DE19826821B4 - Process for the production of steroid hormones by means of recombinant fission yeasts - Google Patents
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Abstract
Verwendung von Spalthefen der Gattung Schizosaccharomyces zur Produktion von mitochondrialen P450-Enzymen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe mit einem Vektor, der das Gen zur Expression des P450-Enzyms enthält, transformiert und die transformierte Spalthefe unter Expressionsbedingungen züchtet.use of fission yeasts of the genus Schizosaccharomyces for the production of mitochondrial P450 enzymes, characterized in that the Fission yeast Schizosaccharomyces pombe with a vector containing the gene for expression of the P450 enzyme, transformed and transformed Fission yeast under expression conditions breeds.
Description
Die Erfindung betrifft die Verwendung rekombinanter Spalthefen der Gattung Schizosaccharomyces zur Produktion von mitochondrialen P450-Enzymen. Sie betrifft ferner ein Verfahren zur Produktion von Steroidhormonen mittels rekombinanter Spalthefen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Produktion von Steroidhormonen mit Spalthefen der Gattung Schizosaccharomyces. Die Erfindung betrifft ferner einen Vektor zur Einschleusung von Genen, die an der Steroidsynthese beteiligte Enzyme codieren, sowie mit diesem Vektor transformierte Mikroorganismen.The The invention relates to the use of recombinant fission yeasts of the genus Schizosaccharomyces for the production of mitochondrial P450 enzymes. It further relates to a process for the production of steroid hormones by recombinant fission yeasts. In particular, the invention relates a process for the production of steroid hormones with fission yeasts of the genus Schizosaccharomyces. The invention further relates to a vector for the introduction of genes involved in steroid synthesis Enzyme encode, as well as with this vector transformed microorganisms.
Steroide und insbesondere Steroidhormone wie Corticosteroide oder Sexualhormone sind wichtige Wirkstoffe in der pharmazeutischen Industrie. Längst läßt sich der Bedarf aus natürlichen Quellen nicht mehr decken. Die Produktion von Steroidhormonen durch Mikroorganismen erlangte deshalb in den letzten Jahren erhebliche Bedeutung, da sie der chemi schen Synthese, insbesondere bezüglich der Stereospezifität, Ausbeute und Art der Reaktionsbedingungen überlegen und somit kostengünstiger ist. Bisher wurden hierbei Mikroorganismen wie Curvularia lunata, Cunninghamella blakesleeana, Arthrobacter simplex oder Bacillus sphericus eingesetzt.steroids and especially steroid hormones such as corticosteroids or sex hormones are important active ingredients in the pharmaceutical industry. It has long been possible the need of natural No longer cover sources. The production of steroid hormones by Therefore, microorganisms have gained considerable importance in recent years Meaning, since they the chemical synthesis, in particular with respect to Stereospecificity Yield and type of reaction conditions superior and thus more cost-effective is. So far, microorganisms such as Curvularia lunata, Cunninghamella blakesleeana, Arthrobacter simplex or Bacillus used sphericus.
Um Mikroorganismen zur Produktion von Steroidhormonen zu befähigen, müssen in diese die entsprechenden Enzyme zur Steroidsynthese eingeschleust und funktionell und in entsprechenden Mengen exprimiert werden. Schlüsselenzyme hierfür sind die mitochondrialen Cytochrom-P450-Monooxygenasen. Versuche zur Expression dieser Enzyme in Mikroorganismen, wie z.B. der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, sind in der Literatur beschrieben. Dabei zeigte sich, dass diese Hefen nach alleiniger Transformation mit dem P450-Enzym keine nennenswerte Aktivität aufwiesen. Vielmehr war die zusätzlich Transformation der Hefen mit den Elektronenübertragungsproteinen Adrenodoxin und Adrenodixin-Reduktase notwendig, oder aber die Konstruktion von Fusionsproteinen mit Teilen dieser Proteine (Y. Yabusaki, Biochimie, 77, 594 (1995). Beim Aufbau längerer Reaktionskaskaden (z.B. von Cholesterin bis zum Cortisol) ergibt sich daher die Notwendigkeit, Hefen mit einer Vielzahl verschiedener Gene transformieren zu müssen, was die genetische Instabilität solcher Stämme stark erhöht und sie für großtechnische Anlagen ungeeignet macht.In order to enable microorganisms for the production of steroid hormones, the corresponding enzymes for steroid synthesis must be introduced into them and be expressed functionally and in appropriate amounts. Key enzymes for this are the mitochondrial cytochrome P 450 monooxygenases. Attempts to express these enzymes in microorganisms, such as the baker's yeast Saccharomyces cerevisiae, are described in the literature. It was found that these yeasts had no significant activity after sole transformation with the P450 enzyme. Rather, the additional transformation of yeasts with the electron transfer proteins adrenodoxin and adrenodixin reductase was necessary, or else the construction of fusion proteins with parts of these proteins (Y. Yabusaki, Biochimie, 77, 594 (1995).) In the construction of longer reaction cascades (eg from cholesterol to to cortisol), therefore, there is a need to transform yeasts with a variety of different genes, which greatly increases the genetic instability of such strains and makes them unsuitable for large scale facilities.
Aus
der
Es besteht daher ein Bedarf nach einem ökonomischen und kostengünstigen Verfahren zur Produktion von Steroiden. Das Verfahren soll stereoselektiv durchführbar sein und die Produktion des gewünschten Hormons in großen Ausbeuten erlauben. Das Verfahren soll universell anwendbar sein und sich zum Aufbau verschiedener Biosynthesewege für Steroide, insbesondere von Steroidhormonen, eignen. Insbesondere sollen häufig und in großen Mengen benötigte Steroidhormone wie Aldosteron, Corticosteron und 18-Hydroxycorticosteron in großen Mengen und kostengünstig produziert werden können.It There is therefore a need for an economical and cost-effective Process for the production of steroids. The process should be stereoselective feasible be and the production of the desired Hormones in large Allow yields. The method should be universally applicable and to develop different biosynthetic pathways for steroids, in particular of steroid hormones. In particular, should be frequent and in big Required quantities Steroid hormones such as aldosterone, corticosterone and 18-hydroxycorticosterone in big Quantities and cost-effective can be produced.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch die Verwendung von Spalthefen der Gattung Schizosaccharomyces zur Produktion von mitochondrialen P450-Enzymen, die dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Spalthefe mit einem Vektor, der das Gen zur Expression des P450-Enzyms enthält, transformiert und die transformierte Spalthefe unter Expressionsbedingungen züchtet, sowie ein Verfahren zur Produktion von Steroiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Spalthefe der Gattung Schizosaccharomyces mit dem Vektor pINT-X transformiert, wobei X das Gen für ein an der Steroidbiosynthese beteiligtes Enzym ist, die rekombinante Hefe unter Expressionsbedingungen des Vektors züchtet, und das gebildete Steroid isoliert. Die Erfindung betrifft ferner den Vektor pINT, sowie damit transformierte Spalthefen.According to the invention this Task solved through the use of fission yeasts of the genus Schizosaccharomyces for the production of mitochondrial P450 enzymes characterized is that one the fission yeast with a vector containing the gene for expression of the P450 enzyme contains transformed and the transformed fission yeast under expression conditions breeds, and a method of producing steroids, characterized is that one a fission yeast of the genus Schizosaccharomyces with the vector pINT-X transformed, where X is the gene for an enzyme involved in steroid biosynthesis is the recombinant Yeast breeds under conditions of expression of the vector, and the steroid formed isolated. The invention further relates to the vector pINT, as well as to it transformed fission yeasts.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß Gene für die Expression mitochondrialer P450-Enzyme, die an der Steroidsynthese beteiligte Enzyme codieren, in das Genom von Spalthefen der Gattung Schizosaccharomyces integriert, funktionell exprimiert und so zur Synthese von Steroidhormonen verwendet werden können. Bevorzugt wird das menschliche Gen CYP11B2, das das Cytochrom P450-Enzym Aldosteronsynthase (P450aldo) codiert, in das Genom von Spalthefen der Gattung Schizosaccharomyces integriert und funktionell exprimiert. Die so veränderte Spalthefe ist dann in der Lage, Steroidhomone zu produzieren. Es wurde ferner gefunden, daß Spalthefen über ein Elektronentransportsystem verfügen, das die Elektronen, die die Cytochrom-P450-Enzyme zur Katalyse benötigen, liefert. Es ist daher nicht notwendig, ein solches Transportsystem zusätzlich in den gewählten Mikroorganismus einzuschleusen, was das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung von Spalthefen besonders effizient macht.Surprisingly, it has been found that genes for the expression of mitochondrial P450 enzymes which encode enzymes involved in steroid synthesis, integrated into the genome of fission yeasts of the genus Schizosaccharomyces, can be functionally expressed and used for the synthesis of steroid hormones. Preferably, the human gene CYP11B2, which encodes the cytochrome P450 enzyme aldosterone synthase (P450 aldo ), is integrated into the genome of fission yeasts of the genus Schizosaccharomyces and is functionally expressed. The modified fission yeast is then able to produce steroid hormones. It has also been found that fission yeasts have an electron transport system that contains the electrons that drive the Cy tochromic P450 enzymes are required for catalysis. It is therefore not necessary to additionally introduce such a transport system into the selected microorganism, which makes the process according to the invention particularly efficient using fission yeasts.
Das Nebennierenrindenenzym Aldosteronsynthase katalysiert die letzten drei Schritte des Biosynthese des Mineralocorticoids Aldosteron: Die Umsetzung von Desoxycorticosteron (DOC) zu Corticosteron, die Umwandlung von Corticosteron zu 18-Hydroxycorticosteron und von 18-Hydroxycorticosteron in Aldosteron. Ferner katalysiert P450aldo auch die Umsetzung von 11-Desoxycortisol zu Cortisol.The adrenal cortical enzyme aldosterone synthase catalyses the last three steps in the biosynthesis of the mineralocorticoid aldosterone: the conversion of desoxycorticosterone (DOC) to corticosterone, the conversion of corticosterone to 18-hydroxycorticosterone, and 18-hydroxycorticosterone to aldosterone. Furthermore, P450 aldo also catalyzes the conversion of 11-desoxycortisol to cortisol.
Erfindungsgemäß können beliebige Spalthefen der Gattung Schizosaccharomyces transformiert werden. Bevorzugt ist jedoch Schizosaccharomyces pombe.According to the invention, any Fission yeast of the genus Schizosaccharomyces be transformed. However, Schizosaccharomyces pombe is preferred.
Als Beispiel für das erfindungsgemäße Verfahren wurde das menschliche Gen CYP11B2 in die Spalthefe mit dem speziell entwickelten Integrationsvektor pINT5 eingeschleust, der durch gentechnische Rekombination mit dem CYP11B2-Gen in den Vektor pINT5-CYP11B2 überführt wurde. Der Vektor erlaubt eine stabile Integration des Gens in das Genom der Hefe, sowie eine kontrollierte Regulation der Transkription der clonierten cDNA.When example for the inventive method The human gene CYP11B2 was added to the fission yeast with the specific integrated integration vector pINT5 introduced by genetic engineering Recombination with the CYP11B2 gene was transferred to the vector pINT5-CYP11B2. The vector allows stable integration of the gene into the genome yeast, as well as a controlled regulation of transcription the cloned cDNA.
Mit diesem Vektor können auch weitere für Enzyme der Steroidbiosynthese (mitochondriale P450-Enzyme) codierende Gene wie z.B. CYP11A1, CYP11B1, CYP17, Gen für 3β-Hydroxysteroidreduktase in Spalthefen transformiert werden. Dadurch können Steroide bzw. Steroidhormone wie z.B. Pregnenolon, Cortisol, Androstendion erhalten werden. Es ist auch möglich, Kombinationen entsprechender Gene einzuschleusen.With this vector can also more for Enzyme of steroid biosynthesis (mitochondrial P450 enzymes) encoding Genes such as e.g. CYP11A1, CYP11B1, CYP17, gene for 3β-hydroxysteroid reductase in Fission yeasts are transformed. This can cause steroids or steroid hormones such as. Pregnenolone, cortisol, androstenedione are obtained. It is possible, too, Introduce combinations of appropriate genes.
Die so transformierte Hefe wird auf üblichen Medien vermehrt. Die gebildeten Steroidhormone befinden sich zum Teil in den Hefezellen und zum Teil im Überstand. Sie können z.B. durch einfache Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel wie Chloroform aus dem Medium isoliert werden; zur Erhöhung der Ausbeute ist ein vorheriger Aufschluß der Hefezellen (z.B. enzymatische Lyse oder mechanisch durch Schütteln mit Glasperlen) möglich.The so transformed yeast is on usual Media multiplies. The formed steroid hormones are for Part in the yeast cells and partly in the supernatant. You can e.g. by simple extraction with an organic solvent how to isolate chloroform from the medium; to increase the Yield is a prior digestion of the yeast cells (e.g., enzymatic Lysis or mechanically by shaking with glass beads) possible.
Zu Konstruktion von pINT5-CYP11B2 wurde eine PCR mit dem Plasmid pSVL-CYP11B2 (Expressionsplasmid mit dem CYP11B2-Gen) als Matrize sowie den Primern 3450-30 und 4125-51 durchgeführt. Die Primer enthalten neben den flankierenden Sequenzen des CYP11B2-Gens die notwendigen Restriktionsschnittstellen (NdeI am 5'-Ende und BamHI am 3'-Ende) für eine Clonierung in den Vektor pINT5. Zusätzlich wurden mit dem Primer 4125-51 sechs carboxyterminale Histidinreste zur immunologischen Erkennung und chromatographischen Aufreinigung des Proteins eingeführt. Das PCR-Fragment sowie der Vektor pINT5 wurden mit den Restriktionsenzymen NdeI und BamHI gespalten, ligiert und E. coli damit transformiert. Eine Transformation anderer Mikroorganismen ist ebenfalls möglich. Die Sequenz des humanen CYP11B2-Gens ist bekannt und kann aus internationalen Datenbanken, z.B. EMBL Heidelberg, abgefragt werden. Die von uns verwendete Sequenz unterscheidet sich von den dort gegenwärtig beschriebenen Sequenzen durch den Austausch zweier Aminosäuren (Prolin statt Leucin an Position 106 und Glycin statt Glutaminsäure an Position 258) sowie durch sechs zusätzliche Histidinseitenketten am carboxyterminalen Ende.To Construction of pINT5-CYP11B2 was PCR with the plasmid pSVL-CYP11B2 (Expression plasmid with the CYP11B2 gene) as template and primers 3450-30 and 4125-51. The primers contain, in addition to the flanking sequences of the CYP11B2 gene the necessary restriction sites (NdeI at the 5 'end and BamHI at 3'-end) for a cloning in the vector pINT5. Additionally were with the primer 4125-51 six carboxyterminal histidine residues to immunological detection and chromatographic purification of the Protein introduced. The PCR fragment and the vector pINT5 were digested with the restriction enzymes NdeI and BamHI cleaved, ligated and transformed with E. coli. Transformation of other microorganisms is also possible. The Sequence of the human CYP11B2 gene is known and can be obtained from international Databases, e.g. EMBL Heidelberg, to be queried. The one used by us Sequence differs from the sequences currently described there by replacing two amino acids (proline instead of leucine an Position 106 and glycine instead of glutamic acid at position 258) as well as by six extra Histidine side chains at the carboxyterminal end.
Die
beigefügte
Figur erläutert
die Erfindung näher.
Die
Im Vektor pINT5-CYP11B2 befindet sich das CYP11B2-Gen unter der Kontrolle des nmtl-Promotors des Spalthefe (J. Biol. Chem., 265, 10857 (1990)). Es zeigte sich, daß die mit diesem Konstrukt transformierten Hefen auch ohne die Kotransformation mit weiteren Elektronenübertragungsproteinen eine starke Steroidhydroxylierungsaktivität aufwiesen. Der nmtl-Promotor kann durch die Zugabe von Thiamin (= Vitamin B1) zum Nährmedium reguliert werden. Bei Abwesenheit von Thiamin ist der Promotor aktiv, in Anwesenheit von Thiamin dagegen abgeschaltet. Ferner enthält der pINT5-Vektor ("Bureik et al., Biol. Chem. 378, 1361 (1197)" sowie "Wagner et al. in Vorbereitung" längere Sequenzen des leu1-Gens von S. pombe. Durch Restriktionsspaltung des Vektors mit dem Enzym Not1 wird ein lineares Integrationskonstrukt erzeugt, bei dem sich die leu1-Sequenzen am Rande befinden und über homologe Rekombination in das leu1-Gen des zu transformierenden Spalthefestamms integrieren können. Da sich die Expressionskassette mit dem nmtl1-Promotor und dem CYP11B2-Gen im Integrationskonstrukt zwischen den leu1-Sequenzen befindet, wird sie somit stabil in das Genom der Hefe integriert. Als Marker enthält den pINT5-Vektor das ura4-Gen der Spalthefe, welches die auxotrophe Mutation ura4.dl18 komplementieren kann.in the Vector pINT5-CYP11B2 is the CYP11B2 gene under control the nmtl promoter of fission yeast (J. Biol. Chem., 265, 10857 (1990)). It turned out that the yeasts transformed with this construct even without cotransformation with other electron transfer proteins had a strong Steroidhydroxylierungsaktivität. The nmtl promoter can by the addition of thiamine (= vitamin B1) to the nutrient medium can be regulated. In the absence of thiamine, the promoter is active, in the presence turned off by thiamine, however. Further, the pINT5 vector ("Bureik et al., Biol. Chem. 378, 1361 (1197) "and" Wagner et al. in Preparation "longer sequences of the leu1 gene of S. pombe. By restriction cleavage of the vector with the enzyme Not1 a linear integration construct is generated, where the leu1 sequences are marginal and homologous Recombination to the leu1 gene of the fission yeast strain to be transformed can integrate. Since the expression cassette with the nmtl1 promoter and the CYP11B2 gene is located in the integration construct between the leu1 sequences Thus, they are stably integrated into the genome of the yeast. As marker contains the pINT5 vector the ura4 gene of fission yeast, which is the auxotrophic mutation ura4.dl18 can complement.
Der Vektor pINT5-CYP11B2 wurde am 4.6.1998 bei der DSMZ – Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig unter der Hinterlegungsnummer DSM 12193 gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt. Nachstehend wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert.The vector pINT5-CYP11B2 was published on 4.6.1998 at the DSMZ - Deutsche Sammlung für Mikroorga nismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig under the accession number DSM 12193 according to the terms of the Budapest Treaty. The process according to the invention will be explained in more detail below.
Beispiel 1example 1
Konstruktion des Vektors pINT5Construction of the vector pINT5
Das
leu1+-Gen wurde durch eine Polymerasekettenreaktion unter Verwendung
des Primerpaares A und B zur Einschleusung von AatII- und NotI-
bzw. PvuII und NotI-Spaltstellen amplifiziert, und das Plasmid pYK411
(Curr. Genet. 14 (1988), 375-379) wurde als Matrize verwendet 
Das erhaltene Fragment wurde gelchromatographisch gereinigt, mit AatII und PvuII gespalten und mit einem AatII/PvuII-Fragment von pUC19 (von Boehringer Mannheim), das das gleiche bakterielle ori-Gen und Ampicillinresis tenzgen enthielt, ligiert, wodurch das Plasmid pINT1 erhalten wurde.The the fragment obtained was purified by gel chromatography, with AatII and PvuII and cleaved with an AatII / PvuII fragment from pUC19 (by Boehringer Mannheim) that have the same bacterial ori gene and ampicillin resistance , resulting in the plasmid pINT1 was obtained.
Der nmt1+-Promotor wurde als (PstI) glatt/BamHI-Fragment aus dem Plasmid pREP1 (J. Biol. Chem. 265 (1990), 10857-10864) isoliert, wohingegen das ura4+-Gen mit dem Primerpaar C und D amplifiziert wurde, wodurch zusätzliche Bam-HI- und NruI-Spaltstellen eingeführt wurden. Das Plasmid pURA4 (Mol. Gen. Genet. 215 (1988), 81-86) wurde als Matrize verwendet. Es wurde mit den entsprechenden Restriktionsenzymen gespalten und über Gel gereinigt.Of the nmt1 + promoter was constructed as a (PstI) smooth / BamHI fragment from the plasmid pREP1 (J. Biol. Chem. 265 (1990), 10857-10864), whereas the ura4 + gene was amplified with the primer pair C and D, whereby additional Bam HI and NruI cleavage sites introduced were. The plasmid pURA4 (Mol. Gen. Genet., 215 (1988), 81-86) was used as a template. It was with the appropriate restriction enzymes split and over Gel cleaned.
Nach der Spaltung von pINT5 mit EcoRV und der Dephosphorylierung mit alkalischer Phosphatase wurde eine Dreifachligierung durchgeführt, wodurch das Plasmid pINT5 erhalten wurde. Siehe auch "Bureik et al., Biol. Chem. 378, 1361 (1997)."To cleavage of pINT5 with EcoRV and dephosphorylation with Alkaline phosphatase was a triple ligation performed, thereby the plasmid pINT5 was obtained. See also Bureik et al., Biol. Chem. 378, 1361 (1997). "
Beispiel 2Example 2
Transformation von Schizosaccharomyces pombetransformation of Schizosaccharomyces pombe
Um
den Integrationsvektor pINT5 zu testen, wurde das tms1+-Gen von
Sc. pombe, ein Multicopy-Suppressor eines durch die Mutante p53
induzierten Wachstumsstopps (Oncogene 6 (1991), 1539-1547), als NdeI/BamHI-Fragment
in die Clonierungsstellen eingeschleust, wodurch das Plasmid pINT5-tms1
erhalten wurde. Die flankierenden NotI-Spaltstellen erlaubten eine
leichte Isolierung des entsprechenden Fragments, das zur Transformation
der Hefe benötigt
wurde. Die Restriktionsendonuclease NotI spaltet selten und fraktioniert
die drei Chromosomen von Sc. pombe nur in 17 verschiedene Fragmente
(Nucleic Acids Res. 17 (1988), 2801-2818). Etwa 100 ng DNA-Fragment
wurde verwendet, um einen h- ura4dl18-Stamm von Sc. pombe nach dem
LiCl-Verfahren zu transformieren
(BioTechniques 5 (1987), 516-518).To test the integration vector pINT5, the tms1 + gene of Sc. pombe, a multicopy suppressor of mutant p53-induced growth arrest (Oncogene 6 (1991), 1539-1547), as an NdeI / BamHI fragment into the cloning sites, thereby obtaining the plasmid pINT5-tms1. The flanking NotI cleavage sites allowed for easy isolation of the corresponding fragment needed to transform the yeast. The restriction endonuclease NotI rarely cleaves and fractionates the three chromosomes of Sc. pombe only into 17 different fragments (Nucleic Acids Res. 17 (1988), 2801-2818). Approximately 100 ng of DNA fragment was used to construct a h-ura4d18 strain of Sc. pombe according to the LiCl method
(BioTechniques 5 (1987), 516-518).
Da das nmt1+-Gen von Sc. pombe hoch exprimiert ist und durch Thiamin transkriptionell reprimiert wird (J. Biol. Chem. 265 (1990), 10857-10864), enthielten alle zur Transformation verwendeten Medien 2μm Thiamin. Um positive Integranten zu selektieren, wurden die Transformationsansätze auf Minimalmedium ohne Uracil plattiert, wodurch durchschnittlich 102 bis 103 Kolonien erhalten wurden. Um die korrekte Integration in den leu1+-Locus zu testen, wurden die Kolonien auf Minimalmedium ohne Leucin replicaplattiert. Keiner der ura4+-Integranten war auf den Platten ohne Leucin lebensfähig, was anzeigt, daß das DNA-Fragment ausschließlich in den leu1+-Locus von Sc. pombe integriert war, wie durch Southern Blot Analyse bestätigt wurde (Daten nicht gezeigt).Since the nmt1 + gene of Sc. pombe is highly expressed and is transcriptionally repressed by thiamine (J. Biol. Chem. 265 (1990), 10857-10864), all media used for the transformation contained 2μm of thiamine. In order to select positive integrants, the transformation batches were plated on minimal medium without uracil giving an average of 10 2 to 10 3 colonies. To test for correct integration into the leu1 + locus, the colonies were replica plated on minimal medium without leucine. None of the ura4 + integrants were viable on the leucine-free plates, indicating that the DNA fragment was restricted exclusively to the leu1 + locus of Sc. pombe, as confirmed by Southern blot analysis (data not shown).
Beispiel 3Example 3
Induzierbare Expression von tms1 in SchizosaccharomycesInducible expression of tms1 in Schizosaccharomyces
Um die Integrität des nmt1+-Promotors zu testen, wurde der Integrationsstamm h-ura4dl18leu1xpINTS- tms1 in mit Leucin supplementiertem Minimalmedium und in Gegenwart von Thiamin bis zur Sättigung gezüchtet. Nach viermaligem Waschen der Zellen in vorgewärmtem Medium ohne Thiamin wurden sie in frischem Medium resuspendiert und weitere 24h bis zur Sättigung gezüchtet. Proteinlysate von reprimierten und induzierten Zellen wurden mittels SDS-Polyacrylamidgelen analysiert, auf Nitrocellulose überführt und mit einem spezifischen polyclonalen Antikörper gegen das tms1-Protein (Eur. J. Biochem, 1993) umgesetzt. Infolge einer durch langsame Thiaminentleerung erzeugten Verzögerung wurde in den Zellen die Expression von tms1 wie erwartet induziert.Around the integrity of the nmt1 + promoter, the integration strain h-ura4dl18leu1xpINTS- tms1 in minimal medium supplemented with leucine and in the presence from thiamine to saturation bred. After washing the cells four times in prewarmed medium without thiamine they are resuspended in fresh medium and allowed to saturate for a further 24h bred. Protein lysates of repressed and induced cells were analyzed by means of SDS-polyacrylamide gels analyzed, transferred to nitrocellulose and with a specific polyclonal antibody against the tms1 protein (Eur. J. Biochem, 1993). As a result of slow thiamine emptying generated delay In the cells expression of tms1 was induced as expected.
Beispiel 4Example 4
Transformation der Hefe NCYC 2036Transformation of the yeast NCYC 2036
Der Hefestamm NCYC 2036 (bezogen von der National Collection of Yeast Cultures, Norwich, England) besitzt den Genotyp h- ura4.dl18 (d.h. Paarungstyp h-, Deletionsmutation im ura4-Gen). Durch die Deletionsmutation sind die Hefezellen zum Überleben auf die externe Zufuhr von Uracil angewiesen (Uracil-Auxotrophie). Die Aufzucht und mikro-/sowie molekularbiologische Handhabung der Spalthefen erfolgte, wenn nicht anders angegeben, in Anlehnung an Standardverfahren (Moreno et al., Methods Enzym., 194, 795 (1991) und Alfa et al.: Experiments with fission Yeast. Cold Spring Harbor Laboratory Press (USA) (1993)). Der Stamm NCYC 2036 wurde mit dem Vektor pINT5-CYP11B2 gemäß einem Transformationsprotokoll von Okazaki et al. (Nucleic Acids Res. 18, 6485, (1999)) transformiert und auf Uracil-Heterotrophie selektioniert. Die korrekte homologe Integration des Vektors in das leu1-Gen der Hefe wurde durch Überprüfung der neu erworbenen Leucin-Auxotrophie (mittels Replicaplattierung auf Leucin-freies Nährmedium) nachgewiesen. Der so erzeugte Spalthefestamm erhielt die Bezeichnung MB164.Of the Yeast strain NCYC 2036 (purchased from the National Collection of Yeast Cultures, Norwich, England) has the genotype h-ura4.dl18 (i.e. Mating type h, deletion mutation in the ura4 gene). By the deletion mutation are the yeast cells for survival dependent on the external supply of uracil (uracil auxotrophy). The rearing and micro- / molecular biological handling of the Colloidal yeast was carried out, if not stated otherwise, based on Standard Method (Moreno et al., Methods Enzym., 194, 795 (1991) and Alfa et al .: Experiments with fission Yeast. Cold Spring Harbor Laboratory Press (USA) (1993)). The strain NCYC 2036 was used with the Vector pINT5-CYP11B2 according to a Transformation protocol by Okazaki et al. (Nucleic Acids Res. 18, 6485, (1999)) and selected for uracil heterotrophy. The correct homologous integration of the vector into the leu1 gene of the vector Yeast was checked by reviewing newly acquired leucine auxotrophy (by replica plating on Leucine-free nutrient medium) demonstrated. The Spalthefestamm thus obtained received the name MB164.
Beispiel 5Example 5
Expression von Aldosteronsynthaseexpression of aldosterone synthase
Um die Funktionsfähigkeit der in der Spalthefe exprimierten Aldosteronsynthase zu überprüfen, wurde die Fähigkeit des Enzyms zum Substratumsatz getestet. Hierzu wurde 1 ml einer stationären Kultur des vorstehend erhaltenen Stammes MB164 in An- und Abwesenheit von Thiamin mit dem radioaktiv markierten Substrat DOC 3 Tage inkubiert. Dann wurden die Reaktionsprodukte aus den Medienüberständen extrahiert und mittels Dünnschichtchromatographie und Autoradiographie identifiziert.Around the functionality the aldosterone synthase expressed in the fission yeast, was the ability of the enzyme was tested for substrate turnover. To this was added 1 ml of a stationary Culture of the MB164 strain obtained above in the presence and absence of thiamine with the radiolabelled substrate DOC for 3 days. Then, the reaction products were extracted from the media supernatants and by means of TLC and autoradiography identified.
Dann wurden die Reaktionsprodukte aus den Medienüberständen mit 800 μl Chloroform extrahiert, die organische Phase abgetrennt und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in 10 μl Dichlormethan aufgenommen und auf eine HPLC-Platte (Kieselgel 60 F254; Fa. Merck) aufgetragen. Zum Vergleich wurden nichtradioaktive Steroide mitaufgetragen. Die Platte wurde in einem Gemisch aus Chloroform, Methanol umd Wasser im Verhältnis 300:20:1 chromatographiert und an der Luft getrocknet. Die Autoradiographie erfolgte durch Auflegen einer Imaging Plate (Typ BAS-IIIs; Fa. Fuji) und Ablesen der Platte durch einen Phosphor-Imager (BAS 2000; Fa. Fuji).Then, the reaction products were extracted from the media supernatants with 800 ul chloroform, the organic phase separated and evaporated in vacuo. The residue was taken up in 10 μl of dichloromethane and applied to an HPLC plate (Kieselgel 60 F 254 , Merck). For comparison, non-radioactive steroids were included. The plate was chromatographed in a mixture of chloroform, methanol and water in a ratio of 300: 20: 1 and dried in air. Autoradiography was performed by placing an imaging plate (type BAS IIIs, Fuji) and reading the plate through a phosphor imager (BAS 2000, Fuji).
Es konnte eine deutliche Produktbildung in Abhängigkeit von der Expression des Enzyms Aldosteronsynthase festgestellt werden. Der Stamm MB 164 setzt bei Wachstum unter induzierenden Bedingungen (d.h. ohne Thiamin) das Substrat DOC zu den Produkten Corticosteron, 18-Hydroxycorticosteron und Aldosteron um. Demgegenüber findet bei Wachstum unter reprimierten Bedingungen (d.h. mit Thiamin) nur ein schwacher Umsatz statt, der vermutlich darauf zurückzuführen ist, daß der mtl1-Promotor auch in Gegenwart von Thiamin nicht völlig abgeschaltet ist. Eine derartige basale Aktivität des mtl1-Promotors ist bekannt. Der Ausgangsstamm NCYC besitzt keine meßbare Aktivität zur Produktion der vorstehenden Produkte.It could produce a significant product formation depending on the expression of the enzyme aldosterone synthase. The strain MB 164, when grown under inducing conditions (i.e., without Thiamine) the substrate DOC to the products corticosterone, 18-hydroxycorticosterone and aldosterone around. In contrast, when grown under repressed conditions (i.e., with thiamine) only a weak turnover, presumably due to that the mtl1 promoter is not completely switched off even in the presence of thiamine is. Such basal activity of the mtl1 promoter is known. The parent strain NCYC has no measurable activity for production the above products.
SEQUENZPROTOKOLL 
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