DE19801243A1 - New avian vitelline anti-conglutinin antibodies useful for diagnosing mastitis - Google Patents

New avian vitelline anti-conglutinin antibodies useful for diagnosing mastitis

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Abstract

Avian vitelline anti-conglutinin antibodies (I) are new. An Independent claim is also included for a kit comprising labeled (I) and standard dilutions of conglutinin.

Description

Die Erfindung betrifft aviäre, vitelline, gegen Conglutinin gerichtete Antikörper, ihre Herstellung sowie ihre Verwendung zur Bestimmung von Conglutinin, z. B. in einem Enzym- Immuno-Assay (EIA).The invention relates to avian, vitelline antibodies directed against conglutinin, their Production and their use for the determination of conglutinin, e.g. B. in an enzyme Immunoassay (EIA).

Conglutinin gehört zur Gruppe von Säuger-Lectinen, die eine collagenartige Struktur besitzen und auch als Collectine (Collagenartige Lectine) oder C-Typ-Collectine bezeichnet werden. Es wird ausschließlich in der Leber gebildet und ist nachweislich an einer Reihe von Antikörper-unabhängigen Erkennungs- und Clearancevorgängen beteiligt, die zur Neutralisation und Eleminierung pathogener Erreger führen.Conglutinin belongs to the group of mammalian lectins that have a collagen-like structure own and also called collectine (collagen-like lectine) or C-type collectine become. It is formed exclusively in the liver and has been shown to be present in a number of Antibody-independent detection and clearance processes involved in the Neutralization and elimination of pathogenic pathogens.

Mit Hilfe eines Enzym-Immuno-Assays bestimmten AKIYAMA, K.; SUGII, S. und HIROTA, Y. (Am. J. Vet Res. 1992, 53(11), 2102-4) die Konzentration von Conglutinin im Blutserum bei 2 bis 7 Jahre alten, gesunden Kühen. Im Mittel waren 56,5 ± 14,4 µg Conglutinin nachweisbar.Using an enzyme immunoassay, AKIYAMA, K .; SUGII, S. and HIROTA, Y. (Am. J. Vet Res. 1992, 53 (11), 2102-4) the concentration of conglutinin in Blood serum in healthy cows aged 2 to 7 years. The mean was 56.5 ± 14.4 µg Detectable conglutinin.

In einer Studie über die Rolle von Conglutinin bei der Infektionsabwehr zeigten Kühe mit Euterentzündungen (Mastitis) signifikant geringere Serumkonzentrationen als klinisch - gesunde Kühe. Nach überstandener Mastitis bzw. nach deren erfolgreicher Behandlung steigt die Serumkonzentration des Conglutinins wieder an (AKIYAMA, K.; SUGII, S. und HIROTA, J., VET-MED SCI. 1992, 54(5), 977-81).In a study on the role of conglutinin in the defense against infection, cows showed Udder inflammation (mastitis) significantly lower serum concentrations than clinically - healthy cows. After mastitis has been overcome or after successful treatment, it increases the serum concentration of conglutinin again (AKIYAMA, K .; SUGII, S. and HIROTA, J., VET-MED SCI. 1992, 54 (5), 977-81).

Manca et al. (Trans Roy Soc. Trop.Med. Ayg. vol 82, 1988: pp 254-257), Bo-Hai und Shu- Rong (Exp. Mol.Path. vol 47, 1987: pp 175-184) zeigten den Nachweis des Antigens von Schistosama haematobium und Coxiella burnetti in Immunkomplexen unter Verwendung von Conglutinin auf.Manca et al. (Trans Roy Soc. Trop.Med. Ayg. Vol 82, 1988: pp 254-257), Bo-Hai and Shu- Rong (Exp. Mol.Path. Vol 47, 1987: pp 175-184) showed detection of the antigen of Schistosama haematobium and Coxiella burnetti in immune complexes using Conglutinin on.

Mit dem US-Patent 5132287 (1992, J.C. Jensenius: Methods of treating disorders which cause conglutinin deficiency) sind monoklonale und polyklonale Antikörper gegen humanes Conglutinin sowie ihre therapeutische und diagnostische Verwendung beschrieben worden. Darin wird auch auf die Schutzwirkung von Conglutinin bei bakteriellen Infektionen und auf seine Rolle bei der Bindung der iC3b-Fraktion des Komplements hingewiesen (nach Hirani et al., J. Immunol. 134 (1985) 1105-1109; vgl. auch Patent DE 195 38 509).U.S. Patent 5,132,287 (1992, J.C. Jensenius: Methods of treating disorders which cause conglutinin deficiency) are monoclonal and polyclonal antibodies against human Conglutinin and its therapeutic and diagnostic uses have been described. It also addresses the protective effects of conglutinin on bacterial infections and pointed out its role in binding the iC3b fraction of the complement (according to Hirani et al., J. Immunol. 134 (1985) 1105-1109; see. also patent DE 195 38 509).

Der Erfindung liegen die Aufgaben zugrunde, gegen Conglutinin gerichtete Antikörper sowie ein in vitro Diagnoseverfahren und ein Testbesteck zur Erkennung von Rindermastitiden zur Verfügung zu stellen. Die Aufgaben wurde durch die Herstellung aviärer, vitelliner, gegen Conglutinin gerichteter Antikörper und die Entwicklung eines Enzym-Immuno-Assays (EIA) gelöst, mit dem Conglutinin in der Rohmilch bestimmt wird. Das erfindungsgemäße Testbesteck beruht auf einem EIA, der als Sandwich-EIA mit Dottersack-Antikörpern (IgY) gegen bovines Conglutinin entwickelt wurde.The invention is based on the objects, antibodies directed against conglutinin and an in vitro diagnostic method and a test kit for the detection of bovine mastitis To make available. The tasks were countered by the production of avian, vitelline, Conglutinin-Targeted Antibodies and the Development of an Enzyme Immuno-Assay (EIA) dissolved, with which conglutinin is determined in the raw milk. The invention Test kit is based on an EIA, which is a sandwich EIA with yolk sac antibodies (IgY) was developed against bovine conglutinin.

Zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Antikörper wird zunächst Conglutinin aus Rinderserum hergestellt und ein Conglutinin-Adjuvans-Gemisch bereitet, mit dem Hennen immunisiert werden. Aus den Eiern dieser Hennen werden die Dotter abgetrennt und aufbereitet. Dazu werden die Dotter nach Verdünnen mit Wasser zentrifugiert, aus dem Überstand nach Versetzen mit NaSO4 die IgY durch Zentrifugieren gefällt und durch Dialysieren gegen PBS sowie mit Hilfe der Affinitäts-Chromatographie an Conglutinin weiter gereinigt.To obtain the antibodies according to the invention, conglutinin is first prepared from bovine serum and a conglutinin-adjuvant mixture is prepared, with which hens are immunized. The yolks are separated from the eggs of these hens and processed. For this purpose, the yolks are centrifuged after dilution with water, the IgY is precipitated from the supernatant after addition with NaSO 4 by centrifugation and further purified by dialysis against PBS and with the aid of affinity chromatography on conglutinin.

Das erfindungsgemäße Testbesteck besteht aus a) gereinigten, festphasegebundenen, aviären, vitellinen Antikörpern gegen bovines Conglutinin, b) gereinigtem Conglutinin für die Standardverdünnungen, c) gereinigten Enzym-markierten Antikörpern (IgY) gegen bovines Conglutinin, d) Beschichtungspuffer, e) Proben-Verdünnungspuffer, f) Waschpuffer. The test kit according to the invention consists of a) cleaned, solid phase-bound, avian, vitelline antibodies against bovine conglutinin, b) purified conglutinin for the Standard dilutions, c) purified enzyme-labeled antibodies (IgY) against bovines Conglutinin, d) coating buffer, e) sample dilution buffer, f) washing buffer.  

In der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren beschrieben, nach dem eine Beurteilung der Eutergesundheit laktierender Milchkühe über die Bestimmung der Conglutinin- Konzentration in Rohmilchproben der einzelnen Euterviertel ermöglicht wird:
Die Rohmilchproben werden im Verhältnis 1 : 5 mit Proben-Puffer verdünnt und davon jeweils 100 µl in die Kavitäten einer Mikrotiterplatte pipettiert, die vorher mit aviären, vitellinen Antikörpem (IgY) gegen bovines Conglutinin beschichtet wurden. Während der folgenden Inkubationszeit bindet dieser, an die feste Phase (Mikrotiterplatte) gebundene, Antikörper in der Rohmilchprobe vorhandenes Conglutinin. Die ungebundenen Probenbestandteile werden durch nachfolgende Spülung der Kavitäten mit Waschpuffer entfernt. Anschließend wird ein Enzym-markierter, gegen bovines Conglutinin gerichteter Antikörper in die Kavitäten der Mikroplatte pipettiert und inkubiert. Ungebundene Enzym­ markierte Antikörper werden durch die nachfolgende Spülung mit Waschpuffer entfernt. Der Nachweis ihrer Bindung wird durch die Zugabe eines Enzym-spezifischen Substrates möglich, dessen Umsatz zu einer Veränderung der optischen Dichte führt, die in einem Photometer gemessen werden kann. Der Substratumsatz ist zeitlich begrenzt und wird durch die Zugabe einer Stopplösung unterbrochen. Im Vergleich zu einer Standardkurve aus Meßwerten von Proben mit bekannter Conglutinin-Konzentration kann die Conglutinin- Konzentration in den Rohmilchproben rechnerisch ermittelt werden.In the present invention, a method is described according to which an assessment of the udder health of lactating dairy cows is made possible by determining the conglutinin concentration in raw milk samples of the individual udder quarters:
The raw milk samples are diluted 1: 5 with sample buffer and 100 µl of each pipetted into the wells of a microtiter plate, which were previously coated with avian, vitelline antibodies (IgY) against bovine conglutinin. During the following incubation period, this antibody, bound to the solid phase (microtiter plate), binds the conglutinin present in the raw milk sample. The unbound sample components are removed by subsequent rinsing of the cavities with wash buffer. An enzyme-labeled antibody directed against bovine conglutinin is then pipetted into the cavities of the microplate and incubated. Unbound enzyme-labeled antibodies are removed by subsequent rinsing with wash buffer. The detection of their binding is made possible by the addition of an enzyme-specific substrate, the conversion of which leads to a change in the optical density, which can be measured in a photometer. The substrate turnover is limited in time and is interrupted by the addition of a stop solution. In comparison to a standard curve from measured values of samples with a known conglutinin concentration, the conglutinin concentration in the raw milk samples can be calculated.

Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß Kühe mit Euterentzündungen signifikant höhere Conglutinin-Konzentrationen in der Rohmilch aufweisen als klinisch gesunde Kühe. Bei der Beteiligung spezifisch euterpathogener Bakterien ist bereits im Stadium der subklinischen Mastitis ein deutlicher Anstieg der Conglutinin-Konzentration in der Rohmilch der betroffenen Euterviertel zu verzeichnen.Surprisingly, it was found that cows with udder inflammation were significant have higher conglutinin concentrations in raw milk than clinically healthy cows. When specifically udder pathogenic bacteria are involved, the subclinical mastitis a marked increase in conglutinin concentration in raw milk of the affected udder quarters.

Das eröffnet die Möglichkeit, diesen Parameter für diagnostische Tests in Rahmen der Früherkennung von Rindermastitiden einzusetzen.This opens up the possibility of using this parameter for diagnostic tests as part of the Use early detection of bovine mastitis.

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail with the aid of exemplary embodiments.

AusführungsbeispieleEmbodiments Beispiel 1example 1 Herstellung von ConglutininProduction of conglutinin

Conglutinin-reiches Rinderserum wird mit Hilfe des Agglutinations-Tests für rote Blutkörperchen (red cell clumping test) nach COOMBS et al. ausgewählt (Blackwell: The Serology of Conglutination and its relation to Disease, 1961: pp. 172-175).Conglutinin-rich bovine serum is tested for red using the agglutination test Blood cells (red cell clumping test) according to COOMBS et al. selected (Blackwell: The Serology of Conglutination and its relation to Disease, 1961: pp. 172-175).

Serum mit einem Titer von über 1 : 640 wird in einer Menge von einem Liter mit Zymosan für 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Das Zymosan wird nach der Beschreibung von COOMBS et al. (1961) hergestellt. Nach dieser Inkubation wird das Produkt dreimal mit dem gleichen Volumen Veronal(Barbital)-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und anschließend das Conglutinin, durch Hinzufügen eines 0,01 M Phosphat-Puffers mit 0,02 M EDTA, 10 Minuten bei Raumtemperatur eluiert. Das Produkt wird danach zentrifugiert und der conglutininhaltige Überstand über Nacht gegen 0,1 M TRIS, 0,3 M NaCl, bei pH 8 dialysiert. Die abschließende Reinigung erfolgt über eine Anionenaustausch-Chromatographie an einer Mono-Q™-Säule unter Verwendung eines NaCl-Gradienten im FPLC-System (Pharmacia).Serum with a titer of over 1: 640 is used in an amount of one liter with Zymosan for Incubated for 2 hours at 4 ° C. The zymosan is described by COOMBS et al. (1961). After this incubation, the product is used three times with the same Volume of veronal (barbital) -buffered saline and then the Conglutinin, by adding a 0.01 M phosphate buffer with 0.02 M EDTA, 10 Minutes eluted at room temperature. The product is then centrifuged and the The supernatant containing conglutinin was dialyzed overnight against 0.1 M TRIS, 0.3 M NaCl, at pH 8. The final purification is carried out using anion exchange chromatography on a Mono-Q ™ column using a NaCl gradient in the FPLC system (Pharmacia).

Beispiel 2Example 2 Herstellung gereinigter Dottersackantikörper (IgY) gegen ConglutininProduction of purified yolk sac antibodies (IgY) against conglutinin

Spezifiziert pathogenfreien (SPF) Hennen wird ein Conglutinin-Adjuvans-Gemisch subkutan injiuiert. Boosterungen erfolgen am 28., 56. und 84. Tag nach der Erstimmunisierung auf die gleiche Weise. Die Eier der immunisierten Hennen werden für die Antikörpergewinnung wöchentlich aufbereitet. Mit Hilfe des Eiweißtrenners wird zunächst der Dotter abgetrennt und unter schwach fließendem Leitungswasser vom restlichen Eiweiß befreit. Durch Rollen auf Filter- oder Fließpapier werden die Dotter getrocknet. Anschließend wird der Dottersack angestochen und der auslaufende Dotter separat für die weitere Reinigung aufgefangen. Der separierte Dotter wird mit deionisiertem Wasser verdünnt, homogenisiert, bei 4°C inkubiert und schließlich mitteltourig zentrifugiert. Der Überstand wird mit NaSO4 versetzt und unter Rühren bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß werden die IgY durch mitteltourige Zentrifugation gefällt. Das Sediment wird in PBS aufgefangen und gegen PBS (1/100 000) dialysiert. Die weitere Reinigung und Konzentrierung der IgY erfolgt über eine Affinitäts- Chromatographie an gereinigtem Conglutinin. Als Kopplungsmatrix dient NHS-aktivierte Sepharose.Specified pathogen-free (SPF) hens are injected subcutaneously with a conglutinin-adjuvant mixture. Boosters take place on the 28th, 56th and 84th day after the first vaccination in the same way. The eggs of the immunized hens are processed weekly for antibody production. With the help of the protein separator, the yolk is first separated and the remaining protein is removed under tap water. The yolks are dried by rolling them on filter or flow paper. Then the yolk sac is pierced and the leaking yolk is collected separately for further cleaning. The separated yolk is diluted with deionized water, homogenized, incubated at 4 ° C and finally centrifuged at medium speed. The supernatant is mixed with NaSO 4 and incubated with stirring at room temperature. The IgY are then precipitated by medium-speed centrifugation. The sediment is collected in PBS and dialyzed against PBS (1/100000). The further purification and concentration of the IgY is carried out via affinity chromatography on purified conglutinin. NHS-activated Sepharose serves as the coupling matrix.

Beispiel 3Example 3 Enzym-Immuno-Assay zur Bestimmung von Conglutinin in der RohmilchEnzyme immunoassay for the determination of conglutinin in raw milk

Polystyren-Mikrotiterplatten werden mit 1 mg/l gereinigten Dottersackantikörpern gegen bovines Conglutinin in 0,2 M/l Natriumazetatpuffer pH 4,0 benetzt (100 µl/Kavität). Die Inkubation erfolgt über Nacht bei 4°C. Die überstehende Flüssigkeit wird abgesaugt und die beschichteten Platten fünfmal mit Waschpuffer (0,01 M/l Phosphatpuffer, pH 7,2; 0,15 M/l NaCl; 0,1% v/v Tween 20) gespült. Die zu testenden Milchproben werden 1 : 5 mit Inkubationspuffer (1 Liter enthält 100 ml PBS, 7,44 g EDTA, 10 g BSA, 0,1% Tween 20) verdünnt und 100 µl in die Kavitäten pipettiert. Bekannte Verdünnungen des gereinigten Conglutinins werden auf die gleiche Weise für die Ermittlung der Standardkurve mitgeführt. Die Inkubation erfolgt bei 37°C fuhr eine Stunde. Es schließt sich ein fünfmaliger Waschvorgang mit dem Waschpuffer an, um ungebundene Bestandteile der Milchproben bzw. Standardverdünnungen zu entfernen. Danach werden 100 µl Peroxidase (POD)-markierter Antikörperlösung gegen bovines Conglutinin in die Kavitäten pipettiert und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Ungebundene POD-markierte Antikörper werden durch fünfmaliges Waschen mit dem Waschpuffer entfernt. Anschließend werden 100 µl Seramun- Blue (Tetramethylbenzidin-Substratlösung der Seramun Diagnostica GmbH) als Substratiösung in die Kavitäten der Microtiterplatte pipettiert und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Substratumsatz wird durch Zupipettieren von 50 µl der Stopplösung (0,5 M H2SO4) unterbrochen und die Mikrotiterplatte in einem Photometer bichromatisch bei 450 nm und 620 nm gemessen. Die Konzentration des Conglutinins in den untersuchten Proben wird über die Standardkurve, unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors, berechnet. Als untere Nachweisgrenze (UNG) gilt die Konzentration, die sich vom 3s Vertrauensbereich der Leerwertkontrolle unterscheiden läßt. Sie wird durch die Gleichung UNG = XL + 1,5 (SL + S1) beschrieben; (XL = Mittelwert des Leerwertes, SL = Streuung der Extinktion des Leerwertes, S1 = Streuung der Extinktion im ansteigenden Teil der Bezugskurve). Die intraserielle Präzision ergibt sich aus den Streuungen der Konzentration im Meßbereich.Polystyrene microtiter plates are wetted with 1 mg / l purified yolk sac antibodies against bovine conglutinin in 0.2 M / l sodium acetate buffer pH 4.0 (100 µl / cavity). Incubation takes place overnight at 4 ° C. The supernatant liquid is suctioned off and the coated plates are rinsed five times with washing buffer (0.01 M / l phosphate buffer, pH 7.2; 0.15 M / l NaCl; 0.1% v / v Tween 20). The milk samples to be tested are diluted 1: 5 with incubation buffer (1 liter contains 100 ml PBS, 7.44 g EDTA, 10 g BSA, 0.1% Tween 20) and 100 µl pipetted into the wells. Known dilutions of the purified conglutinin are carried out in the same way for the determination of the standard curve. Incubation takes place at 37 ° C for one hour. This is followed by a five-time wash with the wash buffer to remove unbound components of the milk samples or standard dilutions. 100 μl of peroxidase (POD) -labeled antibody solution against bovine conglutinin are then pipetted into the wells and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Unbound POD-labeled antibodies are removed by washing five times with the wash buffer. 100 µl Seramun Blue (tetramethylbenzidine substrate solution from Seramun Diagnostica GmbH) are then pipetted into the cavities of the microtiter plate as a substrate solution and incubated for 10 minutes at room temperature. The substrate turnover is interrupted by pipetting in 50 μl of the stop solution (0.5 MH 2 SO 4 ) and the microtiter plate is measured bichromatically in a photometer at 450 nm and 620 nm. The concentration of conglutinin in the samples examined is calculated using the standard curve, taking the dilution factor into account. The lower detection limit (UNG) is the concentration that can be distinguished from the 3s confidence interval of the blank value control. It is described by the equation UNG = X L + 1.5 (S L + S 1 ); (X L = mean value of the blank value, S L = spread of the absorbance of the blank value, S 1 = spread of the absorbance in the rising part of the reference curve). The intraserial precision results from the scatter of the concentration in the measuring range.

Fig. 1 zeigt die Standardkurve für die Berechnung der Conglutination-Konzentration. Fig. 1 shows the standard curve for the calculation of the Conglutination concentration.

Claims (8)

1. Aviäre, vitelline, gegen Conglutinin gerichtete Antikörper.1. Avian, vitelline, anti-conglutinin antibodies. 2. Antikörper nach Anspruch 1, hergestellt durch Immunisieren von Hühnern mit Conglutinin und Aufarbeiten der Eidotter der von den Hühnern gelegten Eier.2. Antibody according to claim 1, prepared by immunizing chickens with Conglutinin and egg yolk processing of the eggs laid by the chickens. 3. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern (IgY) gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst Conglutinin aus Rinderserum herstellt und ein Conglutinin-Adjuvans-Gemisch bereitet, mit dem Hennen immunisiert werden, aus den Eiern dieser Hennen die Dotter abtrennt und derart aufbereitet, daß die Dotter nach Verdünnen mit Wasser zentrifugiert, aus dem Überstand nach Versetzen mit NaSO4 die IgY durch Zentrifugieren gefällt und durch Dialysieren gegen PBS sowie mit Hilfe der Affinitäts- Chromatographie an Conglutinin weiter gereinigt werden.3. A process for the production of antibodies (IgY) according to claim 1 and 2, characterized in that first conglutinin is produced from bovine serum and a conglutinin-adjuvant mixture is prepared, immunized with the hens, the yolks are separated from the eggs of these hens and prepared in such a way that the yolks are centrifuged after dilution with water, the IgY is precipitated from the supernatant after being mixed with NaSO 4 by centrifugation and further purified by dialysis against PBS and with the aid of affinity chromatography on conglutinin. 4. Antikörper nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur Bestimmung von Conglutinin in der Rohmilch von Kühen verwendet werden.4. Antibody according to claim 1 to 3, characterized in that they for the determination of Conglutinin can be used in raw milk from cows. 5. Verwendung der Antikörper nach Anspruch 1 bis 3 gemäß Anspruch 4 in einem Diagnoseverfahren zur Erkennung von Mastitiden.5. Use of the antibodies according to claim 1 to 3 according to claim 4 in one Diagnostic procedure for the detection of mastitis. 6. Verwendung der Antikörper nach Anspruch 1 bis 3 gemäß Anspruch 4 und 5 in einem Enzym-Immuno-Assays (EIA), der als Sandwich-EIA mit Dottersack-Antikörpern (IgY) gegen bovines Conglutinin ausgebildet ist.6. Use of the antibodies according to claim 1 to 3 according to claim 4 and 5 in one Enzyme immunoassays (EIA), which are sandwich EIA with yolk sac antibodies (IgY) is trained against bovine conglutinin. 7. Verwendung der Antikörper nach Anspruch 1 bis 3 gemäß Anspruch 4 bis 6 in einem Testbesteck.7. Use of the antibodies according to claim 1 to 3 according to claim 4 to 6 in one Test kit. 8. Testbesteck nach Anspruch 7, bestehend aus a) gereinigten, festphasegebundenen, aviären, vitellinen Antikörpern gegen bovines Conglutinin gemäß Anspruch 1 bis 3, b) gereinigtem Conglutinin für die Standardverdünnungen, c) gereinigten Enzym-markierten Antikörpern (IgY) gegen bovines Conglutinin, d) Beschichtungspuffer, e) Proben-Verdünnungspuffer, f) Waschpuffer.8. Test kit according to claim 7, consisting of a) cleaned, solid phase-bound, avian, vitelline antibodies against bovine conglutinin according to claims 1 to 3, b) purified Conglutinin for the standard dilutions, c) purified enzyme-labeled antibodies (IgY) against bovine conglutinin, d) coating buffer, e) sample dilution buffer, f) Wash buffer.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2002077643A2 (en) * 2001-03-27 2002-10-03 Schebo Biotech Aktiengesellschaft Detection of inflammations

Cited By (2)

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WO2002077643A3 (en) * 2001-03-27 2003-10-16 Schebo Biotech Ag Detection of inflammations

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