DE19812930A1 - Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren radikalvermittelter Prozesse - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren radiakalvermittelter Prozesse, insbesondere der Bildung von bei oxidativem Streß durch Eisen erzeugten Radikalen. Weiterhin werden neue Radikalinhibitoren offenbart.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren radikalvermittelter Prozesse, insbesondere auch der Bildung von bei oxidativem Streß durch Eisen erzeugten Radikalen. Weiterhin werden neue Radikalinhibitoren offenbart.

Die schädigende Wirkung von reaktiven Sauerstoffintermediaten steht in engem Zusammenhang mit dem Eisenmetabolismus, da aus Fe²⁺ und H₂O₂ das hochtoxische Hydroxylradikal entsteht. Daher ist es nicht überraschend, daß sowohl reaktive Sauerstoffintermediate als auch Eisen beim Entstehen von Krankheiten beteiligt sind, die mit Gewebeschädigungen und Degenera­ tionen oft in Verbindung mit entzündlichen Reaktionen einhergehen.

Bei der Regulation des zellulären Eisenmetabolismus spielt das cytoplasma­ tische "Eisenregulationsprotein-1" (IRP-1) eine wichtige Rolle. Aktiviertes IRP-1 bindet an eisenreaktive Elemente (IRE) in verschiedenen mRNA- Molekülen: Für den Transferrinrezeptor, was zu einer erhöhten Aufnahme von Eisen in der Zelle führt; für die Ferritin-H- und L-Ketten, was zu einer Abnahme der intrazellulären Eisenentgiftung/Speicherung führt; für die erythroidale 5-Aminolaevulinatsynthase, was zu einer verringerten Hämsynthese in roten Blutzellen führt. Die IRP-1-Aktivierung wird durch drei Signale induziert: Eisenmangel, NO und H₂O₂. Insbesondere das letzt­ genannte Signal hat starke Auswirkungen auf durch H₂O₂ induzierte Zell­ schädigungen, da es zu einer verstärken Eisenaufnahme und zu einer verringerten intrazellulären Eisenentgiftung führt, wodurch die Erzeugung von Hydroxylradikalen stimuliert wird. Darüber hinaus führt eine 15-minütige Stimulation durch H₂O₂ zu einer vollständigen IRP-1 Aktivierung, die für mehrere Stunden andauert. Dies zeigt die Bedeutung des IRP/IRE-Regula­ tionssystems in verzögerten Reaktionen, die sogar durch kurzzeitige Stimuli hervorgerufen werden.

Gemäß neueren Erkenntnissen werden weitere genregulatorische und enzymatische Aktivitäten durch oxidativen Stress beeinflußt, z. B. der Transkriptionsfaktor NF-KB (Meyer et al., EMBO J. 12 (1993), 2005-2015), die Gene c-fos, c-jun und egr-1 (Nose et al., Eur. J. Biochem. 201 (1991), 99-106), das Metallothioneingen CUP1 aus Saccharomyces cerevisiae (Liu und Thiele, Genes Dev. 10 (1996), 592-603) und mehrere Kinasen wie p56^Ick (Hardwick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 4527-4531), SOK-1 (Pombo et al., EMBO J. 15 (1996), 4537-4546) und Proteinkinase C (Konishi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 1233-11 237). Bisher war es jedoch schwierig, diese Stress-Reaktionsmechanismen biochemisch zu untersuchen, da keine geeigneten zellfreien Testsysteme zur Verfügung standen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es somit, ein neues Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren der Radikalbildung bereitzustellen, bei dem die Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise vermieden werden können. Insbesondere soll das Verfahren in einem zellfreien System durchführbar sein.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis der Wirkung reaktiver Sauerstoffintermediate auf ein Targetmolekül, umfassend die Schritte

• (a) Bereitstellen eines zellfreien, das Targetmolekül enthaltenden Nachweissystems, insbesondere eines Nachweissystems, umfassend das Targetmolekül und lösliche Bestandteile eines durch Aufschluß eukaryontischer Zellen hergestellten Extrakts,
• (b) Einbringen reaktiver Sauerstoffintermediate in das Nachweissystem und
• (c) Bestimmen der Wirkung der reaktiven Sauerstoffintermediate auf das Targetmolekül.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß eine Rekonstitution der Reaktion des Eisenregulationsproteins-1 auf extrazelluläres H₂O₂ in einem Extrakt aus löslichen Zellbestandteilen möglich ist, der gegebenenfalls durch Zusatz unlöslicher, möglicherweise Membran-assoziierter Komponenten aus dem Zellpellet suplementiert sein kann und durch detergensfreie Lyse von Maus B6-Fibroblasten mit Streptolysin-O oder durch hypotonische mechanische Lyse erhältlich ist. Das erfindungsgemäße zellfreie Nachweis­ system weist die charakteristischen Eigenschaften der IRP-1-Aktivierung durch H₂O₂ in intakten Zellen auf. Die durch H₂O₂ vermittelte Aktivierung von IRP-1 ist temperaturabhängig und wird durch Zugabe von Effektoren für Phosphotransferreaktionen wie Phosphorylierungen oder Dephosphorylierun­ gen beeinflußt. Insbesondere wurde festgestellt, daß die IRP-1-Aktivierung durch Zugabe von ATP-yS und GTP-yS blockiert wird.

Die in vitro Rekonstitution dieses durch oxidativen Stress induzierten Reaktionswegs kann auch auf andere Targetmoleküle für reaktive Sauer­ stoffintermediate übertragen werden und erlaubt die Identifizierung von Effektorsubstanzen für die Wirkung reaktiver Sauerstoffintermediate, insbesondere von Effektorsubstanzen, welche die schädigenden Wirkungen reaktiver Sauerstoffintermediate auf Gewebe hemmen, beispielsweise durch Stimulierung, z. B. der Ferritinsynthese und der Verringerung der Eisenauf­ nahme über den Transferrinrezeptor. Die Effektorsubstanzen führen somit kausal zur Unterbrechung des Kreislaufs, der zu intrazellulären Schädigun­ gen durch Hydroxylradikale führt.

Durch die vorliegende Erfindung wird erstmals ein zellfreies Nachweissystem bereitgestellt, welches eine im Vergleich zur bekannten zellulären Nach­ weissystemen einfache und schnelle Bestimmung der Wirkung reaktiver Sauerstoffintermediate auf ein Targetmolekül erlaubt. Das erfindungs­ gemäße zellfreie Nachweissystem ist erhältlich durch Aufschluß eukaryonti­ scher Zellen und Gewinnung der dabei entstehenden löslichen Komponenten des Zellextrakts, gegebenenfalls unter Abtrennung unlöslicher Zellkom­ ponenten, z. B. durch Zentrifugation. Die zur Herstellung des Extrakts verwendeten Zellen sind vorzugsweise Wirbeltierzellen, besonders bevorzugt Säugerzellen wie etwa Mauszellen, Rattenzellen und insbesondere humane Zellen. Als Zelltypen können normale oder transformierte Zellen verwendet werden, besonders bevorzugt sind normale Fibroblasten. Zum Aufschluß der Zellen wird vorzugsweise eine Lyseprozedur verwendet, bei der auf den Einsatz von Detergenzien bzw. oberflächenaktiven Mitteln verzichtet wird. Eine geeignete Lyseprozedur ist beispielsweise der Aufschluß von Zellen durch Streptolysin-O, wobei dem daraus erhältlichen Extrakt noch unlösliche Komponenten aus dem Zellpellet zugesetzt werden müssen. Eine weitere geeignete Lyseprozedur ist ein mechanischer Aufschluß der Zellen unter hypotonischen Bedingungen. Diese Lyseprozedur ist besonders bevorzugt, da hier auf den Zusatz unlöslicher Zellkomponenten verzichtet werden kann.

Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt das Einbringen reaktiver Sauerstoffintermediate in das Nachweissystem. Die reaktiven Sauerstoffintermediate können in situ, z. B. durch enzymatische Reaktionen, erzeugt oder/und von außen zugesetzt werden. So kann beispielsweise H₂O₂ in situ enzymatisch durch Glucoseoxidase und Glucose erzeugtwerden. Die Konzentration der reaktiven Sauerstoffintermediate im Nachweissystem kann auf einfache Weise variiert und für das jeweils getestete Sauerstoff­ intermediat optimiert werden. Für H₂O₂ haben sich beispielsweise Konzen­ trationen von 10 µM bis 100 µM bei einer in situ Erzeugung durch Zusatz von Enzymen in das Nachweissystem bzw. von 100 µM bis 1 mM bei Zusatz von außen als geeignet erwiesen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet, die Wirkung verschiedener reaktiver Sauerstoffintermediate auf ausgewählte Targetmoleküle zu bestimmen. Beispiele für solche reaktiven Sauerstoffintermediate sind Wasserstoffperoxid, Wasserstoffsuperoxid, insbesondere in Form des Anions, Hydroxylradikale, Singulettsauerstoff, anorganische Peroxide wie Perborate, Persulfate, Percarbonate etc., organische Peroxide, Hypochlorit und andere Oxidationsmittel wie NO und dessen Reaktionsprodukte wie etwa Peroxynitrit. Bevorzugte reaktive Sauerstoffintermediate sind Wasser­ stoffperoxid, das Wasserstoffsuperoxidanion und Hydroxylradikale. Am meisten bevorzugt ist Wasserstoffperoxid.

Die Targetmoleküle sind vorzugsweise Polypeptide und werden ausgewählt aus für reaktive Sauerstoffintermediate sensitiven Faktoren und auf - im Sinne biochemischer Reaktionswege - stromaufwärts davon wirkenden Faktoren. Besonders bevorzugt werden die für reaktive Sauerstoffinter­ mediate sensitiven Faktoren ausgewählt aus den Eisenstoffwechsel regulierenden Proteinen wie IRP-1, Stress-sensitiven Transkriptionsfaktoren wie NF-KB, c-fos, c-jun und egr-1 und Redox-regulierten Kinasen wie p56^ICK und SOK-1. Am meisten bevorzugt sind den Eisenstoffwechsel regulierende Proteine wie IRP-1.

Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt das Bestimmen der Wirkung der reaktiven Sauerstoffintermediate auf das im Nachweissystem enthaltende Targetmolekül unter geeigneten Bedingungen. Dabei hat es sich oftmals als günstig erwiesen, ein Nachweissystem zu verwenden, welches chemische Energieäquivalente oder/und Phosphatgruppendonoren, insbesondere ATP in ausreichender Menge enthält, um die durch das reaktive Sauerstoffmediat zum Targetmolekül führende Signalkaskade aufrechtzuerhalten. Weiterhin enthält das Nachweissystem vorzugsweise eine ausreichende Konzentration von Magnesiumionen.

Die Bestimmung der Wirkung der reaktiven Sauerstoffintermediate auf das Targetmolekül kann grundsätzlich auf beliebige Weise erfolgen. Die zweckmäßigste Art der Bestimmung hängt von jeweiligen Targetmolekül ab. Beispielsweise kann in bestimmten Fällen die Menge des Targetmoleküls im Nachweissystem bestimmt werden. In vielen Fällen wird jedoch die Form des Targetmoleküls bestimmt, d. h. beispielsweise, das Auftreten oder Fehlen einer proteolytischen Spaltung, das Ausmaß von kovalenten Modifikationen wie etwa des Phosphorylierungsgrads oder das Vorhanden­ sein bzw. das Ausmaß von nichtkovalenten Assoziationen mit sich selbst oder mit anderen Komponenten des Nachweissystems. Bei IRP-1 als Targetmolekül wird vorzugsweise das Ausmaß der Assoziation mit IRE-Sequenzen auf mRNA-Molekülen bestimmt. Eine günstige Methode zur Bestimmung von Assoziationen des Targetmoleküls mit Komponenten des Nachweissystems umfaßt einen elektrophoretischen Mobilitätsshift-Assay (EMSA).

Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann als einfache Endpunkt- Bestimmung, d. h. Bestimmung eines Parameters nach einer vorgegebenen Zeit, als kinetische Bestimmung, d. h. als Bestimmung zu mehreren diskreten Zeitpunkten oder als kontinuierliche Bestimmung durchgeführt werden. Ebenso eine mögliche Kombination von kinetischer Bestimmung und Endpunkt-Bestimmung.

Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifizierung von Effektorsubstanzen für die Wirkung reaktiver Sauerstoffintermediate. Hierzu umfaßt das Verfahren weiterhin das Einbringen einer zu testenden potentiellen Effektorsubstanz in das Nach­ weissystem und das Bestimmen der Wirkung der reaktiven Sauerstoffinter­ mediate nach Einwirkung der potentiellen Effektorsubstanz auf das im Nachweissystem befindliche Targetmolekül. Vorzugsweise wird als Kontrolle eine parallele Bestimmung in Abwesenheit der zu testenden potentiellen Effektorsubstanz durchgeführt.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren können auf einfache Weise Effektorsubstanzen identifiziert werden, die eine spezifische Wechselwir­ kung mit Komponenten aus dem biochemischen Signalweg eingehen, der von dem reaktiven Sauerstoffintermediat bis hin zu einem bestimmten Targetmolekül führt. Wenn man z. B. IRP-1 als Targetmolekül und H₂O₂ als reaktives Sauerstoffintermediat verwendet, können auf diese Weise Substanzen identifiziert werden, welche die IRP-1 Aktivierung durch H₂O₂ beeinflussen und vorzugsweise hemmen. Die auf diese Weise identifizierten Substanzen wirken direkt oder/und indirekt auf Komponenten des biochemi­ schen Signalwegs ein, der durch reaktive Sauerstoffintermediate stimuliert und letztendlich zur Schädigung von Zellen führt.

Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise festgestellt, daß ATP-yS und GTP-yS die H₂O₂ vermittelte Aktivierung von IRP-1 vollständig blockieren können. Die Erfindung betrifft somit die Verwendung von yS enthaltenden Nukleotidanaloga, vorzugsweise yS enthaltenden Purinnukleotiden, besonders bevorzugt ATP-yS oder/und GTP-yS zur Hemmung der durch reaktive Sauerstoffintermediate hervorgerufene Aktivierung von IRP-1.

Im breiteren Sinne betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Effektoren für Phosphorylierungs- oder/und Dephosphorylierungsreaktionen, insbesondere von pharmazeutisch verträglichen Substanzen, zur Beein­ flussung der durch reaktive Sauerstoffintermediate hervorgerufenen Wirkung auf Targetmoleküle.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Effektoren für Phosphorylierungs- oder/und Dephosphorylierungs­ reaktionen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen, die durch die Wirkungen reaktiver Sauerstoffintermediate hervorgerufen werden. Beispiele solcher Erkrankungen sind Gewebeschädi­ gungen wie etwa Hypoxie und Reperfusionsschäden einschließlich myocardialer, cerebraler und anderer Gefäßverschlüsse, entzündliche Prozesse wie rheumatoide Arthritis und neurogenerative Erkrankungen, insbesondere mit lokal gestörtem Eisenmetabolismus wie Parkinson'sche Krankheit.

Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert werden.

Beispiele 1. Material und Methoden 1.1 Material

Rekombinantes Streptolysin-O wurde von Dr. Bhakdi (Institut für medizi­ nische Mikrobiologie, Universität Mainz, Deutschland) bezogen. Glucoseoxi­ dase, Katalase, Hexokinase, Herbimycin, Rapamycin, Chelerythrin, Staurosporin, H7 und Phorbol-12-myristat-13-acetat wurden von Sigma bezogen. Genistein und Okadainsäure wurden von LC Laboratories bezogen. Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm stammte von Boehringer Mannheim. SB-203580 wurde von Dr. J. C. Lee (Smith Kline Beecham) zur Verfügung gestellt.

1.2 Permeabilisierung von B6 Fibroblasten mit Streptolysin-O (SLO)

Vor der Permeabilisierung wurden B6 Fibroblasten wie von Pantopoulos und Hentze (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 1267-1271) beschrieben kultiviert, 2 mal mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen, durch vorsichtige Zentrifugation (1000 g bei 5 min) pelletiert und in SLO-Puffer (25 mM Hepes-KOH, pH 7, 4, 115 mM Kaliumacetat, 2,5 mM Magnesium­ acetat und 10 mM Glucose) resuspendiert. Die Zellen wurden mit 0,5 µg/ml SLO für 10 min auf Eis behandelt, durch vorsichtige Zentrifugation pelletiert, in SLO-Puffer resuspendiert (10⁷ Zellen/ml) und bei 37°C für 20 min geschüttelt. Die Permeabilisierung war < 95%, wie durch die Trypanblau- Ausschlußmethode bestimmt wurde.

Ein für die weiteren Versuche geeigneter zellfreier Extrakt konnte auch durch hypotonische Lyse hergestellt werden. Hierzu wurden die Zellen in SLO-Puffer gequollen, 1 : 10 verdünnt und in einem Stampfer (4-10 Stöße) homogenisiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation bei 10 000 g für 5 min aufgeklart. Die Überstände wurden einer Ultrazentrifugation bei 100 000 g für 1 h unterzogen. Die dabei erhaltenen Überstände können - vorzugsweise nach Einstellung isotonischer Bedingungen - ohne Zusatz weiterer Komponenten als Nachweissystem für Targetmoleküle von reaktiven Sauerstoffintermediaten verwendet werden.

1.3 Behandlung mit einem H₂O₂ erzeugendem System

SLO-permeabilisierte Zellen wurden mit H₂O₂ behandelt, das enzymatisch durch Glucoseoxidase und Glucose erzeugt worden war. Die Suspension wurde für die jeweils angegebenen Zeiten bei 37°C geschüttelt. Die Gleichgewichtskonzentration von H₂O₂ in der Suspension (k_G = 1,4 × 10^-8 M.s^-1) wurde auf ca. 50 µM unter Berücksichtigung des Abbaus durch zelluläre Aktivitäten (Pantopoulos et al., J. Biol. Chem. 272 (1997), 9802-9808) geschätzt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe eines Überschusses an Katalase (k_cat-695 s^-1) abgestoppt, und die Zellen wurden durch Zen­ trifugation pelletiert. Wo angegeben, wurden aus den Pellets stammende Lysate durch Lyse von Zellen in 1% (w/w) Triton X100, 40 mM KCl und 25 mM Tris-Cl pH 7,4 (cytoplasmatischer Lysepuffer) und Zentrifugation erhalten.

1.4 Test auf elektrophoretische Mobilitätsänderung (EMSA)

EMSA Tests wurden mit einer radiomarkierten humanen H-Ketten-IRE-Sonde wie bei Pantopoulos und Hentze (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 1267-1271) beschrieben durchgeführt. Die Komplexbildung zwischen Eisen­ reaktivem Element und Eisenregulationsprotein-1 wurde durch Phosphorima­ ging quantitativ bestimmt.

2. Ergebnisse 2.1 In vitro Rekonstitution der Aktivierung von Eisenregulationsprotein-1 (IRP-1) durch H₂O₂

Als Testsystem wurden mit Streptolysin O (SLO), einem S.aureus Toxin, das an Cholesterin in der Plasmamembran bindet, aggregiert und Transmem­ branporen bis zu 30 nm Durchmesser bildet (Bhakdi et al., Infect. Immun. 47 (1985), 52-60), behandelte Zellen verwendet. Die Permeabilisierung mit SLO erlaubte eine Diffusion von löslichen Zellbestandteilen und eine Abtrennung des Cytosols vom Zellpellet durch Zentrifugation.

Die Reaktion von IRP-1 auf H₂O₂ wurde zuerst in Suspensionen von jeweils 10⁷ SLO-permeabilisierten B6 Fibroblasten und intakten Kontroll-B6 Fibroblasten in 250 µl SLO-Puffer bestimmt. Nach einstündiger Behandlung mit H₂O₂ wurde die IRE-Bindungsaktivität in den Überständen und aus Pellets stammenden Lysaten unter Verwendung einer radiomarkierten IRE-Sonde durch EMSA analysiert. Obwohl eine geringe IRP-1 Aktivität im Lysat aus Pellets intakter Kontrollzellen nachgewiesen werden konnte, findet man IRP-1 überwiegend im Überstand aus SLO-permeabilisierten Zellen. Die Behandlung SLO-permeabilisierter Zellen mit H₂O₂ aktiviert IRP-1 ebenso wie in intakten Zellen (7-fache Induktion in intakten Zellen und 4-fache Induktion in permeabilisierten Zellen). Zusätzlich wurden jeweils identische Proben mit 2% 2-Mercaptoethanol behandelt, um die IRE-Bindung von dormantem IRP-1 in vitro vollständig zu aktivieren (Hentze et al., Science 244 (1989), 357-359), und anschließend dem EMSA-Test unterzogen. Es wurde gefunden, daß mehr als 95% des cytoplasmatischen IRP-1 aus dem Zellpellet nach Permeabilisierung mit SLO freigesetzt wird. Die daraus zu ziehende Schlußfolgerung ist, daß die Permeabilisierung von B6 Fibroblasten mit SLO quantitativ ist, und daß die Behandlung der permeabilisierten Zellen mit H₂O₂ zur Aktivierung von IRP-1 führt.

Als nächstes wurde getestet, ob das durch SLO Permeabilisierung erhaltene Cytosol selbst alle notwendigen Komponenten für die Aktivierung von IRP-1 durch H₂O₂ enthielt. Hierzu wurden B6 Fibroblasten mit SLO permeabilisiert, das Cytosol durch Zentrifugation abgetrennt, und das Zellpellet wurde in SLO Puffer gewaschen und resuspendiert. Cytosol und resuspendierte Zellen wurden jeweils in vier Aliquots unterteilt. Zwei der Aliquots wurden separat mit (oder ohne) H₂O₂ behandelt, während die anderen Aliquots der Zellen und des Cytosols in einem Verhältnis von 1 : 1 vermischt und anschließend entweder mit H₂O₂ versetzt oder ohne Zusatz von H₂O₂ verwendet wurden. Nach einer Stunde wurden gleiche Volumina der Überstände durch Zentrifugation gewonnen und durch einen EMSA-Test auf IRE-Bindung analysiert. Während eine Behandlung des Cytosols alleine mit H₂O₂ keinen Effekt auf die IRP-1 Aktivität hat, findet in der Kombination aus der cytosolischen Fraktion mit der Zellpelletfraktion eine IRP-1 Aktivierung durch H₂O₂ statt. Dieses Ergebnis stellt eine in vitro Rekonstitution der IRP-1 Aktivierung durch H₂O₂ dar und zeigt, daß - bei Lyse der Zellen mit SLO - unlösliche Zellfaktoren notwendig sind, um das H₂O₂-Signal aufzunehmen oder/und zu übertragen.

Um zu bestimmen, ob diese Befunde tatsächlich der in vivo Reaktion von IRP-1 auf H₂O₂ entsprechen, wurde die Kinetik der IRP-1 Aktivierung durch H₂O₂ in intakten und SLO-permeabilisierten Zellen verglichen. Entsprechend bisherigen Ergebnissen in vivo (Pantopoulos und Hentze, EMBO J. 14 (1995), 2917-2924; Martins et al., Arch. Biochem. Biophys. 316 (1995), 128-134; Pantopoulos et al., Mol. Cell. Biol. 16 (1996), 3781-3788; Pantopoulos et al., J. Biol. Chem. 272 (1997), 9802-9808), führte die Behandlung von SLO-permeabilisierten B6 Fibroblasten mit H₂O₂ zu einer partiellen (2,7-fachen) Aktivierung von IRP-1 nach 15 min und zu einer vollständigen Aktivierung innerhalb 30 bis 60 min (4,2- bzw. 7-fach). Es wurde keine signifikante Aktivierung innerhalb der ersten 10 min der Behandlung gefunden. Eine gleichzeitige Zugabe eines Überschusses an Katalase zusammen mit dem H₂O₂-erzeugenden System, wodurch eine H₂O₂ Anreicherung verhindert wird, gefolgt durch Inkubation für 60 min bei 37°C führte zu einer vollständigen Hemmung der IRP-1 Aktivierung. Somit ist die gefundene Aktivierung von IRP-1 im verwendeten zellfreien System von H₂O₂ abhängig und zeigt eine identische Kinetik wie in intakten Zellen.

Bei Zugabe eines Überschusses an Katalase durch Beendigung eines 5 bis 15 minütigen Pulses mit H₂O₂ und nachfolgendem Chase der Suspension bei 37°C für bis zu 1 h wird inaktives IRP-1 teilweise 3,6- und 5-fach induziert und teilweise aktiviertes IRP-1 wird vollständig (6,8-fach) in Abwesenheit von H₂O₂ aktiviert. Dies entspricht genau früheren Befunden an intakten Zellen. Interessanterweise scheint das Vorliegen von unlöslichen Faktoren für beide Phasen der IRP-1 Aktivierung durch H₂O₂ bedeutsam zu sein, da die Signalübertragung der IRP-1 Aktivierung nach einem anfänglichen Puls mit H₂O₂ nicht signifikant im separaten SLO-Cytosol stattfindet (2,8-fache Induktion).

2.2 Temperatur- und Energieabhängigkeit der Aktivierung von IRP-1 durch H₂O₂

Aus dem obigen Ergebnis geht hervor, daß das transiente Vorliegen von H₂O₂ bei einer Konzentration oberhalb eines kritischen Schwellenwerts eine Stressreaktion sowohl in intakten als auch in SLO-permeabilisierten Zellen hervorruft, welche zur Aktivierung von IRP-1 führt. Um zu bestimmen, ob dieser Mechanismus temperatursensitiv ist, wurden SLO-permeabilisierte Zellen mit einem Bolus von 0,5 oder 1 mM H₂O₂ für 1 h bei 37°C oder 4°C behandelt. Um den raschen Abbau von H₂O₂ durch zelluläre Katalase zu verhindern, wurden die Zellen mit 50 mM des Katalaseinhibitors 3-Amino- 1,2,4-triazol 2 h vor der Permeabilisierung vorbehandelt.

Eine Analyse der IRE-Bindungsaktivität durch einen EMSA-Test zeigt, daß die Aktivierung von IRP-1 durch H₂O₂ nur bei 37°C, aber nicht bei 4°C erfolgt. Um zu bestimmen, ob die IRP-1 Aktivierung energieabhängig ist, wurden die ATP-Pools durch Vorbehandlung der SLO-permeabilisierten Zellen mit Hexokinase/Glucose erschöpft. Diese Behandlung führte zu einem vollständigen Wegfall der IRP-1 Aktivierung durch H₂O₂, was darauf hinweist, daß ATP eine bedeutsame Rolle im Mechanismus spielt, ver­ mutlich als Energiequelle oder/und als Phosphatgruppendonor in Phospho­ transferreaktionen.

2.3 Hemmung der IRP-1 Aktivierung durch H₂O₂ mit ATP-yS und GTP-yS

Es wurde die Rolle der Nukleotidanaloga ATP-yS und GTP-γyS auf die Aktivierung von IRP-1 durch H₂O₂ untersucht. Dabei wurde gefunden, daß die Behandlung von SLO-permeabilisierten Zellen mit 1 mM ATP keine Wirkung zeigt, während 1 mM ATP-yS die IRP-1 Aktivierung durch H₂O₂ vollständig hemmt. Auch durch Behandlung mit 1 mM GTP-yS wurde eine vollständige Hemmung erreicht, während 1 mM GTP die IRP-1 Aktivierung durch H₂O₂ nicht hemmt. Interessanterweise wird durch Vorbehandlung SLO-permeabilisierter Zellen mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm 30 min vor der Erzeugung von H₂O₂ die IRP-1 Aktivierung verhindert. Die obigen Ergebnisse lassen vermuten, daß die Aktivierung von IRP-1 durch H₂O₂ Phosphorylierungs/Dephosphorylierungsschritte umfasst.

In allen Experimenten wurden die Permeabilisierung von Zellen und die Behandlung von H₂O₂ in einem Puffer durchgeführt, der 2,5 mM Magne­ siumionen enthält. Es stellte sich daher die Frage, ob eine Chelatierung von Mg²⁺ die Aktivierung von IRP-1 durch H₂O₂ beeinflussen könnte.

Tatsächlich wurde gefunden, daß bei Behandlung von mit SLO-permeabili­ sierten Zellen mit dem Chelator EDTA die IRP-1 Aktivierung durch H₂O₂ gehemmt wurde, während eine Behandlung mit EGTA, das ein spezifischer Chelator für Ca²⁺ ist. Keine Wirkung zeigte (vgl. 4-fache IRP-1 Aktivierung durch H₂O₂ in der Kontrolle und EGTA-behandelte Zellen mit der 1,3-fachen Aktivierung in EDTA-behandelten Zellen).

In einem Versuch, die oxidative Stressreaktion einem bereits bekannten Kinasereaktionsmechanismus zuzuordnen, wurden mehrere pharmakolo­ gische Inhibitoren auf ihre Fähigkeit zur Beeinflussung der H₂O₂-Aktivierung von IRP-1 in dem auf SLO basierenden zellfreien System getestet. Unter Verwendung von 100 µM der Kinaseinhibitoren Herbimycin, Genistein, Chelerythrin, Staurosporin, H7, SB-203580 und Rapamycin, dem Phospha­ taseinhibitor Okadainsäure (1 µM) oder Phorbol-12-myristat-13-acetat (200 ng/ml), konnte weder eine Aktivierung von IRP-1 noch eine Hemmung der H₂O₂-vermittelten Aktivierung von IRP-1 festgestellt werden.

Interessanterweise wurde als sehr starker Inhibitor des Stressreaktions­ mechanismus die auf den Metabolismus toxisch wirkende Substanz Natriumazid identifiziert, welche die Cytochromoxidase in der Atmungskette hemmt. Eine Behandlung von SLO-permeabilisierten Zellen mit ≧ 10 µM Natriumazid blockiert vollständig die Aktivierung von IRP-1 durch H₂O₂. Da Natriumazid die Erzeugung von H₂O₂ durch Glucoseoxidase und Glucose nicht verhindert, muß eine Inhibierung von Komponenten erfolgen, die bei der Aktivierung von IRP-1 durch H₂O₂ beteiligt sei.

Claims (21)

1. Verfahren zum Nachweis der Wirkung reaktiver Sauerstoffinter­ mediate auf ein Targetmolekül, umfassend die Schritte:

• (a) Bereitstellen eines Nachweissystems, umfassend das Target­ molekül und lösliche Bestandteile eines durch Aufschluß eukaryontischer Zellen hergestellten Extrakts,
• (b) Einbringen reaktiver Sauerstoffintermediate in das Nachweis­ system und
• (c) Bestimmen der Wirkung der reaktiven Sauerstoffintermediate auf das Targetmolekül.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Aufschluß der Zellen ohne Zusatz von Detergenzien erfolgt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Aufschluß der Zellen unter Zusatz von Streptalysin-O erfolgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Aufschluß der Zellen unter hypotonischen Bedingungen durch mechanische Mittel erfolgt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (b) die reaktiven Sauerstoffintermediate in situ erzeugt oder/und von außen eingesetzt werden.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Sauerstoffintermediate ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffperoxid, Wasserstoffsuperoxid, Hydroxylradikalen, Singulettsauerstoff, anorganischen Peroxiden, organischen Peroxiden, Hypochlorit, NO und Peroxynitrit.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Targetmoleküle ausgewählt werden aus für reaktive Sauer­ stoffintermediate sensitiven Faktoren und auf stromaufwärts davon wirkenden Faktoren.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die für reaktive Sauerstoffintermediate sensitive Faktoren ausgewählt werden aus dem Eisenstoffwechsel regulierenden Proteinen wie IRP-1, stress-sensitiven Transkriptions-Faktoren wie NF-KB, c-fos, d-jun und egr-1 und redox-regulierten Kineasen wie p56^Ick und SOK-1.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein ATP und Magnesiumionen enthaltendes Nachweis­ system verwendet.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (c) einen elektrophoretischen Mobilitätsshift-Assay (EMSA) umfaßt.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (c) eine kinetische Bestimmung oder/und eine Endpunkt­ bestimmung umfaßt.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Identifizie­ rung von Effektorsubstanzen für die Wirkung reaktiver Sauerstoff­ intermediate, weiterhin umfassend das Einbringen einer zu testenden potentiellen Effektorsubstanz in das Nachweissystem und das Bestimmen der Wirkung der reaktiven Sauerstoffintermediate nach Einwirkung der potentiellen Effektorsubstanz auf das im Nachweis­ system befindliche Targetmolekül.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man eine parallele Bestimmung in Abwesenheit der zu testenden potentiellen Effektorsubstanz durchführt.

14. Verwendung von y-S enthaltenden Nukleotidanaloga zur Hemmung der durch reaktive Sauerstoffintermediate hervorgerufenen Aktivie­ rung von IRP-1.

15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die y-S enthaltende Nukleotidanaloga ATP-yS oder/und GTP-yS sind.

16. Verwendung von Effektoren für Phosphorylierungs- oder/und Dephosphorylierungsreaktionen zur Beeinflussung der durch reaktive Sauerstoffintermediate hervorgerufenen Wirkungen auf Targetmole­ küle.

17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Effektoren pharmazeutisch verträgliche Substanzen sind.

18. Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen, die durch die Wirkungen reaktiver Sauerstoffinterme­ diate hervorgerufen werden.

19. Verwendung nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Gewebeschädigungen wie Hypoxie und Reperfu­ sionsschäden.

20. Verwendung nach Anspruch 18, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von entzündlichen Prozessen wie rheumatoide Arthritis.

21. Verwendung nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere solchen mit lokal gestörtem Eisenmetabolismus wie Parkinson'scher Krankheit.