DE19742949A1 - Detecting target substance, e.g. nucleic acid, hormone, enzyme etc. - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erfassung einer Zielsubstanz, das in den Bereichen der Grund lagenforschung wie der Molekularbiologie und der Biochemie ebenso wie der angewandten Wissenschaften wie bei klinischen Labortests und der Identifizierung von Umweltmikroorganismen nützlich ist, und auf ein Label und einen Marker, die bei ei ner derartigen Erfassung eingesetzt werden.The present invention relates to a method for Detection of a target substance that is in the areas of the ground situation research such as molecular biology and biochemistry as well as applied sciences as in clinical Laboratory tests and the identification of environmental microorganisms is useful, and on a label and a marker that ei ner such detection can be used.
Seit kurzem wird häufig ein Nukleinsäurefragmentierungsver fahren in den Bereichen der Medizin und Biologie zum Zweck der Erfassung einer Nukleinsäuresequenz eingesetzt. Eines der in diesen Tagen weit eingesetzten Verfahren ist ein Isotopen verfahren, bei welchem eine Nukleinsäureprobe mit einem ra dioaktiven Isotop markiert und anschließend der Hybridisie rung mit einer Zielnukleinsäure, gefolgt von der Erfassung der Zielnukleinsäure durch Audioradiographie, unterzogen wird.Recently, a nucleic acid fragmentation method is often used drive in the fields of medicine and biology for the purpose the detection of a nucleic acid sequence used. One of the The method widely used these days is an isotope method in which a nucleic acid sample with an ra dioactive isotope marked and then the hybridization with a target nucleic acid followed by detection the target nucleic acid by audio radiography will.
Ein derartiges Isotopenverfahren ist wie nachstehend be schrieben von beträchtlichen Nachteilen begleitet.Such an isotope method is as below be wrote accompanied by considerable disadvantages.
[1] Ein unter Verwendung eines Isotops erhaltenes autoradio graphisches Bild ist nicht scharf und hat eine schlechte räumliche Auflösung. Entsprechend werden durch Nukleinsäure- Hybridisierung erhaltene angrenzende Gene als miteinander überlappend beobachtet, was zu Schwierigkeiten bei der Erken nung der Positionen der Gene relativ zueinander führt.[1] A car radio obtained using an isotope graphic image is not sharp and has a bad one spatial resolution. Accordingly, nucleic acid Hybridization preserved adjacent genes than with each other observed overlapping, causing difficulty in recognition tion of the positions of the genes relative to one another.
[2] Da ein radioaktives Isotop mit einem Risiko eines Austre tens von Radioaktivität begleitet ist, sollte es nur in einem Isotopenlabor gehandhabt werden, das mit besonderen Instru menten zur Verhinderung des Austritts ausgestattet ist.[2] As a radioactive isotope with a risk of Austre at least accompanied by radioactivity, it should only be in one Isotope laboratory handled with special instru is equipped to prevent leakage.
[3] Ein menschlicher Körper wird wesentlich in Mitleiden schaft gezogen.[3] A human body becomes essential in compassion shaft pulled.
[4] Da der Zeitraum zur Erfassung so lange wie mehrere Tage oder sogar mehrere Wochen beträgt, ist es schwierig, ein Iso topenverfahren bei einer schnellen klinischen Diagnose anzu wenden.[4] As the period of time for recording as long as several days or even several weeks, it is difficult to get an iso top procedure in the case of a rapid clinical diagnosis turn around.
[5] Da die Radioaktivität eines Isotops mit einer bestimmten Halbwertszeit abfällt, sollte die Untersuchung hinsichtlich des Datums des Erwerbs des radioaktiven Isotops geplant wer den. Wenn der Zeitplan von dem ursprünglich geplanten nur um mehrere Tage abweicht, kann das radioaktive Isotop nutzlos und können die Ergebnisse einer Untersuchung im großen Maß stab bedeutungslos werden.Since the radioactivity of an isotope with a certain Half-life falls, the investigation should be regarding the date of acquisition of the radioactive isotope who is planned the. If the schedule differs from the originally planned just around If it deviates for several days, the radioactive isotope can be useless and can see the results of an investigation in large measure stab become meaningless.
[6] Ein radioaktives Isotop ist sehr teuer.[6] A radioactive isotope is very expensive.
Angesichts derartiger Umstände wurden alternative Verfahren zur Markierung ohne ein Radioisotop entwickelt.In light of such circumstances, alternative procedures were used designed for labeling without a radioisotope.
Beispielsweise wird bei einer DNA-Markierungsausrüstung (hergestellt von Boehringer) Digoxigenin als Hapten einge setzt (K. Mühlegger et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 371, 953 (1990)). For example, in DNA labeling equipment (manufactured by Boehringer) incorporated digoxigenin as a hapten sets (K. Mühlegger et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 371, 953 (1990)).
Jedoch ist die Erfassungsempfindlichkeit der vorstehend be schriebenen DNA-Markierungsausrüstung, welche 40 fg (4 × 10-14 g) DNA beträgt, verglichen mit der Erfassungsempfindlichkeit eines Isotopenverfahrens weniger empfindlich.However, the detection sensitivity of the DNA labeling equipment described above, which is 40 fg (4 × 10 -14 g) DNA, is less sensitive compared to the detection sensitivity of an isotopic method.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erfassung einer Zielsubstanz, welches frei von den mit einem Isotopenverfahren verbundenen Nachteilen im Hinblick auf die Sicherheit ist und eine ausgezeichnete Erfassungsemp findlichkeit aufweist, sowie ein Label und einen Marker hier für bereitzustellen.It is the object of the present invention to provide a method to detect a target substance which is free from the with disadvantages associated with an isotope method on safety and excellent detection temp has sensitivity, as well as a label and a marker here for provide.
Erfindungsgemäß wird die vorstehende Aufgabe durch ein Ver
fahren zur Erfassung einer Zielsubstanz gelöst, umfassend die
Schritte der:
Bindung eines Labels mit einem Verknüpfungsglied (Linker) und
einem Hapten an eine Zielsubstanz;
Bindung eines Markers an das Hapten, wobei der Marker einen
Anti-Hapten-Antikörper und die Fähigkeit zur Erzeugung eines
Signals hat;
Erzeugung des Signals durch den Marker; und
Erfassung des Signals;
wobei
das Hapten ein Gibberellin oder ein Derivat davon umfaßt und
der Linker aus zehn oder mehr Atomen besteht.According to the invention, the above object is achieved by a method for detecting a target substance, comprising the steps of:
Binding of a label with a linker and a hapten to a target substance;
Binding a marker to the hapten, the marker having an anti-hapten antibody and the ability to generate a signal;
Generating the signal by the marker; and
Acquisition of the signal; whereby
the hapten comprises a gibberellin or a derivative thereof and the linker consists of ten or more atoms.
Ein natürlich vorkommendes Gibberellin wird hier als Gibbe rellin bezeichnet, und ein nicht natürliches Gibberellin, welches durch Entfernung oder Modifikation einer funktionel len Gruppe eines natürlich vorkommenden Gibberellins ohne Veränderung des Gibberellingerüstes erhalten wird, wird hier als Gibberellin-Derivat bezeichnet. A naturally occurring gibberellin is used here as a gibbe called rellin, and a non-natural gibberellin, which by removing or modifying a functional len group of a naturally occurring gibberellin without Modification of the gibberellin framework is obtained here referred to as a gibberellin derivative.
Die wichtigste erfindungsgemäße Ausgestaltungsform besteht darin, daß ein Label mit einem Linker und einem Hapten an ei ne Zielsubstanz wie eine Nukleinsäure gebunden wird.The most important embodiment according to the invention consists that a label with a linker and a hapten on egg ne target substance such as a nucleic acid is bound.
Nachstehend werden die Wirkungen und Vorteile der Erfindung beschrieben.The following are the effects and advantages of the invention described.
Erfindungsgemäß ist der Linker ein Verbindungsstück zwischen dem Hapten und der Zielsubstanz. Der Linker hat zehn oder mehr Atome. Somit ist der Linker lang genug, um einen ausrei chenden Abstand zwischen der Zielsubstanz und dem Hapten be reitzustellen.According to the invention, the linker is a connecting piece between the hapten and the target substance. The left has ten or more atoms. So the linker is long enough to hold you up corresponding distance between the target substance and the hapten to mount.
Entsprechend wird der Anti-Hapten-Antikörper von der steri schen Hinderung durch die Zielsubstanz nicht sonderlich be einträchtigt, wenn er der Antigen-Antikörper-Reaktion mit dem Hapten unterworfen wird, wodurch viele Kontaktmöglichkeiten mit dem Hapten erhalten werden, was zu einer Verbindungsreak tion mit einer höheren Geschwindigkeit führt.Accordingly, the anti-hapten antibody is provided by the steri the hindrance caused by the target substance is not particularly important if he interferes with the antigen-antibody reaction with the Hapten is subjected, creating many contact options with the hapten, resulting in a connection break tion leads at a higher speed.
Daher kann das Label mit dem Hapten effizient an den Marker mit dem Anti-Hapten-Antikörper gebunden werden. Somit wird die Zielsubstanz an eine große Menge des Markers gebunden, wodurch ein intensives Signal erzeugt wird, was verglichen mit einem herkömmlichen Nichtisotopenverfahren zu einer aus gezeichneten Erfassungsempfindlichkeit führt, und wodurch selbst mit einer geringen Menge der Zielsubstanz eine befrie digende Erfassungsleistung bereitgestellt wird.Therefore, the label with the hapten can efficiently attach to the marker bound with the anti-hapten antibody. Thus becomes the target substance is bound to a large amount of the marker, creating an intense signal what compared using a conventional non-isotopic method to one out drawn detection sensitivity leads, and how even with a small amount of the target substance a free Digende acquisition performance is provided.
Erfindungsgemäß können alle Gibberelline und Derivate davon als Hapten eingesetzt werden. Ein Gibberellin und seine Deri vate besitzen eine hohe Affinität zu einem Anti-Gibberellin als Anti-Hapten-Antikörper. Entsprechend tritt die Bindung zwischen dem Hapten und dem Anti-Hapten-Antikörper mit einer höheren Geschwindigkeit auf, wodurch die Zielsubstanz effizi ent mit dem Marker verbunden werden kann. Daher kann erfin dungsgemäß ein intensives Signal vom Marker erzeugt werden, wodurch eine hohe Erfassungsempfindlichkeit erreicht wird.According to the invention, all gibberellins and derivatives thereof can be used can be used as a hapten. A Gibberellin and his Deri vate have a high affinity for an anti-gibberellin as an anti-hapten antibody. The bond occurs accordingly between the hapten and the anti-hapten antibody with a higher speed, making the target substance more efficient ent can be connected to the marker. Therefore, invent an intense signal can be generated by the marker, whereby a high detection sensitivity is achieved.
Erfindungsgemäß können ebenfalls verschiedene biologische Substanzen einschließlich Nukleinsäuren wie DNA und RNA, En zymen, Hormonen, Peptiden, Proteinen, Sacchariden, Fetten, Vitaminen, Zellen, Mikroorganismen, tierischem und pflanzli chem Gewebe und dergleichen als Zielsubstanz erfaßt werden.According to the invention, various biological Substances including nucleic acids such as DNA and RNA, En enzymes, hormones, peptides, proteins, saccharides, fats, Vitamins, cells, microorganisms, animal and vegetable chem tissue and the like can be detected as the target substance.
Wie vorstehend beschrieben werden erfindungsgemäß die mit ei nem Isotopenverfahren verbundenen Probleme hinsichtlich der Sicherheit gelöst und ein hochempfindliches Verfahren zur Er fassung einer Zielsubstanz ebenso wie ein Label und ein Marker für ein derartiges Verfahren bereitgestellt.As described above, according to the invention, those with ei nem isotope method associated problems with regard to the Security solved and a highly sensitive process for er definition of a target substance as well as a label and a Markers provided for such a method.
Die Erfindung wird nachstehend anhand der folgenden genauen Beschreibung unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnun gen näher beschrieben.The invention will hereinafter be detailed in terms of the following Description with reference to the accompanying drawings gen described in more detail.
Es zeigt:It shows:
Fig. 1 eine schematische Ansicht zur Veranschaulichung eines Verfahrens zur Erfassung von λ-DNA in einer bevorzugten Aus führungsform. Fig. 1 is a schematic view to illustrate a method for detecting λ-DNA in a preferred imple mentation form.
Erfindungsgemäß ist das vorstehend beschriebene Hapten vor zugsweise ein Gibberelin, bevorzugter Gibberellin A4, das in der nachstehend gezeigten Formel 1 dargestellt ist, um die Affinität zwischen dem Hapten und dem Anti-Hapten-Antikörper weiter zu steigern, wodurch eine effiziente Bindung des Mark ers an die Zielsubstanz erreicht wird. Als Ergebnis kann ein noch intensiveres Signal erzeugt und die Erfassungsempfind lichkeit weiter gesteigert werden. According to the invention, the hapten described above is present preferably a gibberellin, more preferably gibberellin A4, which is available in of Formula 1 shown below to obtain the Affinity between the hapten and the anti-hapten antibody to further increase, thus ensuring efficient binding of the marrow ers to the target substance is achieved. As a result, a an even more intense signal is generated and the detection sensitivity can be further increased.
Der vorstehend beschriebene Linker umfaßt vorzugsweise eine gerade Kettenstruktur mit 10 oder mehr Atomen und umfaßt min destens eine Kohlenwasserstoffgruppe, die aus der Gruppe, be stehend aus acyclischen Kohlenwasserstoffen, monocyclischen Kohlenwasserstoffen, vernetzten cyclischen Kohlenwasserstof fen, Spiro-Kohlenwasserstoffen, polycyclischen Kohlenwasser stoffen und cyclischen Kohlenwasserstoffen mit mindestens ei ner Seitenkette, ausgewählt ist.The linker described above preferably comprises one straight chain structure with 10 or more atoms and comprises min at least one hydrocarbon group selected from the group be consisting of acyclic hydrocarbons, monocyclic Hydrocarbons, crosslinked cyclic hydrocarbon fen, spiro hydrocarbons, polycyclic hydrocarbons substances and cyclic hydrocarbons with at least ei ner side chain, is selected.
Als Ergebnis einer derartigen Struktur kann das Ziel weit vom Hapten angebracht und die sterische Hinderung aufgrund der Zielsubstanz während der Reaktion zwischen dem Hapten und dem Anti-Hapten-Antikörper weiter vermieden werden.As a result of such a structure, the goal can be far from Hapten attached and the steric hindrance due to the Target substance during the reaction between the hapten and the Anti-hapten antibodies are further avoided.
Die vorstehend aufgeführte Kohlenwasserstoffgruppe ist vor zugsweise über mindestens eine Atomgruppe aneinander gebun den, welche aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl-, Ether-, Amid-, Ester-, Azo-, Nitril-, Nitro- und Aminobindungen, aus gewählt ist.The hydrocarbon group listed above is before preferably bonded to one another via at least one atomic group those which are selected from the group consisting of alkyl, ether, Amide, ester, azo, nitrile, nitro and amino bonds is chosen.
Als Ergebnis einer derartigen Struktur können die im Linker eingeschlossenen Atomgruppen linear aneinander gebunden wer den, und die Länge des Linkers kann erhöht werden, wodurch die sterische Hinderung aufgrund der Zielsubstanz während der Reaktion zwischen dem Hapten und dem Anti-Hapten-Antikörper weiter vermieden werden kann. As a result of such a structure, those in the linker included atomic groups who are linearly bound to each other den, and the length of the linker can be increased, thereby the steric hindrance due to the target substance during the Reaction between the hapten and the anti-hapten antibody can be further avoided.
Der vorstehend beschriebene Linker hat vorzugsweise die durch die Formel 2 dargestellte Struktur:The linker described above preferably has the through the structure shown in formula 2:
R=N-O-CH₂-CO-(NH(CH₂)m)CO)n-R = NO-CH₂-CO- (NH (CH₂) m ) CO) n -
m = 1 ∼10, n = 1 ∼10m = 1 ∼10, n = 1 ∼10
R = Linker.R = linker.
Als Ergebnis einer derartigen Struktur kann die Gesamtlänge des Linkers erhöht werden, wodurch die sterische Hinderung aufgrund der Zielsubstanz während der Reaktion zwischen dem Hapten und dem Anti-Hapten-Antikörper weiter vermieden werden kann.As a result of such a structure, the overall length of the linker, reducing steric hindrance due to the target substance during the reaction between the Hapten and the anti-hapten antibody are further avoided can.
Es ist bevorzugt, daß das vorstehend beschriebene Label eine zur Bindung an die Zielsubstanz befähigte Stelle hat. Eine derartige Bindungsstelle kann in Abhängigkeit von den Arten der Zielsubstanzen variieren. Wenn beispielsweise DNA die Zielsubstanz ist, kann die Bindungsstelle dATP, dGTP, dCTP, dTTP und dUTP sein. Für ein Protein kann beispielsweise Lysin mit Aminogruppen eingesetzt werden.It is preferred that the label described above be a has an area capable of binding to the target substance. One such binding site may depend on the species of target substances vary. For example, if DNA has the Is the target substance, the binding site can be dATP, dGTP, dCTP, dTTP and dUTP. For a protein, for example, lysine can be used with amino groups.
Der vorstehend beschriebene Marker umfaßt vorzugsweise einen Anti-Hapten-Antikörper und ein zur Signalerzeugung durch Re aktion mit einem signalerzeugenden Substrat befähigtes Enzym. Als Ergebnis einer derartigen Struktur ist eine leichte und schnelle Erfassung möglich.The marker described above preferably comprises one Anti-hapten antibodies and one for signal generation by Re enzyme capable of action with a signal generating substrate. As a result of such a structure is light weight and fast acquisition possible.
Das vorstehend beschriebene Enzym ist vorzugsweise mindestens ein Enzym, welches aus der Gruppe, bestehend aus alkalischer Phosphatase, saurer Phosphatase, β-Galactosidase, Esterase, Peroxidase und Saccharidketten-spaltenden Enzymen, ausgewählt ist. The enzyme described above is preferably at least an enzyme selected from the group consisting of alkaline Phosphatase, acid phosphatase, β-galactosidase, esterase, Peroxidase and saccharide chain-cleaving enzymes is.
Als Ergebnis des Einsatzes derartiger Enzyme kann ein inten sives Signal erzeugt und das Signal leicht erfaßt werden.As a result of the use of such enzymes, an inten sive signal can be generated and the signal can be easily detected.
Das vorstehend beschriebene signalerzeugende Substrat ist vorzugsweise eines von chemolumineszierenden Substraten, chromogenen Substraten, fluoreszierenden Substraten, biolo gisch chromogenen Substraten und elektrogenen Substraten. Je des der vorstehend aufgeführten Enzyme hat eine hohe Reakti vität mit einem signalerzeugenden Substrat, wodurch die Er zeugung eines intensiven Signals ermöglicht und eine weiter gesteigerte Erfassungsempfindlichkeit bereitgestellt wird.The signal generating substrate described above is preferably one of chemiluminescent substrates, chromogenic substrates, fluorescent substrates, biolo gisch chromogenic substrates and electrogenic substrates. Ever that of the enzymes listed above has a high reactivity vity with a signal generating substrate, whereby the Er generation of an intense signal and one more increased detection sensitivity is provided.
Wahlweise umfaßt der Marker den Anti-Hapten-Antikörper und eine selbst zur Signalerzeugung befähigte signalerzeugende Verbindung. Als Ergebnis einer derartigen Struktur ist eine leichte und schnelle Erfassung möglich.Optionally, the marker includes the anti-hapten antibody and one capable of generating signals itself Link. As a result of such a structure, there is a easy and quick acquisition possible.
Die vorstehend beschriebene signalerzeugende Verbindung ist mindestens eine, die aus der Gruppe, bestehend aus einer fluoreszierende Substanz oder einer chromogenen Substanz, ausgewählt ist. Eine derartige signalerzeugende Substanz kann ein intensives Signal erzeugen und ermöglicht die leichte Er fassung des Signals.The signal generating compound described above is at least one selected from the group consisting of one fluorescent substance or a chromogenic substance, is selected. Such a signal generating substance can generate an intense signal and allow easy er version of the signal.
Ein Beispiel des im vorstehend beschriebenen Erfassungsver
fahren eingesetzten Labels ist ein Label zur Markierung einer
Zielsubstanz und zur Bindung an einen zur Erzeugung eines Sig
nals befähigten Marker, umfassend:
ein Hapten, welches eine Verbindung der Formel (1) umfaßt;
und
einen Linker, der eine gerade Kettenstruktur mit 10 oder mehr
Atomen umfaßt.
An example of the label used in the detection method described above is a label for marking a target substance and for binding to a marker capable of generating a signal, comprising:
a hapten comprising a compound of formula (1); and
a linker comprising a straight chain structure of 10 or more atoms.
Ein derartiges Label besitzt einen wie vorstehend beschrieben an ein Hapten gebundenen Linker mit einer langen Atomkette. Entsprechend kann die Zielsubstanz vom Hapten entfernt ange bracht werden, wodurch der Effekt der sterischen Hinderung aufgrund der Zielsubstanz verringert wird.Such a label has one as described above linker attached to a hapten with a long atomic chain. Accordingly, the target substance can be removed from the hapten can be brought, thereby reducing the effect of steric hindrance is decreased due to the target substance.
Als Hapten wird das vorstehend beschriebene Gibberellin A4 eingesetzt. Gibberellin A4 hat eine hohe Affinität zum Anti-Hapten-Antikörper. Daher kann durch das Label eine große Men ge des Markers mit dem Anti-Hapten-Antikörper an die Zielsub stanz gebunden werden, wodurch die Empfindlichkeit beträcht lich erhöht wird.The above-described gibberellin A4 used. Gibberellin A4 has a high affinity for Anti-hapten antibodies. Therefore a great men ge the marker with the anti-hapten antibody to the target sub punch bound, which increases the sensitivity considerably is increased.
Das vorstehend beschriebene Label hat vorzugsweise eine Bin dungsstelle, welche zur Bindung an die Zielsubstanz befähigt ist. Eine derartige Bindungsstelle variiert in Abhängigkeit von den Arten der Zielsubstanzen.The label described above preferably has a bin application site, which enables binding to the target substance is. Such a binding site varies depending of the types of target substances.
Der im vorstehend beschriebenen Erfassungsverfahren einge
setzte Marker ist beispielsweise ein Marker zur Erfassung ei
ner Zielsubstanz, umfassend:
einen Anti-Hapten-Antikörper, der zur Bindung an ein Hapten
eines an die Zielsubstanz gebundenen Labels befähigt ist; und
ein Enzym, das zur Signalerzeugung durch Reaktion mit einem
signalerzeugenden Substrat befähigt ist,
wobei das Hapten eine Verbindung der Formel (1) umfaßt.
The marker used in the detection method described above is, for example, a marker for detecting a target substance, comprising:
an anti-hapten antibody capable of binding to a hapten of a label bound to the target substance; and
an enzyme capable of generating signals by reacting with a signal generating substrate,
wherein the hapten comprises a compound of formula (1).
Ein weiteres Beispiel ist ein Marker zur Erfassung einer
Zielsubstanz, umfassend:
einen Anti-Hapten-Antikörper, der zur Bindung an ein Hapten
eines an die Zielsubstanz gebundenen Labels befähigt ist; und
eine signalerzeugende Verbindung, welche selbst zur Signaler
zeugung befähigt ist,
wobei das Hapten eine Verbindung der Formel (1) umfaßt.Another example is a marker for detecting a target substance comprising:
an anti-hapten antibody capable of binding to a hapten of a label bound to the target substance; and
a signal-generating connection which is capable of generating signals itself,
wherein the hapten comprises a compound of formula (1).
Da der vorstehend beschriebene Marker den vorstehend be schriebenen Anti-Hapten-Antikörper gegen Gibberellin A4 be sitzt, kann er sich an das Label mit Gibberellin A4 mit hoher Effizienz binden. Daher kann ein intensives Signal als Ant wort auf die Reaktion zwischen dem Enzym und dem signalerzeu genden Substrat erzeugt werden, wodurch eine hohe Erfassungs empfindlichkeit bereitgestellt wird.Since the marker described above corresponds to the above be wrote anti-hapten antibodies against gibberellin A4 sits, he can refer to the label with gibberellin A4 with high Binding efficiency. Therefore, an intense signal can be used as an Ant word on the reaction between the enzyme and the signal generator low substrate, resulting in high detection sensitivity is provided.
Nachstehend wird ein Erfassungsverfahren als erfindungsgemäße Ausführungsform unter Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben. A detection method as an embodiment of the present invention will now be described with reference to FIG .
Dieses Beispiel ist ein Verfahren zur Erfassung von λ-DNA durch Fluorometrie. Die Vorgehensweise stellt sich wie folgt dar: λ-DNA als Zielsubstanz wird zunächst an das einen Linker und Gibberellin A4 umfassende Label gebunden. Anschließend wird das Label an den Marker gebunden, der einen an eine al kalische Phosphatase gebundenen Anti-Gibberellin A4-Anti körper umfaßt. Nachfolgend wird die alkalische Phosphatase mit einem fluoreszierenden Substrat umgesetzt, welches dann mit einem Anregungsstrahl bestrahlt wird, um die Fluoreszenz auszulösen, die schließlich erfaßt wird.This example is a method for detecting λ-DNA by fluorometry. The procedure is as follows dar: λ-DNA as the target substance is first attached to the one linker and bound gibberellin A4 comprehensive label. Afterward the label is bound to the marker, which is attached to an al potassium phosphatase bound anti-gibberellin A4-anti body embraced. The following is alkaline phosphatase implemented with a fluorescent substrate, which then is irradiated with an excitation beam to reduce the fluorescence trigger, which will eventually be detected.
Als Linker wurde Amino-O-methylamidcapronsäurehydrochlorid eingesetzt. Das Gibberellin A4 und den Linker umfassende La bel hatte die durch die Formel 1 dargestellte Struktur. In diesem Beispiel war der Linker (R) in der Formel 1 Tetrana trium[5-(amidallyl)-2′-desoxyuridin-5′-triphosphat]-N,O- methylamidcaproat. Das an das Ende des Linkers befestigte De soxyuridin-5′-triphosphat (dUTP) war die Bindungsstelle für die Ziel-λ-DNA.Amino-O-methylamidecaproic acid hydrochloride was used as the linker used. The gibberellin A4 and the linker comprising La bel had the structure shown by Formula 1. In in this example the linker (R) in Formula 1 was Tetrana trium [5- (amidallyl) -2'-deoxyuridine-5'-triphosphate] -N, O- methylamide caproate. The De attached to the end of the linker soxyuridine-5'-triphosphate (dUTP) was the binding site for the target λ DNA.
Das Erfassungsverfahren gemäß diesem Beispiel wird nachste hend in Einzelheiten beschrieben. The detection method according to this example becomes next described in detail.
In einem 100 ml-Rundkolben wurden 332 mg (1 mmol) Gibberellin A4 in 35 ml Tetrahydrofuran/Wasser (1 : 1, w/w) gelöst und 19 mg (0,1 mmol) Osmiumoxid unter Eiskühlung zugegeben. Nach Rühren für 10 Minuten wurden 427,8 mg (2 mmol) Natriumper iodat zugegeben, und nach Spülen des Kolbens mit Argongas wurde das Gemisch unter Rühren für 17 Stunden bei Raumtempe ratur umgesetzt. Der im Reaktionsgemisch gebildete Nieder schlag wurde abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zum Abdestillieren von Tetrahydrofuran konzentriert, um eine wäßrige Lösung zu erhalten.In a 100 ml round bottom flask were 332 mg (1 mmol) of gibberellin A4 dissolved in 35 ml tetrahydrofuran / water (1: 1, w / w) and 19 mg (0.1 mmol) osmium oxide were added while cooling with ice. To Stirring for 10 minutes, 427.8 mg (2 mmol) of sodium per iodate added, and after flushing the flask with argon gas the mixture was stirred for 17 hours at room temperature rature implemented. The low formed in the reaction mixture Impact was filtered off and the filtrate under reduced pressure Pressure to distill off tetrahydrofuran concentrated to to obtain an aqueous solution.
Die so erhaltene wäßrige Lösung wurde mit 6 N Schwefelsäure auf pH 1,5 eingestellt und dreimal mit Ethylacetat extra hiert, um 150 ml Ethylacetat-Extrakt zu erhalten. Der so er haltene Ethylacetat-Extrakt wurde mit wasserfreiem Natrium sulfat zum Entwässern unter Stehenlassen versetzt, und an schließend, nach dem Abfiltrieren des wasserfreien Natrium sulfats, wurde das Filtrat konzentriert.The aqueous solution thus obtained was treated with 6N sulfuric acid adjusted to pH 1.5 and three times with ethyl acetate extra hiert to obtain 150 ml of ethyl acetate extract. So he Holding ethyl acetate extract was made with anhydrous sodium sulfate for dehydration was added while leaving to stand, and on closing, after filtering off the anhydrous sodium sulfate, the filtrate was concentrated.
Das so erhaltene konzentrierte Filtrat wurde durch Säulen chromatographie über Silicagel gereinigt. Chloroform/ Ethyl acetat wurde als schrittweises Eluent eingesetzt, wobei von 100% Chloroform ausgegangen wurde, gefolgt von schrittweiser Erhöhung der Menge an Ethylacetat um 5%. In jedem Schritt wurden 20 ml eluiert und fraktioniert. Die Fraktionen, welche Gibberellin A4-17-norketon enthielten, wurden gesammelt, und das Lösungsmittel wurde abdestilliert, um Gibberellin A4-17-norketon, welches ein Gibberelin-Derivat ist, in einer Aus beute von 55% zu erhalten. Die Struktur dieser Verbindung wurde durch ¹H-NMR-, IR- und MS-Spektren identifiziert. The concentrated filtrate thus obtained was passed through columns purified by silica gel chromatography. Chloroform / ethyl acetate was used as a step-wise eluent, from 100% chloroform was started, followed by gradual Increase in the amount of ethyl acetate by 5%. In every step 20 ml were eluted and fractionated. The factions which Gibberellin A4-17-norketone were collected, and the solvent was distilled off to give gibberellin A4-17-norketone, which is a gibberelin derivative, in an off get 55% loot. The structure of this connection was identified by 1 H-NMR, IR and MS spectra.
In einem 100 ml-Rundkolben wurden 2,072 g (10,9 mmol) Car boxymethoxylaminhemihydrochlorid als Ausgangsmaterial gegeben und nach Eiskühlung mit dem Lösungsmittelgemisch aus 20 ml gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und 10 ml Tetrahydrofuran vermischt, und das Gemisch wurde anschließend 10 Minuten bei 0°C gerührt. Da sich das Ausgangsmaterial leicht löste, aber Wasser und Tetrahydrofuran sich nicht mit dem Lösungsmittel gemisch vermischten, wurde die Reaktion in einem Zweiphasen system durchgeführt.In a 100 ml round bottom flask, 2.072 g (10.9 mmol) of Car boxymethoxylamine hemihydrochloride given as starting material and after ice cooling with the solvent mixture of 20 ml saturated sodium hydrogen carbonate and 10 ml tetrahydrofuran mixed, and the mixture was then 10 minutes at Stirred at 0 ° C. Since the starting material dissolved easily, but Water and tetrahydrofuran do not mix with the solvent mixed mixed, the reaction was in a two-phase system carried out.
2,229 g (13,1 mmol) Benzylcarbonylchlorid wurden anschlie ßend in drei Portionen in einem Zeitraum von 10 Minuten unter Eiskühlung zum Gemisch gegeben. Nachfolgend wurde das Gemisch 1 Stunde unter Rühren und Eiskühlung umgesetzt. Nach Vervoll ständigung der Reaktion wurde das Gemisch unter vermindertem Druck zum Abdestillieren des Tetrahydrofurans konzentriert, um eine wäßrige Lösung zu erhalten. Die so erhaltene wäßrige Lösung wurde mit 1 N HCl angesäuert, dreimal mit Methylen chlorid extrahiert und eine Gesamtmenge von 150 ml Methylen chlorid-Extrakt erhalten. Der Methylenchlorid-Extrakt wurde durch Vereinigung mit wasserfreiem Natriumsulfat und an schließendem Stehenlassen entwässert, und anschließend wurde, nach Abfiltrieren des wasserfreien Natriumsulfats, das Fil trat konzentriert. Als Ergebnis wurde als erstes Zwischenpro dukt eine Benzylamidcarbonsäure in einer Ausbeute von 83,2% erhalten. Die Struktur dieser Verbindung wurde durch ¹H-NMR-, IR- und MS-Spektren identifiziert.2.229 g (13.1 mmol) of benzyl carbonyl chloride were then added Eating in three servings over a period of 10 minutes Ice cooling added to the mixture. The following was the mixture Reacted for 1 hour with stirring and ice cooling. After completion If the reaction continued, the mixture was reduced Concentrated pressure to distill off the tetrahydrofuran, to obtain an aqueous solution. The aqueous thus obtained Solution was acidified with 1N HCl, three times with methylene chloride extracted and a total of 150 ml of methylene obtained chloride extract. The methylene chloride extract was by association with anhydrous sodium sulfate and on dehydrated after leaving it to stand, and then, after filtering off the anhydrous sodium sulfate, the Fil entered concentrated. As a result, the first intermediate pro duct a benzylamide carboxylic acid in a yield of 83.2% obtain. The structure of this compound was determined by 1 H-NMR, IR and MS spectra identified.
Nachfolgend wurden 258 mg (0,8 mmol) des vorstehend erhalte nen ersten Zwischenprodukts in einen 30 ml-Rundkolben gege ben, der Kolben wurde mit Argongas gespült, und anschließend wurden 2,5 ml wasserfreies destilliertes Acetonitril als Lö sungsmittel zur Lösung des ersten Zwischenprodukts zugegeben. Subsequently, 258 mg (0.8 mmol) of the above was obtained Place the first intermediate product in a 30 ml round bottom flask ben, the flask was purged with argon gas, and then 2.5 ml of anhydrous distilled acetonitrile were used as Lö solvent added to the solution of the first intermediate product.
Unter Halten des Gemisches bei Raumtemperatur wurde eine in 200 µl wasserfreiem Acetonitril gelöste Lösung von 93 mg (0,8 mmol) N-Hydroxybernsteinsäureimid zugegeben. Anschließend wurde eine in 500 µl wasserfreiem Acetonitril gelöste Lösung von 170 mg (0,8 mmol) DCC (N,N′-dicyclohexylcarbodiimid, nachstehend als DCC abgekürzt) zugegeben und das Gemisch 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Bildung der Bern steinsäureimidverbindung als zweitem Zwischenprodukt wurde durch Dünnschichtchromatographie identifiziert, und diese Verbindung wurde ohne Reinigung im nächsten Schritt verwen det.While maintaining the mixture at room temperature, an in 200 µl of anhydrous acetonitrile dissolved solution of 93 mg (0.8 mmol) N-hydroxysuccinic acid imide was added. Afterward became a solution dissolved in 500 µl of anhydrous acetonitrile of 170 mg (0.8 mmol) DCC (N, N′-dicyclohexylcarbodiimide, hereinafter abbreviated as DCC) and the mixture 18 Stirred for hours at room temperature. The formation of Bern stinimide compound was used as the second intermediate identified by thin layer chromatography, and this Compound was used in the next step without purification det.
Anschließend wurden zur Lösung des vorstehend beschriebenen, in wasserfreiem Acetonitril gelösten zweiten Zwischenprodukts 104,9 mg (0,8 mmol) 6-Aminohexansäure, gelöst in einem Lö sungsmittelgemisch aus 5 ml Methanol und 50 Tropfen Pufferlö sung mit pH 9, bei Raumtemperatur zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 5 Minuten ließ man das Gemisch unter Er hitzen und Rühren in einem Wasserbad bei etwa 40°C für 10 Mi nuten reagieren. Nach Beendigung der Reaktion wurde der als Niederschlag gebildete Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat zur Entfernung des Lösungsmittels unter vermin dertem Druck destilliert. Die wäßrige Schicht wurde mit 1 N HCl angesäuert und dreimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchlorid-Schicht wurde konzentriert.Subsequently, to solve the above-described, second intermediate product dissolved in anhydrous acetonitrile 104.9 mg (0.8 mmol) of 6-aminohexanoic acid, dissolved in a solution solvent mixture of 5 ml of methanol and 50 drops of buffer solution solution with pH 9, added at room temperature. After stirring at The mixture was left under Er at room temperature for 5 minutes heat and stir in a water bath at about 40 ° C for 10 mi utes respond. After completion of the reaction, the as Dicyclohexylurea formed precipitate filtered off and the filtrate to remove the solvent under min distilled at that pressure. The aqueous layer was washed with 1N HCl acidified and extracted three times with methylene chloride. The methylene chloride layer was concentrated.
Das so erhaltene Konzentrat wurde durch Säulenchromatographie über Silicagel gereinigt. Chloroform/ Methanol wurde als schrittweises Eluent eingesetzt, wobei von 100% Chloroform ausgegangen wurde, gefolgt von schrittweiser Erhöhung der Menge an Methanol um 5%. In jedem Schritt wurden jeweils 20 ml des Konzentrats mit dem schrittweisen Eluent eluiert und fraktioniert. Die Fraktionen, welche Benzylamidmethylamidca pronsäure enthielten,,wurden gesammelt, und das Lösungsmittel wurde abdestilliert, um Benzylamidmethylamidcapronsäure als drittes Zwischenprodukt in einer Ausbeute von 85% zu erhal ten. Die Struktur dieser Verbindung wurde durch ¹H-NMR-, IR- und MS-Spektren identifiziert.The concentrate thus obtained was subjected to column chromatography Purified over silica gel. Chloroform / methanol was used as Gradual eluent used, with 100% chloroform was assumed, followed by a gradual increase in Amount of methanol by 5%. In each step, 20 ml of the concentrate is eluted with the gradual eluent and fractionated. The fractions containing benzylamide methylamide approx pronic acid, were collected, and the solvent was distilled off to be benzylamidomethylamidecaproic acid third intermediate product to be obtained in a yield of 85% th. The structure of this compound was determined by 1 H-NMR, IR and MS spectra identified.
In einem 50 ml-Dreihalskolben wurden 150 mg (0,34 mmol) des vorstehend beschriebenen dritten Zwischenprodukts gegeben, und der Kolben wurde mit Argongas gespült. Es wurde Ether zu gegeben, bis das dritte Zwischenprodukt gelöst war. Die Menge an zugegebenem Ether belief sich auf etwa 20 ml. Anschließend wurde Chlorwasserstoffgas kontinuierlich eingeleitet, bis der Punkt des dritten Zwischenprodukts auf der DSC-Platte ver schwand und ein neuer Punkt im Ursprung erschien. Nach Been digung der Reaktion wurde der Ether unter vermindertem Druck abdestilliert, um Amino-O-methylamidcapronsäurehydrochlorid zu erhalten, welche als Linker verwendet werden sollte. Da diese Verbindung sehr labil war, wurde sie im nächsten Schritt ohne Reinigung verwendet.In a 50 ml three-necked flask, 150 mg (0.34 mmol) of des given third intermediate product described above, and the flask was purged with argon gas. It became ether too given until the third intermediate was dissolved. The amount of added ether amounted to about 20 ml. Subsequently hydrogen chloride gas was continuously introduced until the Point of the third intermediate product on the DSC plate ver disappeared and a new point appeared in the origin. After Been Completion of the reaction, the ether was removed under reduced pressure distilled off to amino-O-methylamidcaprochloric acid hydrochloride which should be used as the linker. There this connection was very unstable, it became the next Step used without cleaning.
Der 40 ml-Dreihalskolben, welcher 100,3 mg (0,3 mmol) Amino- O-methylamidcapronsäurehydrochlorid (Linker) enthielt, wurde mit Argongas gespült. 0,6 ml wasserfreies Pyridin wurde zur Lösung des Linkers zugegeben. Eine Lösung von 100 ml des Gib berellin A4-Derivats, gelöst in 0,1 ml wasserfreiem Pyridin, wurde bei Raumtemperatur zugetropft. Man ließ das Gemisch 18 Stunden unter Rühren bei 50°C reagieren. Nach der Reaktion wurde Salzsäure zur Vervollständigung der Reaktion zugegeben. Das Gemisch wurde dreimal mit Ethylacetat extrahiert, und der Ethylacetat-Extrakt wurde mit gesättigtem Salzwasser gewa schen, bis er neutral war. Der erhaltene Ethylacetat-Extrakt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat vermischt und zur Ent wässerung stehengelassen, und anschließend wurde das wasser freie Natriumsulfat abfiltriert und das Filtrat konzentriert. The 40 ml three-necked flask, which contains 100.3 mg (0.3 mmol) of amino O-methylamidecaproic acid hydrochloride (linker) purged with argon gas. 0.6 ml of anhydrous pyridine was used for Solution of the linker added. A solution of 100 ml of the Gib berellin A4 derivative dissolved in 0.1 ml anhydrous pyridine, was added dropwise at room temperature. The mixture was left for 18 months React for hours while stirring at 50 ° C. After the reaction hydrochloric acid was added to complete the reaction. The mixture was extracted three times with ethyl acetate and the Ethyl acetate extract was washed with saturated salt water until it was neutral. The obtained ethyl acetate extract was mixed with anhydrous sodium sulfate and used for Ent watering left, and then the water Filtered off free sodium sulfate and concentrated the filtrate.
Das so erhaltene Konzentrat wurde durch Säulenchromatographie über Silicagel gereinigt. Chloroform/ Methanol wurde als schrittweises Eluent eingesetzt, wobei von 100% Chloroform ausgegangen wurde, gefolgt von schrittweiser Erhöhung der Menge an Methanol um 5%. In jedem Schritt wurden jeweils 20 ml des Konzentrats mit dem schrittweisen Eluent eluiert und fraktioniert. Die Fraktionen, welche Gibberellin A4-N-O- methylamidcapronsäure enthielten, wurden gesammelt, und das Lösungsmittel wurde abdestilliert, um Gibberellin A4-N-O- methylamidcapronsäure als Konjugat des Haptens und des Lin kers in einer Ausbeute von 15% zu erhalten. Die Struktur die ser Verbindung wurde durch ¹H-NMR-, IR- und MS-Spektren iden tifiziert.The concentrate thus obtained was subjected to column chromatography Purified over silica gel. Chloroform / methanol was used as Gradual eluent used, with 100% chloroform was assumed, followed by a gradual increase in Amount of methanol by 5%. In each step, 20 ml of the concentrate is eluted with the gradual eluent and fractionated. The fractions which gibberellin A4-N-O- methylamidecaproic acid were collected, and that Solvent was distilled off to give gibberellin A4-N-O- methylamidecaproic acid as a conjugate of the hapten and the lin kers in a yield of 15%. The structure the This compound was identified by 1 H-NMR, IR and MS spectra certified.
4 mg (8 µmol) Gibberellin A4-N-O-methylamidcapronsäure wurden in 69 µl Dimethylsulfoxid gelöst. Anschließend wurden 9,2 µl (8 µmol) einer 100 mg/ml-Lösung von N-Hydroxybernsteinsäure imid in Dimethylsulfoxid zugegeben. 1,8 µl (8 µmol) Dicyclo hexylcarbodiimid wurden zugegeben und das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur umgesetzt. Der ausgefallene Dicyclohexyl harnstoff wurde abfiltriert. 80 µl (8 µmol) des Reaktionsge misches des Reaktionsprodukts Gibberellin A4-N-O-methyl amidcapronsäure-N-hydroxybernsteinsäureimidester wurden mit 0,42 ml 0,1 M Natriumboratlösung (pH 8,5), in welcher 1 µmol Tetranatrium-5-allylamino-2′-desoxyuridin-5′-triphosphat ge löst waren, vermischt und das Gemisch über Nacht bei Raumtem peratur stehengelassen. Als Ergebnis bildete sich die Ziel substanz Gibberellin A4-[15]-UTP zusammen mit Nebenprodukten.4 mg (8 μmol) of gibberellin A4-N-O-methylamidecaproic acid were dissolved in 69 µl dimethyl sulfoxide. Then 9.2 µl (8 µmol) of a 100 mg / ml solution of N-hydroxysuccinic acid imide added in dimethyl sulfoxide. 1.8 µl (8 µmol) dicyclo Hexylcarbodiimide was added and the mixture overnight reacted at room temperature. The precipitated dicyclohexyl urea was filtered off. 80 µl (8 µmol) of the reaction quantity mixture of the reaction product gibberellin A4-N-O-methyl amidcaproic acid-N-hydroxysuccinic acid imide ester were with 0.42 ml of 0.1 M sodium borate solution (pH 8.5), in which 1 µmol Tetrasodium 5-allylamino-2'-deoxyuridine-5'-triphosphate ge were dissolved, mixed and the mixture overnight at room temperature temperature left. As a result, the goal was formed substance Gibberellin A4- [15] -UTP together with by-products.
Aus dem Reaktionsgemisch wurde die Zielsubstanz isoliert. Die Zielsubstanz wurde mit Hochleistungsionenaustauschchromato graphie auf einer mit TSK-Gel DEAE-2SW (hergestellt von TOSOH) gepackten Säule abgetrennt. Das Reaktionsgemisch in der Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 0 M bis 0,7 M einer Lösung von Natriumchlorid eluiert.The target substance was isolated from the reaction mixture. the Target substance was determined with high performance ion exchange chromatography graph on a TSK gel DEAE-2SW (manufactured by TOSOH) packed column. The reaction mixture in the column was built with a linear gradient from 0 M to 0.7 Eluted with a solution of sodium chloride.
Da die Verweilzeit der Zielsubstanz länger als die eines Hauptnebenprodukts 5-Allylamino-2′-desoxyuridin-5′-triphos phat war, konnte eine befriedigende Trennung erhalten werden. Die Fraktion, in welcher die Zielsubstanz mit der höchsten Konzentration eluiert war, wurde gesammelt und durch Gelfil tration durch Sephadex G-10 (hergestellt von Pharmacia) ent salzt und zum Erhalt des Ziel-Labels, d. h. Tetranatrium[5- (amidallyl) 2′-desopyuridin-5′-triphosphat]-gibberellin A4-N- O-methylamidcaproat (Gibberellin A4-[15]dUTP]) gefrierge trocknet.Since the residence time of the target substance than that of a main by-product was longer 5- allylamino-2'-deoxyuridine-5'-phosphate triphos, a satisfactory separation was obtained. The fraction in which the target substance with the highest concentration was eluted was collected and desalted by gel filtration through Sephadex G-10 (manufactured by Pharmacia) and desalted to obtain the target label, ie tetrasodium [5- (amidallyl) 2 '-desopyuridine-5'-triphosphate] -gibberellin A4-N-O-methylamidcaproate (gibberellin A4- [15] dUTP]) freeze-dried.
Unter Verwendung einer ungeordneten DNA-Markierungsgrund ausrüstung (random prime DNA labelling kit, hergestellt von Boehringer Mannheim) wurde λ-DNA mit dem vorstehend beschrie benen Gibberellin A4-[15]-dUTP-Label markiert. Die markierte λ-DNA wurde mit einem DNA-Verdünnungsmittel, das Heringssa men-DNA enthielt, auf 100 ng/ml verdünnt. Wie in Fig. 1 ge zeigt wurde ein Punkt der verdünnten λ-DNA-Lösung 1 auf eine Nylonmembran 2 aufgebracht und DNA durch UV-Bestrahlung immo bilisiert. Die Verdünnung wurde derart durchgeführt, daß ein bestimmtes Volumen für einen Punkt 0, 5, 10, 20, 40, 80, 400 oder 2000 fg (Femtogramm) λ-DNA enthielt. Eine Lösung mit 0 fg diente als Referenz.Using a disordered basic DNA labeling kit (random prime DNA labeling kit, manufactured by Boehringer Mannheim), λ-DNA was labeled with the above-described gibberellin A4- [15] -dUTP label. The labeled λ DNA was diluted to 100 ng / ml with a DNA diluent containing herring seed DNA. As shown in Fig. 1, a point of the diluted λ-DNA solution 1 was applied to a nylon membrane 2 and DNA was immobilized by UV irradiation. The dilution was carried out in such a way that a certain volume for a point contained 0, 5, 10, 20, 40, 80, 400 or 2000 fg (femtogram) λ-DNA. A solution with 0 fg was used as a reference.
Nach Eintauchen der Nylonmembran in eine Blocklösung für 30 Minuten wurde der mit alkalischer Phosphatase markierte Anti- Gibberellin A4-Antikörper (Marker) an jeden Punkt gebunden. Ungebundener Marker wurde durch Waschen entfernt, und an schließend wurde das fluoreszierende Substrat HNPP (hergestellt von AISIN COSMOS RESEARCH INSTITUTE) damit umge setzt. Nach Beendigung der Reaktion wurden Anregungsstrahlen eingestrahlt, und die vom Punkt der verdünnten λ-DNA-Lösung erzeugte Fluoreszenz wurde erfaßt.After immersing the nylon membrane in a blocking solution for 30 Minutes, the alkaline phosphatase labeled anti- Gibberellin A4 antibody (marker) attached to each point. Unbound marker was removed by washing, and on finally the fluorescent substrate became HNPP (manufactured by AISIN COSMOS RESEARCH INSTITUTE) vice versa puts. After completion of the reaction, excitation rays became irradiated, and the point of the diluted λ-DNA solution generated fluorescence was detected.
Zum Vergleich wurde die Erfassung von λ-DNA auf gleiche Weise wie vorstehend beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anstatt von A4-[15]dUTP Digoxigenin-11-dUTP (DIG-11-dUTP) verwendet wurde.For comparison, the detection of λ-DNA was carried out in the same way carried out as described above, with the exception that instead of A4- [15] dUTP digoxigenin-11-dUTP (DIG-11-dUTP) was used.
Die Ergebnisse der vorstehend beschriebenen Experimente sind in Tabelle 1 gezeigt. In Tabelle 1 bedeutet "+", daß die Er fassung möglich war, "±", daß die Erfassung mit schlechter Empfindlichkeit möglich war, und "-", daß die Erfassung nicht möglich war.The results of the experiments described above are shown in Table 1. In Table 1, "+" means that the Er version was possible "±" that the capture with worse Sensitivity was possible, and "-" that detection was not was possible.
Wie aus der Tabelle hervorgeht, konnte mit Gibberellin mar kierte λ-DNA selbst in einer Menge von so wenig wie 10 fg be friedigend erfaßt werden.As can be seen from the table, with Gibberellin mar labeled λ-DNA itself in an amount as little as 10 fg be be grasped peacefully.
Andererseits konnte mit Digoxigenin markierte λ-DNA nur in der Menge von 40 fg oder höher erfaßt werden.On the other hand, λ-DNA labeled with digoxigenin could only be used in the amount of 40 fg or higher can be recorded.
Wie vorstehend beschrieben werden durch die vorliegende Er findung die mit einem Isotopenverfahren verbundenen Sicher heitsprobleme gelöst und ein Verfahren zur Erfassung einer Zielsubstanz ebenso wie ein Label und ein Marker hierfür be reitgestellt.As described above, the present He Finding the certainty associated with an isotope process problems solved and a method for detecting a Target substance as well as a label and a marker for it mounted.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Erfassung einer Zielsub stanz wird zunächst ein Label mit einem Linker und einem Hap ten an eine Zielsubstanz wie eine Nukleinsäure oder ein Pro tein gebunden. Dann wird ein Marker mit einem Anti-Hapten- Antikörper und der Fähigkeit zur Erzeugung eines Signals an das Hapten auf dem Label gebunden. Man läßt den Marker das Signal erzeugen, welches dann erfaßt wird. Das Hapten ist ein Gibberellin oder dessen Derivate. Der Linker hat 10 oder mehr Atome, welche in einer geraden Kette angeordnet sind. Der Marker umfaßt einen daran gebundenen Anti-Hapten-Antikörper und ein Enzym, das zur Signalerzeugung durch Reaktion mit ei ner signalerzeugenden Substanz befähigt ist, oder wahlweise umfaßt der Marker einen Anti-Hapten-Antikörper und eine selbst zur Signalerzeugung befähigte signalerzeugende Verbin dung.In the method according to the invention for detecting a target sub stanz will initially be a label with a linker and a hap th to a target substance such as a nucleic acid or a pro tein bound. Then a marker with an anti-hapten Antibodies and the ability to generate a signal the hapten tied on the label. You let the marker do that Generate signal which is then detected. The hapten is a Gibberellin or its derivatives. The linker has 10 or more Atoms arranged in a straight chain. Of the Label includes an anti-hapten antibody attached to it and an enzyme capable of generating signals by reacting with egg ner signal generating substance is capable, or alternatively the marker includes an anti-hapten antibody and one signal-generating connection capable of generating signals itself manure.
Claims (20)
Bindung eines Labels mit einem Linker und einem Hapten an ei ne Zielsubstanz;
Bindung eines Markers an das Hapten, wobei der Marker einen Anti-Hapten-Antikörper und die Fähigkeit zur Erzeugung eines Signals hat;
Erzeugung des Signals durch den Marker; und
Erfassung des Signals;
dadurch gekennzeichnet, daß
das Hapten ein Gibberellin oder ein Derivat davon umfaßt und der Linker zehn oder mehr Atome besitzt.1. A method for detecting a target substance, comprising the steps of:
Binding of a label with a linker and a hapten to a target substance;
Binding a marker to the hapten, the marker having an anti-hapten antibody and the ability to generate a signal;
Generating the signal by the marker; and
Acquisition of the signal;
characterized in that
the hapten comprises a gibberellin or a derivative thereof and the linker has ten or more atoms.
ein Hapten, welches eine Verbindung der Formel (1) umfaßt; und
einen Linker, der eine gerade Kettenstruktur mit 10 oder mehr Atomen umfaßt.
a hapten comprising a compound of formula (1); and
a linker comprising a straight chain structure of 10 or more atoms.
einen Anti-Hapten-Antikörper, der zur Bindung an ein Hapten eines an die Zielsubstanz gebundenen Labels befähigt ist; und
ein Enzym, das zur Signalerzeugung durch Reaktion mit einem signalerzeugenden Substrat befähigt ist,
wobei das Hapten eine Verbindung der Formel (1) umfaßt.
an anti-hapten antibody capable of binding to a hapten of a label bound to the target substance; and
an enzyme capable of generating signals by reacting with a signal generating substrate,
wherein the hapten comprises a compound of formula (1).
einen Anti-Hapten-Antikörper, der zur Bindung an ein Hapten eines an die Zielsubstanz gebundenen Labels befähigt ist; und
eine signalerzeugende Verbindung, welche selbst zur Signaler zeugung befähigt ist,
wobei das Hapten eine Verbindung der Formel (1) umfaßt.
an anti-hapten antibody capable of binding to a hapten of a label bound to the target substance; and
a signal-generating connection which is capable of generating signals itself,
wherein the hapten comprises a compound of formula (1).
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Legal Events
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| 8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
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