DE19732917C1 - Coupling of protein or peptide, e.g. enzyme, to carrier - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Transglutaminase- katalysierten Koppeln von Protein oder Peptid an einen Träger unter Erhalt von mindestens 50% der biologischen Aktivität des Proteines oder Peptides, gemäß diesem Verfahren erhältliche trägergekoppelte Proteinimmobilisate und Träger- Protein-Konjugate sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen trägergekop pelten Proteinimmobilisate und Träger-Protein-Konjugate.The present invention relates to a method for transglutaminase catalyzed coupling of protein or peptide to a carrier to give at least 50% of the biological activity of the protein or peptide according to carrier-coupled protein immobilizates and carrier- Protein conjugates and the use of the trägergekop according to the invention pelten protein immobilizates and carrier-protein conjugates.
Die kovalente Verknüpfung von Proteinen zu stabilen Aggregaten bzw. ihre kova lente Bindung an Trägermaterialien sind wichtige Verfahren in der Medizintech nik, Lebensmitteltechnik und Diagnostik. Üblicherweise findet die Vernetzung mit chemischen Reagenzien statt, unter denen Glutardialdehyd eine herausragende Rolle spielt. Andere organische Verbindungen mit mindestens zwei reaktiven funktionellen Gruppen (eine Ausnahme stellt Formaldehyd dar) können ebenfalls eingesetzt werden. Eine stabile Bindung läßt sich auch dadurch erreichen, daß ein Protein vor der Kopplung mit einem zweiten Protein chemisch aktiviert wird. Eine gängige Methode ist beispielsweise die Oxidation von Glykoproteinen mit Periodsäure unter Öffnung eines Zuckerrings und Erzeugung reaktiver Carbonyl funktionen. Bei Immobilisierungsverfahren besitzt meistens das Trägermaterial schon eine geeignete reaktive Gruppe für die Ausbildung einer kovalenten Bin dung zwischen Protein und Trägermatrix, z. B. eine Oxirangruppe.The covalent linkage of proteins to form stable aggregates or their kova Lent binding to carrier materials are important processes in medical technology nics, food technology and diagnostics. Networking usually takes place with chemical reagents take place, among which glutaraldehyde is a prominent one Role play. Other organic compounds with at least two reactive functional groups (formaldehyde is an exception) can also can be used. A stable bond can also be achieved in that one protein is chemically activated before coupling with a second protein. A common method is, for example, the oxidation of glycoproteins with Periodic acid with opening of a sugar ring and generation of reactive carbonyl functions. In the case of immobilization processes, the carrier material usually has it already a suitable reactive group for the formation of a covalent bond dung between protein and carrier matrix, e.g. B. an oxirane group.
Die Proteinkopplung mit chemischen Vernetzungsmitteln verläuft durch die hohe Reaktivität der funktionellen Gruppen in der Regel unter milden Reaktionsbedin gungen, d. h. in neutralem Milieu und bei Raumtemperatur. Diese Verfahrenspa rameter sind auch notwendig, um eine weitgehende Denaturierung der Biomole küle und damit einhergehend den Verlust der biologischen Aktivität zu vermei den. Dennoch läßt sich bei Verwendung chemischer Reagenzien eine Desakti vierung der Proteine nicht verhindern, und in vielen Fällen kommt es zu hohen Verlusten an biologischer Aktivität. Die wesentliche Ursache für den Aktivitätsver lust muß in der vollkommen unkontrollierten und unspezifischen Reaktion zwi schen chemischem Reagenz und Protein gesehen werden.The protein coupling with chemical crosslinking agents runs through the high Reactivity of the functional groups usually under mild reaction conditions gung, d. H. in a neutral environment and at room temperature. This procedural pa parameters are also necessary to ensure that the biomole is largely denatured coolness and the associated loss of biological activity the. Nevertheless, when using chemical reagents, a deactivation can be achieved This does not prevent protein conversion, and in many cases high levels occur Loss of biological activity. The main cause of the activity failure lust must in the completely uncontrolled and unspecific reaction between chemical reagent and protein.
Es ist bereits bekannt, daß Transglutaminasen (Protein-Glutamin: Amin-γ glutamyltransferase E.C. 2.3.2.13) den Aufbau stabiler Querbrücken zwischen Proteinen spezifisch katalysieren. Dabei wird die γ-Carboxamidfunktion von Glutaminseitenketten auf die ε-Aminogruppe von Lysinresten unter Freisetzung von Ammoniumionen übertragen (Folk und Finlayson, Adv. Protein Chem. 31, 1- 133 (1977)). Die neu gebildete Isopeptidbindung hält auch einer Hydrolyse durch Proteasen stand und wird physiologisch erst nach vollständigem Abbau der Pro teine durch eine γ-Glutamylamin-Cyclotransferase gespalten (Fink et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4564-4568 (1980)).It is already known that transglutaminases (protein-glutamine: amine-γ glutamyltransferase E.C. 2.3.2.13) the construction of stable cross bridges between Catalyze proteins specifically. The γ-carboxamide function of Glutamine side chains on the ε-amino group of lysine residues with release transferred by ammonium ions (Folk and Finlayson, Adv. Protein Chem. 31, 1- 133 (1977)). The newly formed isopeptide bond will withstand hydrolysis Proteases stood and becomes physiologically only after complete degradation of the pro proteins cleaved by a γ-glutamylamine cyclotransferase (Fink et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4564-4568 (1980)).
Transglutaminasen wurden im Stand der Technik bereits zum Immobilisieren von Enzymen verwendet. Beispielsweise beschreibt die JP 59 66 886 ein Verfahren, bei dem Trägermaterial und zu koppelndes Protein zum Herstellen von Pro teinimmobilisaten simultan ausgefällt werden (simultanes Immobilisierungsverfah ren). Dazu wurden verschiedene Enzyme (Glucoseoxidase, Katalase, Diaphora se, RNase, Glucosidase, Mannosidase, Glutamatdehydrogenase) mit <2% (w/v) Trägermaterial in einer gepufferten Lösung vernetzt. Dieses Verfahren wurde auch erfolgreich zum Herstellen aktiver Caseinmembranen verwendet (JP 61 227 783 und Motoki et al., Agric. Biol. Chem. 51, 997-1002 (1987)), indem die Protein lösung unmittelbar nach Zugabe der Enzyme auf eine Vinyl- oder Polymethacry latplatte aufgebracht und an der Luft bei 37-40°C getrocknet wurde. Man erhielt auf diese Weise eine zugfeste Membran oder Folie. Ein Nachteil dieses Verfah rens ist jedoch die geringe spezifische Aktivität des erhaltenen Proteinimmobilisa tes. Die Immobilisatausbeuten variieren zwischen <1% (Glucoseoxidase) und 30% (β-Galactosidase), bezogen auf die Ausgangsaktivität. Die Abhängigkeit der Immobilisatausbeute von Proteinkonzentration und Quervernetzungsgrad wurde von Fuchsbauer et al. (Biomaterials 17, 1481-1488 (1996)) am Beispiel von β- Galactosidase aus Aspergillus oryzae mit dem Trägerprotein Gelatine untersucht. Die höchsten Immobilisatausbeuten (30-46% der Ausgangsaktivität) konnten mit einer 10-15% Gelatinelösung von hoher Gallertfestigkeit, vernetzt mit 2 mE Transglutaminase pro mg Protein, erzielt werden.Transglutaminases have already been used in the prior art to immobilize Enzymes used. For example, JP 59 66 886 describes a method in the carrier material and the protein to be coupled for the production of Pro stone immobilizations are simultaneously precipitated (simultaneous immobilization process ren). Various enzymes (glucose oxidase, catalase, Diaphora se, RNase, glucosidase, mannosidase, glutamate dehydrogenase) with <2% (w / v) Carrier material cross-linked in a buffered solution. This procedure was also used successfully for the production of active casein membranes (JP 61 227 783 and Motoki et al., Agric. Biol. Chem. 51, 997-1002 (1987)) by the Protein solution immediately after adding the enzymes to a vinyl or polymethacry lat plate applied and air dried at 37-40 ° C. One received in this way a tensile membrane or film. A disadvantage of this process rens, however, is the low specific activity of the protein immobilisa obtained tes. The immobilizate yields vary between <1% (glucose oxidase) and 30% (β-galactosidase), based on the initial activity. The dependence of the Immobilized yield of protein concentration and degree of cross-linking was by Fuchsbauer et al. (Biomaterials 17, 1481-1488 (1996)) using the example of β- Galactosidase from Aspergillus oryzae investigated with the carrier protein gelatin. The highest immobilizate yields (30-46% of the initial activity) could with a 10-15% gelatin solution of high gel strength, crosslinked with 2 mU Transglutaminase per mg protein.
Ein weiterer Nachteil des simultanen Immobilisierungsverfahrens ist es, daß die ses nur für Enzyme mit kleinen Substratmolekülen geeignet ist, die ungehindert in die Trägermatrix eindringen können, da die Enzyme in der Matrix eingeschlos sen vorliegen. Größere bzw. polymere Substratmoleküle können in die Trägerma trix nicht eindringen, so daß eine enzymatische Reaktion nicht stattfinden kann. Dieses Problem versuchten Kamata et al. (JP 06 46 855 von 1992 und Biosci. Biotech. Biochem. 56, 1323-1324 (1992)) dadurch zu lösen, daß sie Enzyme mit polymeren Substraten (Trypsin, α-Amylase) an ein Ionenaustauschermaterial banden und anschließend mit Transglutaminase anstelle von Glutardialdehyd stabilisierten. Reaktionsansätze zur Stabilisierung von α-Amylase-Immobilisaten mit pH-Werten von 6 bis 8 lieferten jedoch trotz sehr hoher Transglutaminase konzentrationen (280 mE/mg) keine aktiven Immobilisate. α-Amylase hatte nach einer Immobilisierung an zwei unterschiedlichen Ionenaustauschermaterialien und Transglutaminase-katalysierter Stabilisierung bei pH 4 und pH 9 bis 11 die höchste Restaktivität (1,5-3%). Diese Restaktivität kann wahrscheinlich nicht auf eine Stabilisierung durch Transglutaminase zurückgeführt werden, da Trans glutaminase nur im Bereich von pH 5 bis pH 9 aktiv ist. Die Rolle von Trans glutaminase bei diesem Verfahren bleibt also unklar.Another disadvantage of the simultaneous immobilization process is that the This is only suitable for enzymes with small substrate molecules that are unhindered can penetrate into the carrier matrix, since the enzymes are trapped in the matrix sen are present. Larger or polymeric substrate molecules can be in the carrier trix does not penetrate, so that an enzymatic reaction cannot take place. This problem was attempted by Kamata et al. (JP 06 46 855 from 1992 and Biosci. Biotech. Biochem. 56, 1323-1324 (1992)) by using enzymes polymeric substrates (trypsin, α-amylase) to an ion exchange material and then with transglutaminase instead of glutaraldehyde stabilized. Reaction approaches for stabilizing α-amylase immobilizates with pH values of 6 to 8, however, delivered despite a very high level of transglutaminase concentrations (280 mU / mg) no active immobilizates. α-amylase had after an immobilization on two different ion exchange materials and transglutaminase-catalyzed stabilization at pH 4 and pH 9 to 11 die highest residual activity (1.5-3%). This residual activity probably cannot occur stabilization by transglutaminase can be attributed, since Trans glutaminase is only active in the range from pH 5 to pH 9. The role of Trans glutaminase in this process remains unclear.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Pro teine oder Peptide unter Erhalt ihrer biologischen Aktivität an einen Träger ge koppelt werden können.The object of the invention is therefore to provide a method with which Pro proteins or peptides to a carrier while retaining their biological activity can be coupled.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zum Transglutamina se-katalysierten Koppeln von Protein oder Peptid an einen Trager unter Erhalt von mindestens 50% der biologischen Aktivität des Proteines oder Peptides ge löst, wobei der Träger ein bioaktives Molekül oder eine vorgegebene unlösliche Matrix ist, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens des Trägers mit dem zu koppelnden Protein und mit Transglutaminase, wobei der Träger und das Protein oder Peptid als Acyl- und/oder Amindonor wirken und als Transglutaminase substrat geeignet sind.According to the invention, this object is achieved by a method for transglutamina se-catalyzed coupling of protein or peptide to a support to obtain of at least 50% of the biological activity of the protein or peptide ge dissolves, the carrier being a bioactive molecule or a predetermined insoluble one Matrix comprising the step of bringing the carrier into contact with the coupling protein and with transglutaminase, the carrier and the protein or peptide act as acyl and / or amine donor and as transglutaminase substrate are suitable.
Unter "biologischer Aktivität" des Proteines oder Peptides ist dabei die jeweili ge enzymatische Aktivität von Enzymen, die Antikörper-Bindungsaktivität von Antikörpern, die inhibierende Aktivität von Inhibitoren und die Antigenizität von Antigenen zu verstehen. Im Einklang mit dieser Definition können nicht nur vollständige Proteine, sondern auch Proteinfragmente oder Peptide biologisch aktiv sein."Biological activity" of the protein or peptide is the respective ge enzymatic activity of enzymes, the antibody-binding activity of Antibodies, the inhibiting activity of inhibitors and the antigenicity of Understand antigens. In line with this definition can not only complete proteins, but also protein fragments or peptides biological be active.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren lassen sich Protein- oder Peptid- Immobilisate und -Konjugate mit allen von einer Transglutaminase akzeptierten Trägern herstellen. Für die Kopplung benötigen Proteine und Peptide Glutamin- und/oder Lysinreste, die für Transglutaminase zugänglich sind. Andere Verbin dungen sowie modifizierte Proteine oder Peptide müssen mindestens eine Säu reamidfunktion oder eine primäre Amingruppe besitzen. Auch eignen sich Protei ne und andere Verbindungen als Ausgangsmaterialien für die enzymatische Ver netzung, wenn diese zuvor durch Verlängerung mit einer Oligo- oder Poly glutaminylkette, einem Glutaminylpeptid, einer Oligo- oder Polylysinkette oder einem primären Amin unter Zuhilfenahme von chemischen und/oder molekular biologischen Methoden modifiziert worden sind.By the method according to the invention, protein or peptide Immobilisates and conjugates with all accepted by a transglutaminase Manufacture carriers. Proteins and peptides require glutamine and / or glutamine for the coupling Lysine residues accessible to transglutaminase. Other conn Applications as well as modified proteins or peptides must have at least one acid reamide or a primary amine group. Protei are also suitable ne and other compounds as starting materials for the enzymatic Ver wetting, if this was previously done by lengthening with an oligo- or poly glutaminyl chain, a glutaminyl peptide, an oligo- or polylysine chain or a primary amine with the help of chemical and / or molecular biological methods have been modified.
Es wird empfohlen, daß vor der enzymatischen Vernetzungsreaktion mit Trans glutaminase alle Reaktionspartner, also der Träger sowie das zu koppelnde Pro tein oder Peptid, auf ihre Eignung als Enzymsubstrat überprüft werden bzw. Re aktionspartner verwendet werden, deren Eignung als Transglutaminase-Substrat bekannt ist. Die Eignung als Transglutaminase-Substrat kann durch den Einbau von in der Regel fluoreszierenden Transglutaminase-Substraten festgestellt wer den. Es wird dabei zwischen Acyl- bzw. Glutamindonoren einerseits und Amindo noren (Glutaminakzeptoren) andererseits unterschieden. It is recommended that prior to the enzymatic crosslinking reaction with Trans glutaminase all reaction partners, i.e. the carrier and the pro to be coupled tein or peptide, to be checked for their suitability as an enzyme substrate or Re Action partners are used, their suitability as a transglutaminase substrate is known. The suitability as a transglutaminase substrate can be enhanced by the incorporation usually fluorescent transglutaminase substrates the. It is between acyl or glutamine donors on the one hand and amindo noren (glutamine acceptors) on the other hand differentiated.
Für den Nachweis reaktiver Carboxamidgruppen kann beispielsweise die von
Lorand et al. (Anal. Biochem. 44, 207-220 und 221-231(1971)) eingeführte fluo
reszierende Verbindung 5-N-(5'-N'-N'-Dimethylaminonaphthalinsulfonyl)amido
pentylamin verwendet werden. Diese Verbindung weist die folgende Formel (I)
auf:
For the detection of reactive carboxamide groups, for example, the method described by Lorand et al. (Anal. Biochem. 44, 207-220 and 221-231 (1971)) introduced fluorescent compound 5-N- (5'-N'-N'-dimethylaminonaphthalenesulfonyl) amido pentylamine can be used. This compound has the following formula (I):
Die Identifizierung reaktiver Amine in einem breit angelegten Screening-Prozeß
wurde erst mit der Synthese des Dipeptids 1-N-(Carbobenzoxy-L-glutaminyl
glycyl)-5-N-(5'-N'-N'-Dimethylaminonaphthalinsulfonyl)diamidopentan möglich,
die 1997 durch Pasternack et al. (Anal. Biochem., 249, 54-60 (1997)) eingeführt
wurde. Die Verbindung weist die folgende chemische Formel (II) auf:
The identification of reactive amines in a broad screening process was only possible with the synthesis of the dipeptide 1-N- (carbobenzoxy-L-glutaminyl glycyl) -5-N- (5'-N'-N'-dimethylaminonaphthalenesulfonyl) diamidopentane, which was published in 1997 by Pasternack et al. (Anal. Biochem., 249, 54-60 (1997)). The compound has the following chemical formula (II):
Bei Proteinen sollten zwei verschiedene Inkubationsansätze je Protein durchge führt werden (Beispiel 2). Der eine enthält neben Transglutaminase ein markier tes Amin, z. B. C-DNS(I), das zur Bestimmung reaktiver Glutaminreste geeignet ist, der andere ein markiertes Säureamid, z. B. CBZ-Gln-Gly-C-DNS(II), zur Be stimmung reaktiver Lysinseitenketten.In the case of proteins, two different incubation approaches should be carried out for each protein leads (example 2). One contains a marker in addition to transglutaminase tes amine, e.g. B. C-DNA (I), which is suitable for the determination of reactive glutamine residues the other is a labeled acid amide, e.g. B. CBZ-Gln-Gly-C-DNS (II), for Be mood of reactive lysine side chains.
Die Proteine werden nach der Inkubation elektrophoretisch aufgetrennt und an schließend durch Bestrahlung mit UV-Licht der Wellenlänge 366 nm sichtbar ge macht. Um Fehlinterpretationen bei unbekannten oder stark verunreinigten Pro teinpräparaten zu vermeiden, wird empfohlen, nach UV-Bestrahlung des Elektro phoresegels und Dokumentation eine Silber- oder Coomassie-Färbung des Gels vorzunehmen. Peptide und andere kleine Moleküle können durch Chromatogra phie, z. B. analytische HPLC, vom Überschußreagenz getrennt und über ihre Emission als Transglutaminase-Substrat erkannt werden. Prinzipiell lassen sich aber auch radioaktive oder biotinylierte Markierungsreagenzien (z. B. Biotinylami dopentyIamin der Fa. Pierce) für die Vorversuche einsetzen. Der Nachweis einer erfolgreichen Markierung erfolgt dann nach der Auftrennung durch Autoradiogra phie oder mit Avidin-/Streptavidin-Enzym-Konjugaten.After the incubation, the proteins are separated electrophoretically and applied finally visible by irradiation with UV light with a wavelength of 366 nm power. To avoid misinterpretations in the case of unknown or heavily contaminated Pro Avoiding protein supplements is recommended after UV exposure of the electro phoresegels and documentation a silver or Coomassie staining of the gel to undertake. Peptides and other small molecules can be identified by chromatography phie, e.g. B. analytical HPLC, separated from the excess reagent and on their Emission can be recognized as a transglutaminase substrate. In principle, you can but also radioactive or biotinylated labeling reagents (e.g. biotinylami dopentyIamin from Pierce) for the preliminary tests. Evidence of a Successful marking then takes place after the separation by autoradiography phy or with avidin / streptavidin-enzyme conjugates.
Unmodifizierte Proteine lassen sich so in vier Kategorien einordnen:
Unmodified proteins can be classified into four categories:
- - Glutamindonoren: Proteine mit ausschließlich reaktiven Glutaminresten (Kategorie 1);- Glutamine donors: proteins with exclusively reactive glutamine residues (Category 1);
- - Glutaminakzeptoren: Proteine mit ausschließlich reaktiven Lysinresten (Kategorie 2);- Glutamine acceptors: proteins with exclusively reactive lysine residues (Category 2);
- - Glutamindonoren und -akzeptoren: Proteine mit reaktiven Glutamin- und Lysin resten (Kategorie 3);- Glutamine donors and acceptors: Proteins with reactive glutamine and lysine residues (category 3);
- - Proteine ohne reaktive Glutamin- und Lysinreste im nativen Zustand (Kategorie 4).- Proteins without reactive glutamine and lysine residues in the native state (category 4).
Tabelle 1 zeigt beispielhaft wichtige bioaktive Proteine mit reaktiven Seitenket ten, die als Transglutaminasesubstrate dienen können. Prinzipiell können mit dem beschriebenen Testverfahren auch andere Biopolymere sowie synthetische Polymere als Transglutaminasesubstrate erkannt werden.Table 1 shows examples of important bioactive proteins with reactive side kets th, which can serve as transglutaminase substrates. In principle, you can use the test procedure described also other biopolymers as well as synthetic ones Polymers are recognized as transglutaminase substrates.
Tabelle 1Table 1
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit jeder Art von Acyl- und/oder Amindo nor durchgeführt werden, vorausgesetzt, dieser ist als Transglutaminasesubstrat geeignet, was, wie oben dargelegt, getestet werden kann. In bevorzugten Aus führungsformen ist das zu koppelnde Protein oder Peptid ein Glutamindonor und der Träger umfaßt reaktive Amingruppen. In einer alternativen Ausführungsform ist das zu koppelnde Protein oder Peptid ein Glutaminakzeptor und der Träger stellt reaktive Carboxamidgruppen zur Verfügung. Im Falle von Proteinen mit re aktiven Glutamin- und Lysinseitenketten kann der Träger Amingruppen oder Carboxamidgruppen oder Amin- und Carboxamidgruppen enthalten. Selbstver ständlich kann es sich bei dem Träger auch um ein Protein handeln, so daß die reaktiven Amingruppen des Trägers beispielsweise auch Lysinseitenketten, die reaktiven Carboxamidgruppen des Trägers reaktive Glutaminseitenketten sein können.The inventive method can with any type of acyl and / or amindo nor, provided that it is a transglutaminase substrate suitable, which, as stated above, can be tested. In preferred aus Leadership forms, the protein or peptide to be coupled is a glutamine donor and the carrier comprises reactive amine groups. In an alternative embodiment the protein or peptide to be coupled is a glutamine acceptor and the carrier provides reactive carboxamide groups. In the case of proteins with re active glutamine and lysine side chains, the carrier can contain amine groups or Contain carboxamide groups or amine and carboxamide groups. Self-assurance Of course, the carrier can also be a protein, so that the reactive amine groups of the carrier, for example, also lysine side chains, the reactive carboxamide groups of the carrier be reactive glutamine side chains can.
Erfindungsgemäß kann es sich bei dem Träger um ein in Lösung vorliegendes bioaktives Molekül handeln. Bevorzugt ist das bioaktive Molekül ein Enzym. Die Kopplung eines Proteines oder Peptides an ein Enzym dient beispielsweise der Bereitstellung von Molekülen mit zwei unterschiedlichen enzymatischen Aktivitä ten. Die Vernetzung zweier Moleküle kann außerdem für die Bereitstellung von Proteindimeren oder höheren Aggregationsformen, die zum Beispiel als Ligand eines Rezeptors eine biologische Aktivität haben, sinnvoll sein. In jedem Fall müssen von mindestens einem Reaktionspartner reaktive Amine und von minde stens einem weiteren Reaktionspartner reaktive Carboxamidgruppen zur Verfü gung gestellt werden.According to the invention, the carrier can be one that is present in solution act bioactive molecule. The bioactive molecule is preferably an enzyme. the The coupling of a protein or peptide to an enzyme is used, for example Provision of molecules with two different enzymatic activities th. The cross-linking of two molecules can also be used to provide Protein dimers or higher forms of aggregation, for example as a ligand of a receptor have biological activity. In any case must have reactive amines from at least one reactant and min At least one other reactant has reactive carboxamide groups available provided.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Träger um eine vor gegebene unlösliche Matrix. Die enzymatische Vernetzung von Proteinen, zum Beispiel von Gelatine und Casein, führt zu guten Trägern, die auch bei Tempera turen oberhalb von 100°C stabil bleiben. Vernetzte Proteine sind als unlösliche Matrix bevorzugt.In a further embodiment, the carrier is a prior art given insoluble matrix. The enzymatic crosslinking of proteins to Example of gelatin and casein, leads to good carriers, even with tempera temperatures above 100 ° C remain stable. Crosslinked proteins are considered to be insoluble Matrix preferred.
Das zu koppelnde Protein oder Peptid kann ein natives Protein oder Peptid sein, ein rekombinantes oder ein synthetisch hergestelltes. Weiter kann das zu kop pelnde Protein oder Peptid modifiziert oder unmodifiziert vorliegen. Unter Modifi kationen sind dabei sowohl Mutationen der Primärstruktur einschließlich von De letionen und Insertionen sowie Aminosäureaustausche zu verstehen, als auch chemische Modifikationen, wie die nachträgliche PEGylierung, Glykosylierung oder Deglykosylierung, das nachträgliche An- bzw. Einfügen von Cysteinresten etc. Gleiches gilt für den Träger und bezieht sich sowohl auf die unlösliche Trä germatrix als auch auf das bioaktive Molekül.The protein or peptide to be coupled can be a native protein or peptide, a recombinant or a synthetically produced one. Next can be cop pelling protein or peptide modified or unmodified. Under Modifi Cations are both mutations of the primary structure including De to understand letions and insertions as well as amino acid exchanges chemical modifications such as subsequent PEGylation, glycosylation or deglycosylation, the subsequent addition or insertion of cysteine residues etc. The same applies to the carrier and applies to both the insoluble carrier germatrix as well as the bioactive molecule.
Erfindungsgemäß behält das zu koppelnde Protein oder Peptid nach seiner Kopplung mindestens 50% der Ausgangsaktivität bei. In bevorzugten Ausfüh rungsformen beträgt die Aktivität jedoch 60% oder 70%, besonders bevorzugt 80% oder 90% oder sogar mehr als 90% seiner Ausgangsaktivität.According to the invention, the protein or peptide to be coupled retains after its Coupling at least 50% of the initial activity. In preferred execution however, the activity is 60% or 70%, particularly preferred 80% or 90% or even more than 90% of its initial activity.
Bei der Herstellung eines Konjugates aus bioaktiven Molekülen und zu koppeln dem Protein oder Peptid ist es bevorzugt, daß die biologische Aktivität des bio aktiven Moleküles ebenfalls mindestens zu 50% bestehen bleibt. Bevorzugte Ausführungsformen sehen hier ebenfalls Aktivitäten von 60 oder 70%, bevorzugt 80, 90 oder mehr als 90% vor. When producing a conjugate from bioactive molecules and to couple the protein or peptide, it is preferred that the biological activity of the bio active molecule also remains at least 50%. Preferred Embodiments also see activities of 60 or 70% here as preferred 80, 90 or more than 90% before.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Anwendung jeder Protein-Glutamin- Amin-γ-glutamyltransferase. Bevorzugt sind bakterielle Transglutaminase, Pflan zen- oder Säugertransglutaminase. Transglutaminasen sind auch in Mollusken und Krustazeen beschrieben worden und sind wahrscheinlich ubiquitär. Beson ders bevorzugt ist die Verwendung einer bakteriellen Transglutaminase. Die am besten charakterisierte bakterielle Transglutaminase ist die Transglutaminase aus Streptoverticillium mobaraense.The inventive method allows the use of any protein glutamine Amine γ-glutamyl transferase. Bacterial transglutaminase, Pflan are preferred zen or mammalian transglutaminase. Transglutaminases are also found in mollusks and crustaceans have been described and are likely ubiquitous. Special The use of a bacterial transglutaminase is preferred. The on The best characterized bacterial transglutaminase is transglutaminase from Streptoverticillium mobaraense.
Im Fall der Durchführung mit Säugertransglutaminase wird bevorzugt die Trans glutaminase aus Meerschweinchenleber verwendet. Die bisher untersuchten Säugertransglutaminasen reagieren jedoch schwächer als bakterielle Trans glutaminasen und haben teilweise eine höhere Substratspezifität. Ein Beispiel für eine Säugertransglutaminase mit hoher Substratspezifität ist der Blutgerinnungs faktor XIIIa.In the case of implementation with mammalian transglutaminase, the transglutaminase from guinea pig liver is preferably used. However, the mammalian transglutaminases investigated so far react more weakly than bacterial transglutaminases and in some cases have a higher substrate specificity. An example of a mammalian transglutaminase with high substrate specificity is the blood coagulation factor XIII a .
Die Bedingungen für die Durchführung der Transglutaminase-katalysierten
Kopplung richten sich nach der Herkunft der verwendeten Transglutaminase. Bei
Verwendung einer bakteriellen Transglutaminase erfolgt die Transglutaminase-
katalysierte Verknüpfung eines Proteins oder Peptids mit einem Träger, z. B. ei
ner enzymatisch vernetzten Gelatinefolie (Beispiel 3), bei 20-60°C innerhalb von
24 Stunden in einer gepufferten Lösung bei pH-Werten von 5 bis 9. Die Tempera
turen während der enzymatischen Verknüpfung betragen dabei bevorzugt 25 bis
55°C und besonders bevorzugt 30 bis 45°C. In der am höchsten bevorzugten
Ausführungsform erfolgt die Reaktion bei 37°C oder 37°C ± 5°C. Die Inkubati
onszeit bewegt sich bevorzugt zwischen einer halben und 18 Stunden und be
trägt besonders bevorzugt zwischen 1 und 4 Stunden. Der pH-Wert der gepuffer
ten Lösung sollte zwischen pH 5 und 9 liegen; bevorzugte Bereiche hängen vom
verwendeten Puffersystem ab und liegen für die meisten Puffer bei pH 6 bis 8,
besonders bevorzugt pH 7 ± 0,5. Als Puffer können folgende Pufferlösungen
verwendet werden:
The conditions for carrying out the transglutaminase-catalyzed coupling depend on the origin of the transglutaminase used. When using a bacterial transglutaminase, the transglutaminase-catalyzed linkage of a protein or peptide with a carrier, e.g. B. egg ner enzymatically crosslinked gelatin film (Example 3), at 20-60 ° C within 24 hours in a buffered solution at pH values of 5 to 9. The temperatures during the enzymatic link are preferably 25 to 55 ° C and particularly preferably 30 to 45 ° C. In the most preferred embodiment, the reaction is carried out at 37 ° C or 37 ° C ± 5 ° C. The incubation time is preferably between half an hour and 18 hours and particularly preferably between 1 and 4 hours. The pH of the buffered solution should be between pH 5 and 9; preferred ranges depend on the buffer system used and for most buffers are pH 6 to 8, particularly preferably pH 7 ± 0.5. The following buffer solutions can be used as buffers:
Dabei bedeutet:
1) TRIS = Tris(hydroxymethyl)aminomethan
2) Tricin = N-[Tris(hydroxymethyl)methylglycin]
3) MOPS = 3-N-Morpholinopropansulfonsäure
4) TEA = TriethanolaminIt means:
1) TRIS = tris (hydroxymethyl) aminomethane
2) tricine = N- [tris (hydroxymethyl) methylglycine]
3) MOPS = 3-N-morpholinopropanesulfonic acid
4) TEA = triethanolamine
Bei Verwendung von bakterieller Transglutaminase aus Streptoverticillium moba raense ist der bevorzugte Puffer Tricin-HCl-Puffer, während das aus Meer schweinchenleber gewonnene Säugerenzym die besten Ergebnisse in TRIS-HCl- Puffer mit EDTA, Dithiotreitol und Calciumionen erbringt.When using bacterial transglutaminase from Streptoverticillium moba raense is the preferred buffer while the tricine-HCl buffer is from sea pig liver derived mammalian enzyme the best results in TRIS-HCl- Provides buffer with EDTA, dithiotreitol and calcium ions.
Die erhaltenen Träger-gekoppelten Proteinimmobilisate weisen eine unerwartet hohe Belegdichte auf. Man erhält beispielsweise ein Gelatine-Protein-A- Immobilisat mit einer Belegdichte von mindestens 2 ng (50 fmol) Protein A pro mm2 Folie, wenn 1 µmol Protein A und 2 g (ca. 4 dm2) Gelatinefolie in Tris-Acetat- Puffer, pH 6,0, mit 50 nmol bakterieller Transglutaminase für 60 min bei 37°C inkubiert werden (Beispiel 4 und 5). Bei der Berechnung der Belegdichte wurde davon ausgegangen, daß immobilisiertes Protein A noch die maximale Zahl von 2 Antikörpermolekülen der Klasse IgG bindet. Möglicherweise wird aber eine hö here Belegdichte mit diesem Verfahren erreicht.The carrier-coupled protein immobilizates obtained have an unexpectedly high coverage density. For example, a gelatin protein A immobilizate is obtained with a density of at least 2 ng (50 fmol) protein A per mm 2 film if 1 µmol protein A and 2 g (approx. 4 dm 2 ) gelatin film in Tris acetate Buffer, pH 6.0, are incubated with 50 nmol bacterial transglutaminase for 60 min at 37 ° C. (Examples 4 and 5). When calculating the coverage density, it was assumed that immobilized protein A still binds the maximum number of 2 antibody molecules of the IgG class. However, a higher density of documents may be achieved with this method.
Erfindungsgemäß kann das zu koppelnde Protein oder Peptid mehr als eine Protein- und/oder Peptidsequenz umfassen. Wie in einem Multienzymkomplex können so mehrere Proteine oder biologisch aktive Peptide auf engstem Raum immobilisiert werden (Multi-Enzymimmobilisat). According to the invention, the protein or peptide to be coupled can be more than one Comprising protein and / or peptide sequence. Like in a multi-enzyme complex several proteins or biologically active peptides can be stored in a small space immobilized (multi-enzyme immobilization).
Das optimale molare Verhältnis von zu koppelndem Protein oder Peptid zu Trä ger kann den jeweiligen Bedürfnissen entsprechend jeweils experimentell be stimmt werden. Das Mischungsverhältnis für beide Verbindungen hängt von der Anzahl reaktiver Gruppen, der Molekülgröße und der beabsichtigten Verwendung des Konjugats ab. Üblicherweise beträgt das molare Verhältnis 5 : 1 bis 1 : 100 (zu koppelndes Protein oder Peptid zu Träger). Bevorzugte Bereiche sind dabei im Fall einer Kopplung an einen unlöslichen Träger 1 : 5 bis 1 : 50.The optimal molar ratio of protein or peptide to be coupled to Trä ger can be carried out experimentally according to the respective needs become true. The mixing ratio for both compounds depends on the Number of reactive groups, molecular size and intended use of the conjugate. The molar ratio is usually 5: 1 to 1: 100 (to coupling protein or peptide to carrier). Preferred areas are im Case of coupling to an insoluble carrier 1: 5 to 1:50.
Zum Herstellen von Konjugaten mit unterschiedlichen biologischen Aktivitäten werden mindestens zwei verschiedene Transglutaminase-Substratmoleküle, idealerweise ein Glutamindonor (Kategorie 1) und ein Glutaminakzeptor (Kate gorie 2), mit Transglutaminase bei pH 5-9 und Temperaturen von 20-60°C inku biert. Im Fall der Bildung von Träger-Protein-Konjugaten ist das bevorzugte Ver hältnis von zu koppelndem Protein oder Peptid zu bioaktivem Molekül 1 : 20 bis 5 : 1.For producing conjugates with different biological activities are at least two different transglutaminase substrate molecules, ideally a glutamine donor (category 1) and a glutamine acceptor (Kate gorie 2), with transglutaminase at pH 5-9 and temperatures of 20-60 ° C incu beer. In the case of the formation of carrier-protein conjugates, the preferred Ver ratio of protein or peptide to be coupled to bioactive molecule 1: 20 to 5: 1.
Nach Beendigung der Reaktion kann das Produkt bei Bedarf durch Dialyse, Ul trafiltration, Fällung oder ein chromatographisches Verfahren gereinigt werden.After the reaction has ended, the product can, if necessary, by dialysis, Ul trafiltration, precipitation or a chromatographic process.
Zu den Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens zählt es, daß die biologi sche Aktivität der Reaktionspartner in der Regel vollständig erhalten bleibt. Ein weiterer entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber einer bekannten chemischen Kopplung ist vor allem darin zu sehen, daß durch Trennverfahren die teuren, nicht umgesetzten Ausgangsverbindungen zurückge wonnen werden können. So kann beispielsweise ein Konjugat mit zwei unter schiedlichen biologischen Aktivitäten hergestellt werden indem man Protein G (ein Protein der Kategorie 2, siehe auch Tabelle 3) mit Soja-Peroxidase (ein Protein der Kategorie 3) im Verhältnis 1 : 20 mit Transglutaminase vernetzt (Beispiel 7). Eine erfolgreiche Kopplung kann dadurch überprüft werden, daß man Antikörper der Klasse G (IgG), die Protein G spezifisch binden, auf einer Nitrozellulosemembran fixiert, die Testlösung aufbringt und nach mehreren Waschschritten mit 4-Chlor-1-naphthol und Wasserstoffperoxid anfärbt ("Dot- Blot"). Eine quantitative Erfassung der gebildeten Konjugate erfolgt über einen Mikrotiterplatten-Assay (Beispiel 8). Eine Anreicherung bzw. vollständige Reini gung der Protein G-Peroxidase-Konjugate sowie die Rückgewinnung der nicht umgesetzten Ausgangsmaterialien wird durch Chromatographie an einem Anio nenaustauscher (Beispiel 9) oder durch Gelpermeationschromatographie er reicht.One of the advantages of the method according to the invention is that the biologi cal activity of the reactants is usually completely retained. A Another decisive advantage of the method according to the invention over a known chemical coupling can be seen mainly in the fact that through Separation process the expensive, unreacted starting compounds back can be won. For example, a conjugate with two under Different biological activities can be produced by making protein G (a category 2 protein, see also Table 3) with soy peroxidase (a Category 3 protein) cross-linked with transglutaminase in a ratio of 1:20 (Example 7). Successful pairing can be checked by class G (IgG) antibodies that specifically bind protein G on a Nitrocellulose membrane fixed, the test solution applies and after several Washing steps with 4-chloro-1-naphthol and hydrogen peroxide stains ("Dot- Blot "). The conjugates formed are quantitatively recorded using a Microtiter Plate Assay (Example 8). An enrichment or complete cleaning recovery of the protein G-peroxidase conjugates and the recovery of the not converted starting materials is by chromatography on an anion ion exchanger (Example 9) or by gel permeation chromatography enough.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein trägergekoppeltes Proteinimmobilisat sowie auf ein Träger-Protein-Konjugat, die durch das erfindungsgemäße Verfah ren erhältlich sind.The invention further relates to a carrier-coupled protein immobilizate as well as a carrier-protein conjugate, which by the method according to the invention ren are available.
Ein bevorzugtes Träger-Protein-Konjugat ist ein durch Transglutaminase kataly sierte Kopplung erhaltenes Konjugat aus monoklonalem oder polyklonalem Anti körper und Markerenzym. Bei diesem Markerenzym kann es sich beispielsweise um alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase oder jedes andere im Stand der Technik bekannte Markerenzym handeln. Dabei erlaubt die Transglutamina se-katalysierte Kopplung die Verbindung eines Antikörpermoleküls mit bis zu 20 Enzymmolekülen, was die Amplifizierung des Signales z. B. bei nachfolgenden Antigen-Antikörper-Reaktionen erlaubt. Auch durch Vernetzung entstandene oli gomere Enzyme verstärken das Signal.A preferred carrier-protein conjugate is one catalyzed by transglutaminase ized coupling obtained conjugate of monoclonal or polyclonal anti body and marker enzyme. This marker enzyme can be, for example to alkaline phosphatase, horseradish peroxidase or any other in the state marker enzyme known in the art. The transglutamina allows se-catalyzed coupling the connection of an antibody molecule with up to 20 Enzyme molecules, what the amplification of the signal z. B. with subsequent Antigen-antibody reactions allowed. Also oli created through networking gomeric enzymes amplify the signal.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung eines trägergekoppelten Proteinimmobilisates oder Träger-Protein-Konjugates in der enzymatischen Ana lyse.The invention also relates to the use of a beam-coupled Protein immobilisates or carrier-protein conjugates in the enzymatic ana lysis.
Beispielsweise können die in Tabelle 3 aufgelisteten Substratproteine an einen unlöslichen Träger gekoppelt und zur Etablierung eines neuen Transglutamina se-Aktivitätstests herangezogen werden, insbesondere zur Entwicklung eines spezifischen und sensitiven Analyseverfahrens zur Bestimmung von aktivem Faktor XIIIa in humanem Blutserum. Dafür wird eine Mikrotiterplatte mit einem guten Transglutaminase-Substrat, z. B. Casein, beschichtet. Noch freie Bin dungsstellen wurden mit Rinderserumalbumin abgesättigt. Nach Zugabe eines Enzyms, das über reaktive Glutamin- oder Lysinreste verfügt, z. B. alkalische Phosphatase (Beispiel 6), pipettiert man die Transglutaminaseprobe oder eine Vergleichsprobe zu und inkubiert 0,5 bis 5 Stunden oder auch länger, je nach gewünschter Empfindlichkeit, bei pH 5 bis 9 und Temperaturen von 20-50°C. Der kovalent gebundene Enzymanteil wird nach mehrfachem Waschen über eine co lorimetrische Enzymreaktion quantitativ bestimmt, bei alkalischer Phosphatase beispielsweise über die Hydrolyse von para-Nitrophenylphosphat. Bei Verwen dung der Substratproteine Protein A und Protein G, Avidin und Streptavidin ist eine zweite Inkubation mit Antikörper-Enzym-Konjugaten bzw. Biotin-Enzym- Konjugaten notwendig, bevor eine Nachweisreaktion durchgeführt werden kann. Dies verbessert die Sensitivität durch eine höhere Enzymkonzentration auf der Mikrotiterplatte, da Protein A und Protein G bis zu 2, Avidin und Streptavidin bis zu 4 Konjugatmoleküle binden können.For example, the substrate proteins listed in Table 3 can be coupled to an insoluble carrier and used to establish a new transglutamina se activity test, in particular to develop a specific and sensitive analysis method for determining active factor XIII a in human blood serum. For this purpose, a microtiter plate with a good transglutaminase substrate, e.g. B. Casein coated. Binding sites that were still free were saturated with bovine serum albumin. After adding an enzyme that has reactive glutamine or lysine residues, e.g. B. alkaline phosphatase (Example 6), the transglutaminase sample or a comparison sample is added and incubated for 0.5 to 5 hours or longer, depending on the desired sensitivity, at pH 5 to 9 and temperatures of 20-50 ° C. The covalently bound enzyme portion is determined quantitatively after repeated washing by means of a co-lorimetric enzyme reaction, in the case of alkaline phosphatase for example by hydrolysis of para-nitrophenyl phosphate. When using the substrate proteins protein A and protein G, avidin and streptavidin, a second incubation with antibody-enzyme conjugates or biotin-enzyme conjugates is necessary before a detection reaction can be carried out. This improves the sensitivity through a higher enzyme concentration on the microtiter plate, since protein A and protein G can bind up to 2 conjugate molecules, avidin and streptavidin up to 4 conjugate molecules.
Eine Abwandlung des Tests kann darin bestehen, daß die beschichtete Mikroti terplatte durch eine vernetzte Gelatinefolie ersetzt ist. Diese wird dann in eine Enzymlösung eingetaucht, der nachfolgend die Transglutaminaseprobe zugesetzt wird. Nach Inkubation und mehrfachem Waschen kann der Gelatinestreifen direkt für die photometrische Messung in einer Küvette verwendet werden.A modification of the test can consist in that the coated Mikroti terplatte is replaced by a cross-linked gelatin film. This is then converted into a Immersed enzyme solution to which the transglutaminase sample was subsequently added will. After incubation and multiple washes, the gelatin strip can be used directly can be used for photometric measurement in a cuvette.
Weitere erfindungsgemäße Verwendungen sehen die Verwendung als Protein modul in oligomerer oder polymerer Form zum Herstellen von Folgeprodukten vor. So können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durch sequenzielle Im mobilisierung an Trägern Multi-Enzymimmobilisate hergestellt werden, die bei spielsweise bei einer Mehrstufensynthese von organischen oder biologischen Verbindungen eingesetzt werden können. Die erfindungsgemäß hergestellten Multi-Enzymimmobilisate eignen sich auch für diagnostische Anwendungen, bei spielsweise für die Bestimmung von Glycerinlipiden nach enzymatischer Freiset zung und Oxidation von Glycerin, und photometrischer Messung der bei dieser Reaktion gebildeten Reduktionsäquivalente. Further uses according to the invention see the use as a protein module in oligomeric or polymeric form for the manufacture of secondary products before. Thus, with the method according to the invention by sequential Im mobilization on carriers Multi-enzyme immobilizates are produced that are used in for example in a multistage synthesis of organic or biological Connections can be used. The manufactured according to the invention Multi-enzyme immobilizates are also suitable for diagnostic applications for example for the determination of glycerol lipids after enzymatic release tion and oxidation of glycerol, and photometric measurement of this Reduction equivalents formed in the reaction.
Die erfindungsgemäßen Proteinimmobilisate und Träger-Protein-Konjugate kön nen auch zum Herstellen von Biosensoren verwendet werden. Für die Biosensor technik benötigt man stabile bioaktive Verbindungen, die möglichst auf engstem Raum fixiert sind. Aktive Proteinfolien oder andere aktive unlösliche Proteinkom plexe könnten hierbei Vorteile gegenüber löslichen Enzymen bieten. So könnte beispielsweise ein Biosensor konstruiert werden, dessen Oberfläche mit einem bestimmten Antigen, beispielsweise Hepatitis-B-Oberflächenvirusprotein, belegt ist. Nach Inkontaktbringen des Biosensors mit einer Probe, enthaltend eine un bekannte Konzentration von Antikörpern gegen HbsAg und eine bekannte Kon zentration anti-HbsAg-Antikörper-Enzymkonjugat konkurrieren die enzymkonju gierten Antikörper mit den zu bestimmenden Antikörpern um die Bindungsstellen. Nach Besetzung der Bindungsstellen am Biosensor ist ein elektrisches Signal, das durch das Enzym erzeugt wird, umgekehrt proportional zur unbekannten An tikörperkonzentrationen. Der Biosensor kann durch Freisetzen der Antikörper regeneriert werden.The protein immobilizates and carrier-protein conjugates according to the invention can They can also be used to make biosensors. For the biosensor technology you need stable bioactive connections, which are as close as possible Space are fixed. Active protein films or other active insoluble protein com plexes could offer advantages over soluble enzymes. So could For example, a biosensor can be constructed whose surface is covered with a certain antigen, for example hepatitis B surface virus protein, occupied is. After bringing the biosensor into contact with a sample containing an un known concentration of antibodies against HbsAg and a known Kon centration anti-HbsAg antibody-enzyme conjugate compete with the enzyme conjugate ligated antibodies with the antibodies to be determined around the binding sites. After occupying the binding sites on the biosensor, there is an electrical signal, produced by the enzyme is inversely proportional to the unknown An body concentrations. The biosensor can release the antibodies be regenerated.
Erfindungsgemäß können die Träger-gekoppelten Proteinimmobilisate beschich tete Mikrotiterplatten mit biologischer Aktivität sein. Weiter können aktive Mem branen, Enzymcarrier und analytische Teststreifen unter Verwendung der erfin dungsgemäßen Proteinimmobilisate hergestellt werden. In der Diagnostik und Analytik sind eine Vielzahl von Teststreifen bekannt die auf der Aktivität eines an dem Teststreifen immobilisierten Enzymes beruhen Teststreifen finden zuneh mend auch im häuslichen Bereich Verwendung. So wurde z. B. in Japan ein Teststäbchen entwickelt, das durch die enzymatische Bestimmung des Kada verinanteils an der Oberfläche von Fisch eine Aussage über dessen Frische er laubt.According to the invention, the carrier-coupled protein immobilizates can be coated tete microtiter plates with biological activity. Active Mem branen, enzyme carriers and analytical test strips using the inven protein immobilizates according to the invention are produced. In diagnostics and A large number of test strips are known to indicate the activity of an analytical system The test strips are based on immobilized enzyme can also be used in the home. So was z. B. in Japan Test stick developed by the enzymatic determination of the Kada verin share on the surface of fish is a statement about its freshness leaves.
Im folgenden wird die Erfindung anhand der beigefügten Abbildungen und der Beispiele im einzelnen beschrieben.In the following the invention with reference to the accompanying figures and the Examples are described in detail.
Dabei zeigt It shows
Abb. 1 eine Eichgrade für ein Kaninchen-anti-Huhn-IgG alkalische Phos phatasekonjugat, Fig. 1 a calibration grade for a rabbit anti-chicken IgG alkaline phosphatase conjugate,
Abb. 2 die Bindung von Protein A an eine Gelatinefolie in Abhängigkeit von der Konzentration des Vernetzungsenzyms, Fig. 2 the binding of protein A to a gelatin film as a function of the concentration of the crosslinking enzyme,
Abb. 3 die Bestimmung von Transglutaminase durch kovalente Bindung von alkalischer Phosphatase an eine mit Casein beschichtete Mikrotiterplatte und nachfolgender Hydrolyse von Paranitrophenylphosphat, und Fig. 3 the determination of transglutaminase by covalent binding of alkaline phosphatase to a microtiter plate coated with casein and subsequent hydrolysis of paranitrophenyl phosphate, and
Abb. 4 die Anreicherung von Protein G Peroxidasekonjugaten durch Ionen austauschchromatographie an Fractogel EDM-TMAE 650 S. Fig. 4 the enrichment of protein G peroxidase conjugates by ion exchange chromatography on Fractogel EDM-TMAE 650 S.
Transglutaminase wurde aus dem Kulturüberstand von Streptoverticillium moba raense, wie von Gerber et al., Biochem. J. 299, 825-829 (1994), beschrieben, durch Chromatographie an einem stark sauren Ionenaustauscher und Material gereinigt. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte das Enzym als eine ein zelne Bande mit einer spezifischen Aktivität von mehr als 30 E/mg, wenn es im Einklang mit dem von Grossowicz et al., J. Biol. Chem. 187, 111-125 (1950), be schriebenen Verfahren auf Hydroxamatbildung mit CBZ-Glutaminylglycin getestet wurde. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Bicinchonin säure-Standardprotokolls, wie vom Hersteller beschrieben, bestimmt.Transglutaminase was obtained from the culture supernatant of Streptoverticillium moba raense as described by Gerber et al., Biochem. J. 299, 825-829 (1994), described, by chromatography on a strongly acidic ion exchanger and material cleaned. The polyacrylamide gel electrophoresis showed the enzyme as one single band with a specific activity of more than 30 U / mg when it is im Consistent with that of Grossowicz et al., J. Biol. Chem. 187, 111-125 (1950), be methods were tested for hydroxamate formation with CBZ-glutaminylglycine became. Protein concentrations were determined using a bicinchonine acid standard protocol as described by the manufacturer.
Die Proteinlösungen der hier beschriebenen Transglutaminase-Substrate werden mit den in Tab. 2 angegebenen Konzentrationen in 0.02 M Natriumphosphatpuf fer, pH 7.3, gelöst. The protein solutions of the transglutaminase substrates described here are with the concentrations given in Tab. 2 in 0.02 M sodium phosphate buffer fer, pH 7.3, dissolved.
Tabelle 2Table 2
22 µmol C-DNS (Sigma) werden in 27 µl 1 M HCl und 150 µl 0,2 M Tris-Acetat- Puffer, pH 6.0, gelöst. Nachfolgend wird mit bidest. H2O auf 1 ml aufgefüllt.22 μmol of C-DNA (Sigma) are dissolved in 27 μl of 1 M HCl and 150 μl of 0.2 M Tris acetate buffer, pH 6.0. In the following, bidist. H 2 O made up to 1 ml.
12 µmol CBZ-Gln-Gly-C-DNS (Synthese siehe Pasternack et al., Anal. Biochem. 249, 54-60 (1997)) werden in 300 µl DMSO gelöst und mit 2.7 ml 0,01 M HCl verdünnt.12 µmol CBZ-Gln-Gly-C-DNA (for synthesis see Pasternack et al., Anal. Biochem. 249, 54-60 (1997)) are dissolved in 300 μl of DMSO and mixed with 2.7 ml of 0.01 M HCl diluted.
Transglutaminase wird beispielsweise wie in Beispiel 1 beschrieben durch Kulti vierung von Streptoverticillium mobaraense (DSM 40847) gewonnen und durch Ionenaustauschchromatographie nach einem Standardverfahren (Gerber et al., Biochem. J. 299, 825-829 (1994)) angereichert. Die Enzymaktivität wird nach der Methode von Grossowicz et al. (J. Biol. Chem. 187, 111-125 (1950)) bestimmt. Die verwendete Enzymmenge ist in Tab. 2 angegeben.Transglutaminase is for example as described in Example 1 by Kulti vation of Streptoverticillium mobaraense (DSM 40847) obtained and carried out Ion exchange chromatography according to a standard method (Gerber et al., Biochem. J. 299, 825-829 (1994)). The enzyme activity is after the Method by Grossowicz et al. (J. Biol. Chem. 187, 111-125 (1950)). The amount of enzyme used is given in Tab.
2 g Harnstoff werden in einer Mischung aus 2 ml 20% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 2 ml Glycerin, 2 ml gesättigter Bromphenolblaulösung und 2 ml bidest. H2O gelöst.2 g of urea are added to a mixture of 2 ml of 20% (w / v) sodium dodecyl sulfate (SDS), 2 ml of glycerol, 2 ml of saturated bromophenol blue solution and 2 ml of double-distilled. H 2 O dissolved.
Die Reagenzlösungen werden in der Reihenfolge von Tab. 3 gemischt und nach einer vorgegebenen Inkubationszeit analysiert. The reagent solutions are mixed in the order of Tab. 3 and after analyzed for a given incubation period.
Tabelle 3Table 3
Jede Probe wird nach der Methode von Laemmli (Nature 227, 680-685 (1970)) auf 12,5%igen Polyacrylamidgelen mit 5%igen Obergelen elektrophoretisch aufgetrennt und vor der Silberfärbung nach der Methode von Blum et al. (Electrophoresis 8, 93-99 (1987)) mit UV-Licht der Wellenlänge 366 nm unter sucht. Einige Ergebnisse sind in Tab. 1 (s. o.) aufgeführt.Each sample is determined according to the method of Laemmli (Nature 227, 680-685 (1970)) electrophoretically on 12.5% polyacrylamide gels with 5% top gels separated and before the silver staining by the method of Blum et al. (Electrophoresis 8, 93-99 (1987)) with UV light of a wavelength of 366 nm below seeks. Some results are shown in Tab. 1 (see above).
2 g Gelatine min einer Gallertfestigkeit von 250-300 g Bloom werden mit 8 g H2O übergossen und nach 30 min bei 60 °C gelöst. Die auf 50 °C abgekühlte Gelati nelösung wird mit Transglutaminase (0,5 E/g Gelatine) versetzt und sofort in eine Foliengießvorrichtung (Folienmaschine oder Gießkammer) übergeführt. Nach 30 min wird die erstarrte Folie abgelöst und an der Luft über Nacht getrocknet. 8 g of H 2 O are poured over 2 g of gelatin with a gel strength of 250-300 g of Bloom and dissolved at 60 ° C. after 30 minutes. The gelatin solution, cooled to 50 ° C., is mixed with transglutaminase (0.5 U / g gelatin) and immediately transferred to a film casting device (film machine or casting chamber). After 30 minutes, the solidified film is peeled off and air-dried overnight.
Eine vernetzte Gelatinefolie (2 g Trockenmasse) wird in 70 ml 0,2 M Tris-Acetat- Puffer, pH 6,0, auf 37 °C erwärmt. Nach Zugabe von 10 ml 10 mM Protein A in 0,2 M Tris-Acetat-Puffer, pH 6,0, und 20 ml Transglutaminase der Aktivität 4 E/ml inkubiert man 60 min bei 37 °C. Anschließend wird die Folie zweimal mit 100 ml Tris-Acetat-Puffer, pH 6,0, gewaschen, an der Luft getrocknet und in Streifen (ca. 2 mg) geschnitten.A cross-linked gelatin film (2 g dry matter) is in 70 ml of 0.2 M Tris acetate Buffer, pH 6.0, warmed to 37 ° C. After adding 10 ml of 10 mM protein A in 0.2 M Tris-acetate buffer, pH 6.0, and 20 ml of transglutaminase with an activity of 4 U / ml incubated for 60 min at 37 ° C. Then the film is twice with 100 ml Tris acetate buffer, pH 6.0, washed, air dried and cut into strips (approx. 2 mg) cut.
Ein Kaninchen-anti-Huhn-Antikörper (IgG) konjugiert mit Alkalischer Phosphatase (Sigma) wird mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, der zusätzlich 150 mM NaCl, 0,005% (v/v) Tween 20 und 0,09% (w/v) NaN3 enthält (AK-Bindungspuffer), 1 : 2000 bis 1 : 10000 verdünnt. Mit jeder Verdünnung wird eine Farbreaktion nach dem Schema von Tab. 4 durchgeführt. Die Eichgerade zeigt Abb. 1.A rabbit anti-chicken antibody (IgG) conjugated with alkaline phosphatase (Sigma) is mixed with 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 8.0, which also contains 150 mM NaCl, 0.005% (v / v) Tween 20 and contains 0.09% (w / v) NaN 3 (AK binding buffer), diluted 1: 2000 to 1: 10000. A color reaction according to the scheme of Tab. 4 is carried out with each dilution. The calibration line is shown in Fig. 1.
Tabelle 4Table 4
Ein 2-mg-Streifen des Gelatine-Protein-A-Immobilisats wird zum Quellen 30 min in AK-Bindungspuffer gelegt. Das gut abgetropfte Aliquot wird in 100 µl einer 1 : 2000-Verdünnung des Antikörper-Alkalische-Phosphatase-Konjugats überge führt und 10 min bei 37°C inkubiert. Nach dreifachem Waschen mit AK-Bin dungspuffer wird die Farbreaktion nach dem Schema von Tab. 4 durchgeführt. Für den Vergleichsansatz dient eine vernetzte Gelatinefolie ohne Protein A. Abb. 2 zeigt die Abhängigkeit der Protein A-Belegdichte von der Konzentration des Vernetzungsenzyms.A 2 mg strip of the gelatin protein A immobilizate is placed in AK binding buffer for 30 minutes to swell. The well drained aliquot is transferred to 100 μl of a 1: 2000 dilution of the antibody-alkaline-phosphatase conjugate and incubated at 37 ° C. for 10 min. After washing three times with AK binding buffer, the color reaction is carried out according to the scheme in Tab. A crosslinked gelatin film without protein A is used for the comparison. FIG. 2 shows the dependence of the protein A coverage on the concentration of the crosslinking enzyme.
In jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol werden 250 µl einer Ca seinlösung (1 mg/ml in Beschichtungspuffer bestehend aus 40 mM Tris-HCl mit 150 mM NaCl, pH 8,3) pipettiert. Die Mikrotiterplatten werden über Nacht bei 4 °C inkubiert und verbliebene Bindungsstellen mit 250 µl einer 1% (w/v) Rinder serumalbumin-Lösung in Beschichtungspuffer abgesättigt.250 μl of a Ca. his solution (1 mg / ml in coating buffer consisting of 40 mM Tris-HCl with 150 mM NaCl, pH 8.3) pipetted. The microtiter plates are kept at 4 ° C overnight incubated and remaining binding sites with 250 µl of a 1% (w / v) cattle saturated serum albumin solution in coating buffer.
In jede Vertiefung pipettiert man 20 µl einer Probe oder Vergleichsprobe (z. B. nur den verwendeten Puffer ohne Transglutaminase) und 20 µl einer Alkalische- Phosphatase-Lösung (67 µg/ml in Beschichtungspuffer) und inkubiert 120 min bei Raumtemperatur. Anschließend wird dreimal mit Substratpuffer für Alkalische Phosphatase, bestehend aus 1 M Diethanolamin-HCl-Puffer mit 0,01 mM MgCl2, pH 9,8, gewaschen.20 µl of a sample or comparison sample (e.g. only the buffer used without transglutaminase) and 20 µl of an alkaline phosphatase solution (67 µg / ml in coating buffer) are pipetted into each well and incubated for 120 min at room temperature. It is then washed three times with substrate buffer for alkaline phosphatase, consisting of 1 M diethanolamine-HCl buffer with 0.01 mM MgCl 2 , pH 9.8.
100 µl einer Substratlösung aus para-Nitrophenylphosphat in Substratpuffer (2 mg/ml) werden in jede Vertiefung pipettiert, und nach 30 min wird die optische Dichte bei 405 nm (Abb. 3) bestimmt. 100 μl of a substrate solution of para-nitrophenyl phosphate in substrate buffer (2 mg / ml) are pipetted into each well, and after 30 minutes the optical density is determined at 405 nm ( FIG. 3).
Sojabohnen-Peroxidase und Protein G werden in einem molaren Verhältnis von 20 : 1 in 0,3 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, gelöst. Nach Zugabe von Transglutamina se (0,5 E/mg Protein) wird 18 h bei 37 °C inkubiert.Soybean peroxidase and protein G are in a molar ratio of Dissolved 20: 1 in 0.3 M Tris-HCl buffer, pH 7.0. After adding transglutamina se (0.5 U / mg protein) is incubated at 37 ° C. for 18 h.
In jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol werden 100 µl einer Lö sung aus 10 µg Kaninchen-Antikörper (IgG, Sigma) in 1 ml Beschichtungspuffer, bestehend aus 40 mM Tris-HCl mit 150 mM NaCl, pH 8,3 pipettiert. Die Mikroti terplatte wird 60 min bei Raumtemperatur inkubiert, entleert und verbleibende Bindungsstellen mit 200 µl einer 1% (w/v) Rinderserumalbumin-Lösung in Be schichtungspuffer abgesättigt. Nachfolgend wird dreimal mit 200 µl Beschich tungspuffer gespült.In each well of a microtiter plate made of polystyrene 100 μl of a lo Solution from 10 µg rabbit antibody (IgG, Sigma) in 1 ml coating buffer, consisting of 40 mM Tris-HCl pipetted with 150 mM NaCl, pH 8.3. The microti The plate is incubated for 60 min at room temperature, emptied and the remaining Binding sites with 200 µl of a 1% (w / v) bovine serum albumin solution in Be stratification buffer saturated. Then it is coated three times with 200 µl rinsed processing buffer.
In jede Vertiefung werden 100 µl einer Probe oder Vergleichsprobe (z. B. Konju gatansatz ohne Transglutaminase) pipettiert und 60 min bei Raumtemperatur in kubiert. Anschließend wird erneut dreimal mit 200 µl Beschichtungspuffer ge spült.100 µl of a sample or comparison sample (e.g. Konju gate approach without transglutaminase) and pipetted for 60 min at room temperature in cubed. Then it is again three times with 200 μl of coating buffer washes.
Eine Substratlösung wird hergestellt aus 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0, 2 ml einer 5% (w/v) Pyrogallol-Lösung in H2O, 1 ml 0,05% H2O2-Lösung und 13 ml H2O. In jede Vertiefung der Mikrotiterplatte werden 100 µl der Substratlösung pipettiert, und nach 30 min wird die Extinktion bei 405 nm gemessen. A substrate solution is prepared from 2 ml of 0.1 M phosphate buffer, pH 6.0, 2 ml of a 5% (w / v) pyrogallol solution in H 2 O, 1 ml of 0.05% H 2 O 2 solution and 13 ml H 2 O. 100 μl of the substrate solution are pipetted into each well of the microtiter plate, and after 30 minutes the absorbance is measured at 405 nm.
Eine 10×150 mm Ionenaustauschersäule gefüllt mit Fractogel-EMD-TMAE-650 S (Merck) wird mit dem fünffachen Bettvolumen an 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, äquilibriert. 1 ml einer Protein-G-Peroxidase-Konjugatmischung wird auf die Säule gepumpt, und die nicht-bindenden Proteine (Transglutaminase und Protein G in dieser Reihenfolge) werden mit Äquilibrierpuffer von der Säule ge spült. Anschließend werden die Konjugate durch lineare Erhöhung der Ionenkon zentration mit NaCl von 0 bis 0,15 M innerhalb von 60 min eluiert. Die höchsten Konjugatkonzentrationen finden sich in Fraktionen bei 0,08-0,12 M NaCl (Abb. 4).A 10 × 150 mm ion exchange column filled with Fractogel-EMD-TMAE-650 S (Merck) is equilibrated with five times the bed volume of 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. 1 ml of a protein-G-peroxidase conjugate mixture is pumped onto the column and the non-binding proteins (transglutaminase and protein G in that order) are flushed from the column with equilibration buffer. The conjugates are then eluted by linearly increasing the ion concentration with NaCl from 0 to 0.15 M within 60 min. The highest conjugate concentrations are found in fractions at 0.08-0.12 M NaCl ( Fig. 4).
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