DE19806780C1

DE19806780C1 - Vorrichtung zur Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE19806780C1
Application number: DE1998106780
Authority: DE
Inventors: Wolf Prof Dr Bertling
Original assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Current assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Priority date: 1998-02-18
Filing date: 1998-02-18
Publication date: 1999-07-01
Anticipated expiration: 2018-02-19

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren nach dem Oberbegriff der An spruchs 1.

Eine solche Vorrichtung ist z. B. aus der WO 88/09201 A1 be kannt. Dabei kann eine DNA-haltige Lösung zur Isolierung und Aufreinigung der DNA durch ein Adsorptionsmittel geführt wer den. Die DNA wird im Adsorptionsmittel zurückgehalten. Zur Aufreinigung wird anschließend eine Waschlösung durch das Ad sorptionsmittel geführt. Danach wird die aufgereinigte DNA mittels einer Elutionslösung vom Ionentauscher eluiert.

Zur Durchführung des bekannten Verfahrens ist es aus der PCT/EP95/00392 bekannt, eine Einwegspritze mit einem darin aufgenommenen Adsorptionsmittel zu verwenden. Zur Bedienung der bekannten Vorrichtung, insbesondere zum Ansaugen der Lö sungen, sind zwei Hände erforderlich. Es bleibt keine Hand frei, um ein die anzusaugende Lösung enthaltendes Gefäß zu halten. Die Innenseite des Hohlzylinders der Einwegspritze muß zur Gewährleistung der erforderlichen Dichtigkeit eine hohe Oberflächenqualität aufweisen. Das erhöht die Herstel lungskosten.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Insbesondere soll eine kostengünstig herstellbare Vorrichtung angegeben werden, de ren Handhabung vereinfacht ist.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 10.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann nach Art einer Pipet tenspitze mit gängigen Kolbenpipettiervorrichtung benutzt werden. Das Ansaugen und Ausstoßen der Lösungen ist mit einer Hand möglich. Aus herstellungstechnischer Sicht kann auf das Vorsehen eines separaten Kolbens verzichtet werden. Die Ober flächengüte der Innenwand des Hohlzylinders ist unkritisch. Dadurch werden die Herstellungskosten verringert.

Nach einer Ausgestaltung ist das Verschlußmittel ein erstes Einwegventil, das entgegen einer vom zweiten zum ersten Durchgang gerichteten Strömung sperrt. Dabei kann es sich um ein mit einer Kugel oder einem konischen Verschlußkörper ver schließbares Ventil handeln. Zweckmäßigerweise kann die Aus laßöffnung mittels eines zweiten Einwegventils verschließbar sein, das entgegen einer vom ersten zum zweiten Durchgang ge richteten Strömung sperrt. Das erste und/oder zweite Einweg ventil weist/weisen vorzugsweise eine flexible Membran auf. Die Vorrichtung ist zweckmäßigerweise zusammen mit der/n Mem bran/en in einstückiger Ausbildung aus spritzgegossenem Kunststoff hergestellt.

Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal ist der erste Durchgang als in Richtung zur Auslaßöffnung konisch sich ver jüngendes Rohr ausgebildet. Dabei ist die Ansaugöffnung des zweiten Durchgangs vorteilhafterweise in der Nähe der Auslaß öffnung angeordnet. Das erleichtert das Ausstoßen bzw. Ansau gen von Lösung aus bzw. in die Vorrichtung.

Im ersten Durchgang kann ein Adsorptionsmittel vorgesehen sein, welches vorteilhafterweise zwischen der Auslaßöffnung und der Austrittsöffnung angeordnet ist. Das Adsorptionsmit tel kann zwischen einem oberen und einem unteren Filtermittel angeordnet sein. Zweckmäßigerweise befindet sich die Mündung so weit oberhalb des oberen Filtermittels, daß die Füllhöhe eines vorgegebenen anzusaugenden Volumens kleiner ist als der Abstand zwischen dem unteren Mündungsrand und der Oberseite des oberen Filtermittels.

Um ein unerwünschtes Eintreten von Lösung in die Kolbenpipet tiervorrichtung zu vermeiden, kann ein weiteres Filtermittel in der Nähe der Anschlußöffnung vorgesehen sein. In diesem Fall befindet sich die Mündung zwischen dem weiteren und dem oberen Filtermittel.

Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Hierin zeigen

Fig. 1 eine schematische Querschnittsansicht im Ansaugzu stand und

Fig. 2 die Ansicht nach Fig. 1 im Ausstoßzustand.

In den Fig. 1 und 2 umgibt ein konisch sich in Richtung einer Auslaßöffnung 1 verjüngendes erstes Rohr 2 einen ersten Durchgang D1. Eine Anschlußöffnung 3 ist so ausgebildet, daß die Vorrichtung reibschlüssig auf eine Kolbenpipettiervor richtung (hier nicht dargestellt) aufsteckbar ist. Ein zwei tes an der Außenwand des ersten Rohrs 2 angebrachtes Rohr 4 umgibt einen zweiten Durchgang D2. Das zweite Rohr 4 weist in der Nähe der Auslaßöffnung 1 eine Ansaugöffnung 5 auf. Eine Austrittsöffnung 6 mündet radial in den ersten Durchgang D1. Das zweite Rohr 4 ist hier an der Außenwand des ersten Rohrs 2 angespritzt. Es ist aber auch denkbar, daß der zweite Durchgang D2 in Form eines den ersten Durchgang D1 umgebenden Ringkanals ausgebildet ist.

Die Auslaßöffnung 1 ist mit einer flexiblen ersten Membran 7 verschlossen, welche im Ausgangszustand an einer Fläche F1 anliegt. Die Austrittsöffnung 6 ist mit einer flexiblen zwei ten Membran 8 verschlossen, die im Ausgangszustand an einer Fläche F2 anliegt.

Im ersten Durchgang D1 ist zwischen einem oberen 9 und einem unteren Filtermittel 10 ein Adsorptionsmittel 11 aufgenommen. In der Nähe des Anschlußstutzens 3 ist ein weiters Filtermit tel 12 vorgesehen.

Bei den Filtermitteln 9, 10 und 12 kann es sich um eine Glas fritte oder dgl. handeln. Die Wahl des Adsorptionsmittels 11 richtet sich nach dem aus der Lösung zu isolierenden Biomole kül. Im Falle von DNA wird vorzugsweise ein positiv geladener Anionentauscher auf Silika-Basis gewählt. In diesem Zusammen hang ist zu bemerken, daß die Vorrichtung sich auch zur Iso lierung und Aufreinigung anderer Biomoleküle, wie RNA und dgl., eignet.

Der Abstand zwischen der Oberseite des oberen Filtermittels 9 und dem unteren Mündungsrand der Eintrittsöffnung 6 ist mit h1 bezeichnet. Der Abstand h1 ist vorzugsweise so gewählt, daß er größer ist als eine bei einem voreingestellten Ansaug volumen sich ergebende Füllhöhe h2 einer angesaugten Flüssig keit FL.

Die Funktion der Vorrichtung wird nun anhand der Fig. 1 und 2 erläutert.

In Fig. 1 ist die Vorrichtung im Ansaugzustand gezeigt. Die Auslaßöffnung 1 und die Ansaugöffnung 5 tauchen in die aufzu nehmende Flüssigkeit FL ein. Im ersten D1 und zweiten Durch gang D2 herrscht Unterdruck. Infolge des Unterdrucks liegt die erste Membran 7 dichtend an der Fläche FL an; die Auslaß öffnung 1 ist verschlossen. Die Flüssigkeit FL wird durch den zweiten Durchgang D2 in den Raum des ersten Durchgangs D1 eingesaugt, welcher zwischen dem oberen 9 und dem weiteren Filtermittel 12 gebildet ist. Dabei öffnet die zweite Membran 8. In der angesaugten Flüssigkeit FL befindet sich beispiels weise zu isolierende DNA.

Sobald das vorgegebene Volumen an Flüssigkeit FL sich voll ständig im ersten Durchgang D1 befindet, wird die Vorrichtung über einen Auffangbehälter gebracht. Anschließend wird durch Betätigung der Kolbenpipettiervorrichtung Überdruck im ersten Durchgang D1 erzeugt. Infolgedessen wird die zweite Membran 8 gegen die zweite Fläche F2 gedrückt und dadurch die Aus trittsöffnung 6 dicht verschlossen. Der Überdruck wirkt auf die oberhalb des ersten Filtermittels 9 mit einer Füllhöhe h2 stehende Flüssigkeit FL. Die Flüssigkeit FL wird durch das Filtermittel 9, das Adsorptionsmittel 11 und das untere Fil termittel 10 gedrückt und tritt an der Auslaßöffnung 1 der Vorrichtung aus. In der Flüssigkeit FL befindliche DNA wird im Adsorptionsmittel 11 zurückgehalten.

Zur Aufreinigung der im Adsorptionsmittel 11 zurückgehaltenen DNA wird nun der vorgenannte Vorgang wiederholt, wobei eine Waschlösung angesaugt und nachfolgend durch das Adsorptions mittel 11 gedrückt wird. Schließlich erfolgt die Elution der DNA. Dazu wird eine geeignete Elutionslösung angesaugt und durch das Adsorptionsmittel 11 gedrückt. Das Elutionsvolumen enthält die isolierte und aufgereinigte DNA. Anschließend kann die Vorrichtung durch Betätigen eines Pipettenspitzenab werfers verworfen werden.

Nach einer weiteren (hier nicht gezeigten) Variante kann das zweite Rohr 4 innerhalb des ersten Durchgangs D1 angeordnet sein. In diesem Fall ist das zweite Rohr 4 konisch ausgebil det und umgibt einen konischen Verschlußkörper. Der Ver schlußkörper erstreckt sich zur Minimierung eines im zweiten Durchgang D2 verbleibenden Totvolumens über einen wesentli chen Abschnitt desselben; er ist axial bewegbar. Beim Ansau gen wird der konische Verschlußkörper angehoben und ermög licht Flüssigkeitsdurchtritt. Bei der Erzeugung eines Über drucks im ersten Durchgang D1 wird der erste Durchgang durch den konischen Verschlußkörper dicht verschlossen. Die ange saugte Flüssigkeit kann dann durch das im ersten Durchgang befindliche Adsorptionsmittel gedrückt werden.

Das vorbeschriebene Verfahren kann einfach und schnell mit einer Hand durchgeführt werden.

Bezugszeichenliste

1

Auslaßöffnung

2

erstes Rohr

3

Anschlußöffnung

4

zweites Rohr

5

Ansaugöffnung

6

Austrittsöffnung

7

erste Membran

8

zweite Membran

9

oberes Filtermittel

10

unteres Filtermittel

11

Adsorptionsmittel

12

weiteres Filtermittel
D1erster Durchgang
D2zweiter Durchgang
F1erste Fläche
F2zweite Fläche
h1Abstand
h2Füllhöhe
FLFlüssigkeit

Claims

1. Vorrichtung zur Isolierung und Aufreinigung von Nuklein säuren mit einem zur Aufnahme eines Adsorptionsmittels (11) geeigneten ersten Durchgang (D1), der eine Anschlußöffnung (3) zum Anschluß an eine Kolbenpipettiervorrichtung und eine Auslaßöffnung (1) aufweist, und einem zweiten eine Ansaug- (5) und eine Austrittsöffnung (6) aufweisenden Durchgang (D2), wobei die Austrittsöffnung (6) in den ersten Durchgang (D1) mündet und in der Nähe der Mündung ein erstes Verschluß mittel (8) vorgesehen ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Verschlußmittel (8) ein erstes Einwegventil ist, das entgegen einer vom zweiten (D2) zum ersten Durchgang (D1) gerichteten Strö mung sperrt.

3. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo bei die Auslaßöffnung (1) mittels eines zweiten Einweg ventils verschließbar ist, das entgegen einer vom ersten (D1) zum zweiten Durchgang (D2) gerichteten Strömung sperrt.

4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo bei das erste und/oder das zweite Einwegventil eine fle xible Membran (7, 8) aufweist/aufweisen.

5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo bei der erste Durchgang (D1) als in Richtung der Auslaß öffnung (1) konisch sich verjüngendes Rohr (2) ausgebil det ist.

6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo bei die Ansaugöffnung (5) des zweiten Durchgangs (D2) in der Nähe der Auslaßöffnung (1) angeordnet ist.

7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo bei das Adsorptionsmittel (11) zwischen der Auslaßöffnung (1) und der Austrittsöffnung (6) angeordnet ist.

8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo bei das Adsorptionsmittel (11) zwischen einem oberen (9) und einem unteren Filtermittel (10) angeordnet ist.

9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo bei ein weiteres Filtermittel (12) in der Nähe der An schlußöffnung (3) angeordnet ist.

10. Kolbenheberpipette mit einer Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche.