DE19834909A1 - Fiber proteins and their production - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Faserprotei nen in Pflanzenzellen, hierfür verwendbare Pflanzenzellen und durch das Ver fahren erhaltene Faserproteine.The present invention relates to a process for the production of fiber protein NEN in plant cells, plant cells that can be used for this and by ver drive obtained fiber proteins.
Faserproteine sind Proteine, die eine mechanische Stabilität, z. B. Elastizität, aufweisen. Sie entstehen aus Vorläufer-Faserproteinen, die eine Polymerisierung bzw. Quervernetzung erfahren. Hierfür ist das Vorliegen von repetetiven Amino säuresequenzen in den Vorläufer-Faserproteinen und das Einwirken von Protei nen notwendig, die Vorläufer-Faserproteine prozessieren. Faserproteine finden sich in tierischen und menschlichen Zellen. Beispiele von Faserproteine sind Kollagen und Elastin. Beide sind Bestandteile von Bindegeweben, z. B. Haut, Sehnen, Bändern und Blutgefäßen. Kollagen entsteht durch Quervernetzung von Tropokollagen-Molekülen, während Elastin durch Quervernetzung von Tropoelas tin-Molekülen gebildet wird.Fiber proteins are proteins that have mechanical stability, e.g. B. elasticity, exhibit. They arise from precursor fiber proteins that cause polymerization or experience cross-linking. This is due to the presence of repetitive amino acid sequences in the precursor fiber proteins and exposure to protein necessary to process the precursor fiber proteins. Find fiber proteins itself in animal and human cells. Examples of fiber proteins are Collagen and elastin. Both are components of connective tissues, e.g. B. skin, Tendons, ligaments and blood vessels. Collagen is created by cross-linking Tropocollagen molecules, while elastin is cross-linked by tropoelas tin molecules is formed.
Faserproteine werden für medizinische bzw. kosmetische Zwecke verwendet. Hierzu werden sie vielfach aus Zellen von Tieren isoliert. Dies bringt ein großes Risiko, da somit Erkrankungen der Tiere, z. B. BSE, auf den Menschen übertragen werden können.Fiber proteins are used for medical and cosmetic purposes. For this purpose, they are often isolated from animal cells. This brings a big one Risk, since diseases of the animals, e.g. B. BSE, transferred to humans can be.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Faserproteine ohne die vorstehenden Risiken hergestellt werden können.The present invention is therefore based on the object of a method provide with which fiber proteins are produced without the above risks can be.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.According to the invention, this is the subject of the claims reached.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß Vorläufer-Faserproteine in Pflanzenzellen hergestellt werden können, die dann durch Behandlung mit sie prozessierenden Proteinen in die entsprechenden Faserproteine überführt werden können. Insbesondere hat er erkannt, daß die Herstellung von Vorläufer-Faserproteinen in einzelnen Pflanzenzellen wie auch in Pflanzen erfolgen kann. Ferner hat er erkannt, daß die Überführung von Vor läufer-Faserproteinen in die entsprechenden Faserproteine in vitro wie auch in vivo erfolgen kann. In letzterem Fall kann dies z. B. dadurch erfolgen, daß das Vorläufer-Faserprotein zusammen mit dem es prozessierenden Protein in einer Pflanzenzelle exprimiert wird. Der Anmelder hat seine Erkenntnisse an einzelnen Pflanzenzellen wie auch an Pflanzen, insbesondere der Kartoffelpflanze, ge macht.The present invention is based on the knowledge of the applicant that Precursor fiber proteins can be produced in plant cells, which then by treating them with the proteins they process Fiber proteins can be transferred. In particular, he recognized that the Production of precursor fiber proteins in individual plant cells as well as in Plants can be done. He also recognized that the transfer from Vor runner fiber proteins into the corresponding fiber proteins in vitro as well as in can be done in vivo. In the latter case, this can e.g. B. done in that the Precursor fiber protein together with the processing protein in one Plant cell is expressed. The applicant has his findings on individual Plant cells as well as on plants, especially the potato plant makes.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders für ein Verfahren zur
Herstellung eines Faserproteins genutzt, das die folgenden Verfahrensschritte
umfaßt:
According to the invention, the applicant's knowledge is used for a process for producing a fiber protein, which comprises the following process steps:
- (a) Expression eines Vorläufer-Faserproteins in einer Pflanzenzelle, und(a) expression of a precursor fiber protein in a plant cell, and
- (b) Inkubation des Vorläufer-Faserproteins mit einem es prozessierenden Protein.(b) Incubation of the precursor fiber protein with a processing one Protein.
Der Ausdruck "Faserprotein" umfaßt ein Faserprotein jeglicher Art und Abstam mung. Es kann eine zwei- oder dreidimensional vernetzte Struktur aufweisen. Auch kann es ein tierisches oder menschliches Faserprotein sein. Ferner kann es in Wildtyp- oder veränderter Form vorliegen. Letzteres umfaßt ein Faserprotein dessen Aminosäuresequenz im Vergleich zur Wildtyp-Sequenz an ein oder mehreren Stellen verändert ist. Solche Veränderungen können Additionen, Substitutionen, Deletionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Amino säuren sein. Insbesondere können Aminosäuren vorliegen, die in Pflanzenzellen bevorzugt exprimiert werden. Ferner kann das Faserprotein ein Fusionsprotein sein, wobei der Fusionspartner z. B. Oleosin sein kann. Dieses Protein ermöglicht dann die Lokalisation des Faserproteins in der Ölphase von pflanzlichem Ver mehrungsmaterial. Faserproteine, die in veränderter Form vorliegen, weisen eine mechanische Stabilität, z. B. Elastizität, auf, die zumindest mit jener der Wildtyp- Form vergleichbar ist. Bevorzugte Faserproteine sind Kollagen und Elastin sowie Derivate bzw. Fragmente davon. Für sie gelten vorstehende Ausführungen hinsichtlich einer veränderten Form entsprechend.The term "fiber protein" encompasses a fiber protein of any kind and origin mung. It can have a two- or three-dimensionally networked structure. It can also be an animal or human fiber protein. Furthermore, it can are in wild type or modified form. The latter comprises a fiber protein whose amino acid sequence compared to the wild-type sequence at one or is changed in several places. Such changes can add, Substitutions, deletions and / or inversions of one or more amino be acids. In particular, amino acids can be present in plant cells are preferably expressed. Furthermore, the fiber protein can be a fusion protein be, the fusion partner z. B. can be oleosin. This protein enables then the localization of the fiber protein in the oil phase of vegetable ver propagation material. Fiber proteins that are in a modified form have one mechanical stability, e.g. B. elasticity, at least with that of the wild-type Shape is comparable. Preferred fiber proteins are collagen and elastin as well Derivatives or fragments thereof. The above statements apply to them with regard to a changed shape accordingly.
Der Ausdruck "Expression eines Vorläufer-Faserprotein" umfaßt jegliche Ex pression eines für ein Vorläufer-Faserprotein kodierenden Gens in einer Pflanzen zelle, wobei das Vorläufer-Faserprotein in üblicher Weise, z. B. durch Querver netzung oder Polymerisierung, in das entsprechende Faserprotein überführt werden kann. Vorstehende Ausführungen zu dem Ausdruck "Faserprotein" gelten hier entsprechend. Ferner kann das Vorläufer-Faserprotein mit oder ohne Signalpeptid vorliegen. Ersteres kann z. B. das natürliche oder ein fremdes Signalpeptid sein, wodurch eine extrazelluläre Lokalisation des Vorläufer-Faser proteins erreicht wird. Bei letzterem wird dagegen eine Lokalisation des Vor läufer-Faserproteins im Zytoplasma erreicht. Deweiteren kann das Vorläufer- Faserprotein ein Steuerpeptid aufweisen, wodurch eine Lokalisation des Vor läufer-Faserproteins in bestimmten Kompartimenten der Pflanzenzelle, z. B. ER, Chloroplasten oder Vakuolen, erreicht wird. Bevorzugte Vorläufer-Faserproteine sind Tropokollagen und Tropoelastin sowie Derivate bzw. Fragmente davon. Für die Expression eines für ein Vorläufer-Faserprotein kodierenden Gens können übliche Expressionsvektoren für Pflanzenzellen verwendet werden. Solche umfassen Regulationselemente, z. B. Enhancer-, Promotor- und Terminations- Sequenzen, die in Pflanzenzellen erkannt werden. Beispiele hierfür sind CaMV 35S Promotor- und Terminations-Sequenzen (vgl. Odell, J. T. et al., Nature 313 (1985), 810-812). Auch können die Expressionsvektoren, Selektionsmarker, z. B. ein Neomycin- oder Kanamycin-Resistenz-Gen, enthalten. Desweiteren können die Expressionsvektoren Sequenzen enthalten, die ihre Einschleusung in Pflan zenzellen begünstigen. Beispielsweise können die Expressionsvektoren T-DNA von binären Vektoren, wie pSR 8-30 oder pSR 8-35/1 enthalten, wenn sie über Agrobacterium tumefaciens in Pflanzen eingeschleust werden sollen (vgl. Düring, K. et al., Plant Journal 3 (1993), 587-598; Porsch, P. et al., Plant Molecular Biology 37 (1998), 581-585). Darüber hinaus können die Expressionsvektoren auch durch Verfahren in Pflanzenzellen eingeschleust werden, für die sie keine speziellen Sequenzen benötigen. Solche Verfahren sind z. B. Mikroinjektion, Elek troporation, DNA-Transfer mittels Polyethylenglykol, Liposomenfusion oder Partikelkanone.The term "expression of a precursor fiber protein" includes any Ex pression of a gene coding for a precursor fiber protein in a plant cell, the precursor fiber protein in a conventional manner, e.g. B. by Querver wetting or polymerization, converted into the corresponding fiber protein can be. The foregoing, regarding the term "fiber protein" apply accordingly here. Furthermore, the precursor fiber protein can be with or without Signal peptide are present. The former can e.g. B. the natural or a foreign Be signal peptide, causing extracellular localization of the precursor fiber proteins is reached. In the latter, on the other hand, there is a localization of the pre Runner fiber protein reached in the cytoplasm. Furthermore, the precursor Fiber protein have a control peptide, thereby localizing the pre Runner fiber protein in certain compartments of the plant cell, e.g. B. ER, Chloroplasts or vacuoles. Preferred precursor fiber proteins are tropocollagen and tropoelastin as well as derivatives or fragments thereof. For can express a gene encoding a precursor fiber protein Common expression vectors for plant cells can be used. Such include regulatory elements, e.g. B. Enhancer, promoter and termination Sequences that are recognized in plant cells. Examples of this are CaMV 35S promoter and termination sequences (see Odell, J.T. et al., Nature 313 (1985), 810-812). The expression vectors, selection markers, e.g. B. a neomycin or kanamycin resistance gene. Furthermore can the expression vectors contain sequences that insert them into plants favor cells. For example, the expression vectors T-DNA of binary vectors, such as pSR 8-30 or pSR 8-35 / 1, if included Agrobacterium tumefaciens should be introduced into plants (see Düring, K. et al., Plant Journal 3 (1993), 587-598; Porsch, P. et al., Plant Molecular Biology 37: 581-585 (1998). In addition, the expression vectors can also be introduced into plant cells by processes for which they do not exist need special sequences. Such methods are e.g. B. microinjection, elec troporation, DNA transfer using polyethylene glycol, liposome fusion or Particle cannon.
Der Ausdruck Pflanzenzelle umfaßt Pflanzenzellen jeglicher Art und Abstam mung. Es können einzelne Pflanzenzellen, frisch isoliert oder als Zellinie etabliert, oder solche sein, die in einem Verband vorliegen. Letzteres ist z. B. eine Pflanze oder ein Teil davon. Beispiele von Pflanzen sind monocotyle Pflanzen, wie Mais, Reis, Weizen, Gerste und Zuckerrohr, und dicotyle Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Tee und Kaffee.The term plant cell encompasses plant cells of all types and origins mung. Single plant cells, freshly isolated or established as a cell line, or be those that exist in an association. The latter is e.g. B. a plant or part of it. Examples of plants are monocotyledonous plants, such as maize, Rice, wheat, barley and sugar cane, and dicotyledonous plants such as potatoes, Tobacco, tomato, tea and coffee.
Der Ausdruck "Vorläufer-Faserprotein prozessierendes Protein" umfaßt jegliches Protein, das ein Vorläufer-Faserprotein in das entsprechende Faserprotein über führen kann. Die Überführung kann in üblicher Weise, z. B. durch Quervernet zung oder Polymerisierung, erfolgen. Beispiele eines solchen Proteins sind Lysinoxidasen. Auch können es Proteinasen sein, die z. B. im Falle von Kollagen beschrieben worden sind. Die Lysinoxidasen bzw. Proteinasen können als solche bzw. als Derivate oder Fragmente davon vorliegen. Für sie gelten vorstehende Ausführungen hinsichtlich einer veränderten Form eines Faserproteins entspre chend.The term "precursor fiber protein processing protein" includes any Protein that converts a precursor fiber protein into the corresponding fiber protein can lead. The transfer can be carried out in the usual manner, e.g. B. by cross-linking tion or polymerization. Examples of such a protein are Lysine oxidases. It can also be proteinases that e.g. B. in the case of collagen have been described. The lysine oxidases or proteinases as such or as derivatives or fragments thereof. The above apply to them Comments regarding a changed form of a fiber protein correspond chatting.
Der Ausdruck "Inkubation eines Vorläufer-Faserproteins mit einem es prozessie renden Protein" umfaßt jegliche Inkubation dieser Proteine, durch die das Vor läufer-Faserprotein in das entsprechende Faserprotein überführt werden kann. Die Inkubation kann z. B. in vitro erfolgen. Hierzu ist es günstig, das exprimierte Vorläufer-Faserprotein in Lösung mit dem es prozessierenden Protein zu inkubie ren. Auch kann die Inkubation in vivo erfolgen. Hierzu ist es günstig, nicht nur das Vorläufer-Faserprotein, sondern auch das es prozessierende Protein in einer Pflanzenzelle zu exprimieren. Die Expression beider Proteine kann in verschiede nen Pflanzenzellen erfolgen, die dann vereinigt werden, wodurch eine Inkubation des Vorläufer-Faserproteins mit dem es prozessierenden Proteins erfolgt. Auch kann die Expression des Vorläufer-Faserproteins und des es prozessierenden Proteins in der gleichen Pflanzenzelle erfolgen. Die Inkubation beider Proteine erfolgt damit zwangsläufig in dieser Pflanzenzelle. Für die Expression eines ein Vorläufer-Faserprotein prozessierenden Proteins gelten vorstehende Ausführun gen hinsichtlich der Expression eines Vorläufer-Faserproteins entsprechend.The expression "incubation of a precursor fiber protein with an es processie protein "includes any incubation of these proteins by which the pre Runner fiber protein can be converted into the corresponding fiber protein. The incubation can e.g. B. in vitro. For this it is convenient to express the one expressed Precursor fiber protein to be incubated in solution with the processing protein Ren. Incubation can also take place in vivo. For this it is cheap, not only the precursor fiber protein, but also the protein processing it in one To express plant cell. The expression of both proteins can be in different NEN plant cells take place, which are then combined, causing an incubation of the precursor fiber protein with which it is processed protein. Also can express the precursor fiber protein and the one processing it Proteins are made in the same plant cell. The incubation of both proteins inevitably takes place in this plant cell. For the expression of a Precursor fiber protein processing protein applies to the above gene with respect to the expression of a precursor fiber protein accordingly.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Pflanzenzelle, die ein Vorläufer-Faserprotein und ein es prozessierendes Protein exprimiert. Auch ist eine Pflanzenzelle bevorzugt, die von diesen Proteinen nur letzteres exprimiert. Hinsichtlich der Ausdrücke "Pflanzenzelle", "Vorläufer-Faserprotein" und "Vor läufer-Faserprotein prozessierendes Protein" wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen. Ferner kann die Pflanzenzelle in Form eines Vermehrungsmaterials vorliegen.Another object of the present invention is a plant cell that a Precursor fiber protein and a protein processing it expressed. Is too prefers a plant cell that only expresses the latter of these proteins. Regarding the terms "plant cell", "precursor fiber protein" and "vor Runner-fiber protein processing protein "is discussed above referred. Furthermore, the plant cell can take the form of a propagation material available.
Zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Pflanzenzelle können übliche Verfahren verwendet werden. Ergänzend zu vorstehenden Ausführungen wird beispielhaft die Herstellung einer erfindungsgemäßen Pflanze beschrieben, die ein Vorläufer- Faserprotein, z. B. Tropoelastin und ein es prozessierendes Protein, z. B. Lysin oxidase, exprimiert. Hierzu ist es günstig, eine für Tropoelastin kodierende cDNA mit CaMV 35S Promotor- und Terminations-Sequenzen zu versehen und in einen binären Vektor, z. B. pSR 8-30 bzw. pSR 8-35/1 zu inserieren. Gleiches kann mit einer für eine Lysinoxidase kodierende cDNA erfolgen. Die erhaltenen DNA- Moleküle werden zur Transformation von Bakterien, z. B. E.coli S17-1 verwen det, die sich für einen Transfer der DNA-Moleküle in Agrobacterium tumefaciens, z. B. GV 3101, eignen. Hierzu werden E.coli S17-1 und Agrobakterium tume faciens GV 3101 miteinander gemischt und über Nacht inkubiert. Agrobakterien, welche die DNA-Moleküle aufgenommen haben, werden durch Wachstum auf Carbenicillin-haltigem Medium selektioniert. Diese werden dann auf abgeschnit tenen und mehrfach an der Mittelrippe eingeritzten Blättern von Kartoffelpflan zen aufgebracht und zwei Tage im Dunkeln inkubiert. Danach werden die Agro bakterien entfernt und den Kartoffelpflanzen Wuchsstoffe zugegeben, so daß sich Sprosse ausbilden. Diese werden abgeschnitten und zur Kultivierung von neuen Kartoffel pflanzen verwendet. Der Nachweis der Expressionsprodukte Tropoelastin und Lysinoxidase bzw. des erhaltenen Elastins wird mittels spezifi scher Antikörper gegen diese Proteine durchgeführt. Es wird auf die nachfolgen den Beispiele verwiesen.Conventional methods can be used to produce a plant cell according to the invention be used. In addition to the above, it is an example described the production of a plant according to the invention which is a precursor Fiber protein, e.g. B. tropoelastin and a processing protein, e.g. B. Lysine oxidase, expressed. For this purpose it is favorable to use a cDNA coding for tropoelastin with CaMV 35S promoter and termination sequences and into one binary vector, e.g. B. insert pSR 8-30 or pSR 8-35 / 1. The same can be done with a cDNA coding for a lysine oxidase. The DNA obtained Molecules are used to transform bacteria, e.g. B. E. coli S17-1 det, which is for a transfer of the DNA molecules in Agrobacterium tumefaciens, e.g. B. GV 3101, are suitable. For this E.coli S17-1 and Agrobacterium tume faciens GV 3101 mixed together and incubated overnight. Agrobacteria, which the DNA molecules have absorbed are grown up Medium containing carbenicillin selected. These are then cut off leaves of potato flan, several times incised on the midrib Zen applied and incubated for two days in the dark. After that, the agro bacteria removed and the potato plants added growth substances so that sprouts form. These are cut off and used to cultivate used new potato plants. Evidence of expression products Tropoelastin and lysine oxidase or the elastin obtained is by means of speci antibodies against these proteins. It will follow on referred to the examples.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Faserproteine in Pflanzenzellen, insbesondere Pflanzen, in großer Reinheit herzustellen. Die Faserproteine eignen sich daher für die verschiedensten Anwendungen. Solche finden sich z. B. in der Landwirtschaft, Chemie, Kosmetik-Herstellung und Medizin. In letzterem Fall ist z. B. der Einsatz von Faserproteinen für Transplantate und Wundverschlüsse zu nennen. Insbesondere zeichnen sich die Faserproteine dadurch aus, daß sie frei von tierischen oder menschlichen Viren bzw. Krankheitserregern sind. Deweite ren können die Faserproteine in riesigen Mengen hergestellte werden. Dies trifft insbesondere zu, wenn sie aus auf Feldern kultivierten Pflanzen isoliert werden. Die vorliegende Erfindung stellt somit einen großen Beitrag dar, Arzneimittel sicher und in großen Mengen bereitzustellen.With the present invention it is possible to use fiber proteins in plant cells, especially plants, to produce in great purity. The fiber proteins are suitable therefore for a wide variety of applications. Such can be found e.g. B. in the Agriculture, chemistry, cosmetics manufacturing and medicine. In the latter case e.g. B. the use of fiber proteins for grafts and wound closures call. In particular, the fiber proteins are characterized in that they are free of animal or human viruses or pathogens. The vastness The fiber proteins can be produced in huge quantities. This is true especially when they are isolated from crops grown in fields. The present invention thus makes a great contribution, pharmaceuticals available safely and in large quantities.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert.The invention is illustrated by the following examples.
Es wird eine cDNA für humanes Elastin verwendet (vgl. Fazio, M.J., Journal of Investigative Dermatology 91 (1988), 458-464). Diese cDNA wird mittels einer PCR am 5'-Ende mit einer Ncol- und am 3'-Ende mit einer Xbal-Restriktionsstelle versehen. Das erhaltene cDNA-Fragment wird in den Vektor pRT 100 inseriert, der eine Expressionskassette mit CaMV 35S Promotor- und Terminations-Se quenzen enthält (vgl. Töpfer, R. et al., Nucleic Acids Research 15 (1987), 5890; Odell, J. T. et al., vorstehend). Nach Spaltung mit HindIII wird die die Elastin- cDNA enthaltende Expressionskassette isoliert und in den binären Vektor pSR 8- 30 inseriert (vgl. Düring, K. et al.; Porsch, P. et al., vorstehend). Es wird der Expressionsvektor pSR 8-30-Elastin erhalten.A cDNA for human elastin is used (see Fazio, M.J., Journal of Investigative Dermatology 91 (1988), 458-464). This cDNA is generated using a PCR at the 5 'end with an Ncol and at the 3' end with an Xbal restriction site Mistake. The cDNA fragment obtained is inserted into the vector pRT 100, an expression cassette with CaMV 35S promoter and termination Se contains sequences (cf. Töpfer, R. et al., Nucleic Acids Research 15 (1987), 5890; Odell, J.T. et al., Supra). After cleavage with HindIII, the elastin Expression cassette containing cDNA isolated and inserted into the binary vector pSR 8- 30 inserted (see Düring, K. et al .; Porsch, P. et al., Above). It will be the Expression vector pSR 8-30-elastin obtained.
Ferner wird eine cDNA für humane Lysinoxidase verwendet (vgl. Hämäläinen, E.R., Genomics 11 (1991), 508-516). Diese wird wie vorstehend behandelt und in den binären Vektor pSR 8-30 inseriert. Es wird der Expressionsvektor pSR 8-30-Lysinoxidase erhalten.Furthermore, a cDNA for human lysine oxidase is used (cf. Hämäläinen, E.R. Genomics 11: 508-516 (1991). This is treated as above and inserted into the binary vector pSR 8-30. It becomes the expression vector pSR Obtain 8-30 lysine oxidase.
Die Expressionsvektoren pSR 8-30-Elastin und pSR 8-30-Lysinoxidase werden zur Transformation von E.coli S17-1 verwendet. Transformanten werden mit Agrobacterium tumefaciens GV 3101 gemischt und über Nacht bei 27°C inku biert (vgl. Koncz, C., Shell, J., Molecular and General Genetics 204 (1986), 383-396; Koncz, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 131-135). Es wird auf Carbenicillin selektioniert, wobei das hierfür notwendige bla-Gen in den vorstehenden Expressionsvektoren vorliegt. Selektionsklone von Agrobacterium tumefaciens werden auf abgeschnittenen und mehrfach an der Mittelrippe einge ritzten Blättern der Kartoffelpflanze cv. Désirée aufgebracht und die Pflanze wird 2 Tage bei 20°C im Dunkeln inkubiert. Danach werden die Agrobakterien abgetrennt und der Kartoffelpflanze Pflanzenwuchsstoffe zugesetzt, so daß sich bevorzugt Sprosse ausbilden. Ferner werden durch Zugabe von Kanamycin in das Pflanzenmedium nicht-transformierte Zellen der Kartoffelpflanze abgetötet. Heranwachsende Sprosse werden abgeschnitten und auf Medium ohne Pflanzen wachstumsstoffe, aber mit Kanamycin bewurzelt. Die weitere Kultivierung der Kartoffel pflanzen erfolgt in üblicher Weise.The expression vectors pSR 8-30-elastin and pSR 8-30-lysine oxidase are used to transform E.coli S17-1. Transformants are included Agrobacterium tumefaciens GV 3101 mixed and incubated overnight at 27 ° C beer (see Koncz, C., Shell, J., Molecular and General Genetics 204 (1986), 383-396; Koncz, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 131-135 (1987). It is selected for carbenicillin, the necessary bla gene in the above expression vectors is present. Selection clones of Agrobacterium tumefaciens are inserted on the cut and several times on the midrib carved leaves of the potato plant cv. Désirée applied and the plant is Incubated for 2 days at 20 ° C in the dark. After that, the agrobacteria separated and plant growth substances added to the potato plant, so that preferably form rung. Furthermore, by adding Kanamycin in the plant medium killed non-transformed cells of the potato plant. Growing shoots are cut off and placed on medium without plants growth substances, but rooted in kanamycin. The further cultivation of the Planting potatoes is done in the usual way.
Der Nachweis des exprimierten Tropoelastins und der Lysinoxidase bzw. des erhaltenen Elastins wird durch Antikörper im Western Blot bzw. ELISA erreicht, die spezifisch für die einzelnen Proteine sind. Hierzu wird Gesamt-Protein oder die interzelluläre Waschflüssigkeit der Kartoffelpflanze isoliert und in die ent sprechenden Nachweisverfahren eingesetzt.The detection of the expressed tropoelastin and the lysine oxidase or the the elastin obtained is achieved by antibodies in a Western blot or ELISA, which are specific to the individual proteins. For this, total protein or the intercellular washing liquid of the potato plant is isolated and ent speaking detection methods used.
Es zeigt sich, daß Tropoelastin und Lysinoxidase in Pflanzenzellen, insbesondere in einer Pflanze, exprimiert werden können. Ferner zeigt sich, daß durch die Inkubation von Lysinoxidase mit dem Tropoelastin letzteres in Elastin überführt wird und dieses in reiner Form isoliert werden kann. It turns out that tropoelastin and lysine oxidase in plant cells, in particular in a plant that can be expressed. It also shows that the Incubation of lysine oxidase with the tropoelastin the latter converted to elastin is and this can be isolated in pure form.
Es werden cDNAs verwendet, die für die Untereinheiten α1 und α2 des humanen Tropokollagens kodieren (vgl. Chu, M.L. et al., Journal of Biological Chemistry 260 (1985), 2315-2320; Dickson L.A. et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985), 3427-3438). Ferner werden cDNAs verwendet, die für humane Lysinoxidase, humane Prokollagen C-Proteinase bzw. Prokollagen N-Proteinase aus dem Rind kodieren (vgl. Hämäläinen, E.R. et al., vorstehend; Li, S.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 5127-5130; Colige, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 2374-2379).CDNAs are used which are responsible for the subunits α1 and α2 of human Encode tropocollagen (see Chu, M.L. et al., Journal of Biological Chemistry 1985, 260: 2315-2320; Dickson L.A. et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985), 3427-3438). Furthermore, cDNAs are used which are responsible for human lysine oxidase, human procollagen C proteinase or procollagen N proteinase from bovine encode (see Hämäläinen, E.R. et al., supra; Li, S.W. et al., Proc. Acad. Sci. 1996 USA 93: 5127-5130; Colige, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2374-2379 (1997)).
Diese cDNAs werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt und in den Vektor pSR 8-30 inseriert. Es werden die Expressionsvektoren pSR 8-30-Tropo kollagen α1, pSR 8-30-Tropokollagen α2, pSR 8-30-Lysinoxidase, pSR 8-30-C- Proteinase und pSR 8-30-N-Proteinase erhalten. Das weitere Vorgehen erfolgt entsprechend der Beschreibung von Beispiel 1.These cDNAs are treated as described in Example 1 and in the Vector pSR 8-30 inserted. The expression vectors pSR 8-30-Tropo collagen α1, pSR 8-30 tropocollagen α2, pSR 8-30 lysine oxidase, pSR 8-30-C- Proteinase and pSR 8-30 N proteinase obtained. The further procedure follows according to the description of example 1.
Es zeigt sich, daß Tropokollagen und es prozessierende Proteine in Pflanzenzel len, insbesondere in einer Pflanze, exprimiert werden können. Ferner zeigt sich, daß Kollagen erhalten werden kann, das eine hohe Reinheit aufweist.It turns out that tropocollagen and there are processing proteins in plant cells len, especially in a plant, can be expressed. It also shows that collagen can be obtained which has a high purity.
Claims (20)
- (a) Expression eines Vorläufer-Faserproteins in einer Pflanzenzelle, und
- (b) Inkubation des Vorläufer-Faserproteins mit einem es prozessieren den Protein.
- (a) expression of a precursor fiber protein in a plant cell, and
- (b) Incubation of the precursor fiber protein with a process the protein.
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