DE19733195B4 - Highly compact laser scanning microscope with integrated short pulse laser - Google Patents

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    • G02B21/00—Microscopes
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    • G02B21/002—Scanning microscopes

Abstract

Laser-Scanning-Mikroskop, bestehend aus einem Mikroskopteil mit einem mikroskopischen Strahlengang sowie einer Übertragungsoptik zur Abbildung der von einem zu untersuchenden Objekt kommenden Strahlung in Richtung von Beobachtungs- und/oder Detektionsmitteln, sowie einem Scanteil mit Scanmitteln zur Ablenkung eines Laserstrahls, wobei Mikroskopteil und Scanteil eine optische Schnittstelle zur Einkopplung von Laserlicht in den mikroskopischen Strahlengang aufweisen und, einen Bestandteil des Scanteiles bildend, ein Kurzpulslaser, insbesondere zur Mehrphotonenanregung, sowie Einkoppelmittel zur Einkopplung der Strahlung des Kurzpulslasers in die Scanmittel vorgesehen sind, wobei im Strahlengang des Kurzpulslasers nichtlineare Kristalle zur Frequenzkonversion der Laserstrahlung vorgesehen sind.Laser scanning microscope consisting of a microscope part with a microscopic beam path and a transmission optics for imaging the radiation coming from an object to be examined in the direction of observation and / or detection means, as well a scanning part with scanning means for deflecting a laser beam, wherein the microscope part and the scanning part provide an optical interface to the Have coupling of laser light in the microscopic beam path and, forming part of the scan part, a short pulse laser, in particular for multiphoton excitation, as well as coupling agent for Coupling of the radiation of the short pulse laser provided in the scanning means are, wherein in the beam path of the short pulse laser nonlinear crystals are provided for frequency conversion of the laser radiation.

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Description

Laser-Scanning Mikroskope, die Kurzpulslaser (z.B. Picosekunden- oder Femtosekundenlaser) einsetzten, sind bislang vor allem aus der zeitaufgelösten und der Multi-Photonen-Mikroskopie bekannt.Laser Scanning Microscopes employing short pulse lasers (e.g., picosecond or femtosecond lasers), are so far mainly from time-resolved and multi-photon microscopy known.

Aus WO 91/07651 A1 ist ein Zwei- Photon- Laser-Scanning-Mikroskop bekannt, mit Anregung durch Laserpulse im Subpicosekundenbereich bei Anregungswellenlängen im roten oder infraroten Bereich.Out WO 91/07651 A1 discloses a two-photon laser scanning microscope, with excitation by laser pulses in the subpicosecond range at excitation wavelengths in the red or infrared area.

EP 666473 A1 , WO 95/30166 A1, DE 4414940 A1 beschreiben Anregungen im Picosekundenbereich und darüber, mit gepulster oder kontinuierlicher Strahlung. EP 666473 A1 , WO 95/30166 A1, DE 4414940 A1 describe excitations in the picosecond range and above, with pulsed or continuous radiation.

Ein Verfahren zum optischen Anregen einer Probe mittels einer Zwei- Photonen – Anregung ist in DE 4331570 C2 beschrieben.A method for optically exciting a sample by means of a two-photon excitation is in DE 4331570 C2 described.

DE 29609850 U1 der Anmelderin beschreibt die Einkopplung der Strahlung von Kurzpulslasern in einen mikroskopischen Strahlengang über Lichtleitfasern. DE 29609850 U1 the applicant describes the coupling of the radiation of short-pulse lasers in a microscopic beam path via optical fibers.

Die eingesetzten Kurzpulslaser (Wellenlängen-durchstimmbare Laser wie auch Festwellenlängen-Laser) sind i.a. sehr voluminös und aufgrund ihrer hohen technischen Komplexität sehr teuer und für den Anwender nur sehr schwierig handhabbar. Im allgemeinen werden die Laser mit Hilfe von Strahlführungs-Systemen (z.B. Spiegeln oder Glasprismen) direkt optisch in das Scanmodul des Laser Scanning Mikroskops eingekoppelt. Dabei sind allgemein lange optische Strahlwege erforderlich, die das System justierempfindlich und von seiner Ausdehnung sehr groß machen. Bei der i.a. häufig erforderlichen Justage des Lasers (insbesondere auch bei Veränderung der Laserwellenlänge, Abstimmung) kommt es dann i.a. zur räumlichen Wanderung des aus dem Laser ausgekoppelten Laserstrahls. In der Folge ist der Laserstrahl innerhalb des Laser Scanning Mikroskops nicht länger optimal justiert ist. Das letztere Problem kann durch eine Faserkopplung (z.B. unter Einsatz von single-mode, polarisationserhaltenden Fasern) des Kurzpulslasers umgangen werden, so daß die Justage von Laser und Laser Scanning Mikroskop voneinander isoliert sind. Eine derartige Faserkopplung eines Kurzpulslasers in ein Laser Scanning Mikroskop ist prinzipiell möglich, ist aber für die kurzen Pulse aufgrund der optische Dispersion der Glasfaser, sowie der nicht-linearen optischen Effekte wie Selbstphasen-Modulation, Brillouin-Streuung, Raman-Streuung, etc., die bei den hohen Laserintensitäten im Glasfaserkern auftreten können, i.a. sehr problematisch.The used short pulse laser (wavelength tunable lasers such as also fixed-wavelength laser) are i.a. very voluminous and because of their high technical complexity very expensive and for the user very difficult to handle. In general, the laser with Help of beam guidance systems (e.g., mirrors or glass prisms) directly into the scan module optically coupled to the laser scanning microscope. These are general long optical beam paths are required, which makes the system sensitive to adjustment and make it very large from its extent. At the i.a. often required Adjustment of the laser (especially when changing the laser wavelength, tuning) is it then i.a. to the spatial Migration of the laser beam coupled out of the laser. In the The result is the laser beam within the laser scanning microscope is not longer is optimally adjusted. The latter problem may be due to fiber coupling (e.g., using single-mode, polarization-maintaining fibers) of the Short pulse laser are bypassed, so that the adjustment of laser and Laser scanning microscope are isolated from each other. Such Fiber coupling of a short pulse laser into a laser scanning microscope is possible in principle, but is for the short pulses due to the optical dispersion of the glass fiber, as well as the non-linear optical effects such as self-phase modulation, Brillouin scattering, Raman scattering, etc., resulting in high laser intensities in the glass fiber core may occur, i.a. very problematic.

Erfindunginvention

Die Erfindung beschreibt ein hoch-kompaktes Laser Scanning Mikroskop mit einem in das Scanmodul integrierten Kurzpulslaser. Mit dieser Anordnung werden vorteilhaft eine optische Direktkopplung oder eine Faserkopplung des Kurzpulslasers mit dem Laser Scanning Mikroskop umgangen. Dabei sind im Strahlengang des Kurzpulslasers nichtlineare Kristalle zur Frequenzkonversion der Laserstrahlung vorgesehen.The Invention describes a high-compact laser scanning microscope with a short pulse laser integrated into the scan module. With this Arrangement advantageously a direct optical coupling or a Fiber coupling of the short pulse laser with the laser scanning microscope bypassed. In this case, nonlinear crystals are in the beam path of the short pulse laser provided for frequency conversion of the laser radiation.

Kurzpulslaser, der beispielsweise technisch in einer derart hoch-kompakten Bauform ausgeführt werden kann, sind diodenlaser-gepumpte Ionen-dotierte Faserlaser, z.B. diodengepumpte Er3+: dotierte Faserlaser mit einer Laseremission aus dem Laserresonator bei einer Wellenlänge von etwa 1550 nm. Diese Laserstrahlung kann außerhalb des Laserresonators mittels nicht-linearer optischer Kristalle aufgrund der hohen Laser-Intensitäten mit hoher Effizienz (resonant, nicht-resonant, quasi-phase matching) auf eine Wellenlänge von etwa 790 nm frequenzverdoppelt werden. Ein Teil der Strahlung wird in dem Kristall i.a. auch in die dritte Harmonische bei etwa 515 nm und in die vierte Harmonische bei etwa 387 nm umgewandelt werden. Ebenso treten alle anderen denkbaren nicht-linearen Konversionsprozesse mit einer bestimmten Konversionseffizienz in dem Kristall auf. Damit steht beispielhaft ein hoch-kompakter Kurzpulslaser mit mehreren simultan vorhandenen verschiedenen festen Ausgangswellenlängen für diverse mikroskopische Applikationen zur Verfügung.Short-pulse lasers which can be embodied, for example, in a technically highly compact design are diode laser-pumped ion-doped fiber lasers, eg diode-pumped Er 3+ : doped fiber lasers with a laser emission from the laser resonator at a wavelength of approximately 1550 nm outside the laser resonator by means of non-linear optical crystals due to the high laser intensities with high efficiency (resonant, non-resonant, quasi-phase matching) are frequency doubled to a wavelength of about 790 nm frequency. Part of the radiation in the crystal will generally also be converted to the third harmonic at about 515 nm and the fourth harmonic at about 387 nm. Likewise, all other conceivable non-linear conversion processes occur with a certain conversion efficiency in the crystal. Thus, by way of example, a highly compact short-pulse laser with several simultaneously available different fixed output wavelengths for various microscopic applications is available.

Der Laser kann z.B. in einem kompakten Gehäuse bereitgestellt werden, das in dem Chassis des Scanmoduls befestigt wird und aus einer Öffnung in dem kompakten Gehäuse den Laserstrahl, evtl. justierbar, emittiert (1). Der Laserstrahl kann ein außerhalb des kompakten Gehäuses angeordnetes optisches System durchlaufen, das ihn auf den geeigneten Strahldurchmesser und die geeignete Strahldivergenz transformiert. Dieses optische System kann derart variabel ausgeführt werden, daß es zur Anpassung des Strahls an die chromatischen Eigenschaften des mikroskop-optischen Systems geeignet ist (z.B. einen variablen Strahlaufweiter); ebenso kann es so ausgeführt werden, daß es zur Anpassung des Strahldurchmessers an den Objektiv-Pupillendurchmesser zur Optimierung des Verhältnisses aus Transmission und räumlicher Auflösung geeignet ist (variables Zoom).The laser can be provided, for example, in a compact housing, which is fastened in the chassis of the scanning module and emits the laser beam, possibly adjustable, from an opening in the compact housing ( 1 ). The laser beam may pass through an optical system located outside the compact housing which transforms it to the appropriate beam diameter and beam divergence. This optical system can be made variable so that it is suitable for adapting the beam to the chromatic properties of the microscope-optical system (eg a variable beam expander); likewise, it may be designed to be suitable for adjusting the beam diameter to the objective pupil diameter in order to optimize the ratio of transmission and spatial resolution (variable zoom).

Ein Lasershutter (Strahlunterbrecher) zur Sicherstellung der Lasersicherheit des Gerätes ist in das Scanmodul des Laser Scanning Mikroskops im Laserstrahlengang zu integrieren. Dieser kann beispielhaft als ein mechanischer Strahlunterbrecher ausgeführt werden.A laser shutter (beam interrupter) to ensure the laser safety of the device is in the scanning module of the laser scanning microscope Integrate laser beam path. This can be performed by way of example as a mechanical beam breaker.

Die Laserstrahlung kann durch ein wellenlängenselektives optisches Element zur Auswahl der in der Applikation erforderlichen Laserwellenlänge geführt werden. Dieses Element kann als ein dielektrisches Filter, ein akusto-optisches, elektro-optisches, ein refraktives oder dispersives Element oder eine Kombination daraus ausgeführt werden.The Laser radiation can be through a wavelength-selective optical element be guided to select the laser wavelength required in the application. This element can be used as a dielectric filter, acousto-optical, electro-optical, a refractive or dispersive element or a Combination made of it become.

Die Laserstrahlung kann durch ein intensitäts-abschwächendes Element zur Einstellung der in der Applikation erforderlichen Laserleistung geführt werden. Dieses Element kann als ein Neutralfilter, ein akusto-optisches, elektro-optisches, ein refraktives oder dispersives Element oder eine Kombination daraus ausgeführt werden. Im Falle eines akusto-optisches Element kann dieses auch vorteilhaft als Pulse-Picker zur Variation der Pulswiederholrate des Lasers (zeitliche Isolation einzelner Laserpulse aus der kontinuierlichen Abfolge von Laserpulsen) eingesetzt werden.The Laser radiation can be adjusted by an intensity-attenuating element be performed in the application required laser power. This element can be used as a neutral filter, an acousto-optical, electro-optical, a refractive or dispersive element or a combination of these become. In the case of an acousto-optic element, this may also be advantageous as a pulse picker for varying the pulse repetition rate of the laser (temporal isolation of individual laser pulses from the continuous Sequence of laser pulses) can be used.

Eine Prechirp-Einheit, bestehend z.B. aus einer Gitter- oder Prismensequenz oder einer Kombination daraus, kann in den Laserstrahlengang (Beleuchtungsstrahlengang) eingebracht werden zur Bereitstellung negativer Dispersion zur Kompensation der i.a. positiven Dispersion des optischen Systems aus Scanmodul, Mikroskop und Probe. Damit die Bereitstellung möglichst transform-limitierter Laserpulse am Ort der Probe vorteilhaft möglich.A Prechirp unit consisting of e.g. from a grid or prism sequence or a combination thereof, can be in the laser beam path (illumination beam path) be introduced to provide negative dispersion to compensate for i.a. positive dispersion of the optical system from scan module, microscope and sample. In order for the deployment to be more transform-limited Laser pulses at the location of the sample advantageously possible.

Die Laserstrahlung trifft danach auf einen Hauptstrahlteiler (z.B. einen dielektrischen Farbteiler), der die Laserstrahlung in Richtung der zu untersuchenden Probe lenkt. Dieser Hauptstrahlteiler, der als einer von vielen Farbteilern in einem Hauptstrahlteilerrevolver ausgeführt sein kann, kann auch gleichzeitig als das wellenlängenselektive optische Element zur Auswahl der applikativ erforderlichen Laserwellenlänge ausgeführt werden. Im Fall einer nicht-optischen Nachweistechnik (z.B. OBIC oder LIVA) kann der Hauptstrahlteiler auch als ein Vollspiegel ausgeführt werden.The Laser radiation then strikes a main beam splitter (e.g. dielectric color splitter), which directs the laser radiation in the direction of directs the sample to be examined. This main beam splitter, which as one of many color dividers in a main beam divider revolver accomplished can also be simultaneously as the wavelength-selective optical element for selecting the applicator required laser wavelength can be performed. In the case of a non-optical detection technique (e.g., OBIC or LIVA) The main beam splitter can also be designed as a full mirror.

Als Laserstrahl-Scanner können für die Strahlablenkung in x- und y-Richtung Galvanometer-Scanner eingesetzt werden. Im Falle der Multi-Photonen-Mikroskopie wird die Fluoreszenz in der Probe mit einer oder mehrerer der zur Verfügung stehenden Laserwellenlängen angeregt. Der Nachweis der Fluoreszenzstrahlung erfolgt dann i.a. in einer Multikanal-Anordnung nach 2, in der der Einsatz von konfokalen Blenden zum Erreichen der 3D-Auflösung nicht notwendig ist. In einer Variante können jedoch konfokale Pinholes eingesetzt werden, um die Tiefenauflösung weiter zu über diejenige in der einfachen Multi-Photonen-Mikroskopie zu steigern (3).As a laser beam scanner galvanometer scanners can be used for the beam deflection in the x and y direction. In the case of multi-photon microscopy, the fluorescence in the sample is excited with one or more of the available laser wavelengths. The detection of the fluorescence radiation then generally takes place in a multi-channel arrangement 2 in which the use of confocal aperture to achieve the 3D resolution is not necessary. In one variant, however, confocal pinholes can be used to further increase the depth resolution beyond that in simple multi-photon microscopy ( 3 ).

Detektion eines optischen oder eines nicht-optischen Signals, in de-scannter oder in nicht-descannter Detektor-Konfiguration.detection an optical or a non-optical signal, in de-scanned or in non-descanned detector configuration.

Je nach Tastverhältnis der gepulsten Laserstrahlung kann ein Lock-In Verstärker oder ein Box-Car Verstärker zum phasenempfindlichen Nachweis der Detektionssignale, synchronisiert mit der Pulswiederholrate des Lasers eingesetzt werden. Dadurch ergibt sich ein erheblich verbessertes Signal-zu-Rausch-Verhältnis durch Reduzieren der Bandbreite im Nachweissystem, in dem Rauschen zur Detektion kommt.ever after duty cycle The pulsed laser radiation can be a lock-in amplifier or a box-car amplifier for the phase-sensitive detection of the detection signals, synchronized be used with the pulse repetition rate of the laser. Thereby results in a significantly improved signal-to-noise ratio by Reduce the bandwidth in the detection system, in which noise for Detection comes.

Der Einsatz von Wellenlängen um 1550 nm ist bespielsweise in der mikroskopischen Inspektion von Halbleitern, insbesondere strukturierten Silizium-Wafern interessant. Wellenlängen um 1550 nm werden auch durch hoch-dotiertes Silizium noch gut transmittiert. Nur im unmittelbaren Bereich des Objektivfokus, und damit tiefendiskriminierend, kommt es zur Anregung nicht-linearer optischer Prozesse, wie der Multi-Photonen-Anregung (z.B. auch OBIC oder LIVA als nicht-optische Detektionstechniken) oder der Erzeugung höherer Harmonischer. Damit können diese nicht-linearen Prozesse als mikroskopische Kontrastverfahren auch im Zusammenhang mit dicken Silizium-Substarten zur 3D-aufgelösten Mikroskopie z.B. im Bereich der zerstörungsfreien Wafer-Inspektion eingesetzt werden.Of the Use of wavelengths at 1550 nm is recordable in the microscopic inspection of Semiconductors, especially structured silicon wafers interesting. wavelength around 1550 nm are also well-transmitted by highly doped silicon. Only in the immediate area of the lens focus, and thus deeply discriminatory, it comes to the excitation of non-linear optical processes, such as Multi-photon excitation (e.g., also OBIC or LIVA as non-optical Detection techniques) or higher harmonic generation. So they can non-linear processes as a microscopic contrast method too in connection with thick silicon substrates for 3D-resolved microscopy e.g. in the field of non-destructive wafer inspection be used.

Die Wellenlänge um 790 nm eignet sich beispielsweise insbesondere zu universellen Anregung von 2-Photonen-Prozessen in üblicherweise zur Fluoreszenzmarkierung biologischer Proben eingesetzten Farbstoffe.The wavelength at 790 nm, for example, is particularly suitable for universal Excitation of 2-photon processes usually for fluorescence labeling biological dyes used.

Die grüne bzw. ultraviolette Wellenlänge bei 517 nm bzw. 387 nm, kann beispielsweise zur Untersuchung von Proben im Reflexionskontrast, Fluoreszenzkontrast, zur zeitaufgelösten Mikroskopie eingesetzt werden. Die grüne Strahlung bei 517 nm kann auch als sichtbare Pilotstrahlung zur Justage bei der Montage des optischen Systems eingesetzt werden.The green or ultraviolet wavelength at 517 nm and 387 nm, respectively, can be used, for example, to study Samples in reflection contrast, fluorescence contrast, for time-resolved microscopy be used. The green Radiation at 517 nm can also be used as visible pilot radiation Adjustment can be used during assembly of the optical system.

Insbesondere eignet sich das beschriebene System zur Anwendung in physiologischen Fragestellungen, z.B. zum Freisetzen von 'caged compounds'. Hier kann die Strahlung bei 790 nm mittels 3-Photonen-Prozessen zum 'Uncagen' auch in tiefen Schichten dicker Präparate genutzt werden, während die Beobachtung der freigesetzten Ionen dann durch 2-Photonen-Anregung der zur Markierung eingesetzten Fluorophore erfolgt.Especially the described system is suitable for use in physiological Issues, e.g. for releasing 'caged compounds'. Here the radiation can be at 790 nm used by 3-photon processes for 'uncaging' in deep layers of thick preparations be while the Observe the liberated ions then by 2-photon excitation to the marker fluorophores used.

Die Erfindung ist durch folgende besonders vorteilhafte Schwerpunkte gekennzeichnet:

  • • Integration eines Kurzpulslasers in das Scanmodul eines Laser Scanning Mikroskops zur Bereitstellung eines hoch-kompakten Mikroskopsystem.
  • • Integration eines Kurzpulslasers (Festfrequenz- oder wellenlängendurchstimmbar) mit einer dem Laserresonator nachgeschalteten optischen Anordnung aus einem oderer mehreren nicht-linearen optischen Kristallen zur Frequenzkonversion der Laserstahlung durch Frequenzverdopplung, Frequenzverdreifachung, Summen- oder Differenzfrequenz-Erzeugung, einem anderen optisch parametrischen Prozeß oder einer beliebigen Kombination daraus, zur Bereitstellung mehrerer Wellenlängen für diverse mikroskopische Applikationen.
  • • Der Einsatz in der zeitaufgelösten Laser Scanning Mikroskopie.
  • • Der Einsatz in der konfokalen oder nicht-konfokalen Laser Scanning Mikroskopie unter Ausnutzung eines optischen Detektionssignal.
  • • Der Einsatz in der Laser Scanning Mikroskopie unter Ausnutzung eines nicht-optischen Detektionssignal.
  • • Der Einsatz in der Laser Scanning 2-Photonen Mikroskopie.
  • • Der Einsatz in der Materialuntersuchung, insbesondere der Frequenzverdopplung (SHG) an Oberflächen mit Hilfe eines Laser Scanning Mikroskops.
  • • Der Einsatz in der Materialuntersuchung, insbesondere zur 2D- oder 3D-OBIC.
  • • Der kombinierte Einsatz zweier oder mehrerer Techniken, die in den vorigen Punkten beschrieben sind.
The invention is characterized by the following particularly advantageous priorities:
  • Integration of a short pulse laser into the scan module of a laser scanning microscope to provide a highly compact microscope system.
  • Integration of a short pulse laser (fixed frequency or wavelength tunable) with a laser array downstream optical array of one or more non-linear optical crystals for frequency conversion of the laser beam by frequency doubling, frequency tripling, sum or difference frequency generation, another optical parametric process or any other Combination thereof, providing multiple wavelengths for various microscopic applications.
  • • The use in time-resolved laser scanning microscopy.
  • • Use in confocal or non-confocal laser scanning microscopy taking advantage of an optical detection signal.
  • • Use in laser scanning microscopy taking advantage of a non-optical detection signal.
  • • The use in laser scanning 2-photon microscopy.
  • • Use in materials testing, especially frequency doubling (SHG) on surfaces, using a laser scanning microscope.
  • • Use in materials testing, especially for 2D or 3D OBIC.
  • • The combined use of two or more techniques described in the previous points.

Die Abbildungen zeigen:The Pictures show:

1:
Eine beispielhafte Ausführung der Integration eines kompakten Kurzpulslasers in das Scanmodul eines Laser Scanning Mikroskops. 1 :
An exemplary embodiment of the integration of a compact short-pulse laser into the scanning module of a laser scanning microscope.

2:
Optischer Strahlengang für die Ausführung der Integration eines kompakten Kurzpulslasers in das Scanmodul eines Laser Scanning Mikroskops ohne den Einsatz von konfokalen Blenden im Detektionsstrahlengang. 2 :
Optical beam path for the implementation of the integration of a compact short-pulse laser into the scanning module of a laser scanning microscope without the use of confocal diaphragms in the detection beam path.

3:
Optischer Strahlengang für die Ausführung der Integration eines kompakten Kurzpulslasers in das Scanmodul eines Laser Scanning Mikroskops mit den Einsatz von konfokalen Blenden im Detektionsstrahlengang. 3 :
Optical beam path for carrying out the integration of a compact short-pulse laser into the scanning module of a laser scanning microscope with the use of confocal diaphragms in the detection beam path.

4:
Der Strahlengang für eine erfindungsgemäße Kombination eines extern über eine optische Faser eingekoppelten Lasers für den Standardbetrieb eines Laser Scanning Mikroskopes und eines integrierten Kurzpulslasers 4 :
The beam path for a combination according to the invention of an externally coupled via an optical fiber laser for the standard operation of a laser scanning microscope and an integrated short pulse laser

1 zeigt schematisch das Gehäuse eines über eine Lichtdurchtrittsöffnung L mit einem mikroskopischen Strahlengang verbindbaren Scankopfes S, der im Detail in den nächsten Abbildungen beschrieben wird. 1 shows schematically the housing of a connectable via a light passage opening L with a microscopic beam path scanning head S, which is described in detail in the next figures.

In dieses Gehäuse integriert ist das Gehäuse eines Kurzpulslasers KPL 32, der damit mit dem Scankopf S eine kompakte Einheit bildet.Integrated into this housing is the housing of a short pulse laser KPL 32 , which thus forms a compact unit with the scan head S.

Vorteihaft ist am Gehäuse des Scankopfes eine nicht dargestellte Abdeckung vorgesehen, die den Laser 32 mit abdeckt.Vorteihaft a cover, not shown, is provided on the housing of the scan head, which covers the laser 32 with covers.

In 2 sind schematisch eine Mikroskopeinheit M und ein Scankopf S dargestellt, die eine gemeinsame optische Schnittstelle aufweisen.In 2 schematically a microscope unit M and a scan head S are shown, which have a common optical interface.

Der Scankopf S kann sowohl an den Phototubus eines aufrechten Mikroskopes sowie auch vorteilhaft an einen seitlichen Ausgang eines inversen Mikroskopes angesetzt werden ( DE 4323129 A1 ).The scan head S can be attached both to the phototube of an upright microscope and also advantageously to a lateral exit of an inverted microscope ( DE 4323129 A1 ).

In 2 ist ein zwischen Auflichtscan und Durchlichtscan mitttels eines schwenkbaren Spiegels 14 umschaltbarer mikroskopischer Strahlengang dargestellt,
mit Lichtquelle 1, Beleuchtungsoptik 2, Strahlteiler 3, Objektiv 4, Probe 5, Kondensor 5, Lichtquelle 7, Empfängeranordnung 8, einer ersten Tubuslinse 9, einem Beobachtungsttrahlengang mit einer zweiten Tubuslinse 10 und einem Okular 11 sowie einem Strahlteiler 12 zur Einkopplung des Scanstrahls dargestellt.In 2 is a between Auflichtscan and transmitted light scan mitttels a pivoting mirror 14 reversible microscopic beam path shown,
with light source 1 , Illumination optics 2 , Beam splitter 3 , Objective 4 , Sample 5 , Condenser 5 , Light source 7 , Receiver arrangement 8th , a first tube lens 9 , a Beobachtsttrahlengang with a second tube lens 10 and an eyepiece 11 and a beam splitter 12 shown for coupling the scanning beam.

Bestandteil des Scankopfes ist erfindungsgemäß ein Kurzpulslaser 32 mit nachgeordneten Shutter 34 sowie Filtern 33 zur Wellenlängenselektion oder, wie in 4 schematisch dargestellt, mit nachgeordneten einem oder mehreren nichtlinearen optischen Kristallen 43 zur Frequenzkonversion durch Frequenzvervielfachung, Summen- oder Differenzerzeugung, der in oder an das Gehäuse, wie in 1 dargestellt, ansetzbar ist und über geeignete Strahlumlenkelemente, insbesondere Spiegel 38 gemäß 4, in den Scanstrahlengang, hier über Teilerspiegel 24 eingekoppelt wird.Part of the scan head according to the invention is a short pulse laser 32 with downstream shutter 34 as well as filters 33 for wavelength selection or, as in 4 shown schematically, with downstream one or more non-linear optical crystals 43 for frequency conversion by frequency multiplication, summation or difference generation, in or on the housing, as in 1 shown, can be applied and via suitable Strahlumlenkelemente, in particular mirrors 38 according to 4 , in the scanning beam, here on splitter mirror 24 is coupled.

Vorteilhaft ist eine entlang der optischen Achse verschiebbare Optik 38 vorgesehen, um den Fokus im Päparat definiert einzustellen und/oder zu verändern.Advantageous is a displaceable along the optical axis optics 38 provided to set the focus in the preparation and / or changed.

Hierdurch entfällt erstmalig vorteilhaft eine separate Lasereinheit, was neben der größeren Kompaktheit besondere Vorteile bezüglich der fest eingestellten Justierung hat.This eliminates the first advantageous advantageous a separate laser unit, which in addition to the greater compactness special advantages in terms of fixed has adjusted adjustment.

Irgendwelche Justier – oder Einkoppelprobleme bei der Fasereinkopplung entfallen ebenfalls. Weiterhin sind Mittel 35 zur nichtoptischen Detektion, insbesondere zur Strommessung bei der Halbleiterinspektion, sowie weitere Detektionsmittel, hier ein PMT mit vorgeordneter Optik und Filtern, ohne Durchgang des Objektlichtes durch die Scanmittel hinter dem Spiegel 12, der teildurchlässig ausgebildet ist, vorgesehen.Any adjustment or coupling problems with fiber coupling are also eliminated. Furthermore, funds 35 for non-optical detection, in particular for current measurement in the semiconductor inspection, as well as further detection means, here a PMT with upstream optics and filters, without passage of the object light through the scanning means behind the mirror 12 , which is partially permeable, provided.

Die Scaneinheit besteht weiterhin aus Scanningobjektiv 22, Scanner 23, Hauptstrahlteiler 24 und einer gemeinsamen Abbildungsoptik 25 für DetektionskanäleThe scanning unit continues to consist of a scanning lens 22 , Scanners 23 , Main beam splitter 24 and a common imaging optics 25 for detection channels

Ein Umlenkprisma 27 hinter der Abbildungsoptik 25 spiegelt die vom Objekt 5 kommende Strahlung in Richtung dichroitischer Strahleiler 28 im konvergenten Strahlengang der Abbildungsoptik 25, denen Emissionsfilter 30 und geeignete Empfängerelemente 31 (PMT) nachgeordnet sind.A deflecting prism 27 behind the imaging optics 25 reflects the object 5 coming radiation towards dichroic beam radiator 28 in the convergent beam path of the imaging optics 25 , which emission filters 30 and suitable receiver elements 31 (PMT) are subordinate.

Mittels eines teildurchlässigen Spiegels 18 wird ein Überwachungsstrahlengang in Richtung einer Monitordiode 19, der vorteilhaft auf einem nicht dargestellten drehbaren Filterrad Linienfilter 21 sowie Neutralfilter 20 vorgeordnet sind, ausgeblendet.By means of a partially transparent mirror 18 becomes a monitoring beam path in the direction of a monitor diode 19 which advantageously on a non-illustrated rotatable filter wheel line filter 21 as well as neutral filter 20 are upstream, hidden.

Vorteilhaft können bei der Mehrphotonenanregung durch die hohe räumliche Auflösung vor den Empfängern 31 angeordnete pinholes entfallen, diese sind jedoch gerade bei einer Kombination mit weiteren Lasern wie in 5, in drei Richtungen räumlich verstellbar, dennoch gemäß 3 als Lochblenden 37 einsetzbar.In the case of multiphoton excitation, the high spatial resolution in front of the receivers can be advantageous 31 arranged pinholes omitted, but these are just in combination with other lasers as in 5 , spatially adjustable in three directions, yet according to 3 as pinholes 37 used.

In 4 ist ein optional ansetzbarer externer Laser 42 ist über eine Lichtleitfaser 41 mit der Lasereinkoppeleinheit des Scankopfes S verbunden und wird mittels einer verschiebbaren Kollimationsoptik 40 sowie Strahlumlenkelement 39 in den Abtaststrahlengang eingekoppelt. Es kann sich hier auch um einen nicht dargestellten Lasermodul mit mehreren Einzel – und Multiwellenlängenlasern handeln, die einzeln oder gemeinsam in eine oder mehrere Fasern eingekoppelt werden.In 4 is an optional attachable external laser 42 is over an optical fiber 41 connected to the laser coupling unit of the scan head S and is by means of a sliding collimating optics 40 and beam deflecting element 39 coupled into the scanning beam path. This can also be a laser module (not illustrated) with a plurality of single and multi-wavelength lasers, which are coupled individually or together into one or more fibers.

Weiterhin kann die Einkopplung auch über mehrere Fasern gleichzeitig erfolgen, deren Strahlung mikroskopseitig nach Durchlaufen einer nicht dargestellten Anpaßoptik durch Farbvereiniger gemischt wird.Farther can the coupling also over several Fibers occur simultaneously, their radiation microscopically after Passing through a matching optics not shown by Farbereiniger is mixed.

Auch die Mischung der Strahlung verschiedener Laser am Fasereingang über nicht dargestellte Teilerspiegel ist möglich.Also the mixture of radiation of different lasers at the fiber input about not shown splitter mirror is possible.

Der erfindungsgemäß in den Scankopf integrierte Kurzpulslaser 32 wird hier mittels Umlenkelementen 38 bezüglich seiner Richtung geometrisch an den weiteren Scanstrahlengang und die Lage des Spiegels 39 angepaßt.The inventively integrated into the scan head short pulse laser 32 is here by means of deflection 38 with respect to its direction geometrically to the other scanning beam path and the position of the mirror 39 customized.

Claims (10)

Laser-Scanning-Mikroskop, bestehend aus einem Mikroskopteil mit einem mikroskopischen Strahlengang sowie einer Übertragungsoptik zur Abbildung der von einem zu untersuchenden Objekt kommenden Strahlung in Richtung von Beobachtungs- und/oder Detektionsmitteln, sowie einem Scanteil mit Scanmitteln zur Ablenkung eines Laserstrahls, wobei Mikroskopteil und Scanteil eine optische Schnittstelle zur Einkopplung von Laserlicht in den mikroskopischen Strahlengang aufweisen und, einen Bestandteil des Scanteiles bildend, ein Kurzpulslaser, insbesondere zur Mehrphotonenanregung, sowie Einkoppelmittel zur Einkopplung der Strahlung des Kurzpulslasers in die Scanmittel vorgesehen sind, wobei im Strahlengang des Kurzpulslasers nichtlineare Kristalle zur Frequenzkonversion der Laserstrahlung vorgesehen sind.Laser scanning microscope, consisting of a Microscope part with a microscopic beam path and a transmission optics for imaging the radiation coming from an object to be examined in the direction of observation and / or detection means, as well a scanning part with scanning means for deflecting a laser beam, wherein the microscope part and the scanning part provide an optical interface to the Have coupling of laser light in the microscopic beam path and, forming part of the scan part, a short pulse laser, in particular for multiphoton excitation, as well as coupling agent for Coupling of the radiation of the short pulse laser provided in the scanning means are, wherein in the beam path of the short pulse laser nonlinear crystals are provided for frequency conversion of the laser radiation. Laser-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 1, bestehend aus einem ersten Gehäuse mit einem mikroskopischen Strahlengang mit einem Mikroskopobjektiv sowie mindestens einer Übertragungs (Tubus linse zur Abbildung der von einem zu untersuchenden Objekt kommenden Strahlung in Richtung von Beobachtungs- und/oder Detektionsmitteln sowie einem an das erste Gehäuse ansetzbaren zweiten Gehäuse, wobei erstes und zweites Gehäuse eine optische Schnittstelle zur Einkopplung von Laserlicht in den mikroskopischen Strahlengang aufweisen.Laser scanning microscope according to claim 1, consisting from a first housing with a microscopic beam path with a microscope objective and at least one transmission (Tubus lens for imaging the object to be examined coming radiation in the direction of observation and / or detection means and a to the first housing attachable second housing, wherein first and second housings an optical interface for coupling laser light in the have microscopic beam path. Laser-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 2, wobei in einem separatem Gehäuse, das in das zweite Gehäuse integriert ist oder an dieses angesetzt ist, ein Laser vorgesehen ist.Laser scanning microscope according to claim 2, wherein in a separate housing, that in the second case is integrated or attached to this, a laser provided is. Laser-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, wobei im zweiten Gehäuse Detektionsmittel zur Erfassung der von der Probe kommenden Strahlung integriert sind.Laser scanning microscope according to claim 1 or 2, wherein in the second housing Detection means for detecting the radiation coming from the sample are integrated. Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Mittel zur einstellbaren Frequenzkonversion der Laserstrahlung vorgesehen sind.Laser scanning microscope according to one of the preceding Claims, wherein means for adjustable frequency conversion of the laser radiation are provided. Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei bei der Frequenzkonversion eine Frequenzverdopplung, Verdreifachung, Summen- oder Differenzfrequenzerzeugung erfolgt.Laser scanning microscope according to one of the preceding Claims, wherein in the frequency conversion a frequency doubling, tripling, Sum or difference frequency generation takes place. Anwendung eines Laser-Scanning-Mikroskops nach einem der vorangehenden Ansprüche in der Halbleiterinspektion.Use of a laser scanning microscope according to one of the preceding claims in the semiconductor inspection. Anwendung eines Laser-Scanning-Mikroskops nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Multiphotonenanregung.Application of a laser scanning microscope after a of the preceding claims for multiphoton excitation. Anwendung eines Laser-Scanning-Mikroskops nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Erzeugung eines nichtoptischen Detektionssignalsignals.Application of a laser scanning microscope after a of the preceding claims for generating a non-optical detection signal. Anwendung eines Laser-Scanning-Mikroskops nach einem der vorangehenden Ansprüche beim OBIC-Verfahren.Application of a laser scanning microscope after a of the preceding claims OBIC method.
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