DE19820131A1 - New nikkomycin derivatives useful as antifungal agents, fungicides, insecticides and miticides - Google Patents

New nikkomycin derivatives useful as antifungal agents, fungicides, insecticides and miticides

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DE19820131A1
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nikkomycin
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Abstract

Nikkomycin derivatives (I), i.e. nikkomycins Lx, Lz, Li and Lj, are new. Nikkomycin derivatives of formula (I) are new: R1 = a group of formula (i) or (ii): R2 = OH or NHCH(COOH)CH2CH2COOH. An Independent claim is also included for a process for producing of nikkomycin derivatives in which individual genes coding for nikkomycin synthesis are inactivated and correspondingly treated microorganisms produce the nikkomycin derivatives.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nikkomycin-Derivate, ein Verfahren für ihre Herstellung und deren Verwendung zur Bekämpfung von pilzlichen Infektionen.The present invention relates to nikkomycin derivatives, a process for their Production and their use for combating fungal infections.

Pilzliche Infektionen stellen sowohl bei Mensch und Tier als auch bei Pflanzen ein nicht unerhebliches Problem dar. Es besteht daher ein dringender Bedarf an neuen Wirkstoffen. Nikkomycine sind antifungische Substanzen, die zu den Nukleosidpeptid-Antibiotika gehören und von Streptomyces tendae Tü901 produziert werden (Dähn et al.: Arch. Microbiol. 107, 143-160, 1976; Fiedler et al.: J. Chem. Tech. Biotechnol. 32, 271-280, 1982). Alle für die Biosynthese der Nikkomycine erforderlichen Gene wurden aus Streptomyces tendae Tü901/8c isoliert (Möhrle et al.: Mol- Microbiol. 15, 561-571, 1995; Bormann et al.: J. Bacteriol. 178, 1216-1218, 1996). Bekannte, durch Streptomyces tendae produzierte Nikkomycine sind die Nikkomycine Z und X. Auch auf chemischem Wege lassen sich Nikkomycine herstellen. Die US 5,618,793 beschreibt Nikkomycinderivate sowie Verfahren zu deren Herstellung mittels chemischer Methoden. Diese Verfahren sind aber sehr aufwendig, weiterhin sind die bisher bekannten Nikkomycine im neutralen und alkalischen pH-Bereich wenig stabil.Fungal infections do not occur in humans, animals or plants insignificant problem. There is therefore an urgent need for new active ingredients. Nikkomycins are antifungal substances that contribute to the nucleoside peptide antibiotics belong and are produced by Streptomyces tendae Tü901 (Dähn et al .: Arch. Microbiol. 107, 143-160, 1976; Fiedler et al .: J. Chem. Tech. Biotechnol. 32, 271-280, 1982). All genes required for the biosynthesis of the Nikkomycins have been removed Streptomyces tendae Tü901 / 8c isolated (Möhrle et al .: Mol-Microbiol. 15, 561-571, 1995; Bormann et al .: J. Bacteriol. 178, 1216-1218, 1996). Known by Streptomyces tendae Nikkomycins produced are the Nikkomycine Z and X. Also by chemical means Nikkomycins can be produced. US 5,618,793 describes Nikkomycin derivatives and processes for their production by means of chemical methods. These procedures are but very complex, the previously known Nikkomycins are neutral and alkaline pH range not very stable.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Nikkomycine zur Verfügung zu stellen, die bei guter antifungischer Wirksamkeit eine erhöhte Stabilität im neutralen und alkalischen pH- Bereich aufweisen, sowie ein einfaches Verfahren zu deren Herstellung.The object of the present invention is to provide Nikkomycine available at good antifungal activity increased stability in neutral and alkaline pH Have area, as well as a simple process for their preparation.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 2 gelöst. Die Unteransprüche charakterisieren bevorzugte Ausführungsformen. This object is solved by the features of claims 1 and 2. The Sub-claims characterize preferred embodiments.  

Insgesamt sind 22 verschiedene Gene an der Nikkomycin-Synthese von Streptomyces tendae Tü901 beteiligt. Es hat sich nun überraschend gezeigt, daß durch Inaktivierung einzelner für die Nikkomycin-Synthese kodierender Gene neue Nikkomycinderivate erhalten werden können. So werden nach Inaktivierung des nikF-Gens die Nikkomycine LX, LZ, LI und LJ produziert. Die neuen Nikkomycin-Derivate haben die in Fig. 1 gezeigten Strukturen.A total of 22 different genes are involved in the Nikkomycin synthesis of Streptomyces tendae Tü901. It has now surprisingly been found that new nikkomycin derivatives can be obtained by inactivating individual genes coding for the nikkomycin synthesis. After inactivation of the nikF gene, the Nikkomycins L X , L Z , L I and L J are produced. The new nikkomycin derivatives have the structures shown in FIG. 1.

Die Inaktivierung einzelner für die Nikkomycin-Synthese kodierender Gene kann durch dem Fachmann geläufige Methoden erfolgen. Wichtig ist dabei, daß durch diese Inaktivierung einzelner Gene die weiteren zu diesem Operon gehörenden Gene nicht beeinflußt werden. Man kann dies beispielsweise erreichen durch Einfügen von Deletionen, sogenannten in-frame Deletionen, oder auch durch den Einbau anderer Gene, bevorzugt von Resistenzgenen. Die Benutzung von Resistenzgenen erleichtert die spätere Selektionierung.The inactivation of individual genes coding for the Nikkomycin synthesis can by methods familiar to the person skilled in the art are carried out. It is important that through this Inactivation of individual genes does not affect the other genes belonging to this operon to be influenced. You can do this, for example, by inserting Deletions, so-called in-frame deletions, or by incorporating other genes, preferred of resistance genes. The use of resistance genes makes the later easier Selection.

Es ist bei der DNA-Sequenzanalyse eines DNA-Bereichs, der einen Teil der für die Nikkomycinsynthese erforderlichen Gene trägt und der als Insert in dem Plasmid pVM6 Moniert vorliegt (Möhrle et al.: Mol. Microbiol. 15, 561-571, 1995), ein Gen gefunden worden, das als nikF bezeichnet wird (Fig. 2 und 3). Dieses Gen ist homolog zu Genen, die für Cytochrom P 450 Monooxygenasen kodieren (zur Übersicht: D. P. O'Keefe und P. A. Harder, Mol. Microbiol. 5, 2099-2105, 1991).It is in the DNA sequence analysis of a DNA region which carries part of the genes required for nikomycin synthesis and which is present as an insert in the plasmid pVM6 Moniert (Möhrle et al .: Mol. Microbiol. 15, 561-571, 1995) , a gene has been found which is called nikF (FIGS . 2 and 3). This gene is homologous to genes which code for cytochrome P 450 monooxygenases (for overview: DP O'Keefe and PA Harder, Mol. Microbiol. 5, 2099-2105, 1991).

Im folgenden wird als Beispiel die Konstruktion einer Streptomyces tendae-Mutante beschrieben, bei der das nikF-Gen durch Insertion eines Resistenzgens inaktiviert ist. Diese nikF-Geninsertionsmutante produziert die erfindungsgemäßen Nikkomycin- Derivate Nikkomycin LZ, Nikkomycin LX, Nikkomycin LJ und Nikkomycin LI.The construction of a Streptomyces tendae mutant in which the nikF gene is inactivated by insertion of a resistance gene is described below as an example. This nikF gene insertion mutant produces the nikkomycin derivatives according to the invention, nikkomycin L Z , nikkomycin L X , nikkomycin L J and nikkomycin L I.

Die Isolierung des DNA-Bereichs aus dem Nikkomycin-Gencluster, der das nikF Gen trägt, und alle weiteren genetischen Manipulationen erfolgen nach gängigen Methoden. Der DNA-Bereich, der als Insert kloniert in dem Plasmid pVM6 vorliegt und der das nikF- Gen trägt, ist in Fig. 2 dargestellt. The isolation of the DNA region from the Nikkomycin gene cluster, which carries the nikF gene, and all other genetic manipulations are carried out according to common methods. The DNA region which is present as an insert cloned in the plasmid pVM6 and which carries the nikF gene is shown in FIG. 2.

Für die Herstellung der nikF-Geninsertionsmutante wird ausgehend von dem Plasmid pVM6 das 2,9 kb große BamHI-Fragment, das das nikF Gen trägt, herausgeschnitten (mit dem Restriktionsenzym BamHI) und mit dem Plasmidvektor pUC18 verbunden. Das entstehende Plasmid wird als pVM63 bezeichnet. In die NcoI-Schnittstelle des Plasmids pVM63, die in dem nikF-Gen liegt, wird eine Kanamycin-Resistenzkassette (aphII Gen von Tn5) eingebaut. Anschließend wird das resultierende Konstrukt, der 4,1 kb große BamHI-BamHI- DNA-Bereich mit dem durch die aphII-Kassette unterbrochenen nikF- Gen herausgeschnitten (mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII, die in der Klonierungsstelle des Plasmids schneiden) und mit dem Plasmidvektor pWHM3, der sowohl in Escherichia coli als auch in Streptomyceten repliziert (Vara et al.: J. Bacteriol. 171, 5872-5881, 1989), verbunden. Das entstehende Plasmid wird als pNF1 bezeichnet (Fig. 4). Es trägt neben dem aphII-Gen, das Resistenz gegenüber Kanamycin verleiht, das Thiostrepton-Resistenzgen als Plasmid-Markergen, das Resistenz gegenüber Thiostrepton vermittelt.For the production of the nikF gene insertion mutant, starting from the plasmid pVM6, the 2.9 kb BamHI fragment carrying the nikF gene is cut out (with the restriction enzyme BamHI) and linked to the plasmid vector pUC18. The resulting plasmid is called pVM63. A kanamycin resistance cassette (aphII gene from Tn5) is inserted into the NcoI site of the plasmid pVM63, which lies in the nikF gene. The resulting construct, the 4.1 kb BamHI-BamHI-DNA region is then cut out with the nikF gene interrupted by the aphII cassette (with the restriction enzymes EcoRI and HindIII which cut in the cloning site of the plasmid) and with the Plasmid vector pWHM3, which replicates both in Escherichia coli and in Streptomycetes (Vara et al .: J. Bacteriol. 171, 5872-5881, 1989). The resulting plasmid is referred to as pNF1 ( Fig. 4). In addition to the aphII gene, which confers resistance to kanamycin, it carries the thiostrepton resistance gene as a plasmid marker gene, which confers resistance to thiostrepton.

Die Plasmid-DNA pNF1 wird aus Escherichia coli isoliert, in Streptomyces lividans TK23 transformiert, aus diesem Stamm isoliert und dann in Streptomyces tendae transformiert. Die Transformation von Streptomyces lividans und die Isolierung von DNA aus Streptomyceten erfolgen nach den für Streptomyceten gängigen Methoden (Hopwood et at.: Genetic manipulation of streptomycetes. A laboratory manual. The John Innes Foundation, Norwich, 1985). Die Methoden zur Herstellung von Protoplasten, zur Transformation von Streptomyces tendae und die zur Kultivierung von Streptomyces tendae verwendeten Medien sind die in 'Bormann et al.: Appl. Microbiol. Biotechnol. 32, 424-430, 1990' beschriebenen.The plasmid DNA pNF1 is isolated from Escherichia coli, in Streptomyces lividans TK23 transformed, isolated from this strain and then transformed into Streptomyces tendae. The transformation of Streptomyces lividans and the isolation of DNA from it Streptomycetes are carried out according to the usual methods for Streptomycetes (Hopwood et at .: Genetic manipulation of streptomycetes. A laboratory manual. The John Innes Foundation, Norwich, 1985). The methods for the production of protoplasts, for Transformation of Streptomyces tendae and for the cultivation of Streptomyces tendae are the media used in 'Bormann et al .: Appl. Microbiol. Biotechnol. 32, 424-430, 1990 '.

Um die aphII Resistenzgenkassette in das im Genom von Streptomyces tendae liegende nikF-Gen zu inserieren, wird Streptomyces tendae, der freies Plasmid pNF1 trägt, in flüssigem CRM-Medium, das 5 µg/ml Kanamycin enthält, 16 Stunden bei 37°C gezüchtet. Das Myzel wird dann mit Lysozym protoplastiert, und die Protoplasten werden auf Regenerationsmedium (R3)-Agarplatten ausgebracht und zu Kolonien ohne Antibiotika-Selektion 24 Stunden bei 30°C und dann 72 Stunden bei 37°C kultiviert. Die gewachsenen Kolonien werden mit einem Zahnstocher ahgeimpft und auf festem HA- Medium-Platten, die 10 µg/ml Kanamycin bzw. 30 µg/ml Thiostrepton enthalten, parallel ausgestrichen und 3 Tage bei 37°C bebrütet. Der Genotyp der Kanamycin-resistenten und Thiostrepton-sensitiven Mutanten kann durch Southernhybridisierung von genomischer DNA, die mit dem Restriktionsenzym PvuII verdaut wird, und dem 2,9 kb großen BamHI- DNA-Fragment, auf dem nikF liegt (Fig. 2 und 4), als Sonde überprüft werden. Bei korrekten nikF Geninsertionsmutanten hybridisieren 3,06 kb und 4,06 kb große PvuII- Fragmente. Dagegen hybridisieren beim Wildtyp mit derselben Sonde 6,2 kb große, genomische PvuII-Fragmente (Fig. 4).In order to insert the aphII resistance gene cassette into the nikF gene located in the genome of Streptomyces tendae, Streptomyces tendae, which carries free plasmid pNF1, is grown in liquid CRM medium which contains 5 μg / ml kanamycin for 16 hours at 37 ° C. The mycelium is then protoplastized with lysozyme and the protoplasts are placed on regeneration medium (R3) agar plates and cultured to colonies without antibiotic selection at 30 ° C. for 24 hours and then at 37 ° C. for 72 hours. The grown colonies are inoculated with a toothpick and spread in parallel on solid HA medium plates containing 10 µg / ml kanamycin or 30 µg / ml thiostrepton and incubated for 3 days at 37 ° C. The genotype of the kanamycin-resistant and thiostrepton-sensitive mutants can be determined by Southern hybridization of genomic DNA which is digested with the restriction enzyme PvuII and the 2.9 kb BamHI DNA fragment on which nikF is located (FIGS . 2 and 4) , to be checked as a probe. If the nikF gene insertion mutants are correct, 3.06 kb and 4.06 kb PvuII fragments hybridize. In contrast, 6.2 kb genomic PvuII fragments hybridize in the wild type with the same probe ( FIG. 4).

Die nikF Geninsertionsmutanten werden in Nikkomycin-Produktionsmedium (30 g/l Mannitol, 10 g/l lösliche Stärke, 20 g/l Sojamehl, vollfett, 10 g/l Hefeextrakt, Leitungswasser, eingestellt auf pH 6,0) schüttelnd bei 27°C ungefähr 7 Tage kultiviert. Die Mutanten produzieren die erfindungsgemäßen Nikkomycin-Derivate Nikkomycin Ls (ca. 120 mg/l), Nikkomycin LX (ca. 150 mg/l), Nikkomycin LJ und Nikkomycin LI. Diese Verbindungen eluieren flach Auftrennung des Kulturfiltrats mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie nach der Methode von Fiedler et al. (J. Chromatography 316, 487-494, 1984) modifiziert nach Schüz et al. (J. Antibiotics 45, 199-­ 206, 1992) bei Retentionszeiten von ca. 6,4 bis 6,8 Minuten (Nikkomycin LZ), ca. 6,7 bis 7,1 Minuten (Nikkomycin LX), ca. 8, 9 bis 9,2 Minuten (Nikkomycin LJ) und 9,0 bis 9,5 Minuten (Nikkomycin LI). Nikkomycine I, J, Z und X werden nicht von den nikF- Geninsertionsmutanten gebildet (Fig. 5).The nikF gene insertion mutants are shaken in Nikkomycin production medium (30 g / l mannitol, 10 g / l soluble starch, 20 g / l soy flour, full fat, 10 g / l yeast extract, tap water, adjusted to pH 6.0) at 27 ° C cultivated for about 7 days. The mutants produce the Nikkomycin derivatives according to the invention Nikkomycin Ls (approx. 120 mg / l), Nikkomycin L X (approx. 150 mg / l), Nikkomycin L J and Nikkomycin L I. These compounds elute flat separation of the culture filtrate by means of high pressure liquid chromatography according to the method of Fiedler et al. (J. Chromatography 316, 487-494, 1984) modified according to Schüz et al. (J. Antibiotics 45, 199-206, 1992) with retention times of approximately 6.4 to 6.8 minutes (Nikkomycin L Z ), approximately 6.7 to 7.1 minutes (Nikkomycin L X ), approximately 8 , 9 to 9.2 minutes (Nikkomycin L J ) and 9.0 to 9.5 minutes (Nikkomycin L I ). Nikkomycins I, J, Z and X are not produced by the nikF gene insertion mutants ( Fig. 5).

Die Isolierung der erfindungsgemäßen Nikkomycin-Derivate Nikkomycin LZ, Nikkomycin LX, Nikkomycin LJ und Nikkomycin LI aus dem Kulturfiltrat einer oben beschriebenen Kultur einer nikF-Geninsertionsmutante erfolgt durch die nachfolgend beschriebenen Schritte und ist als Reinigungsschema in Fig. 6 dargestellt:The isolation of the nikkomycin derivatives nikkomycin L Z , nikkomycin L X , nikkomycin L J and nikkomycin L I from the culture filtrate of a culture of a nikF gene insertion mutant described above is carried out by the steps described below and is shown as a purification scheme in FIG. 6:

Die Kultur wird mit Eisessig auf 1% Essigsäure eingestellt, wobei ca. pH 3,8-4, 5 erreicht wird. Das Myzel und andere Festbestandteile des Nährmediums werden durch Zentrifugation oder Filtration der Kultur entfernt. Das klare Kulturfiltrat wird dann auf eine Säule mit dem Kationenaustauscher Dowex 50 WX 2 (H⁺) (Serva) gegeben. Die erfindungsgemäßen Nikkomycin-Derivate Nikkomycin LZ, Nikkomycin LX, Nikkomycin LJ und Nikkomycin LI binden an den Ionenaustauscher und werden in einer Frontelution mit 50 mM Ammoniak eluiert. Die pH-Werte der substanzhaltigen Fraktionen liegen bei ca. pH 8-10. Der Ammoniak wird aus den substanzhaltigen Fraktionen entfernt. Diese Fraktionen werden vereinigt und an dem Anionenaustauscher Lewatit MP64 Z II (Acetat⁻) (Bayer AG) chromatographiert. Die Nikkomycine LZ und LJ binden nicht an das Säulenmaterial. Sie befinden sich im Durchlauf und werden getrennt aufgearbeitet. Die Nikkomycine LX und LI binden an das Säulenmaterial.The culture is adjusted to 1% acetic acid with glacial acetic acid, pH approx. 3.8-4.5 being reached. The mycelium and other solid components of the nutrient medium are removed by centrifugation or filtration of the culture. The clear culture filtrate is then placed on a column with the cation exchanger Dowex 50 WX 2 (H⁺) (Serva). The Nikkomycin derivatives according to the invention Nikkomycin L Z , Nikkomycin L X , Nikkomycin L J and Nikkomycin L I bind to the ion exchanger and are eluted in a front elution with 50 mM ammonia. The pH values of the substance-containing fractions are around pH 8-10. The ammonia is removed from the substance-containing fractions. These fractions are combined and chromatographed on the anion exchanger Lewatit MP64 Z II (acetate⁻) (Bayer AG). The Nikkomycins L Z and L J do not bind to the column material. They are in the process and are processed separately. The Nikkomycins L X and L I bind to the column material.

Nach dem Probenauftrag wird die Säule mit Wasser gewaschen, bis keine bei 280 nm absorbierenden Substanzen mehr eluiert werden. Anschließend werden die Nikkomycine LX und LI mit 75 mM Ameisensäure eluiert. Die substanzhaltigen Fraktionen, deren pH- Werte zwischen pH 3,0-3,5 liegen, werden gesammelt, eingeengt und lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in Wasser gelöst und auf einer Biogel P-2 (Biorad)-Säule mit Wasser chromatographiert. Die Fraktionen, die die erfindungsgemäßen Nikkomycin-Derivate Nikkomycin LX und Nikkomycin LI enthalten, werden lyophilisiert. Die substanzhaltigen Fraktionen werden über präparative Hochdruckflüssigkeitschromatographie (Nukleosil C18, 10 µm; 250 mm × 8 mm) mit einem Gradienten aus Wasser und Methanol (0 Minuten bis 2 Minuten: Wasser, 2 Minuten bis 12 Minuten: 0% bis 40% Methanol) bei einer Fließrate von 6 ml/min aufgetrennt. Die erhaltenen Nikkomycin-Präparate sind über 90% substanzhaltig. Aus 1 Liter Kulturfiltrat werden ca. 15 mg Nikkomycin LX und 1 mg Nikkomycin LI isoliert.After the sample application, the column is washed with water until no more substances that absorb at 280 nm are eluted. The Nikkomycins L X and L I are then eluted with 75 mM formic acid. The substance-containing fractions, whose pH values are between pH 3.0-3.5, are collected, concentrated and lyophilized. The lyophilisate is dissolved in water and chromatographed on a Biogel P-2 (Biorad) column with water. The fractions containing the Nikkomycin derivatives Nikkomycin L X and Nikkomycin L I according to the invention are lyophilized. The substance-containing fractions are added using preparative high pressure liquid chromatography (Nucleosil C18, 10 µm; 250 mm × 8 mm) with a gradient of water and methanol (0 minutes to 2 minutes: water, 2 minutes to 12 minutes: 0% to 40% methanol) at a flow rate of 6 ml / min. The Nikkomycin preparations obtained contain over 90% substance. About 15 mg of Nikkomycin L X and 1 mg of Nikkomycin L I are isolated from 1 liter of culture filtrate.

Der Durchlauf von der Lewatit (Acetat-)-Chromatographie, der die Nikkomycin-Derivate Nikkomycin LZ und Nikkomycin LJ, enthält, wird an Lewatit HP64 ZII (OH-) chromatographiert. Die Nikkomycine LZ und LJ werden mit 0,5 M Ameisensäure eluiert. Die substanzhaltigen Fraktionen weisen einen pH von 2-4 auf. Sie werden eingeengt, lyophilisiert und auf einer Biogel P-2 (Biorad)-Säule mit Wasser chromatographiert. Die Fraktionen, die die erfindungsgemäßen Nikkomycin-Derivate Nikkomycin LZ und Nikkomycin LJ enthalten, werden lyophilisiert. Die substanzhaltigen Fraktionen werden über präparative Hochdruckflüssigkeitschromatographie (Nukleosil C18, 10 µm; 250 mm × 8 mm) mit einem Gradienten aus Wasser und Methanol (0 Minuten bis 2 Minuten: Wasser, 2 Minuten bis 12 Minuten: 0% bis 40% Methanol) bei einer Fließrate von 6 ml/min aufgetrennt. Die erhaltenen Nikkomycin-Präparate sind über 90% substanzhaltig. Aus 1 Liter Kulturfiltrat werden ca. 10 mg Nikkomycin LZ und 0,7 mg Nikkomycin LJ isoliert.The passage of the Lewatit (acetate -) chromatography containing the nikkomicin derivatives nikkomycin Z and nikkomycin L L J, is where Lewatit HP64 ZII - chromatographed (OH). The Nikkomycins L Z and L J are eluted with 0.5 M formic acid. The substance-containing fractions have a pH of 2-4. They are concentrated, lyophilized and chromatographed on a Biogel P-2 (Biorad) column with water. The fractions which contain the nikkomycin derivatives nikkomycin L Z and nikkomycin L J according to the invention are lyophilized. The substance-containing fractions are added using preparative high pressure liquid chromatography (Nucleosil C18, 10 µm; 250 mm × 8 mm) with a gradient of water and methanol (0 minutes to 2 minutes: water, 2 minutes to 12 minutes: 0% to 40% methanol) at a flow rate of 6 ml / min. The Nikkomycin preparations obtained contain over 90% substance. Approx. 10 mg of Nikkomycin L Z and 0.7 mg of Nikkomycin L J are isolated from 1 liter of culture filtrate.

Die erfindungsgemäßen Nikkomycin-Derivate sind neu. Sie werden durch folgende Angaben charakterisiert:
The Nikkomycin derivatives according to the invention are new. They are characterized by the following information:

  • A) Nikkomycin LX
    • a) Die über Ionspray-Massenspektrometrie bestimmte Masse für das erfindungsgemäße Nikkomycin LX beträgt 479. Das über IonSpray-Massenspektrometrie erhaltene Massenspektrum ist in Fig. 7 gezeigt, wobei die Masse wegen Protonierung im Vergleich zur tatsächlichen Masse um 1 erhöht ist. Diese experimentell bestimmte Masse stimmt mit der berechneten Masse für die in Fig. 1 dargestellte Verbindung überein.
    • b) Das UV-Spektrum (Fig. 8) zeigt ein Absorptionsmaximum bei 290 nm, das charakteristisch ist für den Nukleosidbaustein der Nikkomycine, Nikkomycin CX, der 4- Formyl-4-imidazolin-2-on als N-glykosidisch gebundene Base trägt (Fiedler et al.: J. Chromatography 316, 487-494, 1984).
    • c) Die erfindungsgemäße Substanz Nikkomycin LX reagiert mit Barbitursäure unter Bildung eines roten Farbstoffs, der bei Auftrennung über Hochdruckflüssigschromatographie nach der oben erwähnten Methode von Eiedler et al. (1984) ein verändertes Laufverhalten zeigt (Fig. 9). Die Substanz zeigt somit ein Verhalten, das für Nikkomycine mit 4-Formyl-4-imidazolin-2-on als Base beschrieben ist (Delzer et al.: 37, 80-82, 1984).
    A) Nikkomycin L X
    • a) The mass determined for the nikkomycin L X according to the invention by ion spray mass spectrometry is 479. The mass spectrum obtained by ion spray mass spectrometry is shown in FIG. 7, the mass being increased by 1 compared to the actual mass due to protonation. This experimentally determined mass agrees with the calculated mass for the compound shown in FIG. 1.
    • b) The UV spectrum ( FIG. 8) shows an absorption maximum at 290 nm, which is characteristic of the nucleoside component of the Nikkomycine, Nikkomycin C X , which carries 4-formyl-4-imidazolin-2-one as the N-glycosidically bound base (Fiedler et al .: J. Chromatography 316, 487-494, 1984).
    • c) The substance nikkomycin L X according to the invention reacts with barbituric acid to form a red dye which, when separated by high pressure liquid chromatography, according to the above-mentioned method by Eiedler et al. (1984) shows a changed running behavior ( Fig. 9). The substance thus exhibits a behavior which has been described for nikkomycins with 4-formyl-4-imidazolin-2-one as the base (Delzer et al .: 37, 80-82, 1984).
  • B) Nikkomycin LZ
    • a) Das UV-Spektrum (Fig. 10) zeigt ein Absorptionsmaximum bei 260 nm, das charakteristisch ist für den Nukleosidbaustein der Nikkomycine, Nikkomycin Cz, der Uracil als N-glykosidisch gebundene Base trägt (Fiedler et al.: J. Chromatography 316, 487-494, 1984).
    • b) Nikkomycin LZ reagiert nicht mit Barbitursäure. Dieser Befund und das Absorptionsmaximum von 260 nm deuten darauf, daß die Substanz Nikkomycin LZ Uracil als Base enthält.
    B) Nikkomycin L Z
    • a) The UV spectrum ( FIG. 10) shows an absorption maximum at 260 nm, which is characteristic of the nucleoside component of the Nikkomycins, Nikkomycin Cz, which carries uracil as an N-glycosidically bound base (Fiedler et al .: J. Chromatography 316, 487-494, 1984).
    • b) Nikkomycin L Z does not react with barbituric acid. This finding and the absorption maximum of 260 nm indicate that the substance contains Nikkomycin L Z uracil as the base.
  • C) III und IV) Nikkomycin LI und Nikkomycin LJ sind homologe Verbindungen zu Nikkomycin LX und Nikkomycin LZ, die am C6'-Atom der Aminohexuronsäure einen Glutaminsäurerest gebunden haben. Sie werden anhand ihrer UV-Absorptionsmaxima, ihres Verhaltens gegenüber Barbitursäure und anhand der Retentionszeiten bei der Hochdruckflüssigkeitschromatographie charakterisiert.C) III and IV) Nikkomycin L I and Nikkomycin L J are homologous compounds to Nikkomycin L X and Nikkomycin L Z , which have a glutamic acid residue attached to the C6 'atom of aminohexuronic acid. They are characterized on the basis of their UV absorption maxima, their behavior towards barbituric acid and on the basis of the retention times in high pressure liquid chromatography.

Der Vorteil der erfindungsgemäßen Substanzen gegenüber den bekannten Nikkomycinen ist deren wesentlich höhere Stabilität im neutralen und alkalischen pH-Bereich. In Fig. 11 ist die pH-Stabilität von Nikkomycin LX dargestellt.The advantage of the substances according to the invention over the known nikomycins is their substantially higher stability in the neutral and alkaline pH range. The pH stability of Nikkomycin L X is shown in FIG .

Eigenschaften der neuen Nikkomycin-DerivateProperties of the new Nikkomycin derivatives

Die Verbindungen sind antifungisch aktiv und bei der Bekämpfung von Pilzen einsetzbar. Die antifungische Aktivität von Nikkomycin LX und Nikkomycin LZ ist vergleichbar mit der der bekannten Nikkomycine Nikkomycin Z und X, die die biologisch aktivsten Nikkomycine mikrobiellen Ursprungs sind. In Tabelle 1 sind die antifungischen Aktivitäten der Nikkomycine LX und X gegenüber dem Ascomyceten Paecilomyces variotii Tü 137 und der Hefe Candida albicans Tü 164 dargestellt. Die Verbindungen wurden im Plattendiffusionstest unter Verwendung von Testplatten untersucht, die jeweils 105 Sporen/ml (Paecilomyces variotii) beziehungsweise 105 Zellen/ml (Candida albicans) in HA-Agar (4 g/l Glucose, 10 g/l Malzextrakt, 4 g/l Hefeextrakt, 18 g/l Agar, pH 6,0) enthielten. Die Substanzen wurden in Wasser gelöst auf Filterrondellen von 9 mm appliziert und auf die Testplatten gelegt. Der Hemmhofdurchmesser wurde nach 15- stündiger Inkubation der Testplatten bei 37°C (Paecilomyces variotii) beziehungsweise 27°C (Candida albicans) bestimmt.The compounds are antifungically active and can be used to combat fungi. The antifungal activity of Nikkomycin L X and Nikkomycin L Z is comparable to that of the well-known Nikkomycine Nikkomycin Z and X, which are the most biologically active Nikkomycins of microbial origin. Table 1 shows the antifungal activities of the Nikkomycins L X and X against the Ascomycetes Paecilomyces variotii Tü 137 and the yeast Candida albicans Tü 164. The compounds were examined in the plate diffusion test using test plates, each of 105 spores / ml (Paecilomyces variotii) and 105 cells / ml (Candida albicans) in HA agar (4 g / l glucose, 10 g / l malt extract, 4 g / 1 yeast extract, 18 g / l agar, pH 6.0). The substances were dissolved in water, applied to filter discs of 9 mm and placed on the test plates. The zone of inhibition was determined after incubation of the test plates at 37 ° C. (Paecilomyces variotii) or 27 ° C. (Candida albicans) for 15 hours.

Bekannt sind die Wirksamkeit von Nikkomycin X und Z bei Coccidiodomycose, Histoplasmose und Blastomycose (Hector et al.: Antimicrob. Agents Chemother. 34, 587-­ 596, 1990), die synergistische Wirkung der Nikkomycine X und Z mit Papulacandin B auf Candida albicans (Hector and Braun: Antimicrob. Agents Chemother. 29, 389-394, 1986), die positive Interaktion von Nikkomycinen und Azolen gegen Candida albicans in vitro und in vivo (Hector und Schauer: Antimicrob. Agents Chemother. 36, 1284-1289, 1992) und die Wirksamkeit von Nikkomycin Z als Pflanzenschutzmittel gegen Insekten und Milben (Zoeblein et al.: Pflanzenschutz Nachrichten Bayer 38, 2 u. 3, 1985). Die erfindungsgemäßen Nikkomycine können gegen pilzliche Infektionen beim Menschen, wie beispielsweise Candida albicans, und bei Tieren angewandt werden. Bevorzugt ist eine Anwendung als Kombinationspräparat mit Glucansynthetase- Inhibitoren oder Azolen. Ein weiteres Anwendungsgebiet ist der Einsatz der neuen Verbindungen im Pflanzenschutz bei der Bekämpfung von Pilzen und Milben. Da Nikkomycine die Chitin-Synthese blockieren, eignen sich sich weiterhin sehr gut zur Bekämpfung von Insekten.The effectiveness of Nikkomycin X and Z in coccidiodomycosis is known, Histoplasmosis and blastomycosis (Hector et al .: Antimicrob. Agents Chemother. 34, 587- 596, 1990), the synergistic effect of Nikkomycine X and Z with Papulacandin B. Candida albicans (Hector and Braun: Antimicrob. Agents Chemother. 29, 389-394, 1986), the positive interaction of nikkomycins and azoles against Candida albicans in vitro and in vivo (Hector and Schauer: Antimicrob. Agents Chemother. 36, 1284-1289, 1992) and the effectiveness of Nikkomycin Z as a plant protection product against insects and Mites (Zoeblein et al .: crop protection news Bayer 38, 2 and 3, 1985). The Nikkomycins invention can against fungal infections in Humans, such as Candida albicans, and in animals. Use as a combination preparation with glucan synthetase is preferred. Inhibitors or azoles. Another area of application is the use of the new Compounds in crop protection in the control of fungi and mites. There Nikkomycins that block chitin synthesis are still very suitable for Control of insects.

Die neuartigen Nikkomycine können als Ausgangssubstanzen für chemische Modifikationen dienen, um Derivate mit veränderten Eigenschaften zu erhalten.The novel Nikkomycins can be used as starting substances for chemical Modifications are used to obtain derivatives with modified properties.

Die folgende Tabelle stellt die antifungische Aktivität der Nikkomycine LX und X gegen Paecilomyces variotii und Candida albicans Tü164 dar. Die antifungische Aktivität wurde im Plattendiffusionstest untersucht. Angegeben sind die Durchmesser der Wachstumshemmhöfe der Testorganismen, die durch die auf Filterrondellen (5 mm Durchmesser) applizierten Verbindungen (0,5 µg/l) hervorgerufen werden.
The following table shows the antifungal activity of the Nikkomycins L X and X against Paecilomyces variotii and Candida albicans Tü164. The antifungal activity was examined in the plate diffusion test. The diameters of the growth inhibition zones of the test organisms are given, which are caused by the compounds (0.5 µg / l) applied to filter roundels (5 mm diameter).

Die Erfindung wird durch die Fig. 1 bis 11 näher erläutert. Es zeigen:The invention is explained in more detail by FIGS. 1 to 11. Show it:

Fig. 1: Chemische Strukturen der erfindungsgemäßen Nikkomycin-Derivate Nikkomycin LZ, Nikkomycin LX, Nikkomycin LJ und Nikkomycin LI. Fig. 1: Chemical structures of the derivatives of the invention nikkomycin nikkomycin Z L, nikkomycin L X, L nikkomicin J and of nikkomicin I L.

Fig. 2: Der 6230 bp-große DNA-Bereich aus dem Nikkomycin-Gencluster aus Streptomyces tendae, der in dem Plasmid pVM6 als Insert vorliegt (Möhrle et al.: Mol. Microbiol. 15, 561-571, 1995) und der das Nikkomycingen nikF trägt. Die Inaktivierung des nikF-Gens führt zu einer Mutante, die die erfindungsgemäßen Nikkomycin-Derivate Nikkomycin LZ, Nikkomycin LX, Nikkomycin LJ und Nikkomycin LI produziert.
Die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme BamHI (B), PvuII (Pv) und NcoI (N) sind angegeben. Darunter sind die auf dem DNA-Bereich liegenden Nikkomycin-Biosynthesegene als Pfeile gezeigt. Die Gene nikD, nikE, nikF, nikG, nikl liegen vollständig auf dem DNA-Bereich, die Gene nikC und nikJ sind nicht vollständig darauf enthalten. Fig. 2: The 6230 bp DNA region from the Nikkomycin gene cluster from Streptomyces tendae, which is present in the plasmid pVM6 as an insert (Möhrle et al .: Mol. Microbiol. 15, 561-571, 1995) and that Nikkomycingen nikF wears. The inactivation of the nikF gene leads to a mutant which produces the nikkomycin derivatives according to the invention, nikkomycin L Z , nikkomycin L X , nikkomycin L J and nikkomycin L I.
The interfaces for the restriction enzymes BamHI (B), PvuII (Pv) and NcoI (N) are given. Below, the Nikkomycin biosynthesis genes lying on the DNA area are shown as arrows. The genes nikD, nikE, nikF, nikG, nikl lie completely on the DNA area, the genes nikC and nikJ are not completely contained on it.

Fig. 3: DNA-Sequenz 2919 bp großen BamHI-BamHI- DNA-Bereichs (pNF1, Fig. 4), auf dem der 3'-Bereich des Nikkomycingens nikE, das komplette Nikkomycin- Biosynthesegen nikF und der 5'-Bereich des Nikkomycingens nikG liegen. Die von der DNA-Sequenz abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen für die nikE und nikG-Genprodukte (inkomplett) und für das komplette nikF-Genprodukt sind unter der DNA-Sequenz angegeben. Die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme BamHI und NcoI sind überstrichen und bezeichnet. Fig. 3: DNA sequence 2919 bp BamHI-BamHI DNA region (pNF1, Fig. 4), on which the 3 'region of the Nikkomycingens nikE, the complete Nikkomycin biosynthetic gene nikF and the 5' region of the Nikkomycingens not lie. The amino acid sequences derived from the DNA sequence for the nikE and nikG gene products (incomplete) and for the complete nikF gene product are given under the DNA sequence. The interfaces for the restriction enzymes BamHI and NcoI are overwritten and labeled.

Fig. 4: Strategie zur Herstellung einer nikF-Geninsertionsmutante. pNF1 zeigt den DNA-Bereich mit dem durch die aph-Kassette unterbrochenen nikF Gen, das mit dem Streptomyceten-Escherichia coli-Plasmid pWHM3 verbunden ist. Darunter ist das 6230 bp große PvuII-Fragment des S. tendae Genoms gezeigt, das das nikF-Gen trägt. Ein Doppelerossover zwischen den homologen DNA-Bereichen des Genoms eines S. tendae Nikkomycin- Produzenten und des Plasmids pNF1 (als fette Balken gezeichnet) führt zu einer Insertion des aph-Gens in das genomische nikF-Gen. Der Genotyp der resultierenden Geninsertionsmutante kann durch Southernhybridisierung mit dem 2,9 kb BamHI-Fragment als Sonde überprüft werden. Nach Restriktion von genomischer DNA mit PvuII hybridisieren bei der nikF-Geninsertionsmutante 3,06 kb und 4,06 kb große PvuII-Fragmente, im Ausgangsstamm von S. tendae 6,2 kb große PvuII-Fragmente. Die Abkürzungen für verwendete Restriktionsenzyme sind angegeben. Fig. 4: Strategy for producing a nikF gene insertion mutant. pNF1 shows the DNA region with the nikF gene interrupted by the aph cassette, which is connected to the Streptomycetes-Escherichia coli plasmid pWHM3. Below this is shown the 6230 bp PvuII fragment of the S. tendae genome that carries the nikF gene. A double erosion between the homologous DNA regions of the genome of a S. tendae nikkomycin producer and the plasmid pNF1 (shown as a bold bar) leads to an insertion of the aph gene into the genomic nikF gene. The genotype of the resulting gene insertion mutant can be checked by Southern hybridization with the 2.9 kb BamHI fragment as a probe. After restriction of genomic DNA with PvuII, 3.06 kb and 4.06 kb PvuII fragments hybridize in the nikF gene insertion mutant and 6.2 kb PvuII fragments in the parent strain of S. tendae. The abbreviations for restriction enzymes used are given.

Fig. 5: Hochdruckflüssigkeitschromatogramm des Kulturfiltrats einer nikF- Geninsertionsmutante von S. tendae (A) und des Nikkomycin produzierenden S. tendae-Ausgangsstammes (B). Die Kulturen wurden in Nikkomycin- Produktionsmedium 7 Tage bei 27°C kultiviert. Die bei der Hochdruckflüssigkeitschromatographie eluierenden Substanzen werden durch Absorptionsmessung bei 280 nm (angegeben als mAU) detektiert. Die mit Pfeilen gezeichneten und bezeichneten Substanzen in A sind die erfindungsgemäßen Nikkomycin-Derivate Nikkomycin LZ, Nikkomycin LX, Nikkomycin LJ und Nikkomycin LI. In B sind die Nikkomycine CZ, CX, D, Z, X, J und I gezeigt. Fig. 5: High pressure liquid chromatogram of the culture filtrate of a nikF gene insertion mutant of S. tendae (A) and the nikkomycin-producing S. tendae starting strain (B). The cultures were cultivated in Nikkomycin production medium at 27 ° C for 7 days. The substances eluting in high pressure liquid chromatography are detected by absorption measurement at 280 nm (indicated as mAU). The substances in A drawn and labeled with arrows are the nikkomycin derivatives according to the invention, nikkomycin L Z , nikkomycin L X , nikkomycin L J and nikkomycin L I. In B the Nikkomycins C Z , C X , D, Z, X, J and I are shown.

Fig. 6: Aufreinigungsschema für die Nikkomycine LX, LZ, LI und LJ aus dem Kulturfiltrat einer nikF Geninsertionsmutante. Fig. 6: Purification scheme for the Nikkomycins L X , L Z , L I and L J from the culture filtrate of a nikF gene insertion mutant.

Fig. 7: IonSpray-Massenspektrum von Nikkomycin LX. Fig. 7: Ion spray mass spectrum of Nikkomycin L X.

Fig. 8: UV-Absorptionsspektrum der erfindungsgemäßen Substanz Nikkomycin LX. FIG. 8 shows UV absorption spectrum of the substance nikkomycin X L according to the invention.

Fig. 9: Hochdruckflüssigkeitschromatogramme des erfindungsgemäßen Nikkomycin- Derivats Nikkomycin LX (A) und nach Reaktion von Nikkomycin LX mit 1 mg/ml Barbitursäure (B). Nikkomycin LX ist mit Pfeil gezeichnet. Fig. 9: High pressure liquid chromatograms of the Nikkomycin derivative according to the invention Nikkomycin L X (A) and after reaction of Nikkomycin L X with 1 mg / ml barbituric acid (B). Nikkomycin L X is drawn with an arrow.

Fig. 10: UV-Absorptionsspektrum der erfindungsgemäßen Substanz Nikkomycin LZ. Fig. 10: UV-absorption spectrum of the substance nikkomycin Z L according to the invention.

Fig. 11: pH-Stabilität von Nikkomycin LX. Nikkomycin LX (0,5 mg/ml) in 0,05 M MES, pH 5, 5 (A), in 0,05 M TES, pH 7,0 (B) und 0,05 M Tricin, pH 8,0 (C) bei 20°C. Die Proben sind über Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert. Fig. 11: pH stability of Nikkomycin L X. Nikkomycin L X (0.5 mg / ml) in 0.05 M MES, pH 5, 5 (A), in 0.05 M TES, pH 7.0 (B) and 0.05 M tricine, pH 8, 0 (C) at 20 ° C. The samples are analyzed by high pressure liquid chromatography.

Claims (10)

1. Nikkomycinderivate der allgemeinen Formel
wobei R1
und R2 -OH oder
ist.1. Nikkomycin derivatives of the general formula
where R1
and R2 -OH or
is. 2. Verfahren zur Herstellung von Nikkomycinderivaten, dadurch gekennzeichnet, daß einzelne für die Nikkomycin-Synthese kodierende Gene inaktiviert werden und entsprechend behandelte Mikroorganismen diese Nikkomycinderivate produzieren.2. Process for the preparation of Nikkomycin derivatives, characterized, that individual genes coding for the Nikkomycin synthesis are inactivated and appropriately treated microorganisms produce these nikkomycin derivatives. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das nikF-Gen von Nikkomycin produzierenden Organismen inaktiviert wird, diese Organismen in einer Nährlösung kultiviert werden und die gewünschten Nikkomycine aus der Nährlösung isoliert werden. 3. The method according to claim 2, characterized, that the nikF gene is inactivated by nikkomycin-producing organisms, these organisms are cultivated in a nutrient solution and the desired Nikkomycins are isolated from the nutrient solution.   4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das nikF-Gen von Nikkomycin produzierenden Organismen durch Insertion eines Resistenzgenes inaktiviert wird.4. The method according to claim 3, characterized, that the nikF gene from nikkomycin producing organisms by insertion of a Resistance genes is inactivated. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Nikkomycin produzierende Organismus Streptomyces tendae Tü901 ist.5. The method according to any one of claims 2 to 4, characterized, that the nikkomycin producing organism is Streptomyces tendae Tü901. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Nikkomycin produzierende Organismus ein für eine Cytochrom P 450 Monooxygenase kodierendes Gen oder Abschnitte daraus enthält.6. The method according to any one of claims 2 to 5, characterized, that the nikkomycin-producing organism is one for a cytochrome P 450 Contains gene encoding monooxygenase or portions thereof. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Nikkomycin produzierende Organismus die Gensequenz aus Fig. 3 oder eine homologe Sequenz oder Abschnitte daraus enthält.7. The method according to any one of claims 2 to 5, characterized in that the nikkomycin-producing organism contains the gene sequence from Fig. 3 or a homologous sequence or sections thereof. 8. Verwendung von Nikkomycinen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Bekämpfung von pilzlichen Infektionen bei Menschen, Tieren oder Pflanzen.8. Use of Nikkomycinen according to one of claims 1 to 7 for combating of fungal infections in humans, animals or plants. 9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nikkomycine kombiniert werden mit Glucansynthetase-Inhibitoren oder Azolen.9. Use according to claim 8, characterized, that the Nikkomycins are combined with glucan synthetase inhibitors or azoles. 10. Verwendung von Nikkomycinen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Bekämpfung von Insekten und Milben.10. Use of Nikkomycinen according to one of claims 1 to 7 for combating of insects and mites.
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