastikschale so adsorbiert, daß die spezifische Bindungsspezifität erhalten bleibt.In this diagnostic procedure, a blood sample is taken, the serum is obtained and brought into contact with the antigen of the invention and then determined whether Antibodies from the serum are bound to the antigen. The invention Diagnostic procedures can be performed as an ELISA, RIA, or other common detection method be designed in which, for example, the antibody bound from the serum With the help of a second antibody. In a preferred embodiment of the The diagnostic method according to the invention is the antigen or a fragment thereof immobilized, d. H. For example, adsorbed on the wall of a plastic tray so that the specific binding specificity is retained.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Diagnoseverfahrens, der das erfindungsgemäße äußere Membranprotein von Helicobacter pylori, ein Fragment davon oder Protein mit dessen immunogenen Eigenschaften oder den vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Antikörper oder das Fragment davon enthält. Je nach Ausgestaltung des diagnostischen Kits können das vorstehend beschriebene äußere Membranprotein von Helicobacter pylori, das Fragment davon oder Protein mit den gleichen immunogenen Eigenschaften bzw. der vorstehend beschriebene Antikörper oder das Fragment davon immobilisiert sein.Finally, the present invention relates to a diagnostic kit for performing the The diagnostic method described above, which is the external according to the invention Membrane protein from Helicobacter pylori, a fragment thereof or protein with the same immunogenic properties or the above-described inventive Contains antibodies or the fragment thereof. Depending on the design of the diagnostic Kits can contain the Helicobacter pylori outer membrane protein described above, the fragment thereof or protein with the same immunogenic properties or the Antibodies described above or the fragment thereof can be immobilized.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. The following examples illustrate the invention.
Helicobacter pylori wurde kultiviert und die Membranfraktion isoliert wie in den Beispielen 1 und 2 von WO 98/04702 beschrieben. Drei Kaninchen wurden mit 0,2 mg der Membranfraktion in kompletten Freund'schen Adjuvans (CFA) subkutan an 8 verschiedenen Stellen in der Nähe von Lymphknoten immunisiert. Daraufhin wurden die Kaninchen nach zwei Wochen mit 0,4 mg Membranfraktion in CFA wie oben beschrieben und nach weiteren zwei Wochen mit 0,1 mg Membranfraktion in Aerosil (Siliziumdioxid) insgesamt zehnmal täglich geboostert. Nach einer weiteren Woche wurden die Kaninchen entblutet und die Seren gewonnen. Die gegen Bestandteile von Escherichia coli gerichteten Antikörper wurden aus den Seren nach dem Verfahren von Gruber und Zingales (1995) entfernt.Helicobacter pylori was cultivated and the membrane fraction isolated as in Examples 1 and 2 of WO 98/04702. Three rabbits were treated with 0.2 mg of Membrane fraction in complete Freund's adjuvant (CFA) subcutaneously on 8 immunized various sites near lymph nodes. Then the Rabbits after two weeks with 0.4 mg membrane fraction in CFA as described above and after another two weeks with 0.1 mg membrane fraction in Aerosil (silicon dioxide) boosted a total of ten times a day. After another week, the rabbits exsanguinated and the sera recovered. The directed against components of Escherichia coli Antibodies were extracted from the sera according to the method of Gruber and Zingales (1995) away.
Genomische DNA des Helicobacter pylori Stammes ATCC 43504 wurde mit Hilfe der DNAzol Methode von GIBCO/BRL (Katalog-Nr. 10503) präpariert. Diese wurde mit den Restriktionsenzymen AluI und Hae III nach der Vorschrift von Sambrook et al. (1989) partiell verdaut. DNA, die größer als 200 bp war, wurde nach Auftrennung der partiell verdauten DNA mittels LMP-Gelelektrophorese ausgeschnitten, die Agarose durch Gelase (BIOzym Diagnostik GmbH, Hameln) verdaut und die verbleibende DNA nach Phenol-Choroform- Extraktion mit Ethanol gefällt. Anschließend wurde an die Enden der partiell verdauten DNA-Fragmente ein EcoRI/Not I Adaptor (Pharmacia, Cat No. 27-7791) nach der Vorschrift von Sambrook et al. (1989) anligiert. Die Ligationsansätze wurden mit einer Tip5-Säule (Qiagen) gereinigt, die Enden der DNA-Fragmente mit Polynukleotidkinase phosphoryliert und die überschüssigen Adaptormoleküle mittels 1%iger LMP-Agarosegelelektrophorese abgetrennt. DNA, die größer als 200 bp war, wurde aus dem Gel ausgeschnitten, die Agarose durch Gelase verdaut und die DNA schließlich mit Ethanol gefällt.Genomic DNA of the Helicobacter pylori strain ATCC 43504 was obtained using the DNAzol method prepared by GIBCO / BRL (Catalog No. 10503). This was with the Restriction enzymes AluI and Hae III according to the Sambrook et al. (1989) partially digested. DNA that was larger than 200 bp was partially digested after separation of the DNA was cut out by LMP gel electrophoresis, the agarose by gelase (BIOzym Diagnostik GmbH, Hameln) digested and the remaining DNA after phenol-choroform Extraction with ethanol precipitated. The digest was then partially digested DNA fragments of an EcoRI / Not I adapter (Pharmacia, Cat No. 27-7791) according to the instructions by Sambrook et al. (1989) ligated. The ligation batches were made with a Tip5 column (Qiagen) cleaned, the ends of the DNA fragments phosphorylated with polynucleotide kinase and the excess adapter molecules using 1% LMP agarose gel electrophoresis severed. DNA that was greater than 200 bp was excised from the gel Agarose digested by gelase and the DNA finally precipitated with ethanol.
Die mit dem EcoRI-Adaptor versehenen AluI- bzw. Hae III-Fragmente der genomischen DNA wurden nach der Vorschrift des Herstellers (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, USA, λTriplExTM library, Gebrauchsinformation) in mit EcoRI verdaute, dephosphorylierte λTriplEx-Arme (Cat. No. #6161-1) ligiert und anschließend mit Hilfe des "Gigapack II Gold"- Verpackungsextraktes (Stratagene GmbH, Heidelberg, Deutschland; Cat. No. #200216) in Phagenköpfe verpackt. λTriplEx ist ein λ-Vektor, der in zwei unterschiedlichen Leserahmen über zwei Translationsstartstellen verfügt und über eine Thymidinreihe verfügt, die am Beginn der Translation den Ribosomen eine Verschiebung im Leserahmen erlaubt, so daß in den Vektor inserierte DNA in allen drei Leserahmen abgelesen werden kann und somit in einem Immunscreening die Nachweiswahrscheinlichkeit über Antikörper drastisch erhöht wird. Der Titer der Genbanken konnte auf 5,0 × 105 pfu/ml (AluI-Genbank; 6% nicht rekombinant) und 4,5 × 105 pfu/ml (Hae III-Genbank; 11% nicht rekombinant) bestimmt werden. Die Größe der inserierten DNA wurde von acht Phagenplaques nach einem PCR- Protokoll (λTriplExTM library, Gebrauchsinformation) auf 0,5 kb bis 5,0 kb bestimmt.The AlRI and Hae III fragments of the genomic DNA provided with the EcoRI adapter were, according to the manufacturer's instructions (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, USA, λTriplEx TM library, instructions for use), in dephosphorylated λTriplEx arms digested with EcoRI (Cat. No. # 6161-1) ligated and then packed into phage heads using the "Gigapack II Gold" packaging extract (Stratagene GmbH, Heidelberg, Germany; Cat. No. # 200216). λTriplEx is a λ vector that has two translation starting points in two different reading frames and has a thymidine row that allows the ribosomes to be shifted in the reading frame at the start of translation, so that DNA inserted into the vector can be read in all three reading frames and thus the probability of detection via antibodies is drastically increased in an immune screening. The titer of the gene banks could be determined to be 5.0 × 10 5 pfu / ml (AluI gene bank; 6% not recombinant) and 4.5 × 10 5 pfu / ml (Hae III gene bank; 11% not recombinant). The size of the inserted DNA was determined from eight phage plaques according to a PCR protocol (λTriplEx ™ library, instructions for use) to be 0.5 kb to 5.0 kb.
24000 pfu der AluI-Genbank wurden auf zwei 150 mm LB-Agarplatten mit dem E. coli Stamm XL1-Blue MRF (Stratagene GmbH, Heidelberg) ausplattiert, die Phagenplaques auf Nitrocellulose transferiert, die unspezifischen Bindungsstellen abgesättigt, die Filter mit einem 1 : 500 verdünnten, fünfmal gegen E. coli abgesättigten Kaninchenserenpool von drei Immunisierungen (siehe Beispiel 1) inkubiert und die an die Plaques gebundenden Antikörper mit einem an alkalische Phosphatase konjugierten Sekundärantikörper nachgewiesen (Clontech, λTriplExTM-Gebrauchsinformation). Von beiden Agarplatten wurden die positiv reagierenden Phagenplaques gepickt und nochmals einem Screening unterworfen, um die Plaques zu vereinzeln. Aus dem zweiten Screening resultierten insgesamt 60 positive Klone.24000 pfu of the AluI gene bank were plated on two 150 mm LB agar plates with the E. coli strain XL1-Blue MRF (Stratagene GmbH, Heidelberg), the phage plaques were transferred to nitrocellulose, the non-specific binding sites were saturated, the filters with a 1: 500 diluted rabbit sera pool, five times saturated with E. coli, from three immunizations (see Example 1) and the antibodies bound to the plaques were detected with a secondary antibody conjugated to alkaline phosphatase (Clontech, λTriplEx ™ package leaflet). The positively reacting phage plaques were picked from both agar plates and subjected to a further screening in order to separate the plaques. The second screening resulted in a total of 60 positive clones.
Die 60 positiv reagierenden Phagenplaques wurden auf 2 LB-Platten getüpfelt und die Plaques wurden auf mehrere Nitrocellulosefilter transferiert. Anschließend wurde mit verschiedenen Genfragmenten der Helicobacter pylori Gene ureA, ureB und cat, die mit Hilfe des "DIG DNA"-Markierungs- und Nachweiskits (Boehringer Mannheim) mit Digoxigenin markiert wurden, hybridisiert. Es konnten jeweils 14 Plaques indentifiziert werden, die mit Gensonden von ureA, ureB bzw. cat hybridisierten. Bei einem wiederholten Screening der 60 Plaques mit dem anti-Membranserum konnten 19 Plaques nicht mehr eindeutig nachgewiesen werden, so daß nur noch 13 Klone zur weiteren Analyse Verwendung fanden.The 60 positive phage plaques were spotted on 2 LB plates and the Plaques were transferred to several nitrocellulose filters. Then was with different gene fragments of the Helicobacter pylori genes ureA, ureB and cat, which with Help with the "DIG DNA" labeling and detection kit (Boehringer Mannheim) Digoxigenin were hybridized. 14 plaques each could be identified that hybridized with ureA, ureB or cat gene probes. With a repeated Screening of the 60 plaques with the anti-membrane serum was no longer possible for 19 plaques clearly detected, leaving only 13 clones for further analysis Were used.
Aus den 13 Phagenplaques wurde unter Benutzung des Exzisionsprotokolls von Clontech (λTriplExTM-Genbank, Gebrauchsinformation) Plasmid-DNA gewonnen. Dies wird dadurch erreicht, indem eine Plasmid-DNA in dem λTriplEx Vektor mit der λ-spezifischen DNA über die lox P-Stellen verbunden sind, die eine Konversion über eine stellenspezifische Rekombination erlauben. Die inserierte DNA aller 13 Plasmide wurde mit den die multiple Klonierungsstelle von pTriplEx flankierenden Primern von Clontech ("λTriplEx 5' LD-Insert Screening Amplimer", "λTriplExTM 3' LD-Insert Screening Amplimer") sequenziert. Acht der 13 inserierten DNA-Fragmente zeigten dabei Sequenzen, die für das Hitzeschockprotein hsp60 von Helicobacter pylori kodieren. Von den restlichen fünf inserierten DNA- Fragmenten erwiesen sich zwei als identisch, so daß die restlichen vier Sequenzen weiteren Untersuchungen unterworfen wurden.Plasmid DNA was obtained from the 13 phage plaques using the Clontech excision protocol (λTriplEx ™ library, package leaflet). This is achieved in that a plasmid DNA in the λTriplEx vector is connected to the λ-specific DNA via the lox P sites, which allow conversion via site-specific recombination. The inserted DNA of all 13 plasmids was sequenced with the primers from Clontech flanking the multiple cloning site of pTriplEx ("λTriplEx 5 'LD-Insert Screening Amplimer", "λTriplEx TM 3' LD-Insert Screening Amplimer"). Eight of the 13 inserted DNA fragments showed sequences that code for the heat shock protein hsp60 from Helicobacter pylori. Of the remaining five inserted DNA fragments, two proved to be identical, so that the remaining four sequences were subjected to further investigations.
Da die genomische Sequenz des Helicobacter pylori-Stammes 26695 inzwischen bekannt ist (Tomb et al., 1997) konnten die Sequenzen der inserierten DNA-Fragmente der vier Klone mit Hilfe des Programms "FastA" (Wisconsin Package, Unix, Version 8, Genetics Computer Group) bestimmten Genen zugeordnet und deren Aminosäuresequenzen abgeleitet werden. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der vier Gene wurden mit Hilfe des Programms "BlastP" unter Benutzung der Internetseite http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi- bin/BLAST/nph-blast gegen eine nicht-redundante Proteindatenbank (enthält "Gen Bank Translationen", "PDB", "Swiss Prot", "SPupdate", "PIR") verglichen. Damit gelang es, homologe Sequenzen diesen vier Aminosäuresequenzen zuzuordnen. Eine Aminosäuresequenz wurde als homolog zu der "(3R)-Hydroxymyristoyl-[acyl carrier protein]dehydratase" von Yersinia enterolitica (P 32205) gefunden, die schon in WO 98/04702 als 17 kD Protein beschrieben wurde. Die zweite Aminosäuresequenz zeigte sich als homolog zu der ATP-abhängigen DNA Helikase RecG von Escherichia coli (P 24230), die dritte Aminosäuresequenz ist homolog zur Biotin Carboxylase von Anabaena-Arten (Q 06862) und die vierte Sequenz zeigte sich als homolog zu dem Eisen-regulierten äußeren Membranprotein FrpB von Neisseria meningitidis (U 55377).Since the genomic sequence of the Helicobacter pylori strain 26695 is now known (Tomb et al., 1997) the sequences of the inserted DNA fragments of the four Clones using the "FastA" program (Wisconsin Package, Unix, Version 8, Genetics Computer Group) assigned to certain genes and their amino acid sequences be derived. The deduced amino acid sequences of the four genes were analyzed using of the "BlastP" program using the website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi- bin / BLAST / nph-blast against a non-redundant protein database (contains "Gen Bank Translations "," PDB "," Swiss Prot "," SPupdate "," PIR "). assign homologous sequences to these four amino acid sequences. A Amino acid sequence was found to be homologous to the "(3R) -hydroxymyristoyl- [acyl carrier protein] dehydratase "from Yersinia enterolitica (P 32205), which has already been described in WO 98/04702 has been described as a 17 kD protein. The second amino acid sequence was shown as homologous to the ATP-dependent DNA helicase RecG from Escherichia coli (P 24230), the third amino acid sequence is homologous to the biotin carboxylase from Anabaena species (Q 06862) and the fourth sequence was found to be homologous to the iron-regulated outer Membrane protein FrpB from Neisseria meningitidis (U 55377).
Die Phagenklone, die für die vier beschriebenen Aminosäuresequenzen kodieren, wurden benutzt, um aus dem mit E. coli abgesättigten Serum gegen die Membranfraktion nach der Methode von Ozaki et al. (1986) monospezifische Antikörper zu isolieren. Eine Western Blot-Analyse gegen ein Ganzkeim-Lysat von Helicobacter pylori zeigte, daß die monospezifischen Antikörper gegen den Clon, der für das Helikase-homologe Protein kodiert, ein ca. 60 kD großes Protein erkennen und daß die monospezifischen Antikörper gegen den Clon, der für das Eisen-regulierte äußere Membranprotein homologe Protein kodiert, ein ca. 97 kD großes Protein erkennen. Als Positivkontrolle wurde ein monospezifisches Antiserum verwendet, das mit einem Phagenclon gewonnen wurde, der ein Gen von ureA beinhaltet. Dieses erkennt im Western-Blot eine deutliche Proteinbande bei ca. 30 kD, was der Urease A-Untereinheit zugeordnet werden kann. Der Nachweis der monospezifischen Antikörper erfolgte mit Hilfe des "Vectastain ABC"-Kits (Vector Laboratories, Burlingame, USA).The phage clones that code for the four amino acid sequences described were identified used to isolate from the serum saturated with E. coli against the membrane fraction after the Ozaki et al. (1986) to isolate monospecific antibodies. A western Blot analysis against a whole germ lysate from Helicobacter pylori showed that the monospecific antibody against the clone responsible for the helicase homologous protein encoded, recognize an approximately 60 kD protein and that the monospecific antibodies against the clone, the protein homologous to the iron-regulated outer membrane protein encoded, recognize an approximately 97 kD protein. As a positive control, a used monospecific antiserum obtained with a phage clone that contains a gene from ureA. This recognizes a clear protein band in the Western blot at approx. 30 kD, which can be assigned to the urease A subunit. Evidence of monospecific antibodies were carried out using the "Vectastain ABC" kit (Vector Laboratories, Burlingame, USA).
Da unter den gefunden Genen nur dasjenige, das für das 97 kD Protein codiert, für ein äußeres Membranprotein codiert und somit ein potentieller Kandidat für die Gewinnung eines Impfstoffs darstellt, wurde dieses näher charakterisiert. SEQ ID NO: 1 zeigt die DNA- Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Gens, das für das 97 kD Antigen kodiert. Von der abgeleiteten Aminosäuresequenz entsprechen offensichtlich die 16 N- terminalen Reste einer Signalsequenz (Heijne (1985)). Das reife Protein von 847 Aminosäuren besitzt ein kalkuliertes Molekulargewicht von 94.1 kD und einen isoelektrischen Punkt von 9.90. Somit liegt das Molekulargewicht recht nahe zu dem Molekulargewicht von 97 kD, das durch SDS-Gelelektrophorese bestimmt wurde. Mit Hilfe von genomischer DNA des Helicobacter pylori-Stammes ATCC 43504 wurde nach bekannten Verfahren (Ausubel et al.) das Genfragment, das für das reife Protein des 97 kD Antigens kodiert, durch PCR amplifiziert und in den Vektor pQE30 (Qiagen, Hilden, Deutschland) insertiert. Die Expression des 97 kD-Antigens in dem E. coli-Stamm "XL1 Blue" (Stratagene GmbH, Heidelberg) ließ sich mit dem Nachweis einer Proteinbande bei 97 kD nach SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Coomassie-Blau Färbung zeigen. Diese Proteinbande reagierte nach einer Western Blot-Analyse intensiv mit dem Antiserum, das gegen die Membranfraktion von H. pylori gerichtet ist.As only one of the genes found that codes for the 97 kD protein for a encoded outer membrane protein and thus a potential candidate for recovery of a vaccine was characterized in more detail. SEQ ID NO: 1 shows the DNA Sequence and the deduced amino acid sequence of the gene for the 97 kD antigen encoded. From the deduced amino acid sequence, the 16 N- obviously correspond terminal residues of a signal sequence (Heijne (1985)). The mature protein from 847 Amino acids have a calculated molecular weight of 94.1 kD and one isoelectric point from 9.90. Thus the molecular weight is quite close to that Molecular weight of 97 kD determined by SDS gel electrophoresis. Genomic DNA from the Helicobacter pylori strain ATCC 43504 was used to known method (Ausubel et al.) the gene fragment, which for the mature protein of 97 kD Antigen encoded, amplified by PCR and into the vector pQE30 (Qiagen, Hilden, Germany) inserted. Expression of the 97 kD antigen in the E. coli strain "XL1 Blue "(Stratagene GmbH, Heidelberg) got involved with the detection of a protein band Show 97 kD after SDS polyacrylamide gel electrophoresis and Coomassie blue staining. This protein band reacted intensively with the antiserum after a Western blot analysis, which is directed against the membrane fraction of H. pylori.
Da die Expressionsrate des kompletten 97 kD-Antigens niedrig war und nach Expression des Proteins in E. coli viele Abbauprodukte auftauchten, sollten Subgenregionen zur Expression gebracht werden, die unter Vorhersage des GCG-Programmes "Peptide Structure" (Wisconsin Package, Unix, Version 8) eine hohe Wahrscheinlichkeit auf Hydrophilizität und Oberflächenlokalisation haben. Hierzu wurden drei Regionen ermittelt: aa17-aa69, aa148-aa224 und aa254-aa323. Diese Regionen wurden nach bekannten Methoden amplifiziert und in dem Vektor pQE30 in E. coli "XL1 Blue"-Zellen zur Expression gebracht. Im Coomassie Blau-gefärbten SDS-Polyacrylamidgel ließen sich prominente Expressionsbanden nachweisen, die mit dem anti-Membranfraktionsserum bei der Western- Blot Analyse reagierten.Because the expression rate of the complete 97 kD antigen was low and after expression of the protein in E. coli many degradation products appeared, should subgene regions Expression can be brought about, predicting the GCG program "Peptides Structure "(Wisconsin Package, Unix, Version 8) have a high probability Have hydrophilicity and surface localization. Three regions were identified: aa17-aa69, aa148-aa224 and aa254-aa323. These regions were known after Methods amplified and expressed in the vector pQE30 in E. coli "XL1 Blue" cells for expression brought. In the Coomassie blue-stained SDS polyacrylamide gel, prominent people could be found Detect expression bands associated with the anti-membrane fraction serum in Western Blot analysis responded.
Die Reinigung der Expressionsprodukte erfolgte durch Bindung der N-terminal fusionierten Histidin-Reste an eine Nickel-Chelatsäule unter denaturierten Bedingungen nach einem modifizierten Protokoll von Qiagen ("The QIA expressionist, a handbook for high level expression and purification of 6 × His-tagged proteins", März 1997). Nach Aufschluß der E. coli-Bakterien mit Hilfe einer Glaskugelmühle (10 min bei 4000 U/min; 0,1-0,2 mm große Glaskugeln) wurde das Zellpellet in 0,1 M NaH2PO4, 8 M Harnstoff, 0,5 M NaCl, 0,02 M Imidazol, pH 8,0 solubilisiert, der Überstand über eine Nickel-Chelatsäule gegeben und nach dem Waschen das gebundene Protein schließlich mit 0,1 M NaH2PO4, 8 M Harnstoff, 0,5 M NaCl, 0,5 M Imidazol, pH 8,0 eluiert. Das Eluat wurde schrittweise gegen verschiedene Puffer, die 0,02 M Tris/HCl, Harnstoff, 0,8 M L-Arginin, 0,15 M NaCl, pH 8,0 enthielten, mit abnehmender Harnstoffkonzentration dialysiert.The expression products were purified by binding the N-terminally fused histidine residues to a nickel chelate column under denatured conditions according to a modified protocol from Qiagen ("The QIA expressionist, a handbook for high level expression and purification of 6 × His-tagged proteins ", March 1997). After disruption of the E. coli bacteria using a glass ball mill (10 min at 4000 rpm; 0.1-0.2 mm glass balls), the cell pellet was placed in 0.1 M NaH 2 PO 4 , 8 M urea, 0 , 5 M NaCl, 0.02 M imidazole, pH 8.0 solubilized, the supernatant passed over a nickel chelate column and after washing the bound protein finally with 0.1 M NaH 2 PO 4 , 8 M urea, 0.5 M NaCl, 0.5 M imidazole, pH 8.0 eluted. The eluate was gradually dialyzed against various buffers containing 0.02 M Tris / HCl, urea, 0.8 M L-arginine, 0.15 M NaCl, pH 8.0 with decreasing urea concentration.
Außerdem wurde versucht, die Proteine im neutralem pH-Bereich, sowie ohne den Zusatz
von Arginin löslich zu halten. Die Proteine waren dabei noch in folgenden Puffern löslich:
97 kD Antigen: 20 mM Tris/HCl, 1 M Harnstoff, 0,8 M Arginin 0,15 M NaCl, pH 7,5
aa17-69: 20 mM Tris/HCl, 0,8 M Arginin, 0,15 M NaCl, pH 7,0
aa148-224: 20 mM Tris/HCl, 3 M Harnstoff, 0,8 M Arginin, 0,15 M NaCl, pH 7,0
aa254-323: 20 mM Tris/HCl, 0,15 M NaCl, pH 7,0In addition, attempts were made to keep the proteins soluble in the neutral pH range and without the addition of arginine. The proteins were still soluble in the following buffers:
97 kD antigen: 20 mM Tris / HCl, 1 M urea, 0.8 M arginine 0.15 M NaCl, pH 7.5
aa17-69: 20 mM Tris / HCl, 0.8 M arginine, 0.15 M NaCl, pH 7.0
aa148-224: 20mM Tris / HCl, 3M urea, 0.8M arginine, 0.15M NaCl, pH 7.0
aa254-323: 20mM Tris / HCl, 0.15M NaCl, pH 7.0
Die Konzentration der gereinigten Proteine wurde nach Messen der Extinktion unter Benutzung der Formel E = ε × c × d (E = Extinktion; ε = molarer Extinktionskoeffizient; d = Schichtdicke der Küvette) berechnet.The concentration of the purified proteins was measured after measuring the absorbance Using the formula E = ε × c × d (E = extinction; ε = molar extinction coefficient; d = Layer thickness of the cuvette).
Mit dem 97 kD-Expressionsprodukt wurden zur Herstellung von Antikörpern wie in Beispiel 1 beschrieben Kaninchen immunisiert. Nach Absättigung der Antiseren mit E. coli- Bestandteilen wurden die Antiseren für eine Western Blot-Analyse mit Ganzkeim-Lysat von H. pylori eingesetzt. Die Antikörper erkennen dabei eine spezifische Proteinbande von 97 kD. Diese Proteinbande wird auch von Antiseren erkannt, die gegen die drei Subregionen aa17-69, aa148-224 und aa254-323 gerichtet sind.The 97 kD expression product was used to produce antibodies as in Example 1 rabbit described immunized. After saturation of the antisera with E. coli The antisera were used for a Western blot analysis with whole germ lysate from H. pylori used. The antibodies recognize a specific protein band of 97 kD. This protein band is also recognized by antisera that target the three subregions aa17-69, aa148-224 and aa254-323 are directed.
Zur Durchführung der Immunfluoreszenz wurden kultivierte H. pylori-Zellen mit PBS, 1% BSA gewaschen und 2 × 108 Zellen mit dem jeweiligen Antiserum (1 : 480) in 100 µl Volumen über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach dreimaligen Waschen der Zellen wurden diese mit 20 µg/ml eines Ziegen-Anti-Kaninchen Ig (H + L)-FITC-markierten Antikörpers (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, USA) eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Wiederum wurde dreimal gewaschen und das Pellet in 50 µl PBS, pH 7,2 aufgenommen. 10 µl wurden auf einen Objektträger getropft und leicht eintrocknen gelassen. Nach Auftropfen von "Mounting Medium" (Sigma, Heidelberg, Deutschland) und Eindeckeln wurde über Nacht getrocknet, mit Nagellack versiegelt und die Bakterien wurden unter Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie betrachtet. Dabei zeigte sich mit den Antiseren, die gegen das reife 97 kD-Antigen gerichtet sind im Vergleich zu den entsprechenden Null-Seren eine sehr intensive Fluoreszenz der lebenden Bakterien, was nicht nur die Lokalisation des 97 kD-Proteins in der äußeren Membran von Helicobacter pylori zeigt, sondern auch deutlich macht, daß bestimmte Epitope des Proteins an der Oberfläche des Bakteriums vorhanden sind und einen Zugang des Bakteriums mit Antikörpern möglich machen. Die Antiseren, die gegen die drei exprimierten Proteinregionen des 97 kD-Antigens gerichtet sind, zeigten im Vergleich zu den entsprechenden Null-Seren nur eine schwach ausgeprägte Immunfluoreszenz.To carry out the immunofluorescence, cultured H. pylori cells were washed with PBS, 1% BSA and 2 × 10 8 cells were incubated with the respective antiserum (1: 480) in 100 μl volume overnight at 4 ° C. After washing the cells three times, they were incubated with 20 μg / ml of a goat anti-rabbit Ig (H + L) -FITC-labeled antibody (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, USA) for one hour at room temperature in the dark. It was washed again three times and the pellet was taken up in 50 μl PBS, pH 7.2. 10 µl was dropped onto a slide and allowed to dry slightly. After "Mounting Medium" (Sigma, Heidelberg, Germany) had been dripped on and the lid was dried, it was dried overnight, sealed with nail polish, and the bacteria were observed under phase contrast and fluorescence microscopy. The antisera, which are directed against the mature 97 kD antigen, showed a very intense fluorescence of the living bacteria in comparison to the corresponding null sera, which not only the localization of the 97 kD protein in the outer membrane of Helicobacter pylori shows, but also makes it clear that certain epitopes of the protein are present on the surface of the bacterium and allow access of the bacterium with antibodies. The antisera, which are directed against the three expressed protein regions of the 97 kD antigen, showed only a weak immunofluorescence in comparison with the corresponding null sera.
Da Oberflächenlokalisierte Antigene bei Bakterien häufig sehr variabel sind und dann nicht für eine Entwicklung einer Spaltvakzine (Vakzine, die nur einzelne Strukturen eines Erregers enthält) geeignet sind, wurde die Konservierheit des 97 kD-Antigens untersucht. Dazu wurden zwei Bakterienisolate von Patienten (pat 01, pat 02) sowie H. pylori-Bakterien der ATCC-Stämme 51110, 60190, 25392 und 43504 in Kultur gebracht und ihre DNA wurde mit Hilfe des "DNAzol"-Verfahrens (GIBCO/BRL; Katalog-Nr. 10503) präpariert. Ausgehend von diesen DNA-Proben wurden, wie in Ausubel et al. (1987) beschrieben, verschiedene Subfragmente amplifiziert und direkt einer Sequenzierung zugänglich gemacht. Die Sequenzen wurden mit Hilfe von "GCG"-Programmen ausgewertet und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen des 97 kD-Antigens von allen untersuchten H. pylori-Stämmen direkt miteinander verglichen (Tabelle 1). Hierbei fand auch die von Tomb et al. (1997) publizierte Sequenz HP 1512 des H. pylori Stammes 26695 Berücksichtigung. Dabei zeigte sich, daß nur in wenigen Positionen des 97 kD-Antigens Aminosäureaustausche vorhanden sind, welche überwiegend konserviert sind. Das 97 kD-Antigen scheint somit ein hochkonserviertes Antigen zu sein und ist von daher für die Entwicklung eines Impfstoffs geeignet.Since surface-localized antigens are often very variable in bacteria and then not for the development of a split vaccine (vaccine that only individual structures of a Pathogen contains) are suitable, the preservation of the 97 kD antigen was examined. Two bacterial isolates from patients (pat 01, pat 02) and H. pylori bacteria were used of ATCC strains 51110, 60190, 25392 and 43504 were cultured and their DNA was prepared using the "DNAzol" method (GIBCO / BRL; Catalog No. 10503). Outgoing of these DNA samples, as described in Ausubel et al. (1987), various Subfragments amplified and made directly accessible for sequencing. The Sequences were evaluated with the help of "GCG" programs and the derived ones Amino acid sequences of the 97 kD antigen from all H. pylori strains examined compared directly with each other (Table 1). The Tomb et al. (1997) published sequence HP 1512 of the H. pylori strain 26695 taken into account. It showed found that amino acid exchanges were only present in a few positions of the 97 kD antigen which are mostly preserved. The 97 kD antigen thus appears to be being highly conserved antigen and is therefore essential for the development of a vaccine suitable.
Es ist die Consensussequenz angegeben. Abweichungen sind für die einzelnen Stämmen
in den jeweiligen Positionen gekennzeichnet. Die vorhergesagte Signalsequenz ist
unterstrichen und die Subregionen, die ebenfalls zur Expression gebracht wurden, sind fett
gedruckt.
The consensus sequence is given. Deviations are marked for the individual strains in the respective positions. The predicted signal sequence is underlined and the subregions that were also expressed are printed in bold.
Sechs Gruppen von jeweils 10 Mäusen (CD1; männlich) wurden an den Tagen 1,8 und 15 mit den gereinigtem Proteinen 97 kD (1), 97 kD/aa17-69 (2), 97 kD/aa148-224 (3), 97 kD/aa254-323 (4), einer Mischung der drei Subfragmente (5) und mit physiologischer Kochsalzlösung (6) immunisiert. Die Impfstoffe für die Gruppen 1 bis 4 enthielten 0,2 mg Protein/Dosis in 0,2 ml und wurden mit 10 µg Choleratoxin (CT) pro Dose gemischt und oral verabreicht. Die Gruppe 5 erhielt eine Mischung der Subfragmente aa17-69 und aa254-323 (0,1 mg von jedem Fragment und 10 µ) CT) und nach 10 min 0,1 mg Subfragment aa148- 224 zusammen mit 5 µg CT. Etwa 20 min vor der Immunisierung wurden 0,2 ml 0,2 N NaHCO2 oral verabreicht. Eine Belastungsinfektion mit 109 cfu des H. pylori Stammes 326 wurde an den Tagen 27, 29 und 31 gegeben. Am Tag 47 wurden die Tiere getötet, die Mägen entnommen, geöffnet, mit Pinzetten gesäubert und anschließend mit 5 ml physiologischer Kochsalzlösung geschüttelt. 0,1 ml dieser Suspension wurden auf 57 cm2 große "Columbia"-Agarplatten, die 5% Pferdeblut enthielten, ausplattiert und drei Tage bei 37°C unter mikroaerophilen Bedingungen ("BBL Jar/Camping Pak Plus", Belton & Dickinson) kultiviert. Die Kolonien wurden auf 4 cm2 ausgezählt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 zusammengefaßt. Die Tiere, die mit dem kompletten 97 kD-Antigen oder mit dem Subfragment 97 kD/aa254-323 immunisiert wurden, zeigten im Vergleich zu den anderen Tieren eine Schutzwirkung gegen eine Belastung mit H. pylori.Six groups of 10 mice each (CD1; male) were treated on days 1, 8 and 15 with the purified proteins 97 kD (1), 97 kD / aa17-69 (2), 97 kD / aa148-224 (3), 97 kD / aa254-323 (4), a mixture of the three subfragments (5) and immunized with physiological saline (6). The vaccines for groups 1 to 4 contained 0.2 mg protein / dose in 0.2 ml and were mixed with 10 µg cholera toxin (CT) per dose and administered orally. Group 5 received a mixture of subfragments aa17-69 and aa254-323 (0.1 mg of each fragment and 10 µ) CT) and after 10 min 0.1 mg subfragment aa148-224 together with 5 µg CT. About 20 min before the immunization, 0.2 ml of 0.2 N NaHCO 2 was administered orally. A stress infection with 10 9 cfu of the H. pylori strain 326 was given on days 27, 29 and 31. On day 47, the animals were sacrificed, the stomachs were removed, opened, cleaned with tweezers and then shaken with 5 ml of physiological saline. 0.1 ml of this suspension was plated onto 57 cm 2 "Columbia" agar plates containing 5% horse blood and cultured for three days at 37 ° C under microaerophilic conditions ("BBL Jar / Camping Pak Plus", Belton & Dickinson) . The colonies were counted to 4 cm 2 . The results are summarized in Fig. 1. The animals which were immunized with the complete 97 kD antigen or with the subfragment 97 kD / aa254-323 showed a protective effect against H. pylori exposure in comparison with the other animals.
H. pylori Infektion in Mäusen nach oraler Impfung mit dem 97 kD Protein (1), den Subfragmenten 97 kD/aa17-69 (2), 97 kD/aa148-224 (3), 97 kD/aa254-323 (4) und einer Mischung der Subfragmente (5) und dem 97 kD Protein (5). 6: Infektionskontrolle. H. pylori infection in mice after oral vaccination with the 97 kD protein (1) Subfragments 97 kD / aa17-69 (2), 97 kD / aa148-224 (3), 97 kD / aa254-323 (4) and one Mixture of the subfragments (5) and the 97 kD protein (5). 6: infection control.
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Claims (21)
- a) die sich von der DNA-Sequenz von Anspruch 2 in der Codonsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Code unterscheidet,
- b) die mit der DNA-Sequenz von Anspruch 2 oder 3(a) hybridisiert, oder
- c) die ein Fragment, eine allelische Variante oder eine andere Variante der DNA- Sequenz von Anspruch 2 ist.
- a) which differs from the DNA sequence of claim 2 in the codon sequence due to the degeneration of the genetic code,
- b) which hybridizes with the DNA sequence of claim 2 or 3 (a), or
- c) which is a fragment, an allelic variant or another variant of the DNA sequence of claim 2.
- a) Züchten einer Zelle nach Anspruch 6 oder 7 oder einer mit der DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder dem Vektor nach Anspruch 5 transformierten Zelle, und
- b) Gewinnung des Membranproteins aus dem Medium oder aus der Zelle.
- a) culturing a cell according to claim 6 or 7 or a cell transformed with the DNA sequence according to one of claims 1 to 4 or the vector according to claim 5, and
- b) obtaining the membrane protein from the medium or from the cell.
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