DE19818999A1 - Vorrichtung zur Erzeugung von frei definierbaren Repertoires - Google Patents

Vorrichtung zur Erzeugung von frei definierbaren Repertoires

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur effektiven Erzeugung von frei definierbaren Repertoires/Bibliotheken mit großen Anzahlen von Ligand- und Akzeptorstrukturen zur kombinatorischen Synthese und zur ultraschnellen Testdurchführung vorzugsweise in der biologischen, biochemischen, pharmazeutischen, medizinischen und chemischen Wirkstofforschung.

Description

Kombinatorische Synthese und ultraschnelle Testdurchführung (High Throughput Scree­ ning, HTS) sind Fachbegriffe für die systematische empirische Suche nach spezifischen molekularen Interaktionen zwischen biologischen Akzeptormolekülen (Rezeptoren Antikörper, Enzyme, Transkriptionsfaktoren etc.) und ihren Liganden geworden.
Es wird auf einschlägige Übersichtsartikel verwiesen:
Pavia M. R., Sawyer T. K., Moos W. H. The generation of molecular diversity. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1993, 3: 387 ff.
Gallop M. A., Barrett R. W., Dower W. J., Fodor S. P. A., Gordon E. M. Applications of combinatori­ al technologies to drug discovery. 1. Background and peptide combinatorial libraries. J. Med. Chem. 1994; 37: 1233-1251.
Gallop M. A., Barrett R. W., Dower W. J., Fodor S. P. A., Gordon E. M. Applications of combinatori­ al technologies to drug discovery. 2. Combinatorial organic synthesis, library screening strategies, and future directions. J. Med. Chem. 1994; 37: 1385-1401.
Combinatorial Peptide and Nonpeptide Liraries - A Handbook (Jung G., ed.) Weinheim: VCH 1996.
Anwendungen finden die hierfür entwickelten Methoden und Geräte in der biologischen Grundlagenforschung und insbesondere in der medizinischen Wirkstoffentwicklung. Große Anzahlen von verschiedenen Ligand- oder Akzeptorstrukturen werden in diesem Zusammenhang als Repertoires oder Bibliotheken bezeichnet. Für das HTS sind regel­ mäßige ebene Anordnungen (Arrays) solcher Bibliotheken mit separaten Orten für die Einzelkomponenten oder für definierte Mischungen besonders vorteilhaft, weil die Identi­ täten der Einzelstrukturen durch deren Positionen im Array definiert sind und die Inter­ aktionstests mit schnellen Pipettierrobotoren durchgeführt werden können. Solche Arrays können zum Beispiel durch Verteilung der Lösungen vorgefertigter Strukturen oder durch serielle Verteilung der Lösungen von Bausteinen für deren in situ Synthese erzeugt werden. Da die Effizienz des HTS proportional mit der Anzahl an simultan testbaren Strukturen steigt, werden Verfahren zur schnelleren Herstellung und Testung solcher Arrays in möglichst miniaturisierter Form benötigt.
Bekannt und beschrieben sind Geräte und/oder Verfahren zur Herstellung solcher Bibli­ otheken, bei denen deren Elemente entweder in vorgegebenen Arrays aus Reaktions­ gefäßen (Mikrotiterplatten, Nanotiterplatten und ähnliche rechteckige Anordnungen) erzeugt werden oder in Spots (Tüpfel, Punkte) in frei formatierbaren Arrays auf der speziell aktivierten Oberfläche eines geeigneten Trägermaterials (Papier, Glas, Quarz­ glas, Kunststoffolie, Keramik, Folie etc.pp.) synthetisiert werden.
Dabei werden die Elemente der Bibliotheken durch eine definierte chemische Verkettung einer bestimmten Anzahl von Reaktionspartnern, die in definierter Reihenfolge aus einem vorgegebenen Pool von Substanzen ausgewählt werden, erzeugt.
In allen bekannten Verfahren werden die Reaktionspartner seriell geladen und die Re­ aktionsgefäße nacheinander in einem Start-Stop-Betrieb angefahren. Erforderliche Zwischenschritte wie Reaktionsstop, Auswaschen überschüssiger Reagenzien etc.pp. werden gesondert, teilweise auch außerhalb der Apparaturen durchgeführt.
Der dadurch erforderliche große Zeitaufwand und die Größe und Struktur der Biblio­ theksträger bedingen eine begrenzte Anzahl von Elementen in den so erzeugten Reper­ toires und stehen einer Erhöhung der Effizienz von deren Anwendung entgegen.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun eine Geräteanordnung, mit der die Geschwindig­ keit der Verteilungsvorgänge und die Anzahl der Bibliothekselemente wesentlich erhöht werden kann.
Stand der Technik ist die Verwendung von Pipettierstationen, die mit x-y- oder r-∅-Bewe­ gungen der Dosierköpfe oder der Array-Unterlage (Substrat) seriell die vorgegebe­ nen Positionen der Anordnungen bedienen. Die Präzision und Geschwindigkeit ist hier limitiert durch die Masse der Geräteteile die bewegt und abgebremst werden muß. Ein bekanntes Gerät ist der Auto-SPOT-Robot ASP222 der Firma AIBIMED Analysen Tech­ nik, Langenfeld. Hinweise auf Anordnungen und Vorrichtungen solcher Art finden sich auch in den Patent- bzw. Offenlegungsvorschriften EP 0 445 915 A1 und DE 40 27 675 A1.
Erfindungsgemäß wird hierfür alternativ eine kontinuierliche, haltfreie Bewegung von Substrat (und Dosierkopf) vorgeschlagen. Die Dosiervorgänge werden dann zeitlich so auf die Rotationsbewegung abgestimmt, daß auf jede Position im Array die richtige Komponente dosiert wird. Jede Einzelstruktur im Array wird schrittweise durch die che­ mische Verankerung von ein bis einhundert, vorzugsweise bis 20, Bausteinen auf einem ebenen unstrukturierten Substrat hergestellt. Hierfür werden konventionelle Methoden der Festphasenimmobilisierung und -synthese eingesetzt, z. B.
Solid-phase Peptide Synthesis - R. B. Merrifield (1969) Adv. Enzymol 32 221-296.
Spot-Synthesis: An easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support - Frank, R. (1992) Tetrahedron, 48 9217-9232.
Beispielhaft werden Peptide aus Aminosäurebausteinen, Oligonucleotide aus Nucledtid­ bausteinen, Peptoide aus N-substituierten Glycinbausteinen, PNA aus N-Aminoethyl,N-(pu­ rin/pyrimidin)acetyl-Glycinbausteinen, Oligosaccharide aus Zuckerbausteinen etc. aufgebaut. Gleiches gilt jedoch für jede andere chemische Verbindung, die durch eine Abfolge von chemischen Syntheseschritten mit den jeweiligen Reagenzien als Bausteine aufgebaut wird. Ebenso können für die Verankerungsreaktionen enzymatisch katalysier­ te Reaktionen genutzt werden.
Daß weitere erforderliche Behandlungsschritte wie Waschen, Abspaltung einer che­ mischen Schutzgruppe, Blockierung (Capping) etc., die zwischen den einzelnen Ver­ ankerungsreaktionen durchgeführt werden müssen, unterbrechungsfrei in den Gesamt­ prozess der Bibliothekserzeugung integriert werden und somit eine Entnahme und Wiedereinfügung der Substrate mit den unfertigen Bibliotheken zum Zwecke einer chemischen Behandlung außerhalb der Apparatur und durch Menschen entfällt, wirkt ebenfalls herstellungsgeschwindigkeits- und effizienzsteigernd.
Schema 1
S (Substrat) + A → S-A
S-A + B → S-A-B
S-A-B + C → S-A-B-C
S-A-B-C + B → S-A-B-C-B etc.
Wie im Schema 1 gezeigt, wächst oder verändert sich die Einzelstruktur durch die Abfol­ ge der Bausteine in den Verankerungsreaktionen. Dies läßt sich eindeutig in Form einer Abfolge von Zeichen (Buchstaben, Zahlen) für jeden Baustein beschreiben. Alle Einzel­ strukturen werden parallel aufgebaut, d. h. sie wachsen alle bis zu ihrer jeweiligen Fertig­ stellung um jeweils einen Baustein je Verteilungszyklus. Zusätzlich zur Bausteinabfolge wird deren Position im Array vorgegeben.
Im Einzelnen ist die Geräteanordnung folgendermaßen aufgebaut:
Das Substrat ist die Oberfläche eines sich gleichförmig drehenden Körpers.
Dieser Körper ist gegebenenfalls in ein umhüllendes Gefäß eingebaut, so daß das Volumen zwischen Substratoberfläche und Gefäßwand möglichst klein sein und gegebe­ nenfalls mit Inertgas geflutet werden kann.
Über der Substratoberfläche ist eine lineare, kreis- oder kreisbogenförmige Anordnung von ein bis einhundert, vorzugsweise bis fünfzig, Dosierköpfen montiert. Jeder Dosier­ kopf ist mit einem Vorratsgefäß für die Lösung eines Bausteins oder Reagenzes bzw. Lösungsmittels verbunden. Diese Vorratsgefäße können gegebenenfalls gekühlt werden.
Durch eine lineare, kreis- oder kreisbogenförmige Bewegung können die Dosierköpfe über der sich gleichförmig bewegenden Substratoberfläche bewegt werden und von dort ein Volumen der Bausteinlösung direkt, gegebenenfalls durch einen Spalt im umhüllen­ den Gefäß, auf die Substratoberfläche aufgebracht werden. Die Position der Dosierköpfe im zu erzeugenden Array entspricht der relativen momentanen Position von Dosierkopf und Substrat und wird aus der Steuerung dieser Bewegungen bzw. ihrer Aktoren abge­ leitet. Sie bestimmt den Zeitpunkt der Absetzung der Bausteinlösung.
Für einen Verteilungszyklus werden alle Positionen des Arrays entsprechend der Vorga­ be ohne Start- und Bremsbeschleunigungsmomente und deren Zeitbedarf bedient.
Nach einem Verteilungszyklus können in der gleichen Apparatur und damit ohne er­ forderliche Neupositionierungen mit den ihnen innewohnenden Positionierfehlern ver­ schiedene notwendige Zwischenschritte folgen, die für alle Positionen des Arrays eine gleiche Behandlung erfordern. Dies kann durch Aufgabe der entsprechenden Reagen­ zienlösungen auf die gesamte Substratoberfläche erfolgen.
Zahlen:
Eine mögliche Vorrichtung ist ausgelegt, Arrays von 2.500 bis zu 160.000 Strukturen herzustellen. Dies entspricht ei­ ner Belegungsdichte von bis zu 3.000 Positionen (Spots) pro cm2.
Zu dosierende Volumina: 100 pl bis 100 nl.
Dosierfrequenz: 10 bis 1060 Hz, bevorzugt 100 Hz.
Prinzip der Dosierung: Tintenstrahldüsen nach dem Druckprinzip oder piezoelek­ trisch.
Waschen und Trocknen der Substratoberfläche: mit Schwammrollen, durch Zentrifugalkraft (Schleudern), forcierte Verdunstung oder Verdrängung im Gasstrom.
Variante 1: Wand eines Zylinders (Trommelscanner) (s.a. Fig. 1)
Das Substrat ist hier bevorzugt eine flexible, aber formstabile Kunststoffolie, die auf die Zylinderwand aufgespannt wird. Nach der Arrayherstellung kann diese Folie wieder abgenommen und separat dem Interaktionstest zugeführt werden.
Um Reagenzien und Lösungsmittel für erforderliche Zwischenschritte (wie Reaktions­ stop, Auswaschen überschüssiger Reagenzien, etc.pp.) Auf der gesamten Substratober­ fläche zu verteilen, werden diese entweder unter Drehung der Trommel über gesonderte Düsen auf der Oberfläche des Substrates aufgetragen und gleichmäßig verteilt, oder die Substratoberfläche wir durch Eintauchen der sich langsam drehenden Trommel in eine mit diesen Reagenzien bzw. Lösungsmitteln gefüllten Wanne vollständig benetzt.
Diese Substanzen werden unter Zuhilfenahme von Trockenrollen mit Schwamm-, Filz-, Vlies- o. ä. -struktur bzw. mittels Luftstrom oder Zentrifugation von der Substratoberfläche wieder entfernt.
Beschreibung
Das Substrat besteht aus einer rechteckigen, flexiblen aber formstabilen Kunststoffolie, deren Oberfläche entsprechend ihrer Zusammensetzung erfindungsgemäß funktionali­ siert wurde.
Sie wird fest und straff auf die Zylinderoberfläche einer Trommel gespannt.
Diese Trommel mit dem Substrat rotiert gleichmäßig um ihre Zylinderachse.
Über dem Substrat befindet sich ein bzw. ein geordnetes Feld von Dosierköpfen. Diese werden schrittweise parallel zur Zylinderachse der Trommel über die Substratoberfläche geführt. Dabei nehmen die Dosierköpfe in jedem Haltzustand bezogen auf das Substrat die Positionen {xi, x(i+1)s, x(i+2)s, x(i+3)s, . . ., x(i+n)s} ein, wobei
i der jeweilige Positionierschritt
n die Anzahl der Dosierköpfe im Feld und
s der Abstand der Dosierköpfe untereinander in Positionierschritten symbolisieren sollen.
Ist die Dauer einer Umdrehung der Trommel mit Substrat T in die ganzzahlige Anzahl z Intervalle der Länge T=T/z unterteilt, nehmen die Dosierköpfe bezogen auf das Sub­ strat zu jedem Zeitpunkt m.T die auf die Substratoberfläche bezogene Längenkoordina­ ten {ym1, ym2, ym3, . . ., ymn} ein.
Diese Koordinaten {xi; ym} spannen das Array Bx,y der zu erzeugenden Bibliothek und damit die geometrischen Orte der Spots auf, an denen die Elemente der Bibliotheken zu synthetisieren sind. Diese Koordinaten beschreiben dann eineindeutig die substanziellen Eigenschaften des Bibliothekselementes.
Varianten 2 und 3 (s. ff.)
Bevorzugte Ausführung des Substrates für die Varianten 2 und 3 ist das Format einer runden, ebenen Scheibe, z. B. im CompactDisc Format (CD).
Die Bibliothek wird auf einer funktionalisierten Oberfläche des Substrates als ringför­ miges Array von Miniaturtüpfeln (Spots) synthetisiert.
Um Reagenzien und Lösungsmittel für erforderliche Zwischenschritte (wie Reaktions­ stop, Auswaschen überschüssiger Reagenzien etc.pp.) auf der gesamten Substrat­ oberfläche zu verteilen, werden diese bei erhöhter Drehzahl des Substrates über gesonderte Düsen auf dessen inneren Bereich aufgetragen und durch die Wirkung einer gemäßigten Zentrifugalkraft gleichmäßig verteilt.
Sie werden bei weiter erhöhter Drehzahl durch Schleudern von der Substratoberfläche wieder entfernt.
Option:
Die Unterseite der Substrate kann dazu genutzt werden, in geeigneter Weise (z. B. optisch) Informationen über die Spot-Positionen und die Art, Zusammensetzung und Struktur der Bibliothek aufzunehmen.
Variante 2: Runde Scheibe aus Kunststoff, Drehwinkel/Radius-Array (s.a. Fig. 2)
Beschreibung:
Das Substrat besteht aus einer runden Kunststoffscheibe, deren Oberfläche entspre­ chend ihrer Zusammensetzung erfindungsgemäß funktionalisiert wurde.
Das Substrat rotiert gleichmäßig um seine Zylinderachse.
Über dem Substrat befindet sich ein bzw. ein geordnetes Feld von Dosierköpfen. Diese werden schrittweise in radialer Richtung über die Substratoberfläche geführt. Dabei nehmen die Dosierköpfe in jedem Haltzustand bezogen auf das Substrat die Positionen {ri, r(i+1)s, r(i+2)s, r(i+3)s, . . ., r(i+n)s ein, wobei
der jeweilige Positionierschritt
n die Anzahl der Dosierköpfe im Feld und
s der Abstand der Dosierköpfe untereinander in Positionierschritten symbolisieren sollen.
Ist die Dauer einer Umdrehung des Substrates T in die ganzzahlige Anzahl z Intervalle T unterteilt, nehmen die Dosierköpfe bezogen auf das Substrat zu jedem Zeitpunkt mT die Winkelkoordinate ∅m ein.
Diese Koordinaten {ri; ∅n} spannen das Array Br,∅ der zu erzeugenden Bibliothek und damit die geometrischen Orte der Spots auf, an denen die Elemente der Bibliotheken zu synthetisieren sind. Diese Koordinaten beschreiben dann ein eindeutig die substanziellen Eigenschaften des Bibliothekselementes.
Variante 3: Runde Scheibe aus Kunststoff, Drehwinkel/Schwenkwinkel-Array (s.a. Fig. 3)
Beschreibung:
Das Substrat besteht aus einer runden Kunststoffscheibe, deren Oberfläche entspre­ chend ihrer Zusammensetzung erfindungsgemäß funktionalisiert wurde.
Das Substrat rotiert gleichmäßig um seine Zylinderachse.
Über dem Substrat befindet sich ein bzw. ein geordnetes Feld von Dosierköpfen, das an einem horizontal drehbaren Schwenkarm angeordnet ist, dessen Drehachse sich soweit außerhalb der Substratfläche befindet, daß alle Dosierköpfe die zu belegende Substrat­ oberfläche überstreichen.
Die Dosierköpfe sind auf dem Schwenkarm so angeordnet, daß sie zur Schwenkachse den gleichen Abstand und zueinander einen festen Winkelabstand haben.
Durch die Schwenkung des Armes werden die Dosierköpfe schrittweise über die Sub­ stratoberfläche geführt. Dabei nehmen sie in jedem Haltzustand bezogen auf das Sub­ strat die Positionen {ϕi, ϕ(i+1)s, ϕ(i+2)s, ϕ(i+3)s, . . ., ϕ(i+n)s ein, wobei
ϕ der jeweilig momentane Schwenkwinkel des Schwenkarmes
i die jeweilige Winkelposition der einzelnen Dosierköpfe
n die Anzahl der Dosierköpfe im Feld und
s der Abstand der Dosierköpfe untereinander in Winkelpositionierschritten symbolisieren sollen.
Ist die Dauer einer Umdrehung des Substrates T in die ganzzahlige Anzahl z Intervalle T unterteilt, nehmen die Dosierköpfe bezogen auf das Substrat zu jedem Zeitpunkt mT die Winkelkoordinate ∅m ein.
Diese Koordinaten {ϕϕ; ∅m} spannen das Array Bϕ,∅ der zu erzeugenden Bibliothek und damit die geometrischen Orte der Spots auf, an denen die Elemente der Bibliotheken zu synthetisieren sind (s.a. Fig. 4). Diese Koordinaten beschreiben dann eineindeutig die substanziellen Eigenschaften des Bibliothekselementes.
Chemische Beschaffenheit des Substrats
Das Substrat besteht aus Glas, Keramik oder aus Polyolefinen mit oder ohne Füllstoffen wie z. B. Polypropylen (PP), Polyethylen (PE), Polymethylpenten (PMP), Polychlortrifluor­ ethylen (PCTFE), Polytetrafluorethylen (PTFE), Polyvinylidenfluorid (PVDF), Etylen-Vinyl­ acetat Copolymer (EVA), Ethylen-Vinylalkohol-Copolymer (EVAL) in Form einer Folie, Membran oder Platte.
Diese werden entweder wie unter A) und B) beschrieben in einem zweistufigen Prozeß an der Oberfläche funktionalisiert oder es werden wie unter C) oder D) beschrieben direkt Aminogruppen eingeführt. Die unter E) beschriebenen Pfropfpolymerisationen ermöglichen durch den Einsatz von heteroatomsubstituierten Monomeren die Funk­ tionalisierung von Polymeroberflächen unter Vervielfältigung der Zahl der ursprünglich eingeführten Funktionalitäten bei gleichzeitiger Ausbildung größerer Abstände von der Substratoberfläche (Spacer).
Bei der zweistufigen Funktionalisierung werden im ersten Schritt abhängig von dem verwendeten Polyolefin funktionelle Gruppe, bevorzugt Hydroxygruppen, an der Ober­ fläche erzeugt. In einem weiteren Prozeß werden die im ersten Schritt zusätzlich er­ zeugten unerwünschten Funktionalitäten, wie Carbonsäuren und deren Ester, Aldehyde, Ketone und Alkene in Hydroxygruppen überführt. Dabei läßt sich die Oberflächenkon­ zentration an funktionellen Gruppen über die Reaktionszeit und -Temperatur während des ersten Reaktionsschritts steuern.
Ausnahme: EVAL wird nicht weiter behandelt, da bereit Hydroxygruppen auf der Ober­ fläche vorhanden sind.
Die so funktionalisierten Substrate werden direkt für die Synthese verwendet oder vorher mit Spacern und/oder Linkern versehen. Literatur:
J. S. Früchtel, G. Jung, Angew. Chem. 1996, 108, 19-46
R. Frank, S. Matysiak, Derivatisierte Polymermaterialien, Patent DE (1)96 38 085.5.
Einige konkrete Vorschriften für die Funktionalisierung von möglichen Substratober­ flächen sind in der Anlage beschrieben.
A) Schritt 1 1. Reaktion: Oxidation von PE, PP und PMP mit Chromtrioxid
Durchführung analog einer Vorschrift für die PP-Oxidation aus: K.-W. Lee, T. J. McCart­ hy, Macromolecules 1988, 21, 309-313.
2. Reaktion: Oxidation von PE, PP und PMP mit Ozon
Durchführung analog einer Vorschrift aus: K. Fujimoto, Y. Takebayashi, H. Inoue, Y. Ikada, Journal of Polymer Science: Part A, Polymer Chemistry, 1993, 31, 1035-43.
Ozongenerator der Firma Fischer Labor-und Verfahrenstechnik, Bonn Bad Godesberg Sauerstoffstrom: 20-40 Liter/h.
3. Reaktion: Oxidation von PP, PE, PMP mit Wasserstoffperoxid in Trifluoressig­ säure
Durchführung analog einer Vorschrift aus: N. C. Deno, E. J. Jedziniak, L. A. Messer, M. D. Meyer, S. G. Stroud, E. S. Tomezsko, Tetrahedron 1977, 33, 2503-2508.
4. Reaktion: Eliminierung von Fluorid aus PVDF
Dehydrofluorierung mit Natriumhydroxid unter Phasentransfer-Bedingungen analog einer Vorschrift aus: A. J. Dias, T. J. McCarthy, Macromolecules 1984, 17, 2529-2531.
Dehydrofluorierung mit DBU analog einer Vorschrift aus: J. V. Brennan, T. J. McCarthy, Polym. Prepr. (Am. Chem. Soc.) Div. Polym. Chem. 1989, 30, 152-153.
5. Reaktion: Reduktion von PTFE und PCTFE mit Naphtalin-Natrium
Reaktionstemperatur: 21°C
Reaktionszeiten: 5 min-24 h
Lösungsmittel: THF
Durchführung: Darstellung der Naphtalin-Natrium-Lösung: H. F. Ebel und A. Lüttringhaus in Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie Band XIII/1, Georg Thieme Verlag Stuttgart 1970, S. 381.
Das Substrat wird unter Schutzgas für die angegebene Reaktionszeit mit einer 0.1 M-1.25 M Lösung aus Naphthalin-Natrium in THF bedeckt und geschüttelt. Dann wird das Substrat mit Wasser, 1 M aq. Natronlauge, 1 M aq. Salzsäure und Tetrahydrofuran ge­ waschen und getrocknet.
6. Reaktion: Reduktion von PTFE und PCTFE mit Benzoin
Durchführung analog einer Vorschrift aus: C. A. Costello, T. J. McCarthy, Macromolecules 1987, 20, 2819-2828. Die Umsetzung ist für PTFE beschrieben und für PCTFE analog durchführbar.
7. Reaktion: Verseifung von EVA
Durchführung analog einer Vorschrift aus: Dissertation K. Schröder, "Oberflächenmodifi­ zierung und -charakterisierung von PP-Blends zur Entwicklung eines Biomaterials", Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 1994, S. 91f.
B) Schritt 2
Hydroborierung mit Boran/THF-Komplex und Oxidation mit Wasserstoffperoxid: Durch­ führung nach einer Vorschrift in: K.-W. Lee, T. J. McCarthy, Macromolecules 1988, 21, 309-313.
Hydroborierung mit Boran/Dimethylsulfid-Komplex und Oxidation mit Wasserstoffperoxid bzw. Natriumperborat nach Vorschriften in: C. F. Lane, H. L. Myatt, J. Daniels, H. B. Hopps, J. Org. Chem. 1974, 39, pp. 1437-1438 und pp. 3052-3054, G. W. Kabalka, T. M. Shoup, N. M. Goudgaon, J. Org. Chem. 1989, 54, 5930-5933.
C) Aminierung von PP-Oberflächen mittels Plasmaverfahren mit Radiofrequenzplasma
Durchführung: vergleiche Anlage "Funktionalisierung von Polypropylen-Oberflächen mittels Plasmaverfahren" des FhG-IST, Braunschweig. Die Oberflächenkonzentration an Aminogruppen läßt sich nach der Plasmapolymerisation mit Allylamin durch eine Be­ handlung mit 50% Trifluoressigsäure in Dichlormethan für 2 h bei Raumtemperatur deutlich steigern.
D) Aminierung von Glas und Metalloxidkeramiken
Eine Übersicht zur Derivatisierung von Siliciumoxidoberflächen gibt: E. F. Vasant, P. van der Voort, K. C. Vrancken, Characterization and chemical modification of the silica surfa­ ce, Studies in Surface Science and Catalysis Vol. 93; Elsevier 1995 Amsterdam.
Die beschriebenen Verfahren lassen sich auch auf Glas und Metalloxidkeramiken an­ wenden.
E) Pfropfpolymerisation auf Polymeroberflächen
Für eine Übersicht zur Oberflächenfunktionalisierung von Polymeren durch Pfropfpoly­ merisation siehe:
M. Ulbricht et al. J. of Membran Science 1996, 115, 31-47
Y. Ikada, Biomaterials 1994, 15, 725-736
und dort zitierte Literatur
Logistik
Das Array der Zielstrukturen wird mittels einer Software festgelegt und in eine zeitliche Abfolge von Dosieroperationen für die Bausteine, Reagenzien und Lösungsmittel trans­ formiert, die für den chemischen/enzymatischen Aufbau der Verbindungsbibliothek benötigt werden. Alle Bewegungen und Schaltungen von Ventilen werden durch einen Computer gesteuert.
Interaktionstest mit den Arrays Variante 1: Bibliothek von immobilisierten Strukturen
Die mit der Bibliothek von Verbindungen belegte Substratoberfläche wird mit der Lösung eines Bindungspartners (Ligand oder Akzeptor) in Kontakt gebracht und inkubiert.
  • A) Das Substrat wird mit der Lösung überschichtet.
  • B) die Lösung wird in einer Wanne entsprechenden Ausmaßes vorgelegt und das Sub­ strat darin versenkt.
  • C) die Lösung wird durch Kapillarkraft zwischen der Substratoberfläche und einer aufge­ legten Deckplatte festgehalten. Option: Verschiedene Teilbereiche der Substratober­ fläche können mit entsprechend geformten Deckplattensegmenten gleichzeitig mit verschiedenen Lösungen unterschiedlicher Bindungspartner inkubiert werden.
Der Nachweis des gebundenen Bindungspartners erfolgt:
  • 1. mittels a) radioaktiver Markierung, b) kovalenter Verknüpfung des Liganden/Akzeptors mit einem Enzym oder c) kovalenter Verknüpfung des Liganden/Akzeptors mit fluoreszie­ renden und nicht fluoreszierenden Farbstoffen. Der Nachweis und die Quantifizierung der Bindung auf den Arrays erfolgt mit marktüblichen Geräten durch Bestimmung der örtlich gebundenen Radioaktivität (Phosphorlmager), Fluoreszenz (Fluorlmager) oder Chemilumineszenz (Lumilmager).
  • 2. durch direkte Markierung der Strukturen der Bibliothekselemente mit Fluoreszenzfarb­ stoffen. Die kovalente Verknüpfung der Farbstoffe mit den Bibliothekselementen kann an verschiedenen Anknüpfungspunkten erfolgen, beispielsweise in Peptiden N- oder C-terminal. Die Messung der Bindung des Bindungspartners erfolgt durch Bestimmung der Änderung der Fluoreszenzintensität nach Interaktion zwischen markiertem Biblio­ thekselement und Bindungspartner.
Eine weitere Möglichkeit zum Bindungsnachweis ist die Messung des Energietransfers vom Fluoreszenzfarbstoff auf bestimmte Gruppen im Bindungspartner. Beispielsweise kann die Struktur des Bibliothekselementes mit Anthranilsäure (2-Aminobenzoesäure) markiert werden und die Bindung z. B. eines Proteins durch Energietransfer vom An­ thranilsäurerest auf einen Tryptophanrest im Protein nachgewiesen werden.
Variante 2: Bibliothek mit löslichen Strukturen
In diesem Fall wird die funktionalisierte und gegebenenfalls mit einem Spacer versehene Substratoberfläche zunächst mit einem "Linker" derivatisiert. Die Bibliothek wird dann auf den Linkerfunktionen aufgebaut. Der Linker erlaubt es, nach der Synthese der Bibliothek die kovalente chemische Verknüpfung mit der Substratoberfläche gezielt zu spalten.
  • A) Die gesamte Substratoberfläche wird mit einem z. B. gasförmigen Spaltreagenz be­ handelt; die dann noch örtlich getrennt liegenden Bibliothekselemente werden durch anschließende Verteilung kleiner Tropfen eines geeigneten Lösungsmittels aufgenom­ men und von dort einzeln in eine Testanordnung überführt.
  • B) Das Spaltreagenz wird als kleine Tropfen gezielt auf die Orte der Bibliothekselemente verteilt und von dort die abgespaltenen Verbindungen einzeln in eine Testanordnung überführt.
Chemische Funktionalisierung des Substrats A) Schritt 1 1. Reaktion: Oxidation mit Chromtrioxid
Polymere: PE, PP, PMP.
Reaktionstemperatur: Raumtemperatur ca. 21°C.
Reaktionszeiten: 15 min-24 h.
Lösungsmittel: Eisessig und Acetanhydrid in Volumenverhältnis von 1 : 1.
Durchführung:
Das Substrat wird mit einer 0.5 M Lösung aus Chromtrioxid im angegebenen Lösungsmittel bedeckt und bei der angegebenen Reaktionstemperatur geschüttelt. Nach der Reaktionszeit wird das Substrat mit Wasser, 0.1 M aq. EDTA-Lösung und Ethanol gewaschen und getrocknet.
2. Reaktion: Oxidation mit Ozon
Polymere: PE, PP, PMP.
Reaktionstemperatur: Raumtemperatur ca. 21°C.
Reaktionszeiten: 15 min-24 h.
Durchführung:
Das Substrat wird in einem Behältnis mit einem durch eine Ozongenerator erzeugten Ozon in Sauerstoff-Strom für die angegebene Reaktionszeit umspült.
Gasstrom: 20-40 Liter/h; Ozongenerator der Firma Fischer Labor-und Verfahrenstechnik, Bonn Bad Godesberg.
3. Reaktion: Oxidation mit wässriger Wasserstoffperoxid-Lösung in Trifluoressigsäure
Polymere: PP, PE, PMP.
Reaktionstemperatur: 50°C-Rückflußtemperatur.
Reaktionszeiten: 5-90 min.
Lösungsmittel: Trifluoressigsäure.
Durchführung:
Das Substrat wird für die angegebene Reaktionszeit mit einer Lösung aus 30% wässriger Wasserstoffperoxidlösung in Trifluoressigsäure im Volumenverhältnis 1 : 9 für die angegebene Reaktionszeit bedeckt und auf die angegebene Reaktionstemperatur erhitzt.
Dann wird das Substrat mit Wasser, Methanol und Dichlormethan gewaschen und getrocknet.
Reaktion 4: Eliminierung von Fluorid aus PVDF Reaktion 4.1
Polymere: PVDF.
Reaktionstemperatur: 80°C.
Reaktionszeiten: 10-360 min.
Lösungsmittel: Heptan.
Durchführung:
Das Substrat wird für die angegebene Reaktionszeit mit einer 1 M Lösung aus DBU im angegebenen Lösungsmittel für die angegebene Reaktionszeit bedeckt und geschüttelt.
Dann wird das Substrat mit Wasser, Methanol und Dichlormethan gewaschen und getrocknet.
Reaktion 4.2
Polymere: PVDF.
Reaktionstemperatur: Raumtemperatur ca. 21°C-80°C.
Reaktionszeiten: 2-360 min.
Durchführung:
Das Substrat wird für die angegebene Reaktionszeit mit einer 8 M wässrigen Lösung aus Natriumhydroxid und einem Phasentransferkatalysator wie z. B. Tetra-n-butylammoniumbromid (10 mg auf 15 ml) für die angegebene Reaktionszeit bedeckt und geschüttelt.
Dann wird das Substrat mit Wasser, Methanol und Dichlormethan gewaschen und getrocknet.
5. Reaktion: Reduktion mit Naphthalin-Natrium
Polymere: PTFE, PCTFE.
Reaktionstemperatur: Raumtemperatur ca. 21°C.
Reaktionszeiten: 5 min-24 h.
Lösungsmittel: THF.
Durchführung:
Darstellung der Naphtalin-Natrium-Lösung: H. F. Ebel und A. Lüttringhaus in Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie Band XIII/1, Georg Thieme Verlag Stuttgart 1970, S. 381.
Das Substrat wird unter Schutzgas für die angegebene Reaktionszeit mit einer 0.1 M-1.25 M Lösung aus Naphthalin-Natrium in THF bedeckt und geschüttelt.
Dann wird das Substrat mit Wasser, 1 M aq. Natronlauge, 1 M aq. Salzsäure und Tetrahydrofuran gewaschen und getrocknet.
6. Reaktion: Reduktion mit Benzoin
Polymere: PTFE, PCTFE.
Reaktionstemperatur: 50°C
Reaktionszeiten: 1 h-24 h.
Lösungsmittel: DMSO.
Durchführung:
Unter Schutzgas und Feuchtigkeitsausschluß stellt man eine 0.4 M Lösung aus Benzoin in DMSO her und gibt diese Lösung tropfenweise zu einer 0.4 M Lösung aus Kalium-tert.-butylat in DMSO, die das Substrat bedeckt. Danach wird für die angegebene Reaktionszeit bei der angegebenen Temperatur geschüttelt.
Dann wird das Substrat mit Wasser, Methanol und Dichlormethan gewaschen und getrocknet.
7. Reaktion: Verseifung von EVA
Polymere: EVA.
Reaktionszeiten: 1 h-24 h.
Lösungsmittel: Methanol.
Durchführung:
Das Substrat wird in einer 2 M Lösung aus Natriumhydroxid in Methanol für die angegebene Reaktionszeit rückflussiert.
Dann wird das Substrat mit 1 M aq. Salzsäure, Wasser, Methanol und Dichlormethan gewaschen und getrocknet.
B) Schritt 2 1. Reaktion: Hydroborierung
Polymere: alle.
Reaktionstemperatur: Raumtemperatur ca. 21°C-50°C.
Reaktionszeiten: 10 min-24 h.
Lösungsmittel: wasserfreie inerte Lösungsmittel wie z. B. Tetrahydrofuran, Methyl-tert.-bu­ tyl-Ether, Diethylether, Dioxan, Benzol, Toluol, Alkane (C5-C8).
Durchführung:
Das Substrat wird für die angegebene Reaktionszeit mit einer 0.1-1 M Lösung aus Boran-THF Komplex oder Boran-Dimethylsulfid-Komplex im angegebenen Lösungsmittel für die angegebene Reaktionszeit bedeckt und bei der angegebenen Reaktionstemperatur geschüttelt.
Oxidation des Boran-haltigen Substrats:
Methode A: Oxidation mit Wasserstoffperoxid:
Das Substrat wir mit einer Lösung aus 30% aq. Wasserstoffperoxid und 1.5 M aq. Natronlauge im Volumenverhältnis 1 : 2 bedeckt und 1-3 h bei Raumtemperatur geschüttelt.
Dann wird das Substrat mit 1 M aq. Natronlauge, 1 M aq. Salzsäure, Wasser, DMF und Dichlormethan gewaschen und getrocknet.
Methode B: Oxidation mit Natriumperborat.
Lösungsmittel: Wasser, THF/Wasser 1 : 1, DMF.
Reaktionstemperatur: Raumtemperatur ca. 21°C-50°C.
Das Substrat wir mit Natriumperborat und dem angegebenen Lösungsmittel bedeckt und 1-3 h bei der angegebenen Reaktionstemperatur geschüttelt.
Dann wird das Substrat mit 1 M aq. Natronlauge, 1 M aq. Salzsäure, Wasser, DMF und Dichlormethan gewaschen und getrocknet.
Bezugszeichenliste
Fig. 1 1 Substrat
2 Drehachse Trommel/Substrat
3 Spots
4 linearer Verschiebebereich der Dosierköpfe/des Feldes der Dosierköpfe Arraykoordinate x
6 Reagenzzuführung, schem.
7 Dosierkopfhalter/Feld der Dosierköpfe
8 Dosierkopf
9 Nullmarkierung
10 Trommel/Substrat-Drehwinkel, Arraykoordinate ∅
Fig. 2 1 Substrat
2 Drehachse Substrat
3 Spots
4 radiale Bewegungsrichtung (Verfahrachse) der Dosierköpfe/des Feldes der Dosier­ köpfe, Arraykoordinate x
6 Reagenzzuführung, schem.
7 Dosierkopfhalter/Feld der Dosierköpfe
8 Dosierkopf
9 Nullmarkierung
10 Drehwinkel des Substrates, Arraykoordinate ∅
Fig. 3 1 Substrat
2 Drehachse Substrat
3 Spots
4 Schwenkbereich der Dosierköpfe/des Feldes der Dosierköpfe
5 Schwenkachse der Dosierköpfe/des Feldes der Dosierköpfe
6 Reagenzzuführung, schem.
7 Dosierkopfhalter/Feld der Dosierköpfe
8 Dosierkopf
9 Nullmarkierung
10 Substrat-Drehwinkel, Arraykoordinate ∅
11 Dosierkopf-Schwenkwinkel, Arraykoordinate ϕ
Fig. 4
Beispieldarstellung einer Bibliothek mit 10.000 Elementen (Spots), hergestellt mit einer Vorrichtung nach Variante 3 (Anspruch 5) hegestellt wurde.

Claims (17)

1. Vorrichtung zur effektiven Erzeugung von frei definierbaren Repertoires/Bibliotheken mit großen Anzahlen von Ligand- und Akzeptorstrukturen (Elemente genannt) zur kombinatorischen Synthese und zur ultraschnellen Testdurchführung vorzugsweise in der biologischen, biochemischen, pharmazeutischen, medizi­ nischen und chemischen Wirkstofforschung,
dadurch gekennzeichnet, daß
  • - die Elemente der Bibliotheken auf der Oberfläche eines oder mehrerer funktionalisierter ebener Träger in frei wählbaren Arrays synthetisiert werden,
  • - die Identifikation der Elemente durch ihre Stellung in die­ sem Array eindeutig gegeben ist,
  • - die Zusammensetzung und die Eigenschaften der herzustellen­ den Bibliothek, d. h. die formale Arraystruktur, die in der Bibliothek enthaltenen Elemente, deren Position im Array und deren Konstruktion/Herstellungsvorschrift (Anzahl, Na­ men und Reihenfolge der Bausteine in der Reaktionskette) in einer Liste oder Datei erfaßt und dem Herstellungsprozeß der Bibliothek und deren Steuerung zugrundegelegt wird,
  • - diese Träger oder Substrate vorzugsweise aus Kunststoff, Keramik, Glas, Kunststoffpapieren, Kunststoffvliesen oder Zellulosepapieren bestehen,
  • - die Synthese der Elemente der Bibliotheken in nicht vor­ strukturierten Miniaturtüpfeln, Miniaturflecken oder Spots stattfindet, die durch die Reagenzlösungen auf der Oberflä­ che des Trägers/Substrates gebildet werden,
  • - das Aufbringen und die Dosierung der einzelnen Reagenzlö­ sungen mittels Dosierköpfen kontaktlos durch räumlich und zeitlich definiertes Aufschießen von Tröpfchen geringster Mengen dieser Lösungen erfolgt,
  • - der Pool der verwendeten Bausteine zur Synthese aus 2 bis 128, vorzugsweise bis 48 Reagenzlösungen gebildet wird,
  • - für jede der Reagenzlösungen ein eigener Dosierkopf verwen­ det wird,
  • - die Dosierköpfe zum Auftragen der Reagenzien einzeln oder in einem starren Feld zusammengefaßt über das Substrat ge­ führt werden,
  • - die Synthese der Elemente durch eine schrittweise chemische Verkettung einer Variation mit möglichen Wiederholungen einzelner Bausteine von 2 bis 100, vorzugsweise bis 40 Rea­ genzlösungen aus dem Pool erfolgt,
  • - die Folgefrequenz der einzelnen Dosiervorgänge 10 bis 1000, vorzugsweise 100 pro Sekunde beträgt,
  • - das Substrat während der Dosiervorgänge gleichmäßig ohne Halt, linear oder kreisförmig, kontinuierlich oder quasi-kontinuierlich in kleinen Schritten in Richtung einer Arraydimension relativ zum Feld der Dosierköpfe bewegt wird,
  • - der Dosierkopf resp. das Feld der Dosierköpfe entsprechend der Arrayeigenschaften in Schritten in Richtung der zweiten Arraydimension relativ zum Substrat bewegt wird,
  • - diese Bewegungen absolut und/oder relativ zueinander so ge­ steuert und/oder verfolgt werden, daß die momentane Zuord­ nung der Position des Dosierkopfes resp. der einzelnen aus dem Feld der Dosierköpfe zu den Arraykoordinaten zu jedem Zeitpunkt bekannt ist,
  • - diese Zuordnung im Vergleich mit der Bibliothekskonstruk­ tion unmittelbar die Steuerung der Dosiervorgänge der ein­ zelnen Dosierköpfe bestimmt und
  • - daß zu jeder Bibliothek eine der Arraystruktur zugeordnete Schablone angefertigt werden kann, die durch Identifikation der Arraykoordinaten eine erste visuelle Auswertung sowohl der Bibliothek selbst als auch der Anwendungsreaktionen er­ möglicht.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzlösungen in Vorratsbehältern aufbewahrt werden, aus denen die zugeordneten Dosierköpfe gespeist werden.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß diese Vorratsbehälter die Reagenzien gekühlt halten kön­ nen und daß die Kühltemperatur bis zu minus 25°C betragen kann.
4. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat eine funktionalisierte, ebene kreisförmige Scheibe ist, die gleichmäßig, kontinuierlich oder quasikonti­ nuierlich in kleinen Schritten rotiert und der Dosierkopf resp. das Feld der Dosierköpfe linear radial in Einzelschrit­ ten über das rotierende Substrat bewegt wird.
5. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat eine funktionalisierte, ebene kreisförmige Scheibe ist, die gleichmäßig, kontinuierlich oder quasikonti­ nuierlich in kleinen Schritten rotiert und der Dosierkopf resp. das Feld der Dosierköpfe in Einzelschritten entlang ei­ ner mindestens die zu belegende Fläche des Bewegungskreises des Substrates überlagernden, zu dieser exzentrischen Kreis­ bogenlinie geführt wird.
6. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat eine funktionalisierte, glatte Folie ist, die straff und glatt auf eine Trommel gespannt ist, die gleichmäßig kontinuierlich oder quasikontinuierlich in klei­ nen Schritten rotiert und der Dosierkopf resp. das Feld der Dosierköpfe linear in Einzelschritten in Axialrichtung über die mit der Trommel bewegte Substratoberfläche geführt wird.
7. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Substrate gemäß den Ansprüchen 4, 5 und 6 aus Glas, Keramik oder aus Polyolefinen mit oder ohne Füllstoffe wie z. B. Polypropylen (PP), Polyethylen (PE), Polymethylpenten (PMP), Polychlortrifluorethylen (PCTFE), Polytetrafluor­ ethylen (PTFE), Polyvinylidenfluorid (PVDF), Ethylen-Vinyl­ acetat-Copolymer (EVA), Ethylen-Vinylalkohol-Copolymer (EVAL) in Form einer Folie, Membran oder Platte gefertigt werden und die Substrate nach an sich bekannten Methoden zu funktionali­ sieren sind.
8. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der oder die Dosierköpfe die ihnen zugeordnete Reagenzlösung ohne aufzusetzen oder in der Bewegung inne­ zuhalten durch schußartiges Abgeben von geringen Mengen der Lösungen auf vorbestimmten Arraykoordinaten des Substrates aufbringen.
9. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß zusätzlich zu den Dosierköpfen für die Reagenzlösungen zur Synthese der Bibliothekskomponenten bis zu 28, bevorzugt bis 8, Spüldüsen, vorhanden sind, durch die die Reagenzien dosiert aufgebracht werden können, die zur Durchführung der zwischen den einzelnen Verankerungsreak­ tionen erforderlichen Behandlungsschritten wie Waschen, Abspaltung einer chemischen Schutzgruppe, Blockierung (Capping) etc. erforderlich sind.
10. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß überschüssige Reagenzien und Lösungsmittel nach Abschluß der zwischen den Verankerungsreaktionen erforder­ lichen Behandlungsschritte vom Substrat entfernt und das Substrat getrocknet werden kann.
11. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß Entfernung der Reagenzien und Lösungsmittel gemäß Anspruch 6 und 7 durch die Einwirkung von Zentrifugal­ kräften (Schleudern), durch forciertes Verdampfen mittels strömender Luft (Luftdusche), durch erhöhte Temperatur, durch direktes Abnehmen mittels Kontakt (Schwammrolle, Filzrolle, Papierrolle u. a.) bzw. durch eine Kombination der genannten Verfahren durchgeführt wird.
12. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Modul bestückt ist oder werden kann, das vor, während oder nach einem, mehreren ausgewählten oder allen Belegungsvorgängen die Spoterzeugung kontrolliert und evtl. Fehler bei der Belegung oder in der Funktion der Dosierköpfe erkannt werden können (Funktionskontrolle).
13. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Funktionskontrolle gemäß Anspruch 12 optisch, mikro­ skop-optisch, fluoreszenz-/lumineszenz-optisch, laser-optisch oder mit Kombinationen daraus erfolgt.
14. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Funktionskontrolle gemäß Anspruch 12 durch die direkte Kontrolle der Tröpfchenbildung, der Tröpfchen und des Tropfenweges der durch die Dosierköpfe abzugebenden Reagenz­ lösungen vor oder nach einer Reihe von Dosiervorgängen optisch, mikroskop-optisch, fluoreszenz-/lumineszenz-optisch, laser-optisch oder mit Kombinationen daraus erfolgt.
15. Schablone nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Auflegen, Überlagern oder Abbilden auf die fertige Bibliothek oder auf die benutzte Bibliothek eine visuelle Zuordnung einzelner, einer Auswahl oder aller Syntheseorte der Bibliothek zu ihren zugrundegelegten Arraykoordinaten gestattet.
16. Schablone nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß diese Schablone gegenständlich vorzugsweise aus Kunststoff gefer­ tigt ist, daß sie als auf die Bibliothek zu projizierendes Lichtbild in der Art eines Diapositivs vorliegt oder daß diese Schablone ein Computerprogramm oder eine digitale Ab­ bildung ist, die in einem Computer mit einer digitalen Abbil­ dung der Bibliothek zur Deckung gebracht werden kann.
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