DE19841125A1

DE19841125A1 - Positioning living cells within a 3-dimensional microstructure with movement-limiting openings, especially useful for study by atomic force microscopy

Info

Publication number: DE19841125A1
Application number: DE1998141125
Authority: DE
Inventors: Klaus Zimmer; Karsten Otte; Ulrike Zeitschel; Dietmar Hirsch; Alexander Braun; Volker Bigl; Frieder Bigl
Original assignee: INST OBERFLAECHENMODIFIZIERUNG
Current assignee: INST OBERFLAECHENMODIFIZIERUNG
Priority date: 1998-09-09
Filing date: 1998-09-09
Publication date: 2000-03-16

Abstract

Positioning living human, animal or plant cells, limiting their mobility and controlling their direction of growth comprises introducing the cells into a 3-dimensional microstructure Positioning living human, animal or plant cells, limiting their mobility and controlling their direction of growth comprises introducing the cells into a 3-dimensional microstructure. The method has the following features: (a) the size of the openings in the microstructure corresponds, at least on one side, to the size of the cells in nutrient medium; (b) most of the openings in the microstructure are smaller than the average size of the cells; and (c) the cells are in a physiological environment.

Description

field of use

Die Erfindung betrifft die Erzeugung dreidimensionaler Strukturen bestimmter Dimension in Halbleitermaterial, Glas, Kunststoff, Keramik oder Verbindungen von diesen und deren Einsatz zur Beweglichkeitseinschränkung, Positionierung und Beeinflußung der Wachstumsrichtung von lebenden, unfixierten Zellen. Des weiteren beschreibt es ein Verfahren zur Einbindung der Zellen in die erzeugten Strukturen. Die Dimensionierung der erzeugten Struktur ermöglicht eine Immobilisierung der Zelle und der Zellmembran. Die Kombination aus Erzeugung von dreidimensionalen Strukturen, dem Einbringen von lebenden Zellen in diese und der damit erfolgenden Beweglichkeitseinschränkung kann insbesondere Anwendung in der hochauflösenden Mikroskopie (AFM-Atom-Kraft- Mikroskop) finden. Die bei Anwendung des Verfahrens gleichzeitig erfolgende genaue Positionierung der Zellen in den Strukturen kann zur gezielten Manipulation der Zellen genutzt werden und ermöglicht z. B. die Untersuchung von Zellen unter einer räumlich eingeschränkten Umgebung bzw. die Untersuchung des Wachstumsverhaltens von verschiedenen Zellen unter spezifischen wohldefinierten Bedingungen.The invention relates to the generation of three-dimensional structures of certain dimensions in Semiconductor material, glass, plastic, ceramic or compounds of these and their Use to restrict mobility, positioning and influencing the Direction of growth of living, unfixed cells. Furthermore it describes a Process for the integration of the cells into the created structures. The dimensioning of the generated structure enables immobilization of the cell and the cell membrane. The Combination of creating three-dimensional structures, the introduction of living cells in this and the resulting mobility restrictions especially used in high-resolution microscopy (AFM atomic force Microscope). The exact one that occurs simultaneously when using the method Positioning the cells in the structures can be used for targeted manipulation of the cells be used and enables z. B. the examination of cells under a spatial restricted environment or the study of the growth behavior of different cells under specific well-defined conditions.

In einer weiteren Ausbaustufe können derartige Strukturen in Verbindung mit definiert an- bzw. eingebrachten Elektroden, Sensoren oder Akzeptoren als Schnittstelle von lebenden Zellen zu signalverarbeitenden Systemen Anwendung finden. In a further stage of expansion, structures of this type in connection with defined or introduced electrodes, sensors or acceptors as an interface between living Cells are used for signal processing systems.

State of the art

Die zum Stand der Technik gehörenden Verfahren beschreiben i.A. die Beobachtung von lebenden oder fixierten Zellen in einem verhältnismäßig großen Volumen und/oder deren Wechselwirkung mit Lösungen, elektrischen Potentialen oder der Substratoberfläche. Die dabei erzeugten Strukturen dienen der Befestigung von Zellen innerhalb des großen Volumens der Struktur. Neuere Untersuchungen beschreiben vor allem die Untersuchung der Zelloberfläche mit dem AFM. Die Vorteile der Anwendung der AFM-Technik in biologischen Fragestellungen bestehen in der Möglichkeit, native, unfixierte Zellen in Echtzeit zu beobachten, und somit Oberflächenveränderungen der Zelle, d. h. die Analyse dynamischer Eigenschaften, direkt zu untersuchen. Theoretisch sollte es möglich sein, mit der AFM-Technik bei diesen Analysen eine Auflösung im Bereich weniger Nanometer zu erreichen. Im folgenden sollen die wichtigsten dem Stand der Technik entsprechenden Methoden zur Untersuchung von lebenden und fixierten Zellen mittels AFM, der Versuch der Stabilisierung der Zellmembran und die dabei erzeugten Strukturen beschrieben werden.The methods belonging to the prior art generally describe the observation of living or fixed cells in a relatively large volume and / or their Interaction with solutions, electrical potentials or the substrate surface. The structures created thereby serve to secure cells within the large one Volume of the structure. Recent investigations mainly describe the investigation of the Cell surface with the AFM. The advantages of using AFM technology in biological issues are the possibility of native, unfixed cells in Observing in real time, and thus surface changes of the cell, i. H. the analysis dynamic properties to investigate directly. Theoretically, it should be possible with the AFM technology in these analyzes has a resolution in the range of a few nanometers to reach. In the following, the most important ones corresponding to the state of the art should be given Methods of examining living and fixed cells using AFM, the trial of Stabilization of the cell membrane and the structures generated thereby are described.

(1) Untersuchungen an teilweise fixierten Zellen: Zum Stand der Technik gehören Untersuchungen an getrockneten Zellen, wie z. B. Neuronenkulturen (Cricenti, A., Destasio, G., Generosi, R., Perfetti, P., Ciotti, M. T. and Mercanti, D. Atomic Force Microscopy of Neuron Networks, Scanning. Microscopy. 9 (1995) 695-700.; Cricenti, A., Destasio, G., Generosi, R., Scarselli, M. A., Perfetti, P., Ciotti, M. T., Mercanti, D., Casalbore, P. and Margaritondo, G. Native and Modified Uneoated Neurons Observed hy Atomic Force Microscopy, J. Vac. Sci. Technol. A. 14 (1996) 1741-1746.), welche sich gegenüber lebenden Präparaten durch eine beträchtlich stabilere Zellmembran auszeichnen oder Untersuchungen an lebenden Makrophagen nach Phagozytose von Latexbeads zur "Auspolsterung" (Stabilisierung) der Zellen mit steifem Material (Beckmann, M., Kolb, H. A. and Lang, F. Atonzic Force Microscopy of Peritoneal Macrophages After Particle Phagocytosis, J. Membrane. Biol. 140 (1994) 197-204.). Hoh, J. H. and Schoenenberger, C. A. (Suiface Morphology and Meclaanical Properties of MDCK Monolavers by Atomic Force Microscopy, J. Cell Sci. 107 (1994) 1105-1114.) untersuchten Veränderungen mechanischer Eigenschaften durch partielle Fixierung lebender Zellen. Dazu wurde der Einfluß von Glutaraldehyd auf die Messung der Oberfläche und die Kraft-Abstands-Kurve bestimmt (Beckmann, M. et al.). Auch die sogenannte Kryo-AFM-Technik versucht, das Problem der weichen Oberfläche lebender Zellen zu umgehen, indem die Messungen der Zellen unter flüssigem N₂ unter einem bestimmten Druck durchgeführt werden und zu einer stabileren Zellmembran führten (Han, W.H., Mou, J. X., Sheng, J., Yang, J. and Shao, Z.F. Cryo Atomic Force Microscopy A New Approach for Biological Imaging at High Resolution, Biochemistry-USA. 34 (1995) 8215-8220.; Shao, Z.F., Yang, J. and Sornlyo, A.P. Biological Atomic Force Microscopy From Microns to Nanometers and Beyond, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11 (1995) 241-265.; Shao, Z.F. and Zhang, Y.Y. Biological cryo atomic force microscopy: A brief review, Ultramicroscopy, 66 (1996) 141-152.; Zhang, Y.Y., Shao, Z.F., Somlyo, A.P. and Somlyo, A.V. Cryo-atomic force microscopy of smooth muscle myosin, Biophys. J. 72 (1997) 1308-1318). Benoit, M., Holstein, T. und Gaub, H. E. (Lateral forces in AFM imaging and immobilization of cells and organelles, Ellr. Biophys. J. Biophys. Lett. 26 (1997) 283-290.) versuchten, durch Immobilisation größerer Zellbestandteile an porösem Filtermaterial eine bessere Stabilisierung bei der Messung zu erhalten.(1) Studies on partially fixed cells: Studies on dried cells, such as B. Neuron Cultures (Cricenti, A., Destasio, G., Generosi, R., Perfetti, P., Ciotti, MT and Mercanti, D. Atomic Force Microscopy of Neuron Networks, Scanning. Microscopy. 9 (1995) 695-700 .; Cricenti, A., Destasio, G., Generosi, R., Scarselli, MA, Perfetti, P., Ciotti, MT, Mercanti, D., Casalbore, P. and Margaritondo, G. Native and Modified Uneoated Neurons Observed hy Atomic Force Microscopy, J. Vac. Sci. Technol. A. 14 (1996) 1741-1746.), which are distinguished from living preparations by a considerably more stable cell membrane or studies on living macrophages after phagocytosis of latex beads for "cushioning" ( Stabilization) of the cells with stiff material (Beckmann, M., Kolb, HA and Lang, F. Atonzic Force Microscopy of Peritoneal Macrophages After Particle Phagocytosis, J. Membrane. Biol. 140 (1994) 197-204.). Hoh, JH and Schoenenberger, CA (Suiface Morphology and Meclaanical Properties of MDCK Monolavers by Atomic Force Microscopy, J. Cell Sci. 107 (1994) 1105-1114.) Investigated changes in mechanical properties by partial fixation of living cells. The influence of glutaraldehyde on the measurement of the surface and the force-distance curve was determined (Beckmann, M. et al.). The so-called cryo-AFM technique also tries to avoid the problem of the soft surface of living cells by measuring the cells under liquid N ₂ under a certain pressure and leading to a more stable cell membrane (Han, WH, Mou, JX, Sheng, J., Yang, J. and Shao, ZF Cryo Atomic Force Microscopy A New Approach for Biological Imaging at High Resolution, Biochemistry-USA. 34 (1995) 8215-8220 .; Shao, ZF, Yang, J. and Sornlyo , AP Biological Atomic Force Microscopy From Microns to Nanometers and Beyond, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11 (1995) 241-265 .; Shao, ZF and Zhang, YY Biological cryo atomic force microscopy: A brief review, Ultramicroscopy, 66 (1996) 141-152 .; Zhang, YY, Shao, ZF, Somlyo, AP and Somlyo, AV Cryo-atomic force microscopy of smooth muscle myosin, Biophys. J. 72 (1997) 1308-1318). Benoit, M., Holstein, T. and Gaub, HE (Lateral forces in AFM imaging and immobilization of cells and organelles, Ellr. Biophys. J. Biophys. Lett. 26 (1997) 283-290.) Attempted larger ones by immobilization Cell components on porous filter material to get better stabilization during the measurement.

(2) Untersuchungen an lebenden Zellen: Zum Stand der Technik gehören Beobachtungen mechanischer und elastischer Eigenschaften von lebenden Zellen wie z. B. des Zytoskeletts (Hofmann, U.G., Rotsch, C., Parak, W.J. and Radmacher, M. Investigating the cytoskeleton of chicken cardiocytes with the atomic force microscope, J. Struct. Biol. 119 (1997) 84-91.; Radmacher, M., Rotsch, C., Fritz, M., Kacher, C.M., Hofmann, U., Gaub, H.E. and Hansma, P.K. Measuring the Elastic Properties of Bio Polymers and Living Cells with the Atomic Force Microscope, Abstr. Pap. Amer. Chem. Soc. 212 (1996) 324-POLY.) von Kardiozyten und Thrombozyten oder die Beobachtung dynamischer Eigenschaften von Aktinfilamenten in lebenden Gliazellen mittels AFM (Henderson, E., Haydon, P.G. and Sakaguchi, D.S. Actin Filament Dynamics in Living Glial Cells Imaged by Atomic Force Microscopy, Science, 257 (1992) 1944-1946). Auch bei Echtzeituntersuchungen der Aktivierung humaner Thrombozyten unter physiologischen Bedingungen konnten Komponenten des Zytoskeletts und membrangebundene Filamente nachgewiesen werden (Fritz, M., Radmacher, M. and Gaub, H.E. Granuia Motion and Membrane Spreording During Aetivortion of Human Platelets Jmaged by Atomic Force Microscopy, Biophys. J. 66 (1994) 1328-1334.; Fritz, M., Radmacher, M., Cleveland, J.P., Allersrna, M.W., Stewart, R.J., Gieselmann, R., Janmey, P., Schmidt, C.F. and Hansma, P.K. Imaging Globular und Filamentous Proteins in Physiological Buffer Solutions with Tapping Mode Atomic Force Microscopy, Langmuir. 11 (1995) 3529-3535.). Desweiteren konnte die dreidimensionale Struktur lebender Zellen und subzellulärer Strukturen dargestellt und Bewegungen von Filamenten unter der Zellmembran beobachtet werden; weiterhin gelang auch die mechanische Entfernung einzelner Zellen aus gemischten primären Zellkulturen mit Hilfe des AFM (Parpura, V., Haydon, P.G. and Henderson, E. 3 Dimensional Imaging of Living Neurons and Glia with the Atomic Force Microscope, J. Cell Sci. 104 (1993a) 427-432). Zum Stand der Technik gehört auch die Identifikation der zu untersuchenden Makromoleküle auf den Zellen u. a. mittels immunhistochemischer Darstellung mit Gold-markierten Antikörpern, so wurden z. B. Gold markierte sekundäre Antikörper zur Darstellung von Membranvesikel verwendet (Thimonier, J., Montixi, C., Chauvin, J. P., He, H.T., Rocca-Serra, J. and Barbet, J. Thy-1 immunolabeled thymocyte microdomains studies with the atomic force microscope and the electron microscope, Biophys. J. 73 (1997) 1627-1632).(2) Investigations on living cells: Observations belong to the prior art mechanical and elastic properties of living cells such. B. the cytoskeleton (Hofmann, U.G., Rotsch, C., Parak, W.J. and Radmacher, M. Investigating the cytoskeleton of chicken cardiocytes with the atomic force microscope, J. Struct. Biol. 119 (1997) 84-91 .; Radmacher, M., Rotsch, C., Fritz, M., Kacher, C.M., Hofmann, U., Gaub, H.E. and Hansma, P.K. Measuring the Elastic Properties of Bio Polymers and Living Cells with the Atomic Force Microscope, Abstr. Pap. Amer. Chem. Soc. 212 (1996) 324-POLY.) Of cardiocytes and platelets or the observation of dynamic properties of actin filaments in living glial cells using AFM (Henderson, E., Haydon, P.G. and Sakaguchi, D.S. Actin Filament Dynamics in Living Glial Cells Imaged by Atomic Force Microscopy, Science, 257 (1992) 1944-1946). Even in real-time investigations of the activation of human Platelets under physiological conditions could detect components of the cytoskeleton and membrane-bound filaments can be detected (Fritz, M., Radmacher, M. and Gaub, H.E. Granuia Motion and Membrane Spreording During Aetivortion of Human Platelets Jmaged by Atomic Force Microscopy, Biophys. J. 66 (1994) 1328-1334 .; Fritz, M., Radmacher, M., Cleveland, J.P., Allersrna, M.W., Stewart, R.J., Gieselmann, R., Janmey, P., Schmidt, C.F. and Hansma, P.K. Imaging Globular and Filamentous Proteins in Physiological Buffer Solutions with Tapping Mode Atomic Force Microscopy, Langmuir. 11 (1995) 3529-3535.). Furthermore, the three-dimensional structure of living cells and Subcellular structures are shown and movements of filaments under the cell membrane to be watched; the mechanical removal of individual cells was also successful mixed primary cell cultures using the AFM (Parpura, V., Haydon, P.G. and Henderson, E. 3 Dimensional Imaging of Living Neurons and Glia with the Atomic Force Microscope, J. Cell Sci. 104 (1993a) 427-432). The state of the art also includes Identification of the macromolecules to be examined on the cells u. a. by means of immunohistochemical representation with gold-labeled antibodies, z. B. Gold labeled secondary antibodies are used to display membrane vesicles (Thimonier, J., Montixi, C., Chauvin, J.P., He, H.T., Rocca-Serra, J. and Barbet, J. Thy-1 immunolabeled thymocyte microdomains studies with the atomic force microscope and the electron microscope, Biophys. J. 73 (1997) 1627-1632).

(3) Auflösungsverbesserung der AFM-Messungen an lebenden Zellen: Eine Möglichkeit, die Auflösung der AFM-Untersuchung zu erhöhen, ist die Einschränkung der Beweglichkeit der lebenden Zellen. Zum Stand der Technik gehören allerdings nur sehr wenige Strukturen und Methoden, die direkt dazu eingesetzt werden, lebende Zellen in ihrer Bewegung zu immobilisieren und die Zelloberfläche zu stabilisieren. Nach einer Infektion mit einem Virus konnten Ohnesorge et al. (Ohnesorge, F.M., Hörber, J.K.H., Häberle, W., Czerny, C.P., Smith, D.P.E. and Binnig, G. AFM review study on pox viruses and living cells, Biophys. J. 73 (1997) 2183-2194) spezifische Prozesse an der Oberfläche lebender Zellen, welche mit einer Mikropipette fixiert waren, in Echtzeit (9 min) beobachten. Weiterhin wurden Porenfilter verwendet (S. Kasas and A. Ikai, A method for anchoring round shaped cells for atomic force microscope imaging, Biophys. J. 68 (1995) 1678), in welche die Zellen von der Rückseite eingebracht werden. Die resultierende Beweglichkeitseinschränkung ermöglicht bessere AFM-Untersuchungen. Eine andere Möglichkeit, die Auflösung zu verbessern, ist das Aufpressen der Zelle auf ein Substrat durch Zentrifugieren (H. Iwamoto, N. Wakayama, Jpn. J. Appl. Phys. 36 (1997) 3872).(3) Resolution improvement of AFM measurements on living cells: One way that Increasing the resolution of the AFM exam is the limitation of mobility living cells. Very few structures and, however, belong to the state of the art Methods that are used directly to move living cells immobilize and stabilize the cell surface. After infection with a virus Ohnesorge et al. (Ohnesorge, F.M., Hörber, J.K.H., Häberle, W., Czerny, C.P., Smith, D.P.E. and Binnig, G. AFM review study on pox viruses and living cells, Biophys. J. 73 (1997) 2183-2194) specific processes on the surface of living cells, which with fixed in a micropipette, observe in real time (9 min). Furthermore, were Pore filter used (S. Kasas and A. Ikai, A method for anchoring round shaped cells for atomic force microscope imaging, Biophys. J. 68 (1995) 1678), in which the cells from the Back be introduced. The resulting mobility restriction enables better AFM exams. Another way to improve the resolution is Pressing the cell onto a substrate by centrifugation (H. Iwamoto, N. Wakayama, Jpn. J. Appl. Phys. 36 (1997) 3872).

Zum Stand der Technik gehören auch Methoden und Strukturen zur Immobilisierung von Zellen, Enzymen oder anderen Biomolekülen für viele analytische und biotechnologische Verfahren. Dabei werden die verschiedensten Techniken der adsorptiven Ankopplung an die Oberfläche oder Einkapselungsverfahren verwendet. Dazu gehören z. B. Glasfibermatten (Patent EP 0 267 470 A1), mit hydrophilen Polymeren beschichtete Träger (Patent EP 0 628 819 A2), Mikrokapseln für Filteranwendungen (Patent US 95/02 752) und poröse anorganische Materialien (Patent EP 0 314 290 A2, EP 0 121 981 B1). Die Änderung der Adhäsionseigenschaften des Substratmaterials kann z. B. auch durch das Anlegen von hochfrequenten elektrischen Impulsen an auf das Substrat aufgebrachte planare Elektrodenstreifen erfolgen. Durch inhomogene elektrische Felder entstehen wandernde oder wechselnde elektrische Oberflächenwellen. Diese werden zur lagestabilen Positionierung von Einzellern verwendet (DE 44 00 955 A1, EP 0 785 428 A1). Mit Hilfe des AFM ist auch die Messung der relativen Adhäsion verschiedener lebender Gliazellen an ein bestimmtes Substrat untersucht worden (Parpura, V., Haydon, P. G., Sakaguchi, D. S. and Henderson, E. Atomic Force Microscopy and Manipulatiou of Living Glial Cells, J. Vac. Sci. Technol. A. 11 (1993) 773-775).The prior art also includes methods and structures for immobilizing Cells, enzymes or other biomolecules for many analytical and biotechnological Method. The most diverse techniques of adsorptive coupling to the Surface or encapsulation process used. These include e.g. B. glass fiber mats (Patent EP 0 267 470 A1), supports coated with hydrophilic polymers (Patent EP 0 628 819 A2), microcapsules for filter applications (patent US 95/02 752) and porous inorganic materials (patent EP 0 314 290 A2, EP 0 121 981 B1). The change in Adhesion properties of the substrate material can e.g. B. also by creating high-frequency electrical pulses to planar applied to the substrate Electrode strips are made. Inhomogeneous electrical fields cause wandering or changing electrical surface waves. These are used for the stable positioning of Single cell used (DE 44 00 955 A1, EP 0 785 428 A1). With the help of the AFM is also the Measurement of the relative adhesion of different living glial cells to a specific one Substrate have been examined (Parpura, V., Haydon, P.G., Sakaguchi, D. S. and Henderson, E. Atomic Force Microscopy and Manipulatiou of Living Glial Cells, J. Vac. Sci. Technol. A. 11 (1993) 773-775).

Zum Stand der Technik gehören des weiteren Lebenserhaltungssysteme, die dazu genutzt werden, die Wechselwirkung zwischen einer Zelle und einer die Zelle beeinflussenden Substanz zu untersuchen (Patent: US 5 496 697 A).The state of the art also includes life support systems used for this the interaction between a cell and one that influences the cell Investigate substance (patent: US 5 496 697 A).

Disadvantages of the prior art

Die im ersten Teil zum Stand der Technik gehörenden Verfahren ermöglichen zwar die Untersuchung der Zellen mittels AFM, jedoch ist die Auflösung aufgrund der weichen Zellmembran gering. Diese verhindert eine hohe Auflösung bei der Untersuchung der Zelle, da höhere Kräfte eine Ablösung der Zelle von der Unterlage oder eine Schädigung der Zelle nach sich ziehen (V. Parpura et al.). Die teilweise Immobilisierung der Zelle (z. B. elektrische Felder, Fixierung etc.) führt zwar zur Verbesserung der Auflösung der Methode, aber auch zu einem Einfluß auf das natürliche Wachstum der Zelle oder sogar zum Absterben (Trocknung (A. Cricenti et al.), Kryo-AFM-Technik (Z.F. Shao et al.)). Eine Fixierung mit Mikropipetten (F.M. Ohnesorge et al.) bzw. Mikromanipulatoren z. B. bedeutet meist ein Herausreißen der Zelle aus ihrem natürlichen Zellverband und damit eine starke Beeinträchtigung, welche bei biochemischen Untersuchungen das Ergebnis verfälscht. Desweiteren erlaubt die Untersuchung an fixierten Zellen keine Darstellung dynamischer Eigenschaften, einem der Hauptvorteile des Einsatzes der Rasterkraftmikroskopie. Auch eine Manipulation von Zellen mittels neurobiologisch relevanter Substanzen ist nur an lebenden, ungestörten Zellen möglich.The methods belonging to the prior art in the first part enable the Examination of the cells using AFM, however, the resolution is due to the soft Cell membrane low. This prevents high resolution when examining the cell, because higher forces cause the cell to detach from the surface or damage the cell entail (V. Parpura et al.). The partial immobilization of the cell (e.g. electrical Fields, fixation etc.) leads to an improvement in the resolution of the method, but also to an influence on the natural growth of the cell or even death (drying (A. Cricenti et al.), Cryo-AFM technique (Z.F. Shao et al.)). Fixation with micropipettes (F.M. Ohnesorge et al.) Or micromanipulators e.g. B. usually means tearing out the Cell from its natural cell structure and thus a strong impairment, which in biochemical studies falsified the result. Furthermore, the Examination on fixed cells no representation of dynamic properties, one of the Main advantages of using atomic force microscopy. Manipulation of cells using neurobiologically relevant substances is only possible on living, undisturbed cells possible.

Einige der beim Stand der Technik beschriebenen Verfahren zur Positionierung von Zellen erfordern umfangreiche und somit teure Strukturierungsschritte (z. B. Positionierung mittels elektrischer Felder). Desweiteren können die so positionierten und damit elektrophysiologisch beeinflußten Zellen nur sehr eingeschränkt elektrophysiologisch untersucht werden, da dies bereits zur Positionierung verwendet wurde.Some of the cell positioning methods described in the prior art require extensive and therefore expensive structuring steps (e.g. positioning using electric fields). Furthermore, the so positioned and thus electrophysiological affected cells can only be examined electrophysiologically to a very limited extent, since this has already been used for positioning.

Ein Nachteil der beschriebenen Methoden zur Immobilisierung von Zellen für analytische und biotechnologische Verfahren ist vor allem die Verwendung von vielen Zellen in einem großen Volumen. Entscheidend hierbei ist die Untersuchung ihrer Gesamtwirkung auf eine Lösung und nicht notwendigerweise die wirkliche Reaktion in der Nähe oder direkt an der Zellwand. Die adsorptiv arbeitenden Verfahren stabilisieren geringfügig die komplette Zelle, haben aber den Nachteil der mangelnden Stabilität der Zellmembran und der daraus resultierenden schlechten Verwendbarkeit für hochauflösende AFM-Untersuchungen. Bei den Einkapselungsverfahren werden die Zellen nicht an der Oberfläche, sondern innerhalb eines Körpers immobilisiert und sind somit nicht für das AFM zugänglich. Eine Positionierung der Zellen oder eine zusätzliche Strukturierung der Halterung ist außerdem zum großen Teil nicht möglich.A disadvantage of the methods described for immobilizing cells for analytical and biotechnological process is mainly the use of many cells in one large Volume. The decisive factor here is the examination of their overall effect on a solution and not necessarily the real reaction near or directly on the cell wall. The adsorptive processes slightly stabilize the entire cell, but have the disadvantage of the lack of stability of the cell membrane and the resulting poor usability for high-resolution AFM examinations. Both Encapsulation processes are not carried out on the surface of the cells, but within one Immobilized and are therefore not accessible to the AFM. A positioning of the Cells or an additional structuring of the holder is also largely not possible.

Object of the invention

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu schaffen und eine Struktur zu erzeugen, die es ermöglicht, lebende Zellen in ihrer Bewegung einzuschränken. Von entscheidender Bedeutung dabei ist die Einschränkung der Bewegung und Stabilisierung, nicht nur der kompletten Zelle, sondern auch der Zelloberfläche, ohne diese dabei zu töten. Dies setzt voraus, daß die Einschränkung der Beweglichkeit der Zelle wie auch alle weiteren Untersuchungen in einer für sie nicht-toxischen Umgebung geschehen. Die Bewegungseinschränkung und Positionierung der Zelle soll eine mikroskopische Beobachtung mit dem AFM mit hoher Auflösung, eine Beobachtung des Zellwachstums und/oder eine gezielte Manipulation der Zelle ermöglichen. Es ist damit möglich, lebende Zellen über einen längeren Zeitraum zu beobachten und, kombiniert mit einem Lebenserhaltungssystem, Veränderungen während des Wachstums und der Differenzierung der Zelle oder den Einfluß neurobiologisch relevanter Substanzen auf die Zelle in Echtzeit zu verfolgen. Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung, das Volumen zur Zellbeobachtung und/oder Manipulation zu verkleinern. Die Auswahl der Materialien soll der Aufgabe entsprechend so erfolgen, daß durch weitere Prozeßschritte eine Manipulation und/oder die Beobachtung des Zellwachstums und/oder der -reaktion erfolgen kann. Des weiteren besteht die Aufgabe der Erfindung darin, ein Verfahren und eine Struktur zu schaffen, welche eine preiswerte Alternative zu denen im Stand der Technik erwähnten darstellt.The object of the invention is to provide a method and to generate a structure that it enables the movement of living cells to be restricted. Of crucial It is important to restrict movement and stabilization, not just that entire cell, but also the cell surface, without killing it. This sets that the limitation of the mobility of the cell as well as all others Investigations are carried out in an environment that is not toxic to them. The Restriction of movement and positioning of the cell is said to be microscopic Observation with the AFM with high resolution, an observation of the cell growth and / or enable targeted manipulation of the cell. It is possible living Observe cells over a longer period of time and, combined with a Life support system, changes during growth and differentiation the cell or the influence of neurobiologically relevant substances on the cell in real time follow. It is a further object of the invention to use the volume for cell observation and / or to reduce manipulation. The choice of materials should do the job accordingly take place so that manipulation and / or the through further process steps Observation of cell growth and / or the reaction can take place. Furthermore there is the object of the invention is to provide a method and a structure which a represents inexpensive alternative to those mentioned in the prior art.

Solution of the task

Die Einschränkung der Beweglichkeit der lebenden Zelle wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß eine dreidimensionale Struktur (Abb. I) erzeugt wird, die in ihren äußeren Abmessungen mindestens in 2 Dimensionen denen der lebenden, ausgewachsenen Zelle entspricht. Mindestens eine Öffnung an einer Seite oder ein Teil der Struktur muß der Größe der sich in Nährlösung befindlichen Zelle entsprechen, damit das Einbringen der Zelle in die Struktur ermöglicht wird (Abb. IC und Abb. IIC). Mit dem Anwachsen der Zelle und dem beginnenden Wachstum erfolgt aufgrund der Volumenzunahme der Zelle die Einschränkung ihrer Beweglichkeit. Durch eine Variation der Dimensionierung der erfindungsgemäßen dreidimensionalen Struktur ist eine Beweglichkeitsbeschränkung verschiedener Zelltypen möglich.The limitation of the mobility of the living cell is achieved according to the invention in that a three-dimensional structure ( Fig. I) is generated which corresponds in its outer dimensions at least in two dimensions to that of the living, fully grown cell. At least one opening on one side or part of the structure must correspond to the size of the cell in the nutrient solution so that the cell can be inserted into the structure ( Fig. IC and Fig. IIC). As the cell grows and begins to grow, the mobility of the cell is restricted due to the increase in volume. By varying the dimensioning of the three-dimensional structure according to the invention, it is possible to restrict the mobility of different cell types.

Die Beweglichkeitsbeschränkung der Zellmembran erfolgt erfindungsgemäß dadurch, daß ein Teil der Struktur aus einer Membran mit Öffnungen (Abb. IE und Abb. IIA) besteht, welche Löcher enthält, die kleiner als die Zelle sind und mehr als eines dieser Löcher über der Zelle liegt und die Zellwand als solche immobilisieren. Dies wird z. B. dadurch erreicht, daß sich die Zelle während ihres Wachstums in der Mikrostruktur an dessen Form (z. B. an die eines Mikronetzes) anpaßt und dadurch die Zellmembran in ihrer Eigenbewegung eingeschränkt und während der AFM-Messung stabilisiert wird. Die Dimensionierung der Maschenweite, die Dicke der Membran und der Breite der Stege hat entsprechend der Größe der ausgewachsenen Zelle und der zu erzielenden Stabilisierung zu erfolgen. Bei Verwendung z. B. von Gehirnzellen von Ratten beträgt die Maschenweite etwa 5 × 5 µm², die Dicke der Stege etwa 200-300 nm und die Breite der Stege etwa 300-400 nm. Die unter der Membran befindliche Wanne (Abb. ID und Abb. IIA) sollte nicht tiefer als 10 µm sein.According to the invention, the mobility of the cell membrane is limited in that part of the structure consists of a membrane with openings ( Fig. IE and Fig. IIA), which contains holes that are smaller than the cell and more than one of these holes lies above the cell and immobilize the cell wall as such. This is e.g. B. achieved in that the cell adapts to its shape (z. B. that of a micro network) during its growth in the microstructure and thereby the cell membrane is restricted in its own movement and is stabilized during the AFM measurement. The dimensioning of the mesh size, the thickness of the membrane and the width of the webs must be carried out in accordance with the size of the adult cell and the stabilization to be achieved. When using z. B. of brain cells from rats, the mesh size is about 5 × 5 µm ² , the thickness of the webs about 200-300 nm and the width of the webs about 300-400 nm. The tub located under the membrane ( Fig. ID and Fig. IIA ) should not be deeper than 10 µm.

Das schädigungsfreie Einbringen bzw. die Positionierung der Zellen in die unter der porösen Membran befindlichen Wannen (Abb. ID) erfolgt erfindungsgemäß je nach verwendeter Struktur durch Zentrifugation oder Bewegung der Struktur in Nährlösung. Bei Verwendung von Mikrowannen mit einer Membranabdeckung (Abb. I) wird die Struktur in der Nährlösung bewegt, so daß sich die Zelle durch eine größere Öffnung (Abb. IB) der Membran bewegt und sich in dem darunter befindlichen Behälter absetzt. Eine Zentrifugation der Struktur in Nährlösung ist notwendig bei Strukturen, deren Öffnung sich seitlich der 3D-Mikrostruktur befindet. Des weiteren lassen sich auch Mikrostrukturen herstellen, deren Zellöffnung sich auf der Rückseite befindet (Abb. IIC). In allen Fällen wird gewährleistet, daß sich die Zelle in einer physiologischen Umgebung befindet.The damage-free insertion or positioning of the cells in the tubs located under the porous membrane ( Fig. ID) is carried out according to the invention, depending on the structure used, by centrifugation or movement of the structure in nutrient solution. When using microwells with a membrane cover ( Fig. I), the structure in the nutrient solution is moved so that the cell moves through a larger opening ( Fig. IB) of the membrane and settles in the container underneath. A centrifugation of the structure in nutrient solution is necessary for structures whose opening is on the side of the 3D microstructure. Furthermore, microstructures can also be produced, the cell opening of which is on the back ( Fig. IIC). In all cases it is ensured that the cell is in a physiological environment.

Des weiteren erfolgt die Strukturerzeugung bei Verwendung von verschiedenen Substratmaterialien wie z. B. Si (Abb. IA) und SiO₂ (Abb. IB), Quarz, Quarz/SiN oder eine Kombination aus allen, um die Aufgabe der Erfindung nach verschiedenen Gesichtspunkten (Beobachtung in Transmission, Manipulation . . .) zu erfüllen. Furthermore, the structure is generated using different substrate materials such. B. Si ( Fig. IA) and SiO ₂ ( Fig. IB), quartz, quartz / SiN or a combination of all to achieve the object of the invention from different points of view (observation in transmission, manipulation ...).

Advantages of the invention

Die erfindungsgemäß beschriebene Struktur ermöglicht nicht nur eine Immobilisierung der Zelle als Ganzes, sondern auch eine Stabilisierung der weichen Zellmembran. Dadurch ist es möglich, eine höhere Auflösung bei AFM-Untersuchungen zu erreichen, ohne die Zelle in ihrem Wachstum zu schädigen. Die Zellen befinden sich unter physiologischen Bedingungen und zeigen ein normales Wachstum. Das Einbringen und damit die Positionierung der Zellen geschieht auf schonende Art und Weise, die Zellen werden nicht zusätzlich stimuliert, wie es z. B. bei einer mechanischen Positionierung mittels Mikromanipulatoren oder der Positionierung im Hilfe eines elektrischen Feldes zu erwarten ist. Dies hat den entscheidenden Vorteil, daß bei den verschiedenen Untersuchungen nur die Reaktion auf die experimentell gewünschten Stimuli gemessen werden können und nicht auf Reaktionen, welche zum Positionieren bzw. mechanischen Fixieren der Zelle dienen. Das erfindungsgemäß beschriebene Verfahren und die Struktur erlauben weiterhin die Beobachtung und/oder Manipulation von Zellen während ihres Wachstums, ohne die Zelle dabei unbeabsichtigt zu schädigen oder sogar zu töten. Ein wesentlicher Vorteil der beschriebenen Struktur ist die preiswerte Produktion von angepaßten Mikrostrukturen, die in Kombination mit dem Einbringen der Zelle je nach gewünschter Anwendungsart eine vielfältige Untersuchung der Zelle ermöglichen. Die damit verbundene Positionierung der Zelle ergibt eine preiswerte Alternative zu denen im Stand der Technik beschriebenen Verfahren der Bewegung der Zellen auf einem Substrat. Die Strukturen sind einfach handhabbar und leicht zu sterilisieren. Außerdem wird eine immunhistochemische Charakterisierung verschiedenster Oberflächenantigene nicht beeinflußt. Die freie Wahl der Dimensionierung der Mikrostruktur hat den Vorteil der Flexibilität bei der Wahl der zu untersuchenden Zellen, d. h. vor allem ihrer Größe. Desweiteren können mehrere solcher Strukturen beliebig oder in bestimmten Abständen sowohl in Reihe als auch in Serie durch Kanäle miteinander verbunden werden (Abb. II). Nach Befüllung benachbarter Strukturen kann beispielsweise auch der Einfluß der einzelnen Zellen untereinander bzw. durch räumliche Einschränkung das Wachstum der Zellen untersucht werden.The structure described according to the invention not only enables immobilization of the cell as a whole, but also stabilization of the soft cell membrane. This makes it possible to achieve a higher resolution in AFM examinations without damaging the growth of the cell. The cells are under physiological conditions and show normal growth. The introduction and thus the positioning of the cells is done in a gentle manner, the cells are not additionally stimulated, as is the case, for. B. with mechanical positioning using micromanipulators or positioning with the help of an electric field is to be expected. This has the decisive advantage that only the reaction to the experimentally desired stimuli can be measured in the various examinations and not to reactions which serve to position or mechanically fix the cell. The method and the structure described according to the invention furthermore allow the observation and / or manipulation of cells during their growth without inadvertently damaging or even killing the cell. A major advantage of the structure described is the inexpensive production of adapted microstructures which, in combination with the introduction of the cell, enable a diverse examination of the cell depending on the desired type of application. The associated positioning of the cell results in an inexpensive alternative to the methods of moving the cells on a substrate described in the prior art. The structures are easy to handle and easy to sterilize. In addition, immunohistochemical characterization of various surface antigens is not affected. The free choice of the dimensioning of the microstructure has the advantage of flexibility in the choice of the cells to be examined, ie above all their size. Furthermore, several such structures can be connected to one another at random or at certain intervals, both in series and in series, by channels ( Fig. II). After filling adjacent structures, for example, the influence of the individual cells with one another or, through spatial restriction, the growth of the cells can also be examined.

Für die Erzeugung der Mikrostrukturen können aus der Mikrosystemtechnik weitestgehend bekannte Verfahren herangezogen werden mit dem Vorteil einer preiswerten Massenfertigung. Ein weiterer großer Vorteil ist, daß die Zellen mittels eines Lebenserhaltungssystems im Langzeitversuch beobachtet werden können, da sie ohne Beeinträchtigung in einer der Zelle angepaßten Umgebung weiter wachsen können. For the generation of microstructures, microsystem technology can largely be used Known methods are used with the advantage of an inexpensive Mass production. Another great advantage is that the cells can be Life support system can be observed in long-term trials, as they are without Impairment can continue to grow in an environment adapted to the cell.

Ein weiterer Vorteil ist die Nutzung von verschiedenen Substratmaterialien, die vor allem die Vielfältigkeit des Verfahrens in den Vordergrund stellt. So ermöglicht die Verwendung von z. B. Si/SiO₂ das nachfolgende Aufbringen eines elektrischen Kontaktarrays oder die Verwendung von z. B. Glas die gleichzeitige Beobachtung der Zelle in Transmission.Another advantage is the use of different substrate materials, which above all emphasize the diversity of the process. So the use of z. B. Si / SiO _2, the subsequent application of an electrical contact array or the use of z. B. Glass the simultaneous observation of the cell in transmission.

Description of the pictures

Abb. I Schematische Darstellung einer dreidimensionalen Wannenstruktur mit einer teilgeöffneten Deckschicht. Fig. I Schematic representation of a three-dimensional tub structure with a partially open top layer.

Abb. II Schematische Draufsicht auf eine beliebige Kombination von Einzellenhaltern mit Einfüllöffnungen von hinten und abgedeckten Verbindungskanälen. Fig. II Schematic top view of any combination of single cell holders with filling openings from behind and covered connection channels.

Abb. III Prinzipielle Prozeßschritte bei der Herstellung von Mikrofixierelementen auf Siliziumbasis. Fig. III Basic process steps in the manufacture of microfixing elements based on silicon.

Abb. III-A Abscheidung eines geeigneten Schichtsystems auf einkristallinem Silizium. Fig. III-A deposition of a suitable layer system on single-crystalline silicon.

Abb. III-B Erzeugung einer Haftmaske mittels lithographischer Methoden. Fig. III-B Creation of an adhesive mask using lithographic methods.

Abb. III-C Anisotrope Übertragung der Maskenstrukturen in die Oxidschicht mittels RIE oder strahlgestützter Ätzmethoden. Fig. III-C Anisotropic transfer of the mask structures into the oxide layer using RIE or beam-assisted etching methods.

Abb. III-D Anisotroper Ätzschritt des Siliziums zur Herstellung der Gruben. Fig. III-D Anisotropic etching step of the silicon to produce the pits.

Abb. IV Grundsätzliche Prozeßschritte bei der Herstellung von Mikrofixierelementen auf transparenten Trägern. Fig. IV Basic process steps in the manufacture of microfixing elements on transparent supports.

Abb. IV-A Abscheidung eines geeigneten Schichtsystems. Fig. IV-A deposition of a suitable layer system.

Abb. IV-B Erzeugung einer Haftmaske mittels lithographischer Methoden. Fig. IV-B Creation of an adhesive mask using lithographic methods.

Abb. IV-C Anisotrope Übertragung der Strukturen durch die obere Fixierungsschicht in die Spacerschicht mittels RIE oder strahlgestützter Ätzmethoden. Fig. IV-C Anisotropic transfer of the structures through the upper fixation layer into the spacer layer using RIE or beam-assisted etching methods.

Abb. IV-D Isotroper, vorzugsweise chemischer Ätzschritt zur Unterätzung der oberen Fixierungsschicht. Fig. IV-D isotropic, preferably chemical etching step to undercut the upper fixation layer.

Example description

Im folgenden sollen zwei Beispiele der Mikrostrukturerzeugung und das Einbringen der Zellen in diese beschrieben werden. Die hier beschriebenen Strukturen wurden vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, mit einer Kombination aus Elektronenstrahl-Lithographie, Photolithographie oder Laser-Ablation und nachfolgenden Ätzschritten erzeugt. Des weiteren sind die Dimensionen der erzeugten Strukturen auf die Größe von den Gehirnzellen einer Ratte angepaßt. Eine Anpassung der Strukturdimensionen auf andere Zell-Arten ist allerdings ebenso Inhalt des Patentes.The following are two examples of microstructure generation and the introduction of the Cells in this are described. The structures described here were preferred but not necessarily with a combination of electron beam lithography, Photolithography or laser ablation and subsequent etching steps generated. Furthermore are the dimensions of the structures created based on the size of the brain cells Adjusted rat. However, the structural dimensions have to be adapted to other cell types also the content of the patent.

example 1 Production of microfixation pits covered with a partially opened layer in SiO ₂ / Si

Das erste Anwendungsbeispiel zielt auf die Herstellung von Fixierelementen in einkristallinem Silizium durch die Anwendung von Strukturierungsmethoden und trocken bzw. naßchemischer Ätzmethoden.The first application example aims at the production of fixing elements in single crystalline silicon through the use of structuring methods and dry or wet chemical etching methods.

Mit dieser Methodik können Gruben bzw. trichterförmige Vertiefungen in einkristallines Silizium geätzt werden, die durch eine dünne, strukturierte Schicht abgedeckt werden. Vorzugsweise kommen dabei anisotrope Ätzmittel (NaOH) mit einer hohen Selektivität zur Deckschicht, beispielsweise Siliziumdioxid, zur Anwendung. Alternativ können auch isotrope Ätzer (HNO₃ + HF + H₂O) mit ausreichender Selektivität eingesetzt werden.This method can be used to etch pits or funnel-shaped depressions in single-crystal silicon, which are covered by a thin, structured layer. Anisotropic etchants (NaOH) with a high selectivity for the cover layer, for example silicon dioxide, are preferably used. Alternatively, isotropic etchers (HNO ₃ + HF + H ₂ O) with sufficient selectivity can also be used.

Typischerweise wird eine anorganische Deckschicht in Form eines Nitrides bzw. Oxides mit einer Dicke im Bereich von 200 nm bis 1 µm verwendet. Die Dicke der Deckschicht hängt vom verwendeten naßchemischen Ätzprozeß ab. Die resultierende Dicke der Deckschicht nach erfolgter Ätzung der Zellfixierungsgrube sollte nicht größer als 300 nm sein, um im Fall einer mikroskopischen Charakterisierung eine störungsfreie AFM-Messung zu ermöglichen. Die Herstellung der Mikrowannen erfolgt im einfachsten Fall nach folgendem Prozeßschema: Ausgangspunkt ist eine oxidierte Siliziumscheibe vorzugsweise mit einer <100<-Orientierung. Die Oxidschicht, die sowohl als Grubenabdeckschicht als auch als Siliziumätzmaske dient, kann duch thermische Oxidation, CVD-Verfahren oder mittels Sol-Gel-Technik hergestellt werden. Bei oxidierten Siliziumscheiben ist eine Dicke von etwa 500 nm in der Regel ausreichend.An inorganic cover layer in the form of a nitride or oxide is typically included a thickness in the range of 200 nm to 1 micron used. The thickness of the top layer depends from the wet chemical etching process used. The resulting thickness of the top layer after the etching of the cell fixation pit should not be greater than 300 nm in the case microscopic characterization to enable a trouble-free AFM measurement. In the simplest case, the microwells are manufactured according to the following process scheme: The starting point is an oxidized silicon wafer, preferably with a <100 <orientation. The oxide layer, which is used both as a pit cover layer and as Silicon etching mask can be used by thermal oxidation, CVD or by means of Sol-gel technology can be produced. The thickness of oxidized silicon wafers is approximately 500 nm is usually sufficient.

Die als Grubenabdeckung vorgesehene und mit Öffnungen durchbrochene Deckschicht (Abb. III-A B1b) wird mit einer lithographischen Haftmaske (Abb. III-B C) versehen, die mittels Laserablation, Elektronenstrahl- oder Photolithographie hergestellt wird. Die Öffnungen setzen sich aus Befüllungs- und Analyseöffnungen zusammen, wobei die Befüllungsöffnung eine Größe von etwa 7-10 µm besitzt und die Analyseöffnungen mit etwa 3 µm deutlich kleiner sind. Die Stegbreite zwischen den einzelnen Öffnungen sollte kleiner als 500 nm sein. Bei Nutzung der Elektronenstrahllithographie ist eine 600 nm dicke PMMA (950 K) Schicht (Empfindlichkeit etwa 200 µC/cm² bei einem Strahlstrom von 1 nA) als Resistmaske günstig.The top layer provided as a pit cover and perforated with openings ( Fig. III-A B1b) is provided with a lithographic adhesive mask ( Fig. III-B C), which is produced by laser ablation, electron beam or photolithography. The openings are made up of filling and analysis openings, the filling opening having a size of approximately 7-10 μm and the analysis openings being significantly smaller at approximately 3 μm. The web width between the individual openings should be less than 500 nm. When using electron beam lithography, a 600 nm thick PMMA (950 K) layer (sensitivity about 200 μC / cm ² at a beam current of 1 nA) is favorable as a resist mask.

Nachfolgend wird die Struktur der Haftmaske vorzugsweise mittels Trockenätzen (RIBE mit CF₃H bei 700 V, 200 µA/cm², 15 Minuten) in die Oxidschicht übertragen, wodurch das Silizium (Abb. III-D A1) an den geöffneten Stellen freigelegt wird.The structure of the adhesive mask is then transferred into the oxide layer, preferably by means of dry etching (RIBE with CF ₃ H at 700 V, 200 µA / cm ² , 15 minutes), as a result of which the silicon ( Fig. III-D A1) is exposed at the open positions .

Nachfolgend wird ein naßchemischer Ätzschritt (wässrige Lösung von KOH 20% bei 80°C) durchgeführt, der zur Unterätzung der durchlöcherten Deckschicht führt. Bei Verwendung eines anisotropen Ätzers entsteht unter der durchbrochenen Deckschicht eine pyramidale Grube. Die Stegbreite sowie die Ätzzeit müssen so gewählt werden, daß die unter den Einzelöffnungen entstehenden Pyramiden sich zu einer Pyramide bzw. einem Pyramidenstumpf vereinigen. Die Tiefe der Gruben ist so der Dicke des Zellkörpers angepaßt, daß eine ober- und unterseitige mechanische Fixierung erfolgt. Die lateralen Abmessungen der Ätzgrube, die der Größe der Zelle entsprechen, werden durch die Öffnungen der Deckschicht vorgegeben und liegen üblicherweise im Bereich von 10 bis 100 µm.Subsequently, a wet chemical etching step (aqueous solution of KOH 20% at 80 ° C) carried out, which leads to the undercut of the perforated cover layer. Using An anisotropic etch creates a pyramidal layer under the open top layer Pit. The web width and the etching time must be chosen so that the under The pyramids that form individual openings form a pyramid or a pyramid Unite the truncated pyramid. The depth of the pits is adapted to the thickness of the cell body, that there is mechanical fixation on the top and bottom. The lateral dimensions the etching pit, which correspond to the size of the cell, are through the openings of the Cover layer predetermined and are usually in the range of 10 to 100 microns.

Die Beimpfung von Mikrostrukturen mit Befüllungsöffnungen erfolgt durch definiertes oder zufälliges Einbringen von einer oder mehreren Zelle(n) mittels Mikropipette o. ä. bzw. Manipulatoren oder durch Ablagerung von "abgekapselten" Zellen infolge der Wirkung von Gravitations- und/oder Zentrifugalkräften durch die Befüllungsöffnungen auf den Boden der Gruben. In der nachfolgenden Wachstumsphase erfolgt die mechanische Fixierung durch die allseitige Einengung des Zellkörpers.Microstructures with filling openings are inoculated by defined or Accidental insertion of one or more cells using a micropipette or similar Manipulators or by deposition of "encapsulated" cells due to the action of Gravitational and / or centrifugal forces through the filling openings on the bottom of the Pits. In the subsequent growth phase, mechanical fixation takes place through the all-round narrowing of the cell body.

Example 2 Manufacture of microfixation pits covered with a partially opened layer transparent material

Die ortsgenaue Untersuchung von mechanisch definiert fixierten Zellen mit dem Ziel der Nutzung hochauflösender Mikroskopieverfahren (AFM, SNOM-Scanning Nearfield Optical Microscopy) oder anderen optischen Methoden erfordert einen optisch transparenten Träger, der zumindest die mechanischen Fixierelemente aufnimmt. Darüber hinaus sind bei optisch transparenten Trägern eine Anzahl weiterer Untersuchungs-, Reiz- und Reizabnahmemethoden gleichzeitig mit den bereits genannten möglich. The location-specific examination of mechanically defined cells with the aim of Use of high-resolution microscopy methods (AFM, SNOM scanning nearfield optical Microscopy) or other optical methods requires an optically transparent support, which at least accommodates the mechanical fixing elements. In addition, at optical transparent carriers a number of other examination, stimulus and Stimulus reduction methods are possible simultaneously with those already mentioned.

Die Herstellung der Zellhaltevorrichtung erfolgt prinzipiell wiederum mittels anisotroper und selektiver Ätzverfahren. Im nachfolgend beschriebenen Fall wird dies durch die Kombination von SiO₂-/Si₃N₄-Schichten, die auf einem Quarzträger aufgebracht werden, erreicht. Diese Materialien weisen bei Verwendung eines fluorhaltigen naßchemischen Ätzers (z. B. HF) eine deutlich unterschiedliche Ätzrate auf.In principle, the cell holding device is in turn produced by means of anisotropic and selective etching processes. In the case described below, this is achieved by the combination of SiO ₂ / Si ₃ N ₄ layers which are applied to a quartz carrier. When using a fluorine-containing wet chemical etcher (e.g. HF), these materials have a significantly different etching rate.

Auf einen doppelseitig polierten Quarzträger (Abb. IV-A A1) wird vorder- und rückseitig eine in der Dicke an die nachfolgenden Prozeßschritte angepaßte Siliziumnitridschicht (z. B. 250 nm) (Abb. IV-A B1a und B1b) aufgebracht, die als Ätzstoppschicht wirkt. Nachfolgend wird auf der Vorderseite eine in der Dicke der Zelldimension angepaßte Siliziumdioxidschicht (ca. 2 bis 5 µm; Abb. IV-C C1) abgeschieden, die später zur Herstellung der Mikrozellfixierungsgruben dienen soll. Abschließend erfolgt eine nochmalige Beschichtung mit Si₃N₄ als Maskierungs- und Halteschicht (Abb. IV-A B1c).A silicon nitride layer (e.g. 250 nm) ( Fig. IV-A B1a and B1b), which is adapted to the thickness of the subsequent process steps ( Fig. IV-A B1a and B1b), is applied to the front and back of a quartz carrier ( fig Etching stop layer works. Subsequently, a silicon dioxide layer (approx. 2 to 5 µm; Fig. IV-C C1), which is adapted to the thickness of the cell dimension, is deposited on the front side, which will later serve to manufacture the microcell fixation pits. Finally, there is another coating with Si ₃ N ₄ as a masking and holding layer ( Fig. IV-A B1c).

Im folgenden lithographischen Schritt werden die Befüll- und Meßöffnungen (Abb. II-E1 und 2) als Haftmaske definiert. Bei Verwendung der Elektronenstrahllithographie (ESL) hat sich eine 1300 nm dicke PMMA-Resistmaske (Empfindlichkeit etwa 250 µC/cm² bei einem Strahlstrom von 2 nA) als günstig erwiesen (Abb. IV-B D1). Bei der ESL wird außerdem noch eine zusätzliche 50 nm dicke Titanschicht zwischen der Siliziumnitridschicht und dem PMMA aufgebracht. Die Haftmaske wird dann mittels RIBE (CHF₃ 700 eV, 200 µA/cm², 100 Minuten) oder anderen anisotropen Ätzverfahren (z. B. RIE, IBE) in die obere Siliziumnitridschicht (Abb. IV-C B1c) und in die Siliziumdioxidschicht übertragen. Die Siliziumdioxidschicht muß dabei nicht vollständig durchätzt werden, sondern es kann eine Restdicke von ca. 1 µm Oxid verbleiben. Abschließend erfolgt die naßchemische Unterätzung (Abb. IV-D F) der oberen Siliziumnitridschicht mit einem fluorhaltigen Ätzmittel (BHF-Ätzer) durch selektive Auflösung des SiO₂ durch die geöffnete Siliziumnitriddeckschicht.In the following lithographic step, the filling and measuring openings ( Fig. II-E1 and 2) are defined as an adhesive mask. When using electron beam lithography (ESL), a 1300 nm thick PMMA resist mask (sensitivity around 250 µC / cm ² with a beam current of 2 nA) has proven to be favorable ( Fig. IV-B D1). At the ESL, an additional 50 nm thick titanium layer is also applied between the silicon nitride layer and the PMMA. The adhesive mask is then purified by RIBE (CHF ₃₇₀₀ eV, 200 microamps / cm ^2, 100 minutes) or other anisotropic etching techniques (for. Example, RIE, IBE) into the upper silicon nitride layer (Fig. IV-C B1c) and the silicon dioxide layer transfer. The silicon dioxide layer does not have to be completely etched through, but a residual thickness of approximately 1 μm oxide can remain. Finally, the wet chemical undercut ( Fig. IV-D F) of the upper silicon nitride layer is carried out with a fluorine-containing etchant (BHF etcher) by selective dissolution of the SiO ₂ through the opened silicon nitride cover layer.

Claims

1. A method for restricting mobility, positioning and influencing the direction of growth of human, animal or plant living cells using three-dimensional microstructures and the introduction of cells into them, characterized in that

a) that the dimensions of the openings contained in the microstructure correspond to the size of the cell in the nutrient solution at least at one point;
b) that the majority of the openings in the structure are sized to be smaller than the average size of the cells used;
c) that the cell is in a physiological environment.

2. Microstructure according to claim 1, characterized in that at least one Side of the structure is a membrane with openings that are smaller than the cell in Nutrient solution.

3. Microstructure according to claim 2, characterized in that part of the structure a semiconductor material.

4. Microstructure according to claim 2, characterized in that part of the structure a ceramic, an oxide or a polymer.

5. Microstructure according to claim 3 and 4, characterized in that on or in the Structure surfaces are made of metal.

6. Microstructure according to claim 5, characterized in that on a substrate one or more of these structures are located.

7. Microstructure according to claim 5, characterized in that the structures partially or are completely connected.

8. Microstructure according to claim 5, characterized in that at or in the vicinity the cell has one or more electrodes.

9. Microstructure according to claim 5, characterized in that part of the structure or the complete structure is made up of one or more electrodes.

10. A method for introducing the living cells into the microstructure, thereby characterized that the complete structure is in the nutrient solution.

11. The method according to claim 10, characterized in that part of the structure in Nutrient solution or chemically defined substances.

12. The method according to claim 10 and 11, characterized in that the cells by Movement of the substrate in the nutrient solution can be introduced into the structure.

13. The method according to claim 10 and 11, characterized in that the cells by Centrifugation of the substrate in nutrient solution can be introduced into the structure.

14. The method according to claim 10 and 11, characterized in that the cells with the help mechanical aids are introduced into the structure.

15. The method according to claim 10 and 11, characterized in that part of the structure or the entire structure is flushed with the nutrient solution and so the cells in the Structure.

16. The method according to claim 10 and 11, characterized in that the cells sufficiently long time on the structure that the cells adhere within the Microstructure enables.

17. Microstructure according to one of the preceding claims, characterized in that the Structure in chip form is inserted into a ceramic package with electrical connections, such as it can be used for electronic circuits.

18. Microstructure according to one of the preceding claims, characterized in that the Structure is part of a micromanipulation device.