DE19835219A1

DE19835219A1 - Use of 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase DNA to produce plants with increased tocopherol, vitamin K, chlorophyll and/or carotenoid content

Info

Publication number: DE19835219A1
Application number: DE1998135219
Authority: DE
Inventors: Andreas Reindl; Mejia Patricia Leon; Palmas Juan Manuel Esteves; Gracia Maria Araceli Cantero; Marcus Ebneth; Karin Herbers
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1998-08-05
Filing date: 1998-08-05
Publication date: 2000-02-10

Abstract

The use of a DNA sequence encoding a 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DOXS) to produce plants with an increased tocopherol, vitamin K, chlorophyll and/or carotenoid content is new. Independent claims are also included for the following: (1) a method to produce a plant with increased tocopherol, vitamin K, chlorophyll and/or carotenoid content is characterized in that the plant expresses a 2458 bp sequence, fully defined in the specification or a sequence which hybridizes with it; (2) a method of transforming a plant comprises transforming a plant cell, callus tissue, a whole plant or protoplast of a plant cell with an expression cassette containing a promoter and a DNA sequence; (3) a plant with increased tocopherol, vitamin K, chlorophyll and/or carotenoid content containing an expression cassette as above; and (4) a test system based on the expression of an expression cassette as above to identify inhibitors of DOXS.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von DNA-Sequen zen codierend für eine 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Synthase (DOXS) zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Tocopherol-, Vitamin K-, Chlorophyll- und/oder Carotinoid-Gehalt, speziell die Verwendung einer DNA-Sequenz SEQ ID No. 1 oder einer mit dieser hybridisierenden DNA-Sequenz, einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Tocopherol-, Vitamin K-, Chlorophyll- und/ oder Carotinoid-Gehalt, die derart hergestellte Pflanze selbst, sowie die Verwendung der SEQ ID No. 1 zur Herstellung eines Test systems zur Identifizierung von Inhibitoren der DOXS.The present invention relates to the use of DNA sequences zen coding for a 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DOXS) for the production of plants with increased tocopherol, Vitamin K, chlorophyll and / or carotenoid content, especially that Use of a DNA sequence SEQ ID No. 1 or one with this hybridizing DNA sequence, a process for the production of Plants with increased tocopherol, vitamin K, chlorophyll and / or carotenoid content, the plant itself, and the use of SEQ ID No. 1 for making a test systems for the identification of DOXS inhibitors.

Ein wichtiges Ziel pflanzenmolekulargenetischer Arbeiten ist bisher die Erzeugung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Zuckern, Enzymen und Aminosäuren. Wirtschaftlich interessant ist jedoch auch die Entwicklung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Vitaminen, wie z. B. der Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes.An important goal of plant molecular genetic work is so far the production of plants with an increased sugar content, Enzymes and amino acids. However, it is economically interesting also the development of plants with an increased content of Vitamins such as B. the increase in tocopherol content.

Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E-Ak tivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesell schaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E). Die erste Gruppe (1a-d) stammt von Tocopherol ab, die zweite Gruppe besteht aus Derivaten des Tocotrienols (2a-d):
The eight naturally occurring compounds with vitamin E activity are derivatives of 6-chromanol (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E). The first group (1a-d) is derived from tocopherol, the second group consists of tocotrienol derivatives (2a-d):

1a, α-Tocopherol: R¹ = R² = R³ = CH₃
1b, β-Tocopherol [148-03-8]: R¹ = R³ = CH₃, R² = H
1c, γ-Tocopherol [54-28-4]: R¹ = H, R² = R³ = CH₃
1d, δ-Tocopherol [119-13-1]: R¹ = R² = H, R³ = CH₃
1a, α-tocopherol: R ¹ = R ² = R ³ = CH ₃
1b, β-tocopherol [148-03-8]: R ¹ = R ³ = CH ₃ , R ² = H
1c, γ-tocopherol [54-28-4]: R ¹ = H, R ² = R ³ = CH ₃
1d, δ-tocopherol [119-13-1]: R ¹ = R ² = H, R ³ = CH ₃

2a, α-Tocotrienol [1721-51-3]: R¹ = R² = R³ = CH₃
2b, β-Tocotrienol [490-23-3]: R¹ = R³ = CH₃, R² = H
2c, γ-Tocotrienol [14101-61-2]: R¹ = H, R² = R³ = CH₃
2d, δ-Tocotrienol [25612-59-3]: R¹ = R² = H, R³ = CH₃ 2a, α-tocotrienol [1721-51-3]: R ¹ = R ² = R ³ = CH ₃
2b, β-tocotrienol [490-23-3]: R ¹ = R ³ = CH ₃ , R ² = H
2c, γ-tocotrienol [14101-61-2]: R ¹ = H, R ² = R ³ = CH ₃
2d, δ-tocotrienol [25612-59-3]: R ¹ = R ² = H, R ³ = CH ₃

Wirtschaftlich große Bedeutung besitzt α-Tocopherol.Α-Tocopherol is of great economic importance.

Der Entwicklung von Kulturpflanzen mit erhöhtem Tocopherol-Gehalt durch Gewebekultur oder Samenmutagenese und natürliche Auswahl sind Grenzen gesetzt. So muß einerseits der Tocopherol-Gehalt bereits in Gewebekultur erfaßbar sein und andererseits können nur diejenigen Pflanzen über Gewebekulturtechniken manipuliert werden, deren Regeneration zu ganzen Pflanzen aus Zellkulturen gelingt. Außerdem können Kulturpflanzen nach Mutagenese und Selektion unerwünschte Eigenschaften zeigen, die durch teilweise mehrmalige Rückkreuzungen wieder beseitigt werden müssen. Auch wäre die Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes durch Kreuzung auf Pflanzen der selben Art beschränkt.The development of crops with increased tocopherol content through tissue culture or seed mutagenesis and natural selection there are limits. So on the one hand the tocopherol content can already be detected in tissue culture and, on the other hand, can only those plants manipulated via tissue culture techniques their regeneration to whole plants from cell cultures succeed. In addition, after mutagenesis and Selection show undesirable properties caused by partial repeated backcrosses must be eliminated. Also would be to increase the tocopherol content by crossing Plants of the same species are restricted.

Aus diesen Gründen ist das gentechnische Vorgehen, ein für die Tocopherol Syntheseleistung kodierendes, essentielles Biosynthe segen zu isolieren und in Kulturpflanzen gezielt zu übertragen, dem klassischen Züchtungsverfahren überlegen. Dieses Verfahren setzt voraus, daß die Biosynthese und deren Regulation bekannt ist und daß Gene, die die Biosyntheseleistung beeinflussen, identifiziert werden.For these reasons, the genetic engineering approach is one for the Essential biosynthesis encoding tocopherol synthesis performance isolate blessings and transfer them in crops, superior to the classic breeding process. This method assumes that biosynthesis and its regulation are known and that genes that affect biosynthetic performance be identified.

Isoprenoide oder Terpenoide bestehen aus verschiedenen Klassen lipidlöslicher Moleküle und werden teilweise oder vollständig aus C₅. Isopren-Einheiten gebildet. Reine Prenyllipide (z. B. Carotinoide) bestehen aus C-Skeletten, die ausschließlich auf Isopren-Einheiten zurückgehen, während gemischte Prenyllipide (z. B. Chlorophyll) eine Isoprenoid-Seitenkette besitzen, die mit einem aromatischen Kern verbunden ist.Isoprenoids or terpenoids consist of different classes of lipid-soluble molecules and are partially or completely made of C ₅ . Isoprene units formed. Pure prenyl lipids (e.g. carotenoids) consist of C skeletons that are exclusively based on isoprene units, while mixed prenyl lipids (e.g. chlorophyll) have an isoprenoid side chain which is linked to an aromatic nucleus.

Ausgangspunkt der Biosynthese von Prenyllipiden sind 3 × Acetyl- CoA Einheiten, die über β-Hydroxymethylglutaryl-CoA (HMG-CoA) und Mevalonat in die Ausgangs-Isopren-Einheit (C₅), dem Isopentenylpy rophosphat (IPP), umgewandelt werden. Kürzlich wurde durch in vivo Fütterungsexperimente mit C¹³ gezeigt, daß in verschiedenen Eubakterien, Grünalgen und pflanzlichen Chloroplasten ein Mevalo nat-unabhängiger Weg zur Bildung von IPP beschritten wird:
The starting point for the biosynthesis of prenyl lipids are 3 × acetyl-CoA units, which are converted via β-hydroxymethylglutaryl-CoA (HMG-CoA) and mevalonate into the starting isoprene unit (C ₅ ), the isopentenyl pyrophosphate (IPP). It has recently been shown by in vivo feeding experiments with C ¹³ that in various eubacteria, green algae and plant chloroplasts a Mevalo nat-independent route to the formation of IPP is followed:

Dabei werden Hydroxyethylthiamin, das durch Decarboxylierung von Pyruvat entsteht, und Glycerinaldehyd-3-Phosphat (3-GAP) in einer durch die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Synthase vermittelten "Transketolase"-Reaktion zunächst in 1-Deoxy-D-Xylu lose-5-phosphat umgewandelt (Schwender et al., FEBS Lett. 414 (1), 129-134 (1997); Arigoni et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA 94 (2), 10600-10605 (1997); Lange et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 (5), 2100-2104 (1998); Lichtenthaler et al., FEBS Lett. 400 (3), 271-274 (1997). Dieses wird dann durch eine intramolekulare Umord nung in IPP umgesetzt (Arigoni et al., 1997). Biochemische Daten deuten darauf hin, daß der Mevalonat-Weg im Zytosol operiert und zur Bildung von Phytosterolen führt. Das Antibiotikum Mevinolin, ein spezifischer Inhibitor der Mevalonat-Bildung, führt lediglich zur Inhibition der Sterol-Biosynthese im Zytoplasma, während die Prenyllipid-Bildung in den Plastiden unbeeinflußt ist (Bach und Lichtenthaler, Physiol. Plant 59 (1983), 50-60. Der Mevalonat unabhängige Weg ist dagegen plastidär lokalisiert und führt vornehmlich zur Bildung von Carotinoiden und plastidären Prenyl lipiden (Schwender et al., 1997; Arigoni et al. 1997).Hydroxyethylthiamine, which is obtained by decarboxylation of Pyruvate is formed and glyceraldehyde-3-phosphate (3-GAP) in one mediated by the 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase "Transketolase" reaction initially in 1-deoxy-D-xylu loose 5-phosphate converted (Schwender et al., FEBS Lett. 414 (1), 129-134 (1997); Arigoni et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA 94 (2), 10600-10605 (1997); Lange et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 (5), 2100-2104 (1998); Lichtenthaler et al., FEBS Lett. 400 (3), 271-274 (1997). This is then caused by an intramolecular reorganization implementation in IPP (Arigoni et al., 1997). Biochemical data indicate that the mevalonate pathway operates in the cytosol and leads to the formation of phytosterols. The antibiotic mevinolin, a specific inhibitor of mevalonate formation only leads to inhibit sterol biosynthesis in the cytoplasm while the Prenyllipid formation in the plastids is unaffected (Bach and Lichtenthaler, Physiol. Plant 59 (1983), 50-60. The Mevalonat the independent path, on the other hand, is localized and leads primarily for the formation of carotenoids and plastidic prenyl lipids (Schwender et al., 1997; Arigoni et al. 1997).

IPP steht im Gleichgewicht mit seinem Isomer, dem Dimethylallyl Pyrophosphat (DMAPP). Eine Kondensation von IPP mit DMAPP in Kopf-Schwanz Anlagerung ergibt das Monoterpen (Cia) Geranyl-Pyro phosphat (GPP). Die Addition von weiteren IPP Einheiten führt zum Sesquiterpen (C₁₅) Farnesy-Pyrophosphat (FPP) und zum Diterpen (C₂₀) Geranyl-Geranyl-Pyrophosphat (GGPP). Die Verknüpfung zweier GGPP Moleküle führt zur Bildung der C₄₀-Vorläufer für Carotinoide. GGPP wird durch eine Prenylketten-Hydrogenase zum Phytyl-Pyro phosphat (PPP) umgeformt, dem Ausgangsstoff für die weitere Bildung von Tocopherolen.IPP is in equilibrium with its isomer, dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP). A condensation of IPP with DMAPP in head-tail attachment gives the monoterpene (Cia) geranyl pyrophosphate (GPP). The addition of further IPP units leads to the sesquiterpene (C ₁₅ ) Farnesy pyrophosphate (FPP) and the diterpene (C ₂₀ ) geranyl-geranyl pyrophosphate (GGPP). Linking two GGPP molecules leads to the formation of the C ₄₀ precursors for carotenoids. GGPP is converted to phytyl pyrophosphate (PPP) by a prenyl chain hydrogenase, the starting material for the further formation of tocopherols.

Bei den Ringstrukturen der gemischten Prenyllipide, die zur Bildung der Vitamine E und K führen, handelt es sich um Quinone, deren Ausgangsmetabolite aus dem Shikimat-Weg stammen. Die aroma tischen Aminosäuren Phenylalanin bzw. Tyrosin werden in Hydroxy phenyl-Pyruvat umgewandelt, welches durch Dioxygenierung in Homo gentisinsäure überführt wird. Diese wird an PPP gebunden, um den Vorläufer von α-Tocopherol und α-Tocoquinon, das 2-Methyl-6-phy tylquinol, zu bilden. Durch Methylierungsschritte mit S-Adenosyl methionin als Methyl-Gruppen-Donor entsteht zunächst 2,3-Dimethyl-6-phytylquinol, dann durch Zyklisierung γ-Tocopherol und durch nochmalige Methylierung α-Tocopherol (Richter, Bioche mie der Pflanzen, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1996).The ring structures of the mixed prenyl lipids used for Lead to the formation of vitamins E and K, they are quinones, whose starting metabolites come from the Shikimate pathway. The aroma Table amino acids phenylalanine and tyrosine are in hydroxy phenyl pyruvate, which is converted into homo by dioxygenation gentisic acid is transferred. This is tied to PPP in order to Precursors of α-tocopherol and α-tocopoquinone, the 2-methyl-6-phy tylquinol. By methylation steps with S-adenosyl methionine as a methyl group donor is initially formed 2,3-dimethyl-6-phytylquinol, then by cyclization γ-tocopherol and by repeated methylation of α-tocopherol (Richter, Bioche mie of plants, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1996).

In der Literatur finden sich Beispiele die zeigen, daß die Mani pulation eines Enzyms den Metabolit-Fluß direktional beeinflußen kann. In Experimenten mit einer veränderten Expression der Phytoen Synthase, welche zwei GGPP-Moleküle zu 15-cis-Phytoen miteinander verknüpft, konnte ein direkter Einfluß auf die Carotinoid-Mengen dieser transgenen Tomatenpflanzen gemessen werden (Fray und Grierson, Plant Mol.Biol.22 (4), 589-602 (1993); Fray et al., Plant J., 8, 693-701 (1995). Wie zu erwarten, zeigen transgene Tabakpflanzen mit verringerten Mengen an Phenylalanin- Ammonium Lyase reduzierte Phenylpropanoid-Mengen. Das Enzym Phenylalanin-Ammonium Lyase katalysiert den Abbau von Phenyl alanin, entzieht es also der Phenylpropanoid-Biosynthese (Bate et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91 (16): 7608-7612 (1994); Howles et al., Plant Physiol. 112. 1617-1624 (1996). There are examples in the literature which show that the Mani of an enzyme directionally affect the metabolite flow can. In experiments with a changed expression of the Phytoene synthase, which two GGPP molecules to 15-cis-phytoene linked together, could have a direct impact on the Carotenoid levels of these transgenic tomato plants were measured (Fray and Grierson, Plant Mol. Biol. 22 (4), 589-602 (1993); Fray et al., Plant J., 8, 693-701 (1995). As expected, show transgenic tobacco plants with reduced amounts of phenylalanine Ammonium lyase reduced amounts of phenylpropanoid. The enzyme Phenylalanine ammonium lyase catalyzes the breakdown of phenyl alanine, it deprives phenylpropanoid biosynthesis (Bate et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91 (16): 7608-7612 (1994); Howles et al., Plant Physiol. 112, 1617-1624 (1996).

Über die Erhöhung des Metabolitflusses zur Steigerung des Toco pherol-Gehaltes in Pflanzen durch Übeexpression einzelner Biosynthesegene ist bisher wenig bekannt. Lediglich WO 97/27285 beschreibt eine Modifikation des Tocopherol-Gehaltes durch verstärkte Expression bzw. durch Herunterregulation des Enzyms p-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD).About increasing the metabolite flow to increase the toco pherol content in plants by overexpression of individual Little is known about biosynthetic genes. Only WO 97/27285 describes a modification of the tocopherol content by increased expression or by downregulating the enzyme p-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen und Carotinoiden.The object of the present invention was to develop a transgenic plant with an increased tocopherol content, Vitamin K, chlorophylls and carotenoids.

Die Aufgabe wurden überraschenderweise gelöst durch die Über expression eines 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Sythase (DOXS) - Gens in den Pflanzen.The task was surprisingly solved by the over expression of a 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthesis (DOXS) - Gens in the plants.

Um den Metabolit-Fluß aus dem Primärstoffwechsel in den Isopre noid-Stoffwechsel zu verstärken, wurde die Bildung von IPP als allgemeines Ausgangssubstrat für alle plastidären Isoprenoide erhöht. Zu diesem Zweck wurde in Pflanzen die Aktivität der DOXS durch Überexpression des homologen Gens (Gen aus Orgnismus der selben Art) erhöht. Dies kann auch durch die Expression eines heterologen Gens (Gens aus entfernten Organismen) erreicht werden. Nukleotidsequenzen sind aus Arabidopsis thaliana DOXS (Acc. No. U 27099), Reis (Acc. No. AF024512) und Pfefferminze (Acc. No. AF019383) beschrieben.To the metabolite flow from the primary metabolism into the isoprene To boost noid metabolism, the formation of IPP was considered general starting substrate for all plastidic isoprenoids elevated. For this purpose, the activity of DOXS in plants by overexpression of the homologous gene (gene from orgnism of the same type) increased. This can also be done by expressing a heterologous gene (gene from distant organisms) reached become. Nucleotide sequences are from Arabidopsis thaliana DOXS (Acc. No. U 27099), rice (Acc. No. AF024512) and peppermint (Acc. No. AF019383).

In einem Ausführungsbeispiel wird das DOXS-Gen aus Arabidopsis thaliana (Seq-ID No.: 1; Mandel et al. Plant J. 9, 649-658 (1996); Acc. No. U27099) in transgenen Pflanzen verstärkt exprimiert. Eine Plastidenlokalisierung ist durch die in der Gensequenz enthaltenen Transitsignalsequenz gewährleistet. Auch geeignet als Expressionskassette ist eine DNA-Sequenz, die für ein DOXS-Gen codiert, das mit Seq-ID No. 1 hybridisiert und das aus anderen Organismen bzw. vorzugsweise aus anderen Pflanzen stammt.In one embodiment, the DOXS gene is from Arabidopsis thaliana (Seq ID No .: 1; Mandel et al. Plant J. 9, 649-658 (1996); Acc. No. U27099) is increasingly expressed in transgenic plants. A plastid localization is due to that in the gene sequence included transit signal sequence guaranteed. Also suitable as Expression cassette is a DNA sequence that is responsible for a DOXS gene encoded with Seq-ID No. 1 hybridizes and that from others Organisms or preferably from other plants.

Das nun vermehrt zur Verfügung stehende GGPP wird weiter in Richtung Tocopherole und Carotinoide umgesetzt.The GGPP, which is now increasingly available, will continue in Implemented towards tocopherols and carotenoids.

Die effiziente Bildung von Carotinoiden ist essentiell für die Photosynthese, wobei sie neben den Chlorophyllen als "Lichtsamm ler-Komplexe" zur besseren Ausnutzung der Photonenenergie dienen (Heldt, Pflanzenbiochemie. Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg Berlin Oxford, 1996). Zusätzlich erfüllen Carotinoide wichtige Schutzfunktionen gegen Sauerstoff-Radikale wie den Singulett-Sauerstoff, den sie wieder in den Grundzustand zurück führen können (Asada, 1994; Demming-Adams und Adams, Trends in Plant Sciences 1; 21-26 (1996). Es wurde eine 1-Deoxy-D-Xylu lose-5-Phosphat Synthase defekte Arabidopsis thaliana Mutante isoliert, die einen "Albino-Phänotyp" zeigt (Mandel et al. 1996). Daraus ist abzuleiten, daß eine verringerte Menge an Carotinoiden in den Plastiden negative Auswirkungen auf die Pflanze hat.The efficient formation of carotenoids is essential for that Photosynthesis, in addition to the chlorophylls as "light collection ler complexes "to better utilize the photon energy (Heldt, Plant Biochemistry. Spectrum Academic Publisher Heidelberg Berlin Oxford, 1996). In addition, carotenoids meet important protective functions against oxygen radicals like that Singlet oxygen they return to the basic state (Asada, 1994; Demming-Adams and Adams, Trends in Plant Sciences 1; 21-26 (1996). It became a 1-deoxy-D-xylu Loose 5-phosphate synthase defective Arabidopsis thaliana mutant isolated, which shows an "albino phenotype" (Mandel et al. 1996). From this it can be deduced that a reduced amount of carotenoids in the plastids has negative effects on the plant.

Zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Entwicklung eines Testsystems zur Identifizierung von Inhibitoren der DOXS.An additional object of the present invention was therefore Development of a test system for the identification of inhibitors the DOXS.

Diese Aufgabe wurde gelöst durch die Expression eines DOXS-Gens aus Arabidopsis bzw. damit hybridisierenden DNA-Sequenzen und anschließende Testung von Chemikalien auf Hemmung der DOXS-Enzym aktivität.This problem was solved by the expression of a DOXS gene from Arabidopsis or DNA sequences hybridizing therewith and subsequent testing of chemicals for inhibition of the DOXS enzyme activity.

Die Herstellung der transgenen Pflanzen erfolgt durch Transforma tion der Pflanzen mit einem das DOXS-Gen enthaltenden Konstrukt. Als Modellpflanzen für die Produktion von Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen und Carotinoiden wurden Arabidopsis und Raps eingesetzt.The transgenic plants are produced by Transforma tion of the plants with a construct containing the DOXS gene. As model plants for the production of tocopherols, vitamin K, chlorophylls and carotenoids became Arabidopsis and rapeseed used.

Die Klonierung des vollständigen DOXS-Gens aus Arabidopsis erfolgt über die Isolierung der für das DOXS-Gen spezifischen cDNA (Seq-ID No.: 1).Cloning of the complete Arabidopsis DOXS gene is done by isolating those specific for the DOXS gene cDNA (Seq ID No .: 1).

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der DNA-Sequenz SEQ ID No. 1, die für eine DOXS oder deren funktionelles Äquivalent kodiert, zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Tocopherol-, Vitamin K, Chlorophyll und/oder Carotinoid-Gehalt. Die Nuklein säuresequenz kann dabei z. B. eine DNA- oder eine cDNA-Sequenz sein. Zur Insertion in eine Expressionskassette geeignete kodie rende Sequenzen sind beispielsweise solche, die für eine DOXS ko dieren und die dem Wirt die Fähigkeit zur Überproduktion von Tocopherol verleihen.The invention relates to the use of the DNA sequence SEQ ID No. 1, for a DOXS or its functional equivalent encoded, for the production of a plant with increased tocopherol, Vitamin K, chlorophyll and / or carotenoid content. The nucleus acid sequence can z. B. a DNA or a cDNA sequence his. Code suitable for insertion into an expression cassette Sequences are, for example, those that co and the ability of the host to overproduce Give tocopherol.

Die Expressionskassetten beinhalten außerdem regulative Nuklein säuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine Expressionskassette stromaufwärts, d. h. am 5'-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d. h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden ko dierenden Sequenz für das DOXS-Gen operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anord nung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. wei terer requlativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten aber nicht darauf beschränkten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten und Translationsver stärker wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaic-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987) 8693-8711).The expression cassettes also contain regulatory nucleotides acid sequences which express the expression of the coding sequence in control the host cell. According to a preferred embodiment comprises an expression cassette upstream, i. H. at the 5 'end the coding sequence, a promoter and downstream, d. H. at the 3'-end, a polyadenylation signal and optionally others regulatory elements, which with the intervening ko sequence for the DOXS gene are operatively linked. Under An operational link is understood to be the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and possibly white tter reulative elements such that each of the regulative Elements its function in the expression of the coding Can fulfill sequence as intended. The operative Linking preferred but not limited to sequences are targeting sequences to ensure the subcellular Localization in the apoplast, in the vacuole, in plastids, in Mitochondrium, in the endoplasmic reticulum (ER), in the cell nucleus, in oil corpuscles or other compartments and translation ver stronger than the 5 'tobacco mosaic virus leader sequence (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987) 8693-8711).

Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in den Tabak-Transformationsvektor pBinAR-Hyg eingebaut werden. Abb. 1 zeigt die Tabaktransformationsvektoren pBinAR-Hyg mit 35S-Promo tor (A) bzw. pBinAR-Hyg mit samenspezifischem Promotor Phaseolin 796 (B):
As an example, the plant expression cassette can be installed in the tobacco transformation vector pBinAR-Hyg. Fig. 1 shows the tobacco transformation vectors pBinAR-Hyg with 35S promoter (A) or pBinAR-Hyg with seed-specific promoter Phaseolin 796 (B):

- HPT: hygromycin phosphotransferase
- OCS: octopine synthase terminator
- PNOS: nopaline synthase promoter
- Such restriction interfaces are also shown net that only cut the vector once.

Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzen virus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294). Dieser Promotor enthält bekanntlich unterschiedliche Erkennungssequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989), 2195-2202).In principle, everyone is the promoter of the expression cassette Promoter suitable for the expression of foreign genes in plants can control. In particular, one is preferably used herbal promoter or a promoter that is a plant virus originated. The CaMV 35S promoter is particularly preferred from the cauliflower mosaic virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294). As is known, this promoter contains different ones Recognition sequences for transcriptional effectors that are in their Whole to a permanent and constitutive expression of the introduced gene (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989), 2195-2202).

Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen DOXS- Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert wer den kann. Derartige Promotoren wie z. B. der PRP1-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), ein durch Salizyl säure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzenesul fonamid-induzierbarer (EP-A 388186), ein durch Tetrazyklin induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP-A 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können u. a. verwendet werden.The expression cassette can also be a chemically inducible one Contain promoter through which the expression of the exogenous DOXS Gene is controlled in the plant at a specific time that can. Such promoters such. B. the PRP1 promoter (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), one by Salizyl acid inducible promoter (WO 95/19443), a by Benzenesul fonamide-inducible (EP-A 388186), one by tetracycline inducible (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404) by abscisic acid-inducible (EP-A 335528) or by Ethanol or cyclohexanone inducible (WO 93/21334) promoter can u. a. be used.

Weiterhin sind insbesonders solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Biosynthese von Tocopherol bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Furthermore, those promoters are preferred which are the Ensure expression in tissues or parts of plants in which the biosynthesis of tocopherol or its precursors takes place.

Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cyto solischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245).Promoters that are leaf-specific are particularly noteworthy Ensure expression. The promoter of cyto should be mentioned FBPase from potato or the ST-LSI promoter from potatoes (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245).

Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors konnte ein Fremd protein stabil bis zu einem Anteil von 0,67% des gesamten lösli chen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen expri miert werden (Fiedler und Conrad, Bio/Technology 10 (1995), 1090-1094). Die Expressionskassette kann daher beispielsweise einen samenspezifischen Promotor (bevorzugt den Phaseolin- Promotor (US 5504200), den USP- (Baumlein, H. et al. Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459-467) oder LEB4-Promotor (Fiedler und Conrad, 1995)), das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und ein ER-Retentionssignal enthalten. Der Aufbau einer derar tigen Kassette ist in der Abb. 1 schematisch beispielhaft dargestellt.With the help of a seed-specific promoter, a foreign protein could be stably expressed in the seeds of transgenic tobacco plants up to a proportion of 0.67% of the total soluble seed protein (Fiedler and Conrad, Bio / Technology 10 (1995), 1090-1094). The expression cassette can therefore, for example, be a seed-specific promoter (preferably the phaseolin promoter (US 5504200), the USP- (Baumlein, H. et al. Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459-467) or LEB4 Promoter (Fiedler and Conrad, 1995)), the LEB4 signal peptide, the gene to be expressed and an ER retention signal. The structure of such a cassette is shown schematically as an example in Fig. 1.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten DOXS-DNA Sequenz und vorzugsweise einer zwischen Promotor und DOXS-DNA-Sequenz inserierten DNA, die für ein chloroplastenspezifisches Transit peptid kodiert, sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.An expression cassette is produced by fusion a suitable promoter with a suitable DOXS-DNA sequence and preferably one between promoter and DOXS DNA sequence inserted DNA for a chloroplast-specific transit encoded peptide, and a polyadenylation signal according to common Recombination and cloning techniques, such as, for example in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and T. J. Silhavy, M. L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987).

Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in den Apoplasten, in Plastiden, in die Vakuole, in das Mitochondrium, in das Endoplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen einen Verbleib im Komparti ment des Entstehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423). Für die Menge der Proteinakkumulation in transgenen Pflanzen besonders förderlich erwiesen hat sich eine Lokalisation im ER (Schouten et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792).Sequences which target in the Apoplasts, in plastids, in the vacuole, in the mitochondrion, in the endoplasmic reticulum (ER) or due to a lack corresponding operative sequences remain in the compartment ensure the formation of the cytosol (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15: 4 (1996), 285-423). For the amount of Protein accumulation particularly beneficial in transgenic plants Localization in ER (Schouten et al., Plant Mol. Biol. 30: 781-792 (1996).

Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren DNA- Sequenz für ein DOXS-Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Besonders bevorzugt sind für die Chloropla sten spezifische Transitpeptide, welche nach Translokation des DOXS-Gens in die Chloroplasten vom DOXS-Teil enzymatisch abge spalten werden. Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plastidären Transketolase (TK) oder einem funktionellen Äquivalent dieses Transitpeptids (z. B. dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Rubisco oder der Ferredoxin NADP Oxido reduktase) abgeleitet ist.Expression cassettes can also be used whose DNA Sequence encoded for a DOXS fusion protein, part of the Fusion protein is a transit peptide that translocates the Controls polypeptides. Chloropla are particularly preferred Most specific transit peptides, which after translocation of the DOXS gene in the chloroplasts from the DOXS part enzymatically will split. The transit peptide which from plastid transketolase (TK) or a functional one Equivalent to this transit peptide (e.g. the transit peptide of the small subunit of the Rubisco or the Ferredoxin NADP Oxido reductase) is derived.

Die inserierte Nukleotid-Sequenz kodierend für eine DOXS kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen DOXS-Genabschnit ten verschiedener Organismen bestehen. Im allgemeinen werden synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons erzeugt, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinan der können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.The inserted nucleotide sequence coding for a DOXS can synthetically manufactured or naturally derived or one Mixture of synthetic and natural DNA components included, as well as from various heterologous DOXS gene segments different organisms. Generally will synthetic nucleotide sequences with codons generated by Plants are preferred. These codons preferred by plants can be determined from codons with the highest protein frequency be found in most interesting plant species be expressed. When preparing an expression cassette different DNA fragments can be manipulated to create a Obtain nucleotide sequence which is convenient in the reads in the correct direction and with a correct reading frame Is provided. For connecting the DNA fragments adapters or linkers can be attached to the fragments become.

Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-Regio nen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion die ser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktions stellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatori schen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'-Transkrip tionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz die für ein DOXS-Gen codiert und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.The promoter and terminator regions can expediently be used in the direction of transcription with a linker or polylinker, the one or more restriction sites for the insertion the contains this sequence. Usually the linker 1 to 10, mostly 1 to 8, preferably 2 to 6 restrictions put. In general, the linker has within the regulatory areas of less than 100 bp, often less than 60 bp, but at least 5 bp. The promoter can be both native or homologous as well as alien or heterologous to the host plant his. The expression cassette contains in the 5'-3 'transcript direction of the promoter, a DNA sequence for a DOXS gene encoded and a region for transcriptional termination. Different termination areas are arbitrary against each other interchangeable.

Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnitt stellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restrikti onsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Trans versionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerre pair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffül len von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.Manipulations can also find the appropriate restriction cut provide or dispose of the superfluous DNA or restriction Remove interfaces, be used. Where insertions, Deletions or substitutions such. B. Transitions and Trans versions may be considered in vitro mutagenesis, "primerre pair ", restriction or ligation can be used. With suitable Manipulations, such as B. restriction, "chewing-back" or replenishment len of overhangs for "bluntends" can have complementary ends of the fragments are made available for ligation.

Von Bedeutung für den erfindungsgemäßen Erfolg kann u. a. das Anhängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL sein (Schouten, A. et al. Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), die durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natürlicherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt werden.Of importance for the success of the invention can u. a. the Append the specific ER retention signal SEKDEL (Schouten, A. et al. Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), this triples the average level of expression to quadruple. Other retention signals, which are naturally found in plant and animal proteins occur for the construction of the cassette be used.

Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadeny lierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA- Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, ins besondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 ff) oder funktionelle Äquivalente.Preferred polyadenylation signals are vegetable polyadenylation lation signals, preferably those which are essentially T-DNA Polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, ins particular of gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid correspond to pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 ff) or functional equivalents.

Eine Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven Promotor (bevorzugt den CaMV 35 S-Promotor), das LeB4-Signalpep tid, das zu exprimierende Gen und das ER-Retentionssignal enthal ten. Als ER-Retentionssignal wird bevorzugt die Aminosäuresequenz KDEL (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) verwendet.An expression cassette can be a constitutive one, for example Promoter (preferably the CaMV 35 S promoter), the LeB4 signal pep tid, the gene to be expressed and the ER retention signal The amino acid sequence is preferred as the ER retention signal KDEL (lysine, aspartic acid, glutamic acid, leucine) is used.

Vorzugsweise wird die fusionierte Expressionskassette, die für ein DOXS-Gen kodiert, in einen Vektor, beispielsweise pBin19, kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu trans formieren. Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z. B. von Tabakpflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die ein in die Expressionskassette integriertes Gen für die Ex pression eines DOXS-Gens enthalten.Preferably, the fused expression cassette used for encodes a DOXS gene into a vector, for example pBin19, cloned, which is suitable for trans Agrobacterium tumefaciens form. Agrobacteria transformed with such a vector can then be used in a known manner to transform plants, especially of crops, such as. B. of tobacco plants, used, for example, wounded leaves or Leaf pieces are bathed in an agrobacterial solution and then be cultivated in suitable media. The transformation of Planting by agrobacteria is known, among other things, from F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, published by S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38. From the transformed cells of the wounded leaves or leaf pieces can be regenerated transgenic plants in a known manner, which a gene for the Ex. integrated into the expression cassette pression of a DOXS gene included.

Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine DOXS kodierenden DNA wird eine Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle Regulationssignale, beispielsweise Sequenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 (1993) beschrieben.For transforming a host plant with one for a DOXS coding DNA is an expression cassette as an insertion in built a recombinant vector whose vector DNA additional functional regulation signals, for example Contains sequences for replication or integration. Suitable Vectors are inter alia in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology "(CRC Press), Chap. 6/7, pp. 71-119 (1993).

Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonierungstechniken können die Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u. a. pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können.Using the recombination and Cloning techniques can transform the expression cassettes into suitable ones Vectors are cloned that reproduce, for example in E. coli. Suitable cloning vectors include a. pBR332, pUC series, M13mp series and pACYC184. Particularly suitable are binary vectors found in both E. coli and Can replicate agrobacteria.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer Expressionskassette enthaltend eine DNA-Sequenz SEQ ID No. 1 oder eine mit dieser hybridisierende DNA-Sequenz zur Trans formation von Pflanzen, -zellen, -geweben oder Pflanzenteilen. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des Toco pherol-, Vitamin K-, Chlorophyll und Carotinoid-Gehaltes der Pflanze.Another object of the invention relates to the use an expression cassette containing a DNA sequence SEQ ID No. 1 or a DNA sequence hybridizing with this for trans formation of plants, cells, tissues or parts of plants. The aim of the use is preferably to increase the toco pherol, vitamin K, chlorophyll and carotenoid content of Plant.

Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen. Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.Depending on the choice of the promoter, the expression can be specific in the leaves, seeds or other parts of the plant respectively. Such transgenic plants, their reproductive material as well their plant cells, tissues or parts are another Subject of the present invention.

Die Expressionskassette kann darüberhinaus auch zur Transforma tion von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen mit dem Ziel einer Erhöhung der Tocopherol-, Vitamin K-, Chlorophyll und/oder Carotinoid-Produktion eingesetzt werden.The expression cassette can also be used for transforma tion of bacteria, cyanobacteria, yeast, filamentous fungi and algae with the aim of increasing the tocopherol, vitamin K, chlorophyll and / or carotenoid production can be used.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genann ten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Phy siol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. The transfer of foreign genes into the genome of a plant is made referred to as transformation. There are the described Methods for transforming and regenerating plants Plant tissues or plant cells for transient or stable Transformation used. Protoplasts are suitable methods transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene cannon - the so-called particle bombardment method, electroporation, incubation dry embryos in DNA-containing solution, microinjection and Agrobacterium mediated gene transfer. The called Methods are described, for example, in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 and in Potrykus Annu. Rev. Plant Phy siol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225).

Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu trans formieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711).The construct to be expressed is preferably converted into a vector cloned, which is suitable for trans Agrobacterium tumefaciens form, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711).

Mit einer Expressionskassette transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Hafer, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschie denen Baum-, Nuß- und Weinspezies, verwendet werden, z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.Agrobacteria transformed with an expression cassette can also in a known manner for the transformation of plants, especially of crops, such as cereals, corn, oats, soybeans, Rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, Potato, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa, lettuce and various which tree, nut and wine species are used, e.g. B. by wounded leaves or pieces of leaf in an agrobacterial solution bathed and then cultivated in suitable media.

Funktionell äquivalente Sequenzen, die für ein DOXS-Gen kodieren, sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquiva lente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch einer Pflanze ange paßte, künstliche Nukleotid-Sequenzen.Functionally equivalent sequences that code for a DOXS gene, are those sequences which, despite a different nucleotide sequence still have the desired functions. Functional equiva Lente thus encompass naturally occurring variants of those herein described sequences as well as artificial, e.g. B. by chemical Synthesis obtained, based on the codon use of a plant matched, artificial nucleotide sequences.

Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für eine DOXS kodierende Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der DOXS-Nukleotidsequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein.A functional equivalent is understood to mean in particular also natural or artificial mutations of one originally isolated for a DOXS coding sequence, which continues the Show the desired function. Mutations include substitutions, Additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues. Thus, for example, too such nucleotide sequences with the present invention which is obtained by modifying the DOXS nucleotide sequence receives. The aim of such a modification can e.g. B. the other Limitation of the coding sequence contained therein or z. B. also the insertion of further restriction enzyme interfaces his.

Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist.Functional equivalents are also those variants whose Function compared to the original gene or gene fragment, is weakened or strengthened.

Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft beispielsweise der Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes in der Pflanze durch Überexpression des DOXS-Gens in Kulturpflanzen vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rücküber setzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, die DOXS Aktivität aufweisen oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Metho den vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.In addition, artificial DNA sequences are suitable as long as they as described above, the desired property for example the increase in the tocopherol content in the plant Mediate overexpression of the DOXS gene in crop plants. Such Artificial DNA sequences can, for example, by Rücküber setting of proteins constructed using molecular modeling, the Have DOXS activity or determined by in vitro selection become. Coding DNA sequences which are particularly suitable by back-translating a polypeptide sequence according to that for the Host plant specific codon usage were obtained. The specific codon usage can be one with plant genetic metho the familiar specialist through computer evaluations of others, easily identify known genes of the plant to be transformed.

Als weitere geeignete äquivalente Nukleinsäure-Sequenzen sind zu nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Bestandteil des Fusionsproteins ein pflanzliches DOXS-Polypeptid oder ein funktionell äquivalenter Teil, davon ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z. B. ein weiteres Polypeptid mit enzyma tischer Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz mit deren Hilfe ein Nachweis auf DOXS-Expression möglich ist (z. B. myc-tag oder his-tag). Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine regulative Proteinsequenz, wie z. B. ein Signal- oder Trans itpeptid, das das DOXS-Protein an den gewünschten Wirkort leitet.Other suitable equivalent nucleic acid sequences include name sequences which code for fusion proteins, where Part of the fusion protein is a plant DOXS polypeptide or a functionally equivalent part of it. The second part the fusion protein can e.g. B. another polypeptide with enzyma table activity or having an antigenic polypeptide sequence which can be used to detect DOXS expression (e.g. myc-tag or his-tag). However, these are preferably a regulatory protein sequence, such as B. a signal or trans itpeptide that directs the DOXS protein to the desired site of action.

Gegenstand der Erfindung sind aber auch die erfindungsgemäß erzeugten Expressionsprodukte sowie Fusionsproteine aus einem Transitpeptid und einem Polypeptid mit DOXS-Aktivität.The invention also relates to the invention generated expression products and fusion proteins from one Transit peptide and a polypeptide with DOXS activity.

Erhöhung des Tocopherol-, Vitamin K-, Chlorophyll und/oder Caro tinoid-Gehaltes bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung dieser Verbindungen durch funktionelle Überexpression des DOXS- Gens in der Pflanze gegenüber der nicht gentechnisch modifizierten Pflanze für die Dauer mindestens einer Pflanzenge neration.Increase in tocopherol, vitamin K, chlorophyll and / or caro tinoid content means in the context of the present invention artificially acquired ability to increase biosynthesis of these compounds by functional overexpression of the DOXS Gens in the plant versus the non-genetically engineered modified plant for at least one plantation generation.

Der Biosyntheseort von Tocopherol ist im allgemeinen das Blattge webe, so daß eine blattspezifische Expression des DOXS-Gens sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die Tocopherol-Bio synthese nicht auf das Blattgewebe beschränkt sein muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - beispielsweise in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen kann.The tocopherol biosynthesis site is generally the leaf weave, so that a leaf-specific expression of the DOXS gene makes sense. However, it is obvious that the tocopherol bio synthesis must not be limited to the leaf tissue, but also in all other parts of the plant - for example in fatty seeds - tissue-specific.

Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen DOXS- Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.In addition, a constitutive expression of the exogenous DOXS Gens an advantage. On the other hand, an inducible one Expression appear desirable.

Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten DOXS- Gens kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemvermehrung ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des DOXS-Gens und deren Auswirkung auf die Tocopherol- Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden. The effectiveness of expression of the transgenically expressed DOXS Gens can be grown in vitro, for example, by shoot meristem propagation be determined. In addition, the type and amount can be changed Expression of the DOXS gene and its effect on the tocopherol Biosynthetic performance on test plants in greenhouse experiments getting tested.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem transgene Pflanzen, transformiert mit einer Expressionskassette enthaltend die Sequenz SEQ ID No.1 oder eine mit dieser hybridisierenden DNA- Sequenz, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflanzen, wie z. B. Gerste, Weizen, Roggen, Mais, Hafer, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies.The invention also relates to transgenic plants, transformed with an expression cassette containing the Sequence SEQ ID No.1 or a DNA hybridizing with it Sequence, as well as transgenic cells, tissues, parts and propagation material of such plants. Transgenes are particularly preferred Cultivated plants, such as. B. barley, wheat, rye, corn, oats, Soy, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, Hemp, potato, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa, lettuce and the different tree, nut and wine species.

Pflanzen im Sinne der Erfindung sind mono- und dikotyle Pflanzen oder Algen.Plants in the sense of the invention are mono- and dicotyledonous plants or algae.

Um effiziente Hemmstoffe der DOXS finden zu können, ist es notwendig, geeignete Testsysteme, mit denen Inhibitor-Enzym- Bindungsstudien durchgeführt werden können, zur Verfügung zu stellen. Hierzu wird beispielsweise die komplette cDNA-Sequenz der DOXS aus Arabidopsis in einen Expressionsvektor (pQE, Qiagen) kloniert und in E. coli überexprimiert.In order to be able to find efficient DOXS inhibitors, it is necessary suitable test systems with which inhibitor-enzyme Attachment studies can be carried out put. For example, the complete cDNA sequence the Arabidopsis DOXS into an expression vector (pQE, Qiagen) cloned and overexpressed in E. coli.

Das mit Hilfe der Expressionskassette exprimierte DOXS-Protein eignet sich besonders zur Auffindung von für die DOXS spezifi schen Hemmstoffen.The DOXS protein expressed using the expression cassette is particularly suitable for locating the speci inhibitors.

Dazu kann die DOXS beispielsweise in einem Enzymtest eingesetzt werden, bei dem die Aktivität der DOXS in An- und Abwesenheit des zu testenden Wirkstoffs ermittelt wird. Aus dem Vergleich der beiden Aktivitätsbestimmungen läßt sich eine qualitative und quantitative Aussage über das Hemmverhalten des zu testenden Wirkstoffes machen. Methoden zur Aktivitätsbestimmung der DOXS sind beschrieben (Putra et. al., Tetrahedron Letters 39 (1998), 23-26; Sprenger et al., PNAS 94 (1997), 12857-12862).To do this, the DOXS can be used in an enzyme test, for example in which the activity of the DOXS in presence and absence of the active ingredient to be tested is determined. From the comparison of the two activity regulations a qualitative and quantitative statement about the inhibitory behavior of the person to be tested Make active ingredient. Methods for determining the activity of DOXS are described (Putra et. al., Tetrahedron Letters 39 (1998), 23-26; Sprenger et al., PNAS 94 (1997), 12857-12862).

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Testsystems kann eine Vielzahl von chemischen Verbindungen schnell und einfach auf hemmende Eigenschaften überprüft werden. Das Verfahren gestattet es, reproduzierbar aus einer großen Anzahl von Substanzen gezielt solche mit großer Wirkstärke auszuwählen, um mit diesen Substan zen anschließend weitere, dem Fachmann geläufige vertiefte Prüfungen durchzuführen.With the aid of the test system according to the invention, a large number can from chemical compounds to inhibiting quickly and easily Properties are checked. The procedure allows reproducibly targeted from a large number of substances select those with great potency to work with these substances zen then further deepened, familiar to the expert Carry out tests.

Durch Überexpression der für eine DOXS kodierenden Gensequenz Seq ID NO: 1 in einer Pflanze kann prinzipiell eine erhöhte Resistenz gegenüber Inhibitoren der DOXS erreicht werden. Die derart hergestellten transgenen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. By overexpressing the gene sequence coding for a DOXS In principle, Seq ID NO: 1 in a plant can be increased Resistance to inhibitors of DOXS can be achieved. The transgenic plants thus produced are also Subject of the invention.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind:
Further objects of the invention are:

- Process for the transformation of a plant thereby identified records that one contains an expression cassette DNA sequence SEQ ID No. 1 or hybridize with this the DNA sequence in a plant cell, in callus tissue, a whole plant or protoplasts of plants.
- Use of a plant for the production of plant DOXS.
- Use of the expression cassette containing a DNA Se quenz SEQ ID No. 1 or a DNA hybridizing with this Sequence for the production of plants with increased resistance against inhibitors of DOXS by increased expression a DNA sequence SEQ ID No. 1 or one with this hybridi DNA sequence.
- Use of the DNA sequence SEQ ID No. 1 or one with this hybridizing DNA sequence for the production of plants with increased tocopherol, vitamin K, chlorophyll and / or carotid noid content by expression of a DOXS DNA sequence in Plants.
- Use of the expression cassette containing a DNA Se quenz SEQ ID No. 1 or a DNA hybridizing with this Sequence for producing a test system for identification of inhibitors of DOXS.

Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:The invention is illustrated by the following examples, but is not limited to these:

General cloning procedures

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonie rungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gel elektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombi nanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchge führt.The clone carried out in the context of the present invention steps such as B. restriction cleavages, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of Linking nucleic acids on nitrocellulose and nylon membranes of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria, multiplication of phages and sequence analysis recombi As with Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6) described by leads.

Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli, XL-I Blue) wurden von Stratagene bezogen. Der zur Pflanzentransformation verwendete Agrobakterienstamm (Agrobacteriuzn tumefaciens, C58C1 mit dem Plasmid pGV2260 oder pGV3850kann) wurde von Deblaere et al. in (Nucl. Acids Res. 13 (1985) 4777) beschrieben. Alternativ können auch der Agrobakterienstamm LBA4404 (Clontech) oder andere geeignete Stämme eingesetzt werden. Zur Klonierung können die Vektoren pUCl9 (Yanish-Perron, Gene 33 (1985), 103-119) pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitro gen), pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8720) und pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990), 221-230) benutzt werden.The bacterial strains used below (E. coli, XL-I Blue) were sourced from Stratagene. The one for plant transformation Agrobacterial strain used (Agrobacteriuzn tumefaciens, C58C1 with the plasmid pGV2260 or pGV3850) was developed by Deblaere et al. in (Nucl. Acids Res. 13 (1985) 4777). Alternatively can also be the agrobacterial strain LBA4404 (Clontech) or others suitable strains are used. For cloning, the Vectors pUCl9 (Yanish-Perron, Gene 33 (1985), 103-119) pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitro gen), pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8720) and pBinAR (Höfgen and Willmitzer, Plant Science 66 (1990), 221-230) can be used.

Sequence analysis of recombinant DNA

Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).Recombinant DNA molecules were sequenced using a Laser fluorescence DNA sequencer from Licor (distributed by MWG Biotech, Ebersbach) using the Sanger method (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977).

example 1 Preparation of the Arabidopsis thaliana DOXS transformation con structs

Das Arabidopsis thaliana DOXS Gen wurde wie in Mandel et al. (1996) beschrieben als vollständige cDNA in den Vektor pElues cript KS- (Stratagene) kloniert.The Arabidopsis thaliana DOXS gene was described in Mandel et al. (1996) described as complete cDNA in the vector pElues cript KS- (Stratagene) cloned.

Zur Herstellung von Überexpressionskonstrukten wurde ein 2.3 kb Fragment (mit F-23-C bezeichnet) über die pBluescript KS- HincII und SacI Schnittstellen isoliert. Diese Sequenz enthält die vollständige DOXS-cDNA vom ATG-Startcodon bis zur EcoRI-Schnitt stelle, die 80 bp stromabwärts des Stopcodons liegt. Dieses Fragment wurde über die Schnittstellen SmaI und SacI in den pBIN19 Vektor (Abb. 2) kloniert (Bevan et al., Nucl.Acid Res. 12,8711 (1980), der den 35S Promotor des Cauliflower Mosaik Virus (Franck et al., Cell 21 (1), 285-294 (1980) dreimal hinter einander angeordnet enthält.A 2.3 kb fragment (labeled F-23-C) was isolated via the pBluescript KS-HincII and SacI interfaces to produce overexpression constructs. This sequence contains the complete DOXS cDNA from the ATG start codon to the EcoRI interface, which is 80 bp downstream of the stop codon. This fragment was cloned into the pBIN19 vector ( Fig. 2) via the SmaI and SacI interfaces (Bevan et al., Nucl.Acid Res. 12, 8711 (1980), which is the 35S promoter of the Cauliflower Mosaic Virus (Franck et al. , Cell 21 (1), 285-294 (1980) contains three consecutive times.

Zur Herstellung von Antisense-Konstrukten wurde entweder die vollständige cDNA (mit F-23-C bezeichnet) oder ein 700 bp Fragment der 5'-Region in den oben erwähnten pBIN19-Vektor kloniert. Die vollständige DOXS-cDNA wurde über KpnI und SpeI aus dem Polylinker des pBluescript KS- isoliert und in die pBIN19-Po lylinker-Schnittstellen XbaI und KpnI kloniert (Abb. 3). Zur Klonierung des 700 bp Fragments wurde die cDNA mit Hilfe der EcoRV Schnittstelle, die an Position 701 der cDNA liegt und der pBS KS-lokalisierten Smal Schnittstelle verdaut. Das entstandene Fragment wurde in den Vektor pBS KS-subkloniert und erneut über die EcoRV und Smal Schnittstellen in den oben beschriebenen pBIN19-Vektor in Antisense-Orientierung kloniert. Die Transforma tionen von Arabidopsis thaliana Pflanzen mit den oben beschriebe nen Konstrukten erfolgten mit Agrobakterium tumefaciens mit der Vakuum-Infiltrationsmethode (Bent et al., Science 265(1994), 1856-1860). Mehrere unabhängige Transformanden wurden pro Kon strukt isoliert. Jeder Buchstabe (siehe Tabelle 1) bedeutet eine unabhängige transfomierte Linie. Aus der daraus erhaltenen T1-Ge neration wurden Pflanzen auf Homo-oder Heterozygotie untersucht. Mehrere Pflanzen jeder Linie wurden gekreuzt, um eine Segregati onsanalyse durchzuführen. Die Nummer in der Tabelle 1 entspricht der individuellen Pflanze, welche für weitere Analysen ausgewählt wurde. Es wurden sowohl homo- als auch heterozygote Linien erhalten. Die Segregationsanalyse der erhaltenen Linien ist in der folgenden Tabelle 1 dargestellt:To produce antisense constructs, either the complete cDNA (labeled F-23-C) or a 700 bp fragment of the 5 'region was cloned into the pBIN19 vector mentioned above. The complete DOXS cDNA was isolated from the polylinker of pBluescript KS- via KpnI and SpeI and cloned into the pBIN19-Polylinker interfaces XbaI and KpnI ( Fig. 3). To clone the 700 bp fragment, the cDNA was digested using the EcoRV interface located at position 701 of the cDNA and the pBS KS-localized Smal interface. The resulting fragment was KS-subcloned into the vector pBS and cloned again via the EcoRV and Smal interfaces into the pBIN19 vector described above in antisense orientation. The transformations of Arabidopsis thaliana plants with the constructs described above were carried out with Agrobacterium tumefaciens using the vacuum infiltration method (Bent et al., Science 265 (1994), 1856-1860). Several independent transformants were isolated per construct. Each letter (see Table 1) means an independent transformed line. From the T1 generation obtained therefrom, plants were examined for homozygosity or heterozygosity. Several plants from each line were crossed to perform a segregation analysis. The number in Table 1 corresponds to the individual plant that was selected for further analysis. Both homozygous and heterozygous lines were obtained. The segregation analysis of the lines obtained is shown in Table 1 below:

Tabelle 1 Table 1

Segregationsanalyse der transgenen DOXS-T2-Pflanzen Segregation analysis of the transgenic DOXS-T2 plants

Example 2 Detection of increased DOXS RNA levels in transgenic plants

Gesamt RNA aus 15 Tage alten Keimlingen verschiedener transgener Linien, welche das DOXS-Überexpressionskonstrukt besitzen, wurde nach der Methode von Logeman et al., Anal.Biochem. 163, 16-20 (1987) extrahiert, in einem 1.2% Agarosegel aufgetrennt, auf Filter transferiert und mit einem 2.1 kb langen DOXS-Fragment als Sonde hybridisiert (Abb. 4). Total RNA from 15 day old seedlings of different transgenic lines, which have the DOXS overexpression construct, was determined according to the method of Logeman et al., Anal.Biochem. 163, 16-20 (1987), separated in a 1.2% agarose gel, transferred to filters and hybridized with a 2.1 kb long DOXS fragment as a probe ( Fig. 4).

Example 3 Detection of increased DOXS protein levels in transgenic plants

Gesamtprotein (Abb. 5) aus 15 Tage alten Keimlingen verschiedener, unabhängiger transgener Pflanzen, welche das DOXS- Überexpressionskonstrukt besitzen, wurde isoliert und mit einem polyklonalen Anti-DOXS-Antikörper (IgG) in einer Westernanalyse detektiert (Abb. 6).Whole protein ( Fig. 5) from 15 day old seedlings of different, independent transgenic plants, which have the DOXS overexpression construct, was isolated and detected with a polyclonal anti-DOXS antibody (IgG) in a Western analysis ( Fig. 6).

Example 4 Measurement of the carotenoid and chlorophyll content

Die Bestimmung der Gesamtcarotinoid- und Chlorophyllmengen wurde wie in Lichtenthaler und Wellburn (1983) beschrieben mit 100% Acetonextrakten durchgeführt. Die Ergebnisse der Mehrfachmessun gen der transgenen Linien, welche das DOXS-Überexpressionskon strukt besitzen, sind in der folgenden Tabelle 2 dargestellt.The determination of the total carotenoid and chlorophyll amounts was made as described in Lichtenthaler and Wellburn (1983) with 100% Acetone extracts performed. The results of the multiple measurements gene of the transgenic lines, which the DOXS overexpression con own structure are shown in Table 2 below.

Tabelle 2 Table 2

Gesamtcarotinoid- und Chlorophyllgehalt der transgenen DOXS-Linien Total carotenoid and chlorophyll content of the transgenic DOXS lines

Example 5 Transformation of rapeseed

Die Herstellung der transgenen Rapspflanzen orientiert sich an einem Protokoll von Bade, JB und Damm, B (in Gene, Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Ma nual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die Zusammensetzung der verwendeten Medien angegeben sind. Die Trans formationen erfolgten mit dem Agrobacterium Stamm LBA4404 (Clon tech). Als binäre Vektoren wurden die bereits oben beschriebenen pBIN19-Konstrukte mit der gesamten DOXS-cDNA verwendet. In diesen pBIN-Vektoren wurde die NOS-Terminatorsequenz durch die OCR-Ter minatorsequenz ersetzt. Brassica napus Samen wurden mit 70% (v/v) Ethanol oberflächensteril gemacht, 10 min in 55°C H₂O gewaschen, in 1%iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v Teepol, 0,1% v/v Twenn 20) für 20 min inkubiert und sechsmal mit sterilem H₂O für jeweils 20 min gewaschen. Die Samen wurden drei Tage auf Fil terpapier getrocknet und 10-15 Samen in einem Glasskolben mit 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehreren Keimlingen (ca. 10 cm groß) wurden die Wurzeln und Apices entfernt und die verbleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explante werden 30 min mit 50 ml Basal medium gewaschen und in einen 300 ml Kolben überführt. Nach Zu gabe von 100 ml Kallus-Induktionsmedium wurden die Kulturen für 24 h bei 100 U/min inkubiert.The production of the transgenic rape plants is based on a protocol by Bade, JB and Damm, B (in Gene, Transfer to Plants, Potrykus, I. and Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30- 38), which also gives the composition of the media used. The transformations were carried out with the Agrobacterium strain LBA4404 (Clon tech). The pBIN19 constructs already described above with the entire DOXS cDNA were used as binary vectors. In these pBIN vectors, the NOS terminator sequence was replaced by the OCR terminator sequence. Brassica napus seeds were sterilized with 70% (v / v) ethanol, washed for 10 min in 55 ° CH ₂ O, in 1% hypochlorite solution (25% v / v Teepol, 0.1% v / v Twenn 20 ) incubated for 20 min and washed six times with sterile H ₂ O for 20 min each. The seeds were dried on filter paper for three days and 10-15 seeds were germinated in a glass flask with 15 ml of germination medium. The roots and apices were removed from several seedlings (approx. 10 cm in size) and the remaining hypocotyls were cut into pieces approx. 6 mm long. The approx. 600 explants obtained in this way are washed for 30 min with 50 ml of basal medium and transferred to a 300 ml flask. After addition of 100 ml of callus induction medium, the cultures were incubated at 100 rpm for 24 h.

Vom Agrobacterium-Stamm wurde eine Übernachtkultur bei 29°C in LB mit Kanamycin (20 mg/l) angesetzt, davon 2 ml in 50 ml LB ohne Kanamycin für 4 h bei 29°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,4-0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wurde das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wurde durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine OD600 von 0.3 eingestellt.An overnight culture of the Agrobacterium strain was set up at 29 ° C. in LB with kanamycin (20 mg / l), of which 2 ml in 50 ml LB without kanamycin for 4 hours at 29 ° C. up to an OD ₆₀₀ of 0.4-0 , 5 incubated. After pelleting the culture at 2000 rpm for 25 min, the cell pellet was resuspended in 25 ml of basal medium. The concentration of the bacteria in the solution was adjusted to an OD600 of 0.3 by adding further basal medium.

Aus den Raps-Explanten wurde das Kallus-Induktionsmedium mit ste rilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobacterium-Lösung hinzugefügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agrobacterien- Suspension wurde entfernt, die Raps-Explante für 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus- Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wurde für 24 h auf einem Rotationsschüttler bei 100 U/min durchgeführt. Die Co- Kultivierung wurde durch Wegnahme des Kallus-Induktionsmediums gestoppt und die Explante zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explanten wurde in 15 cm Pe trischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten ent fernt. Zur Regeneration wurden jeweils 20-30 Explanten in 90 mm Petrischalen überführt, welche 25 ml Sproß-Induktionsmedium mit Kanamycin enthielten. Die Petrischalen wurden mit 2 Lagen Leuko por verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16/8 H inkubiert. Alle 12 Tage wurde die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Sproß-Induktionsmedium überführt. Alle weiteren Schritte zur Regeneration ganzer Pflanzen wurde wie von Bade, J. B. und Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Potry kus, I. und Spangenberg, G.,eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) beschrieben durchgeführt.The callus induction medium with ste removed pipettes, added 50 ml Agrobacterium solution, mixed gently and incubated for 20 min. The Agrobacteria Suspension was removed, the oilseed rape explant for 1 min with 50 ml Callus induction medium washed and then 100 ml callus Induction medium added. The co-cultivation was carried out for 24 h carried out on a rotary shaker at 100 rpm. The co- Cultivation was done by removing the callus induction medium stopped and the explant twice for 1 min each with 25 ml and twice for 60 min with 100 ml of washing medium at 100 rpm washed. The washing medium with the explants was in 15 cm Pe transferred tri dishes and ent the medium with sterile pipettes ent distant. 20-30 explants in 90 mm were used for regeneration Petri dishes transferred with 25 ml sprout induction medium Contained kanamycin. The petri dishes were made with 2 layers of leuco closed por and at 25 ° C and 2000 lux with photoperiods of Incubated 16/8 h. Every 12 days, the developing calli transferred to fresh petri dishes with shoot induction medium. All further steps for the regeneration of whole plants was like by Bade, J.B. and Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Potry kus, I. and Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38).

Example 6 Increase in tocopherol biosynthesis in oilseed rape

Die cDNA der DOXS wurde mit einem CaMV35S-Promotor versehen und in Raps unter Verwendung des 35S-Promotors überexprimiert.The cDNA of the DOXS was provided with a CaMV35S promoter and overexpressed in oilseed rape using the 35S promoter.

Parallel dazu wurde der samenspezifische Promotor des Phaseolin genes verwednet, um den Tocopherolgehalt spezifisch im Rapssamen zu erhöhen. Mit den entsprechenden Konstrukten transfomierte Rapspflanzen wurden im Gewächshaus angezogen. Anschließend wurde der α-Tocopherolgehalt der Gesamtpflanze bzw. der Samen der Pflanze bestimmt. In allen Fällen war die α-Tocopherolkonzentra tion im Vergleich zur nicht transfomierten Pflanze erhöht. In parallel, the seed-specific promoter of the Phaseolin genes used to determine the tocopherol content in the rapeseed to increase. Transformed with the appropriate constructs Rapeseed plants were grown in the greenhouse. Then was the α-tocopherol content of the whole plant or the seeds of the Plant determined. In all cases the α-tocopherol concentration was tion increased compared to the non-transformed plant.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims

1. Use of DNA sequences coding for a 1-deoxy-D-Xy lulose-5-phosphate synthase (DOXS) for the production of Plants with increased tocopherol, vitamin K, chlorophyll and / or carotenoid content.

2. Use of a DNA sequence SEQ ID No. 1 or one with this hybridizing DNA sequence coding for a 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DOXS) for production of plants with an increased content of tocopherols, vitamin K, Chlorophylls and / or carotenoids.

3. Process for the production of plants with increased toco pherol, vitamin K, chlorophyll and / or carotenoid content, characterized in that a DNA sequence SEQ-ID No. 1 or a DNA sequence hybridizing with this in plants is expressed.

4. Processes for transforming a plant characterized thereby records that one contains an expression cassette Promoter and a DNA sequence in a plant cell, in Callus tissue, a whole plant or protoplasts from Introduces plant cells.

5. A method for transforming plants according to claim 4, characterized in that the transformation using the Agrobacterium tumefaciens, electroporation or the particle bombardment method.

6. Plant with increased tocopherol, vitamin K, chlorophyll and / or carotenoid content containing an expression A cassette according to claim 4.

7. Plant according to claim 6, selected from the group of soybeans, Canola, barley, oats, wheat, rapeseed, corn or sunflower.

8. Use of SEQ ID No. 1 for the production of a test system for the identification of inhibitors of DOXS.

9. Test system based on the expression of an expression Cassette according to claim 4 for the identification of inhibitors the DOXS.

10. Use of a plant containing a DNA sequence SEQ ID No. 1 or a DNA sequence hybridizing with this Production of plant DOXS.