DE19729211A1

DE19729211A1 - New semaphorin L proteins

Info

Publication number: DE19729211A1
Application number: DE1997129211
Authority: DE
Inventors: Bernhard Prof Dr Fleckenstein; Armin Dr Ensser
Original assignee: Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH; Hoechst Marion Roussel Inc
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1997-07-09
Filing date: 1997-07-09
Publication date: 1999-01-14
Anticipated expiration: 2017-07-10
Also published as: DE19729211C2

Abstract

A semaphorin L protein (I) comprising a N-terminal signal peptide, a characteristic semaphorin domain and a C-terminal region comprising an immunoglobulin-like domain and a transmembrane domain, is new. Also claimed are: (i) derivatives of (I); (ii) nucleic acids encoding (I) and its derivatives; and (iii) antibodies that recognise the human semaphorin L epitope corresponding to amino acids 179-378 or 480-666 of a 666 amino acid sequence.

Description

Gegenstand der Erfindung sind neuen Semaphorine, die sich durch eine besondere Domänenstruktur auszeichnen und deren Derivate, Nukleinsäuren (DNA, RNA, cDNA), die für diese Semaphorine kodieren und deren Derivate sowie die Verwendung derselben.The invention relates to new semaphorins that are distinguished by a special Identify the domain structure and their derivatives, nucleic acids (DNA, RNA, cDNA), which code for these semaphorins and their derivatives as well as the Using the same.

Semaphorine wurden erstmals von Koldokin {Kolodkin et al. (1993) Cell 75: 1389- 1399} als Mitglieder einer konservierten Genfamilie beschrieben.Semaphorins were first used by Koldokine {Kolodkin et al. (1993) Cell 75: 1389- 1399} described as members of a conserved gene family.

Inzwischen wurden die Gene bzw. Teile der Gene weiterer Semaphorine kloniert und teilweise charakterisiert. Bisher waren insgesamt 5 humane (H-Sema-III, H-Sema-V, H-Sema-IV, H-Sema-B und H-Sema-E) {Kolodkin et al. (1993); Roche et al. (1996) Onkogene 12: 1289-1297; Sekido et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4120-4125; Xiang et al. (1996) Genomics 32: 39-48; Hall et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 39: 11780-11785; Yamada et al. (1997) (GenBank Zuordnungs-Nr. AB000220)}, 8 murine (Gene der Maus; M-Sema A bis M-Sema-H) {Püschel et al. (1995) Neuron 14: 941-948; Messerschmidt et al. (1995) Neuron 14: 949-959; Inigaki et al. (1995) FEBS Letters 370: 269-272; Adams et al. (1996) Mech. Dev. 57: 33-45; Christensen et al. (1996) (Genbank Zuordnungs-Nr. Z80941, Z93948)}, 5 gallide (Huhn) (Collapsin-1 bis -5) {Luo et al. (1993); Luo et al. (1995) Neuron 14: 1131-1140}, und Gene von Ratte (R-Sema-III) {Giger et al. (1996) J. Comp. Neurol. 375: 378-392}, Zebrafisch, Insekten (Fruchtfliege (Drosophila melanogaster: D-Sema-I und D-Sema-II), Käfer (Tribolium confusum: T-Sema-I), Grasshüpfer (Schistocerca americana: G-Sema-I)) {Kolodkin et al. (1993)}, und Nematoden (C. elegans: Ce-Sema) {Roy et al. (1994) (GenBank Zuordnungs-Nr. U15667)} bekannt. Weiterhin besitzen zwei Poxviren (Vaccinia (ORF-A39) und Variola (ORFA39-homolog)) {Kolodkin et al. (1993)} sowie der Aleclaphine Herpesvirus Typ 1 (AHV-1) (AHV-Sema) {Ensser und Fleckenstein (1995) Gen. Virol. 76: 1063-1067} zu Semaphorinen homologe Gene.In the meantime, the genes or parts of the genes of other semaphorins have been cloned and partially characterized. So far there have been a total of 5 human (H-Sema-III, H-Sema-V, H-Sema-IV, H-Sema-B, and H-Sema-E) {Kolodkin et al. (1993); Roche et al. (1996) Oncogenes 12: 1289-1297; Sekido et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. United States 93: 4120-4125; Xiang et al. (1996) Genomics 32: 39-48; Hall et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 39: 11780-11785; Yamada et al. (1997) (GenBank allocation no. AB000220)}, 8 murine (mouse genes; M-Sema A to M-Sema-H) {Püschel et al. (1995) Neuron 14: 941-948; Messerschmidt et al. (1995) Neuron 14: 949-959; Inigaki et al. (1995) FEBS Letters 370: 269-272; Adams et al. (1996) Mech. Dev. 57: 33-45; Christensen et al. (1996) (Genbank assignment no. Z80941, Z93948)}, 5 gallide (Chicken) (Collapsin-1 to -5) {Luo et al. (1993); Luo et al. (1995) Neuron 14: 1131-1140}, and genes from rat (R-Sema-III) {Giger et al. (1996) J. Comp. Neurol. 375: 378-392}, zebrafish, insects (fruit fly (Drosophila melanogaster: D-Sema-I and D-Sema-II), beetles (Tribolium confusum: T-Sema-I), grasshoppers (Schistocerca americana: G-Sema-I)) {Kolodkin et al. (1993)}, and nematodes (C. elegans: Ce-Sema) {Roy et al. (1994) (GenBank allocation no. U15667)} known. Furthermore, two pox viruses (Vaccinia (ORF-A39) and Variola (ORFA39 homolog) {Kolodkin et al. (1993)} and the Aleclaphine herpesvirus type 1 (AHV-1) (AHV-Sema) {Ensser and Fleckenstein (1995) Gen. Virol. 76: 1063-1067} genes homologous to semaphorins.

Einen Überblick über die bisher identifizierten Semaphorine in verschiedenen Spezies gibt Tabelle 1. In Tabelle 1 sind die Namen der Semaphorine, die verwendeten Synonyme, die Spezies aus dem das jeweilige Semaphorin isoliert wurde, sowie, soweit bekannt, Daten zur Domänenstruktur des kodierten Proteins (Spalten 4 und 5 in Tabelle 1), die Zuordnungsnummer unter der die Sequenz des Gens in Gendatenbanken, z. B. in einer EST (expressed sequence tags) Datenbank, EMBEL (European Moleoular Biology Laboratory, Heidelberg) oder NCBI (National Center for Biotechnology Information, Maryland, USA) gespeichert ist und die entsprechende Referenz unter der diese Daten publiziert wurden, angegeben.An overview of the semaphorins identified so far in various Species are given in Table 1. In Table 1 are the names of the semaphorins that used synonyms, the species from which the respective semaphorin is isolated as well as, as far as known, data on the domain structure of the encoded protein (Columns 4 and 5 in Table 1), the allocation number under which the sequence of the Gene in gene databases, e.g. B. in an EST (expressed sequence tags) database, EMBEL (European Moleoular Biology Laboratory, Heidelberg) or NCBI (National Center for Biotechnology Information, Maryland, USA) and the corresponding reference under which this data was published is given.

Alle Genprodukte der bisher bekannten Semaphorin Gene weisen ein N-terminales Signalpeptid auf, an dessen C-terminalem Ende sich eine charakteristische Sema-Domäne mit einer Länge von etwa 450 bis 500 Aminosäuren befindet. Innerhalb der Sema-Domäne finden sich stark konservierte Aminosäuremotive und eine Anzahl hochkonservierter Cysteinreste. Die Genprodukte unterscheiden sich in den auf die Sema-Domäne folgenden C-terminalen Sequenzen, die aus einer oder mehreren Domänen aufgebaut sind. Sie weisen beispielsweise in diesen C-terminalen Aminosäuresequenzen Transmembrandomänen (TM), Immunoglobulin-ähnliche Domänen (Ig) (konstanter Teil des Immunoglobulins), zytoplasmatische Sequenzen (CP), Prozessierungssignale (P) beispielsweise mit der Konsesussequenz (RXR), wobei R für die Aminosäure Arginin und X für eine beliebige Aminosäure steht und/oder hydrophile C-Termini (HPC) auf. Auf der Basis der unterschiedlichen Domänenstruktur im C-Terminus lassen sich die Semaphorine in 5 verschiedene Untergruppen einteilen (I bis V):
I Sezerniert, ohne weitere Domäne (z. B. ORF-A49)
II Ig Sezerniert (ohne Transmembrandomäne) (z. B. AHV-Sema)
III Ig, TM, CP Membranverankert mit zytoplasmatischer Sequenz (z. B. CD100)
IV Ig, (P), HPC Sezerniert mit hydrophilem C-Terminus (z. B. H-Sema-III, M-Sema-D, Collapsin-1)
V Ig, TM, CP Membranverankert mit C-terminalem 7 Thrombospondin-Motiv (z. B. M-Sema-F und -G).All gene products of the previously known Semaphorin genes have an N-terminal signal peptide, at the C-terminal end of which there is a characteristic Sema domain with a length of about 450 to 500 amino acids. Within the Sema domain there are highly conserved amino acid motifs and a number of highly conserved cysteine residues. The gene products differ in the C-terminal sequences following the Sema domain, which are composed of one or more domains. In these C-terminal amino acid sequences, for example, they have transmembrane domains (TM), immunoglobulin-like domains (Ig) (constant part of the immunoglobulin), cytoplasmic sequences (CP), processing signals (P), for example with the consensus sequence (RXR), where R stands for the Amino acid arginine and X stands for any amino acid and / or hydrophilic C-termini (HPC). On the basis of the different domain structure in the C-terminus, the semaphorins can be divided into 5 different subgroups (I to V):
I Secreted, without further domain (e.g. ORF-A49)
II Ig Secreted (without transmembrane domain) (e.g. AHV-Sema)
III Ig, TM, CP membrane anchored with cytoplasmic sequence (e.g. CD100)
IV Ig, (P), HPC Secreted with hydrophilic C-terminus (e.g. H-Sema-III, M-Sema-D, Collapsin-1)
V Ig, TM, CP membrane anchored with C-terminal 7 thrombospondin motif (e.g. M-Sema-F and -G).

Ein Rezeptor oder extrazellulärer Ligand für Semaphorine wurde bisher nicht beschrieben. Im Zusammenhang mit Semaphorin-vermittelten Effekten wurden intrazelluläre, heterotrimere GTP-bindende Proteinkomplexe beschrieben. Als ein Bestandteil dieser Proteinkomplexe wurden bei Hühnern sogenannte CRMP-Proteine (Collapsin response mediator protein) identifiziert, welche vermutlich Bestandteil der Semaphorin-induzierten intrazellulären Signalkaskade sind {Goshima et al. (1995) Nature 376: 509-514}. Das CRMP62 beispielsweise besitzt Homologie zu unc-33, einem für das gerichtete Axonwachstum essentiellen Nematoden-Protein. Ein humanes Protein mit 98% Aminosäure-Identität zu CRMP62 ist ebenfalls bekannt {Hamajima et al. (1996) Gene 180: 157-163}. Von Ratten wurden ebenfalls mehrere CRMP-verwandte Gene beschrieben {Wang et al. (1996) Neurosci. 16: 6197-6207}.A receptor or extracellular ligand for semaphorins has not yet been established described. In connection with Semaphorin-mediated effects were intracellular, heterotrimeric GTP-binding protein complexes are described. As a Part of these protein complexes were so-called in chickens CRMP proteins (Collapsin response mediator protein) identified which presumably Are part of the semaphorin-induced intracellular signal cascade {Goshima et al. (1995) Nature 376: 509-514}. For example, the CRMP62 has Homology to unc-33, one that is essential for directed axon growth Nematode protein. A human protein with 98% amino acid identity too CRMP62 is also known {Hamajima et al. (1996) Gene 180: 157-163}. from Several CRMP-related genes have also been described in rats {Wang et al. (1996) Neurosci. 16: 6197-6207}.

Die sezernierten oder transmembranen Semaphorine vermitteln repulsive Signale für wachsende Nervenknospen. Sie spielen eine Rolle bei der Entwicklung des zentralen Nervensystems (ZNS) und werden vor allem in Muskel- und Nervengewebe exprimier: {Kolodkin et al. (1993); Luo et al. (1993) Cell 75: 217-227}.The secreted or transmembrane semaphorins convey repulsive signals for growing nerve buds. They play a role in the development of the central nervous system (CNS) and are mainly in muscle and Expressing nerve tissue: {Kolodkin et al. (1993); Luo et al. (1993) Cell 75: 217-227}.

Außer im ZNS konnte eine deutliche Expression von M-Sema-G auch auf Zellen des lymphatischen und hämatopoetischen Systems beobachtet werden, im Gegensatz zum nahe verwandten M-Sema-F {Furuyima et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 33376-33381}.In addition to the CNS, a clear expression of M-Sema-G could also be found on cells of the lymphatic and haematopoietic systems are observed in opposition to the closely related M-Sema-F {Furuyima et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 33376-33381}.

Kürzlich wurden zwei weitere humane Semaphorine identifiziert, H-Sema-IV und H-Sema-V und zwar in einer Region auf Chromosom 3p21.3, deren Deletion mit verschiedenen Formen von Bronchialkarzinomen assoziiert ist. H-Sema-IV {Roche et al. (1996), Xiang et al. (1996), Sekido et al. (1996)} ist auf Aminosäureebene etwa zu 50% identisch mit M-Sema-E, während H-Sema-V {Sekido et al. (1996)} das direkte Homolog zu M-Sema-A ist (86% Aminosäureidentität). Da diese Gene (H-Sema-IV und -V) im Rahmen von DNA-Sequenzierungs-Projekten der deletierten 3p21.3 Loci gefunden wurden, ist die komplexe Intron-Exon-Struktur dieser beiden Gene bekannt. Die beiden Gene werden in verschiedenen neuronalen und nicht neuronalen Geweben exprimiert.Two more human semaphorins have recently been identified, H-Sema-IV and H-Sema-V in a region on chromosome 3p21.3, whose deletion with associated with various forms of lung cancer. H-Sema-IV {Roche et al. (1996), Xiang et al. (1996), Sekido et al. (1996)} is at the amino acid level about 50% identical to M-Sema-E, while H-Sema-V {Sekido et al. (1996)} that is direct homologue to M-Sema-A (86% amino acid identity). Because these genes (H-Sema-IV and -V) as part of DNA sequencing projects of the deleted 3p21.3 loci were found is the complex intron-exon structure of both of these Genes known. The two genes are in different neuronal and not expressed in neuronal tissues.

Ebenfalls erst vor kurzem wurde das zelluläre Oberflächenmolekül CD100 (human), exprimiert und induziert auf aktivierten T-Zellen als Semaphorin identifiziert (ebenfalls in Tabelle 1 aufgeführt). Es unterstützt die Interaktion mit B-Zellen über den Rezeptor CD40 und den entsprechenden Liganden CD40L. CD100 ist ein membranverankertes Glykoprotein-Dimer von 150 kd (Kilodalton). Es wurde eine Assoziation des intrazztoplasmatischen C-Terminus von CD100 mit einer noch unbekannten Kinase beschrieben {Hall et al. (1996)}. Damit war CD100 das erste und bisher einzige Semaphorin, dem eine Rolle im Immunsystem zugeschrieben wird.Also only recently was the cellular surface molecule CD100 (human), expressed and induced on activated T cells identified as Semaphorin (also listed in Table 1). It supports interaction with B cells via the receptor CD40 and the corresponding ligand CD40L. CD100 is a membrane-anchored glycoprotein dimer of 150 kd (kilodaltons). there has been a Association of the intrazztoplasmic C-terminus of CD100 with a still unknown kinase described {Hall et al. (1996)}. This made the CD100 the first and so far the only semaphore that has been assigned a role in the immune system will.

Unter der Fragestellung "Transformierende Gene von Rhadinoviren" wurde das komplette Genom des Alcelaphinen Herpesvirus Typ 1 (AHV-1) kloniert und sequenziert {Ensser et al. (1995)}. AHV-1 ist der Erreger des bösartigen Katarrhalfiebers, einer mit einem lymphoproliferativen Syndrom einhergehenden, meist fatalen Erkrankung verschiedener Wiederkäuer. Bei der Analyse wurde an einem Ende des viralen Genoms ein offener Leserahmen mit entfernter, aber signifikanter Homologie zu einem Gen von Vacciniavirus (ORF-A39 ≘ VAC-A39 in Ensser et al. (1995)) J. Gen. Virol. 76: 1063-1067), welches der Genfamilie der Semaphorine zugerechnet wurde gefunden. Während das AHV-1 Semaphorin (AHV-Sema) eine gut konservierte Semaphorin-Struktur besitzt, sind die Poxvirus-Gene (ORF-A39 und ORF-A39-homolog, siehe Tabelle 1) C-terminal verkürzt, d. h. bei ihnen ist die konservierte Sema-Domäne nur unvollständig vorhanden.Under the question "Transforming genes of rhadinoviruses" was the complete genome of the alcelaphine herpesvirus type 1 (AHV-1) cloned and sequenced {Ensser et al. (1995)}. AHV-1 is the causative agent of the malignant Catarrhal fever, one associated with lymphoproliferative syndrome mostly fatal disease of various ruminants. The analysis was on one end of the viral genome is an open reading frame with distant, but significant homology to a gene from vaccinia virus (ORF-A39 ≘ VAC-A39 in Ensser et al. (1995)) J. Gen. Virol. 76: 1063-1067), which belongs to the gene family of the Semaphorine attributed was found. While the AHV-1 semaphore (AHV-Sema) has a well-conserved semaphorin structure, the poxvirus genes are (ORF-A39 and ORF-A39 homologous, see Table 1) C-terminally shortened, i.e. H. with them the conserved Sema domain is only incomplete.

Ein Datenbankvergleich des gefundenen AHV-Sema mit dbEST (Datenbank (db) von expressed sequence tags (EST)) 4 EST-Sequenzen (Zuordnungsnummern H02902, H03806 (Klon 151129), R33439 und R33537 (Klon 135941) von 2 unabhängigen cDNA-Klonen aus humaner Plazenta. Diese wiesen deutlich höhere Homologie zum AHV-1 Semaphorin auf, als zu den bis dahin beschriebenen neuronalen Semaphorinen.A database comparison of the found AHV-Sema with dbEST (database (db) of expressed sequence tags (EST)) 4 EST sequences (assignment numbers H02902, H03806 (clone 151129), R33439 and R33537 (clone 135941) from 2 independent human placenta cDNA clones. These showed significantly higher Homology to the AHV-1 semaphore than to those previously described neural semaphorines.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Semaphorine mit einer neuen, bisher nicht bekannten und nicht zu erwartenden Domänenstruktur, denen eine biochemische Funktion im Immunsystem zukommt (immunmodulierende Semaphorine). Die erfindungsgemäßen Semaphorine werden als Semaphorine vom Typ L (Sema-L) bezeichnet. Sie enthalten ein N-terminales Signalpeptid, eine charakteristische Sema-Domäne und im C-terminalen Bereich des Proteins eine Immunglobulin-ähnliche Domäne und eine hydrophobe Domäne, die eine potentielle Transmembrandomäne darstellt.The present invention relates to semaphorins with a new one so far unknown and not expected domain structure to which a has a biochemical function in the immune system (immunomodulating Semaphorins). The semaphorins according to the invention are used as semaphorins from Type L (Sema-L) called. They contain an N-terminal signal peptide, a characteristic Sema domain and one in the C-terminal region of the protein Immunoglobulin-like domain and a hydrophobic domain that is a potential Represents transmembrane domain.

Die Aminosäure-Sequenz des Signalpeptids kann weniger als 70, vorzugsweise weniger als 60 Aminosäuren und mehr als 20, vorzugsweise mehr als 30 Aminosäuren aufweisen, besonders bevorzugt ist eine Länge von etwa 40 bis 50 Aminosäuren.The amino acid sequence of the signal peptide can be less than 70, preferably less than 60 amino acids and more than 20, preferably more than 30 Have amino acids, a length of about 40 to 50 is particularly preferred Amino acids.

Die Sema-Domäne kann eine Länge von 300 bis 700 oder mehr, vorzugsweise von etwa 400 bis 600 Aminosäuren aufweisen. Bevorzugt sind Sema-Domänen mit einer Länge von 450 bis 550 Aminosäuren, vorzugsweise von etwa 500 Aminosäuren.The Sema domain can be from 300 to 700 or more, preferably from have about 400 to 600 amino acids. Sema domains with a 450 to 550 amino acids in length, preferably about 500 amino acids.

Die Immunglobulin-ähnliche Domäne kann eine Länge von etwa 30 bis 110 oder mehr Aminosäuren aufweisen, bevorzugt sind Längen zwischen 50 und 90, besonders bevorzugt etwa 70 Aminosäuren.The immunoglobulin-like domain can be about 30 to 110 or more in length have more amino acids, lengths between 50 and 90 are preferred, particularly preferably about 70 amino acids.

Die Transmembrandomäne kann eine Länge von etwa 10 bis 35, vorzugsweise von etwa 15 bis 30, besonders bevorzugt von etwa 20 bis 25 Aminosäuren aufweisen.The transmembrane domain can be from about 10 to 35, preferably from about 10 to 35, in length have about 15 to 30, particularly preferably from about 20 to 25 amino acids.

Gegenstand der Erfindung sind Semaphorine vom Typ L aus verschieden Spezies, insbesondere aus Wirbeltieren, beispielsweise aus Vögeln und/oder Fischen, vorzugsweise aus Säugetieren, beispielsweise aus Primaten, Ratte, Kanninchen, Hund, Katze, Schaf, Ziege, Kuh, Pferd, Schwein, besonders bevorzugt aus Mensch und Maus. Gegenstand der Erfindung sind auch entsprechende Semaphorine aus Mikroorganismen, insbesondere aus pathogenen Mikroorganismen, beispielsweise aus Bakterien, Hefen und/oder Viren, z. B. aus Retroviren, insbesondere aus humanpathogenen Mikroorganismen.The subject of the invention are semaphorins of type L from different species, in particular from vertebrates, for example from birds and / or fish, preferably from mammals, for example from primates, rats, rabbits, Dog, cat, sheep, goat, cow, horse, pig, particularly preferably from humans and mouse. The invention also relates to corresponding semaphorines from Microorganisms, especially from pathogenic microorganisms, for example from bacteria, yeasts and / or viruses, e.g. B. from retroviruses, in particular from human pathogenic microorganisms.

Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein entsprechendes humanes Semaphorin (H-Sema-L), das ein Signalpeptid, eine Sema-Domäne, eine Immunglobulin ähnliche Domäne und eine Transmembrandomäne aufweist. Eine spezielle Ausführungsform ist das Semaphorin, das durch die Aminosäuresequenz gemäß Tabelle 4 gegeben ist.One embodiment of the invention is a corresponding human semaphorin (H-Sema-L), which is a signal peptide, a Sema domain, an immunoglobulin has a similar domain and a transmembrane domain. A special one Embodiment is the semaphorin, which by the amino acid sequence according to Table 4 is given.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind korrespondierende Semaphorine in anderen Spezies, die im Bereich der Sema-Domäne eine Aminosäureidentität größer als 40%, vorzugsweise größer 50%, besonders bevorzugt größer 60% im Bezug auf die Sema-Domäne von H-Sema-L (Aminosäuren 45 bis 545 der Sequenz in Tabelle 4) aufweisen. Aus näher verwandten Spezies (z. B. Primaten, Maus) können die korrespondierenden Semphorine durchaus Aminosäureidentitäten größer als 70%, vorzugsweise größer als 80%, besonders bevorzugt größer als 90% aufweisen.Corresponding semaphorins are a further embodiment of the invention in other species that have an amino acid identity in the region of the Sema domain greater than 40%, preferably greater than 50%, particularly preferably greater than 60% im Reference to the Sema domain of H-Sema-L (amino acids 45 to 545 of the sequence in Table 4). From closely related species (e.g. primates, mice) the corresponding semphorins can certainly have amino acid identities greater than 70%, preferably greater than 80%, particularly preferably greater than 90%.

Eine derartige Ausführungsform der Erfindung ist ein korrespondierendes Semaphorin der Maus (murines Semaphorin (M-Sema-L)). Beispielsweise enthält dieses die partielle Aminosäuresequenz gemäß Tabelle 5 (murines Semaphorin (M-Sema-L)).Such an embodiment of the invention is a corresponding one Mouse semaphorin (murine semaphorin (M-Sema-L)). For example contains this the partial amino acid sequence according to Table 5 (murine Semaphorin (M-Sema-L)).

Die Erfindung betrifft auch korrespondierende Semaphorine, die eine Aminosäureidentität (über die Gesamtlänge der Aminosäuresequenz des Protein betrachtet) von nur etwa 15 bis 20% bei wenig verwandten Spezies (phylogenetisch weit voneinander entfernt), vorzugsweise 25 bis 30%, besonders bevorzugt 35 bis 40% oder eine höhere Identität im Bezug auf die gesamte Aminosäuresequenz von H-Sema-L gemäß Tabelle 4 aufweisen.The invention also relates to corresponding semaphorines that have a Amino acid identity (over the total length of the amino acid sequence of the protein considered) of only about 15 to 20% in less related species (phylogenetically far apart), preferably 25 to 30%, particularly preferably 35 to 40% or greater identity with respect to the entire amino acid sequence of H-Sema-L according to Table 4.

Die Gene der erfindungsgemäßen Semaphorine, die für Semaphorine von Typ L kodieren weisen eine komplexe Exon-Intron-Struktur auf. Diese Gene können beispielsweise zwischen 10 und 20 Exons, vorzugsweise etwa 11 bis 18, besonders bevorzugt 12 bis 16 Exons und eine entsprechende Anzahl von Introns aufweisen. Sie können aber auch die gleiche Anzahl Exons und Introns aufweisen wie das Gen von H-Sema-L (13 bis 15, vorzugsweise 14 Exons).The genes of the semaphorins according to the invention which are used for semaphorins of type L code have a complex exon-intron structure. These genes can for example between 10 and 20 exons, preferably about 11 to 18, particularly preferably have 12 to 16 exons and a corresponding number of introns. But they can also have the same number of exons and introns as the gene from H-Sema-L (13 to 15, preferably 14 exons).

Als eine Folge dieser komplexen Intron-Exon Struktur kann das Primärtranskript der mRNA unterschiedlich gespliced werden, wodurch unterschiedliche Splicevarianten dieser Semaphorine entstehen. Die aus diesen Splicevarianten translatierten Proteine sind Derivate der erfindungsgemäßen Semaphorine. Sie entsprechen in ihrer Aminosäuresequenz und auch weitgehend in ihrer Domänenstruktur den beschriebenen, erfindungsgemäßen Semaphorinen vom Typ L, sind jedoch gegenüber diesen verkürzt. Beispielsweise können Splicevarianten, denen die Transmembrandomäne ganz oder teilweise fehlt, gebildet werden. Semaphorin-Derivate, die keine oder keine vollständige Transmembrandomäne, aber ein Signalpeptid enthalten, können sezerniert werden und auf diese Weise außerhalb der Zelle lokal oder auch über größere Entfernungen wirken, beispielsweise auf andere Zellen. Weitere Splicevarianten können beispielsweise keine Sequenz mehr enthalten, die für ein Signalpeptid kodiert und gegebenenfalls auch keine Sequenz, die für eine für hydrophobe Aminosäuresequenz kodiert, die eine potentielle Transmembrandomäne darstellt. Eine Folge wäre, daß diese Semaphorin-Derivate weder in die Membran eingebaut, noch sezerniert werden würden (es sei denn über sekretorische Vesikel). Solche Semaphorin-Derivate könnten an intrazellulären Prozessen, beispielsweise an Signaltransduktionsprozessen beteiligt sein. Auf diese Weise könnte mit dem gleichen Grundmoleküle (beanspruchte Semaphorine) und den davon abgeleiteten Derivaten (beispielsweise Splicevarianten) vielfälltige intra- und extrazelluläre Prozesse reguliert und/oder aufeinander abgestimmt werden.As a result of this complex intron-exon structure, the primary transcript of the mRNA are spliced differently, creating different splice variants these semaphorines arise. The ones translated from these splice variants Proteins are derivatives of the semaphorins according to the invention. They correspond in their amino acid sequence and also largely in their domain structure Semaphorins according to the invention of the type L described, however, are shortened compared to these. For example, splice variants that the Transmembrane domain is completely or partially absent, are formed. Semaphorin derivatives, the no or no complete transmembrane domain, but one Containing signal peptide can be secreted and in this way outside affect the cell locally or over greater distances, for example other cells. Further splice variants cannot, for example, no longer have a sequence contain, which codes for a signal peptide and possibly also no sequence, which codes for a hydrophobic amino acid sequence which is a potential Represents transmembrane domain. One consequence would be that these Semaphorin derivatives would neither be incorporated into the membrane nor secreted (unless via secretory vesicles). Such Semaphorin derivatives could be attached to intracellular Processes, for example be involved in signal transduction processes. on this way could be with the same basic molecules (claimed semaphorins) and the derivatives derived therefrom (for example splice variants) intra- and extracellular processes regulated and / or coordinated with one another will.

Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft Semaphorin-Derivate, die sich von den erfindungsgemäßen Semaphorinen ableiten, die aber keine oder keine vollständige Transmembrandomäne enthalten. A particular embodiment of the invention relates to semaphorin derivatives which derive from the semaphorines according to the invention, but none or none complete transmembrane domain included.

Eine weiter Ausführungsform der Erfindung betrifft Semaphorin-Derivate, die sich von den erfindungsgemäßen Semaphorinen ableiten, die aber kein Signalpeptid enthalten.Another embodiment of the invention relates to semaphorin derivatives which derive from the semaphorins according to the invention, but which are not a signal peptide contain.

Signalpeptide können auch posttranslational abgespalten werden. Dadurch werden membranständige (mit TM-Domäne) oder sezernierte (Splicevariante ohne TM-Domäne) Semaphorin-Derivate mit verkürzter Domänenstruktur gebildet werden. Solche posttranslational prozessierten Semaphorin-Derivate enthalten nur noch Sema-Domäne, Ig-Domäne und gegebenenfalls Transmembrandomäne. Eine Signalpeptidschnittstelle kann beispielsweise direkt am Ende des Signalpeptids liegen, z. B. 40 bis 50 Aminosäuren oder weiter vom Aminoterminus entfernt lokalisiert sein.Signal peptides can also be split off post-translationally. This will be membrane-bound (with TM domain) or secreted (splice variant without TM domain) Semaphorin derivatives with a shortened domain structure are formed. Such post-translationally processed Semaphorin derivatives only contain Sema domain, Ig domain and optionally transmembrane domain. One Signal peptide interface can, for example, directly at the end of the signal peptide lie, e.g. B. 40 to 50 amino acids or further from the amino terminus be localized.

"Verkürzte" (d. h. weniger Domänen enthaltende) Semaphorine-L-Derivate sind von anderen Semaphorinen dadurch zu unterscheiden, daß sie eine sehr große (< 90%) Aminosäureidentität oder eine identische Aminosäuresequenz mit den Semaphorinen vom Typ L in den vorhandenen Domänen aufweisen."Truncated" (i.e., containing fewer domains) Semaphorine L derivatives are from to distinguish other semaphorines by the fact that they have a very large (<90%) Amino acid identity or an identical amino acid sequence with the Have L-type semaphorines in the domains present.

Die erfindungsgemäßen Semaphorine können auch in anderer Weise posttranslational modifiziert sein. Beispielsweise können sie ein-, zwei-, drei-, vier fünf-, sechs-, sieben-, acht-, neun- zehn- oder mehrfach glykosyliert (N- und/oder O-glykosyliert) vorliegen. Die Aminosäuresequenzen der Semaphorine können dann ebenso viele oder mehr Konsensussequenzen für potentielle Glykosylierungsstellen aufweisen, vorzugsweise fünf derartige Stellen. Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft Semaphorine, bei denen die Glykosylierungsstellen an den Positionen lokalisiert sind, die den Positionen 105, 157, 258, 330 und 602 der H-Sema-L Aminosäuresequenz entsprechen (Tabelle 4).The semaphorins according to the invention can also be used in other ways be post-translationally modified. For example, they can be one, two, three, four five, six, seven, eight, nineteen or multiple glycosylated (N- and / or O-glycosylated). The amino acid sequences of the semaphorins can then as many or more consensus sequences for potential glycosylation sites have, preferably five such locations. One embodiment of the invention relates to semaphorins in which the glycosylation sites are at the positions are located at positions 105, 157, 258, 330 and 602 of the H-Sema-L Amino acid sequence (Table 4).

Darüber hinaus können die Semaphorine in Form ihrer phosphorylierten Derivate vorliegen. Semaphorine können die Substrate unterschiedlicher Kinasen sein, beispielsweise können die Aminosäuresequenzen Konsensussequenzen für Protein Kinase C, Tyrosin Kinase und/oder Kreatin Kinasen aufweisen. Weiterhin können die Aminosäuresequenzen der Semaphorine Konsensussequenzen für potentielle Myristilierungsstellen aufweisen. An diesen Stellen können entsprechende Semaphorin-Derivate mit Myristinsäure verestert sein.In addition, the semaphorins can be in the form of their phosphorylated derivatives are present. Semaphorins can be the substrates of different kinases, for example, the amino acid sequences can be consensus sequences for protein Kinase C, tyrosine kinase and / or creatine kinases. Furthermore you can the amino acid sequences of the semaphorine consensus sequences for potential Have myristilation sites. Corresponding Semaphorin derivatives can be esterified with myristic acid.

Die erfindungsgemäßen Semaphorine und deren Derivate können in Form von Monomeren, Dimeren und/oder Multimeren vorliegen, beispielsweise können zwei oder mehr Semaphorine bzw. deren Derivate über intermolekulare Disulfidbrücken miteinander verbunden sein.The semaphorins according to the invention and their derivatives can be in the form of Monomers, dimers and / or multimers are present, for example two or more semaphorins or their derivatives via intermolecular disulfide bridges be connected to each other.

Derivate der erfindungsgemäßen Semaphorine sind weiterhin Fusionsproteine, die Semaphorine vom Typ L oder Teile derselben enthalten und ein anderes Peptid oder Protein bzw. ein Teil desselben. Solche Peptide oder Proteine bzw. Teile derselben können z. B. Epitope-Tags (z. B. His-Tag (6×Histidin), Myc-Tag, flu-Tag), die z. B. zur Aufreinigung der Fusionsproteine verwendet werden können, oder solche, die zur Markierung der Fusionsproteine verwendet werden können, z. B. GFP (green fluoroscent protein).Derivatives of the semaphorins according to the invention are also fusion proteins which Semaphorins of type L or parts thereof contain and another peptide or protein or part thereof. Such peptides or proteins or parts same can z. B. Epitope tags (e.g. His-Tag (6 × histidine), Myc-Tag, flu-Tag), the z. B. can be used to purify the fusion proteins, or those that can be used to label the fusion proteins, e.g. B. GFP (green fluoroscent protein).

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind DNA- und RNA-Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Semaphorine von Typ L und/oder deren Derivate kodieren, beispielsweise die entsprechenden Gene, die unterschiedlichen Splicevarianten der mRNA, die dazu korrespondierenden cDNAs sowie deren Derivate, z. B. Salze der DNA bzw. RNA. Derivate im Sinne der Erfindungen sind Sequenzen oder Teile davon, die z. B. mit molekularbiologischen Methoden verändert und an die jeweiligen Anforderungen angepaßt werden, beispielsweise verkürzte Gene, cDNAs oder Chimäre derselben, Konstrukte für Expressionen und klinierungen und deren Salze.The invention also relates to DNA and RNA sequences that are used for the encode semaphorins according to the invention of type L and / or their derivatives, for example the corresponding genes, the different splice variants of the mRNA, the corresponding cDNAs and their derivatives, e.g. B. Salts of DNA or RNA. For the purposes of the invention, derivatives are sequences or parts of which z. B. changed with molecular biological methods and to the respective Requirements are adapted, for example shortened genes, or cDNAs Chimera thereof, constructs for expressions and clinics and their salts.

Eine Ausführungsform betrifft die genomischen Sequenzen (Gene) der Semaphorin (Typ L) kodierenden DNA. Das beinhaltet die Intron- und Exon-Sequenzen und genregulatorische Sequenzen, beispielsweise Promotor-, Enhancer- und Silencer-Sequenzen.One embodiment relates to the genomic sequences (genes) of the Semaphorin (Type L) encoding DNA. This includes the intron and exon sequences and gene regulatory sequences, for example promoter, enhancer and Silencer sequences.

Ein Gegenstand dieser Ausführungsform ist das Gen von H-Sema-L bzw. dessen Derivate. One subject of this embodiment is the gene of H-Sema-L or its Derivatives.

Ein weiterer Gegenstand dieser Ausführungsform ist das Gen von M-Sema-L bzw. dessen Derivate.Another subject of this embodiment is the gene of M-Sema-L or its derivatives.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die cDNA von H-Sema-L oder deren Derivate. Eine besondere Ausführungsform ist die cDNA von H-Sema-L gemäß der Aminosäuresequenz in Tabelle 2.Another object of the invention is the cDNA of H-Sema-L or their Derivatives. A particular embodiment is the cDNA of H-Sema-L according to FIG Amino acid sequence in Table 2.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die cDNA von M-Sema-L oder deren Derivate. Eine besondere Ausführungsform ist die partielle cDNA-Sequenz von M-Sema-L gemäß Tabelle 3 sowie cDNA-Sequenzen, die diese partielle cDNA-Sequenz enthalten.Another object of the invention is the cDNA of M-Sema-L or their Derivatives. A particular embodiment is the partial cDNA sequence of M-Sema-L according to Table 3 as well as cDNA sequences showing this partial cDNA sequence included.

Die Erfindung beinhaltet auch Allele und/oder individuelle Ausprägungsformen der Gene/mRNAs/cDNAs, die sich nur geringfügig von hier beschriebenen Semaphorin-Sequenzen unterscheiden und für ein identisches oder nur geringfügig verändertes Protein (Abweichung in der Aminosäure-Sequenz kleiner oder gleich 10%) kodieren.The invention also includes alleles and / or individual manifestations of the Genes / mRNAs / cDNAs that differ only slightly from those described here Semaphorin sequences differ and for an identical or only slightly changed Protein (deviation in the amino acid sequence less than or equal to 10%) encode.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Plasmide, die DNA, die für die Semaphorine des Typs L bzw. deren Derivate kodiert enthalten. Solche Plasmide können beispielsweise Plasmide mit hohen Replikationsraten sein, die für eine Amplifikation der DNA, z. B. in E. coli geeignet sind.Another object of the invention are plasmids, the DNA for the Semaphorins of type L or their derivatives contain coded. Such plasmids can be, for example, plasmids with high replication rates for a Amplification of the DNA, e.g. B. in E. coli are suitable.

Eine spezielle Ausführungsform sind Expressionsplasmide, mit denen die Semaphorine bzw. Teile davon oder deren Derivate in prokarytischen und/oder eukaryotischen Expressions-Systemen exprimiert werden können. Es sind sowohl Expressionsplasmide die konstitutive als auch solche, die induzierbare Promotren enthalten, geeignet.A special embodiment are expression plasmids with which the Semaphorins or parts thereof or their derivatives in prokaryotic and / or eukaryotic expression systems can be expressed. There are both Expression plasmids the constitutive as well as those that have inducible promoters included, suitable.

Darüber hinaus können die Semaphorine bzw. deren Derivate als Fusionsproteine exprimiert werden, beispielsweise mit Proteinen oder Peptiden, die einen Nachweis des exprimierten Fusionsproteins erlauben, z. B. als Fusionsprotein mit GFP (green fluorescent protein). Die Semaphorine können auch als Fusionsproteine mit einem, zwei, drei oder mehreren Epitope-Tags, beispielsweise mit Myc- und/oder His-(6×Histidin) und/oder flu-Tags exprimiert werden. Entsprechend können Plasmide verwendet oder hergestellt werden, die DNA-Sequenzen enthalten, die für diese Peptide/Proteine kodieren, beispielsweise Plasmide, die DNA-Sequenzen enthalten, die für GFP und/oder Epitope-Tags, z. B. Myc-Tag, His-Tag, flu-Tag kodieren.In addition, the semaphorins or their derivatives can be used as fusion proteins are expressed, for example with proteins or peptides, which are a detection of the expressed fusion protein, e.g. B. as a fusion protein with GFP (green fluorescent protein). The semaphorins can also be used as fusion proteins with a, two, three or more epitope tags, for example with Myc and / or His (6 × histidine) and / or flu tags are expressed. Similarly, plasmids used or manufactured that contain DNA sequences relevant for this Encode peptides / proteins, e.g. plasmids that contain DNA sequences, those for GFP and / or epitope tags, e.g. B. Myc-Tag, His-Tag, Flu-Tag encode.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Antikörper, die spezifisch die Semaphorine vom Typ L, deren Derivate oder Teile davon binden bzw. erkennen. Dies können beispielsweise polyklonale oder monoklonale Antikörper, die z. B. in Maus, Kanninchen, Ziege, Schaf, Huhn usw. hergestellt werden können, sein.Another object of the invention are antibodies that specifically Semaphorins of type L, their derivatives or parts thereof bind or recognize. This can, for example, polyclonal or monoclonal antibodies, which z. Am Mouse, rabbit, goat, sheep, chicken etc. can be made.

Eine besondere Ausführungsform dieses Gegenstandes sind Antikörper, die gegen die Epitope die den Aminosäuresequenzen von Position 179 bis 378 bzw. 480 bis 666 der H-Sema-L Sequenz gemäß Tabelle 4 entsprechen, gerichtet sind.A particular embodiment of this subject are antibodies that are directed against the epitopes correspond to the amino acid sequences from position 179 to 378 or 480 to 666 correspond to the H-Sema-L sequence according to Table 4.

Diese Antikörper können beispielsweise zur Aufreinigung der entsprechenden Semaphorine, z. B. von H-Sema-L und dessen Derivaten z. B. über Affinitätssäulen oder zum immunologischen Nachweis der Proteine, z. B. im ELISA, im Western-Blot und/oder in der Immunhistochemie verwendet werden.These antibodies can, for example, be used to purify the corresponding Semaphorins, e.g. B. of H-Sema-L and its derivatives z. B. via affinity columns or for immunological detection of proteins, e.g. B. in ELISA, in Western blot and / or used in immunohistochemistry.

Die cDNA von H-Sema-L hat eine Länge von 2636 Nukleotiden (Tabelle 2). Das Genprodukt der H-Sema-L-cDNA hat eine Länge von etwa 666 Aminosäuren (Tabelle 4) und weist die typische Domänenstruktur eines Semaphorin vom Typ-L Domänen mit N-terminalem Signalpeptid (Aminosäuren 1 bis 44), Sema-Domäne (Aminosäure 45 bis ungefähr Aminosäure 545) und Ig (Immunglobulin)-Domäne (etwa Aminosäuren 550 bis 620) sowie am C-terminalen Ende eine hydrophobe Aminosäuresequenz auf, die eine potentielle Transmembrandomäne darstellt. Diese Domänen-Struktur wurde bisher für Semaphorine noch nie beschrieben. Es handelt sich um ein membranassoziiertes, wahrscheinlich an der Zelloberfläche lokalisiertes Glykoprotein einer neuen Untergruppe. Aufgrund dieser bisher nicht bekannten Domänenstruktur können die Semaphorine nun in VI Untergruppen eingeteilt werden:
I Sezerniert, ohne weitere Domäne (z. B. ORF-A49)
II Ig Sezerniert (ohne Transmembrandomäne) (z. B. AHV-Sema)
III Ig, TM, CP Membranverankert mit zytoplasmatischer Sequenz (z. B. CD100)
IV Ig, (P), HPC Sezerniert mit hydrophilem C-Terminus (z. B. H-Sema-III, M-Sema-D, Collapsin-1)
V Ig, TM, CP Membranverankert mit C-terminalem 7 Thrombospondin-Motiv (z. B. M-Sema-F und -G)
VI Ig, TM Membranverankert (z. B. H-Sema-L).The H-Sema-L cDNA is 2636 nucleotides in length (Table 2). The gene product of the H-Sema-L-cDNA has a length of about 666 amino acids (Table 4) and has the typical domain structure of a semaphorin of type L domains with N-terminal signal peptide (amino acids 1 to 44), Sema domain (amino acid 45 to approximately amino acid 545) and Ig (immunoglobulin) domain (approximately amino acids 550 to 620) and at the C-terminal end a hydrophobic amino acid sequence which represents a potential transmembrane domain. This domain structure has never been described for semaphorins before. It is a membrane-associated glycoprotein, probably located on the cell surface, of a new subgroup. Due to this previously unknown domain structure, the semaphorins can now be divided into VI subgroups:
I Secreted, without further domain (e.g. ORF-A49)
II Ig Secreted (without transmembrane domain) (e.g. AHV-Sema)
III Ig, TM, CP membrane anchored with cytoplasmic sequence (e.g. CD100)
IV Ig, (P), HPC Secreted with hydrophilic C-terminus (e.g. H-Sema-III, M-Sema-D, Collapsin-1)
V Ig, TM, CP membrane anchored with C-terminal 7 thrombospondin motif (e.g. M-Sema-F and -G)
VI Ig, TM membrane anchored (e.g. H-Sema-L).

Die nichtglykosylierte, nichtprozessierte Form des H-Sema-L hat ein errechnetes Molekulargewicht von etwa 74,8 kD (74823.20 Dalton) (berechnet mit PeptideSort, GCG-Programm-Paket). Der Isoelektrische Punkt berechnet sich zu pH = 7.56. Eine mögliche Signalpeptid-Schnittstelle liegt zwischen den Aminosäuren 44 und 45 (Tabelle 3; berechnet mit Signal P, einem auf neuronalen Netzwerken basierenden Programm zur Analyse von Signalsequenzen {Nielsen H. et. al. (1997) Protein Engineering 10: 1-6}). Dies ergibt für das prozessierte Protein (ohne Signalpeptid) ein Molekulargewicht (MW) von 70322.85 Dalton (703 KD) und einen Isoelektrischen Punkt von pH = 7.01.The non-glycosylated, unprocessed form of the H-Sema-L has a calculated one Molecular weight of about 74.8 kD (74823.20 Dalton) (calculated with PeptideSort, GCG program package). The isoelectric point is calculated as pH = 7.56. One possible signal peptide cleavage site is between amino acids 44 and 45 (Table 3; calculated with signal P, a neural network based Program for the analysis of signal sequences {Nielsen H. et. al. (1997) Protein Engineering 10: 1-6}). This gives for the processed protein (without signal peptide) a molecular weight (MW) of 70322.85 Daltons (703 KD) and one Isoelectric point of pH = 7.01.

Die genomische Struktur ist ebenfalls weitgehend geklärt. Das H-Sema-L-Gen weist 13 bis 15, vorzugsweise 14 Exons und 12 bis 14 Introns, vorzugsweise 13 Introns auf. Aufgrund dieser komplexen Exon-Intron-Struktur sind unterschiedliche Splice-Varianten möglich. Die mRNA des transkribierten H-Sema-L-Gens findet sich im Northern-Blot vor allem in Placenta, Keimdrüsen, Thymus, Darm und Milz. Ein Hinweis auf eine spezifisch regulierte Expression in Endothelzellen liegt vor.The genomic structure has also been largely clarified. The H-Sema-L gene points 13 to 15, preferably 14 exons and 12 to 14 introns, preferably 13 introns on. Because of this complex exon-intron structure are different Splice variants possible. The mRNA of the transcribed H-Sema-L gene can be found in Northern blot mainly in the placenta, gonads, thymus, intestine and spleen. A There is evidence of specifically regulated expression in endothelial cells.

Durch alternatives Splicing können auch Formen von H-Sema-L mit intrazytoplasmatischen Sequenzen entstehen, die eine Rolle in der intrazellulären Signaltransduktion spielen, ähnlich wie z. B. bei CD100. Ebenfalls möglich wären durch alternatives Splicing entstehende, sezernierte Formen von H-Sema-L, analog zum viralen AHV-Sema. Through alternative splicing, forms of H-Sema-L can also be used with intracytoplasmic sequences arise that play a role in the intracellular Play signal transduction, similar to e.g. B. with CD100. Would also be possible Secreted forms of H-Sema-L resulting from alternative splicing, analogous to the viral AHV-Sema.

Postranslationale Modifikationen wie Glykosylierung und Myristilierung von H-Sema-L sind ebenfalls möglich. Konsensus-Sequenzen für N-Glykosylierungsstellen wurden mit Hilfe des Programs Prosite (GCG Program-Paket) an den Positionen 105, 157, 258, 330, 602 der Aminosäuresequenz von H-Sema-L (gemäß Tabelle 4) gefunden, solche für Myristilierung an den Positionen 114, 139, 271, 498, 499, 502, 654 (Konsensus-Sequenz: G∼(E, D, R, K, H, P, F, Y, W)×(S, T, A, G, C, N)∼P)). Darüber hinaus enthält die Aminosäuresequenz von H-Sema-L mehrere Konsensus-Sequenzen für potentielle Phosphorylierungsstellen durch unterschiedliche Kinasen. Deshalb kann davon ausgegangen werden, daß H-Sema-L das Substrat unterschiedlicher Kinase sein kann, z. B. Phosphorylierungsstellen für Kreatin-Kinase 2, Protein-Kinase C und Tyrosin-Kinase:Post-translational modifications such as glycosylation and myristilation of H-Sema-L are also possible. Consensus sequences for N-glycosylation sites were using the Prosite Program (GCG Program Package) at the positions 105, 157, 258, 330, 602 of the amino acid sequence of H-Sema-L (according to Table 4) found, those for myristilation at positions 114, 139, 271, 498, 499, 502, 654 (consensus sequence: G∼ (E, D, R, K, H, P, F, Y, W) × (S, T, A, G, C, N) ∼P)). In addition, the amino acid sequence of H-Sema-L contains several Consensus sequences for potential phosphorylation sites by different Kinases. Therefore it can be assumed that H-Sema-L is the substrate different kinase, e.g. B. Phosphorylation sites for Creatine Kinase 2, Protein Kinase C and Tyrosine Kinase:

Vorausgesagte Kreatin-Kinase 2-Phosphorylierungs-Stellen (Konsensussequenz Ck2: (S,T)×2(D,E)) (Prosite, GCG) an den Position 119, 131, 173, 338, 419, 481 der Aminosäuresequenz.Predicted Creatine Kinase 2 Phosphorylation Sites (Consensus Sequence Ck2: (S, T) x 2 (D, E)) (Prosite, GCG) at positions 119, 131, 173, 338, 419, 481 of FIG Amino acid sequence.

Vorausgesagte Protein-Kinase-C-Phosphorylierungs-Stellen (Konsensussequenz PkC: (S,T)×(R,K)) (Prosite, GCG) an den Position 107, 115, 190, 296, 350, 431, 524, 576 der Aminosäuresequenz.Predicted protein kinase C phosphorylation sites (consensus sequence PkC: (S, T) × (R, K)) (Prosite, GCG) at positions 107, 115, 190, 296, 350, 431, 524, 576 of the amino acid sequence.

Vorausgesagte Tyrosin-Kinase-Phosphorylierungs-Stellen (Konsensussequenz: (R,K)×{2,3}(D,E)×{2,3}Y) (Prosite, GCG) an Position 205 der Aminosäuresequenz.Predicted tyrosine kinase phosphorylation sites (consensus sequence: (R, K) × {2,3} (D, E) × {2,3} Y) (Prosite, GCG) at position 205 of the amino acid sequence.

Die Konsensusequenzen sind im Einbuchstabencode für Aminosäuren angegeben.The consensus sequences are given in the one-letter code for amino acids.

Ein für Integrine charakteristisches "RGD"-Motiv (Arginin-Glycin-Asparaginsäure) findet sich an Position 267.An "RGD" motif (arginine-glycine-aspartic acid) characteristic of integrins can be found at position 267.

Die Glykosylierungsstellen sind gut konserviert zwischen viralem AHV-Sema, H-Sema-L und (soweit bekannt) M-Sema-L.The glycosylation sites are well conserved between viral AHV sema, H-Sema-L and (if known) M-Sema-L.

Eine Di- oder Multimerisierung von H-Sema-L ist möglich und wurde bei anderen Semaphorinen wie CD100 beschrieben {Hall et al. (1996)}. Das CD100 Molekül ist ebenfalls ein membranverankertes Glykoprotein-Dimer von 150 kd. CD100 ist jedoch nicht nahe verwandt mit dem erfindungsgemäßen humanen Semaphorin (H-Sema-L). A dimerization or multimerization of H-Sema-L is possible and has been done with others Semaphorins such as CD100 described {Hall et al. (1996)}. The CD100 molecule is also a membrane-anchored glycoprotein dimer of 150 kd. CD100 is however not closely related to the human semaphorin according to the invention (H-Sema-L).

Die partielle cDNA-Sequenz von M-Sema-L hat eine Länge von 1195 Nukleotiden. Diese Sequenz kodiert für ein Protein mit 394 Aminosäuren. Diese 394 Aminosäuren entsprechen den Aminosäuren 1 bis 396 von H-Sema-L. Das Signalpeptid im M-Sema-L ersteckt sich über die Aminosäuren 1 bis 44 (genau wie im H-Sema-L). Die Sema-Domäne beginnt bei der Aminosäure 45 und erstreckt sich bis zum Ende bzw. wahrscheinlich über das Ende der Sequenz gemäß Tabelle 4 hinaus.The partial cDNA sequence of M-Sema-L is 1195 nucleotides in length. This sequence codes for a protein with 394 amino acids. This 394 Amino acids correspond to amino acids 1 to 396 of H-Sema-L. That Signal peptide in M-Sema-L extends over amino acids 1 to 44 (just like in the H-Sema-L). The Sema domain starts at amino acid 45 and extends until the end or probably over the end of the sequence according to Table 4 out.

Ein Vergleich der Proteinsequenzen der bekannten und der neuen Semaphorine und eine phylogenetische Analyse dieser Sequenzen zeigt, daß sich die Gene entsprechend ihrer phylogenetischen Verwandtschaft einteilen lassen. Hier fließt natürlich die C-terminale Domänenstruktur der entsprechenden Semaphorin-Subtypen als entscheidender Faktor mit ein, weshalb Semaphorine der gleichen Untergruppen in der Regel auch phylogenetisch näher verwandt sind, als Semaphorine unterschiedlicher Untergruppen. Darüber hinaus ist ein Faktor die Spezies aus der das entsprechende Semaphorin isoliert wurde.A comparison of the protein sequences of the known and the new semaphorins and phylogenetic analysis of these sequences shows that the genes can be classified according to their phylogenetic relationship. Here flows of course the C-terminal domain structure of the corresponding Semaphorin subtypes as a deciding factor, which is why semaphorins are the same Subgroups are usually also more closely related than phylogenetically Semaphorins of different subgroups. In addition, one factor is that Species from which the corresponding semaphorin was isolated.

Eine phylogenetische Analyse der bekannten Semaphorin Aminosäuresequenzen (vollständige Sequenzen und/oder Teilsequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen für H-Sema-L und M-Sema-L gemäß den Tabellen 4 und 5 verwendet wurden, für alle anderen Sequenzen, die unter den Zugangsnummern gespeicherten Sequenzen bzw. die von diesen Sequenzen abgeleiteten kodierenden Aminosäuresequenzen)) mittels des Programms CLUSTALW {Thompson J.D. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680} zeigte, daß die Aminosäuresequenzen von AHV-Sema, H-Sema-L und M-Sema-L phylogenetisch nahe miteinander verwandt sind und eine eigene phylogenetische Gruppe bilden. Sie sind untereinander deutlich näher verwandt, als mit irgendeinem anderen bisher bekannten Semaphorin. Die Analyse zeigt weiterhin, daß auch andere Semaphorine phylogenetisch nahe miteinander verwandt sind und eine eigene Gruppe innerhalb der Semaphorine bilden. Beispielsweise fallen die Semaphorine, die sezerniert werden, z. B. H-Sema-III-, IV, -V, und -E in eine phylogenetische Gruppe. Zu dieser Subfamilie gehören auch deren Homologe in anderen Spezies, während das humane (transmembrane) CD100 beispielsweise mit dem Collapsin-4 in eine phylogenetische Gruppe fällt. Die strukturell verschiedenen M-Sema-F und -G, sowie die Semaphorine der Nicht-Wirbeltiere bilden wiederum getrennte, phylogenetische nahe verwandte Gruppen.A phylogenetic analysis of the known Semaphorin amino acid sequences (Complete sequences and / or partial sequences, where the amino acid sequences for H-Sema-L and M-Sema-L according to Tables 4 and 5 were used for all other sequences stored under the access numbers Sequences or the coding derived from these sequences Amino acid sequences)) using the program CLUSTALW {Thompson J.D. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680} showed that the amino acid sequences of AHV-Sema, H-Sema-L and M-Sema-L phylogenetically close to each other are related and form their own phylogenetic group. they are much more closely related to one another than to any other so far known semaphore. The analysis also shows that other semaphorins phylogenetically closely related to each other and a separate group within the semaphorine form. For example, the semaphorins that are secreted fall be e.g. B. H-Sema-III-, IV, -V, and -E into a phylogenetic group. To this Subfamilies also include their homologues in other species, while the human (transmembrane) CD100, for example with the collapsin-4 in a phylogenetic group falls. The structurally different M-Sema-F and -G, as well as the semaphorines of the non-vertebrates form separate, phylogenetic closely related groups.

Im Bezug auf die gesamten Aminosäuresequenzen liegen die beobachteten Homologien innerhalb der phylogenetischen Gruppen zwischen etwa 90% Aminosäureidentität im Bezug auf sehr nahe verwandte Gene wie z. B. H- und M-Sema-E oder -III/D und etwas weniger als 40% bei wenig verwandten Genen der Semaphorine. Innerhalb der Sema-Domäne liegt die beobachtete Aminosäureidentität um einige Prozent höher, und durch ihren großen Anteil am Gesamtprotein (50-80% des Proteins gehören zur Sema-Domäne) der Aminosäuresequenz beeinflußt diese wesentlich die Gesamtidentität. H-Sema-L ist, über das Gesamtprotein berechnet, zu 46% identisch mit AHV-Sema, wird dagegen die Sema-Domäne allein betrachtet, dann beträgt die Aminosäureidentität 53%. Dies ist höher als z. B. zwischen den verwandten M-Sema-B und -C (37% Identität im Bezug auf das Gesamtprotein, 43% Identität im Bezug auf die Sema-Domäne), ähnlich wie M-Sema-A und -E (43% Gesamtprotein, 53% Sema-Domäne). Die Aminosäureidentität zwischen der partiellen M-Sema-L Sequenz (Tabelle 6) und H-Sema-L (Tabelle 5) liegt im Bereich der Sema-Domäne bei 93%, so daß davon ausgegangen werden kann, daß es sich um das entsprechend homologe Gen der Maus handelt.With respect to the entire amino acid sequences, those observed lie Homologies within the phylogenetic groups between about 90% Amino acid identity in relation to very closely related genes such as e.g. B. H- and M-Sema-E or -III / D and slightly less than 40% in the case of genes that are little related to the Semaphorins. The observed one lies within the Sema domain Amino acid identity a few percent higher, and because of their large proportion of the Total protein (50-80% of the protein belongs to the Sema domain) the The amino acid sequence has a significant influence on the overall identity. Calculated over the total protein, H-Sema-L is 46% identical to AHV-Sema, on the other hand, if the Sema domain is considered alone, then the Amino acid identity 53%. This is higher than e.g. B. between relatives M-Sema-B and -C (37% identity in relation to total protein, 43% identity in Reference to the Sema domain), similar to M-Sema-A and -E (43% total protein, 53% Sema domain). The amino acid identity between the partial M-Sema-L Sequence (Table 6) and H-Sema-L (Table 5) are in the area of the Sema domain at 93%, so it can be assumed that it is the corresponding to the homologous gene of the mouse.

Korrespondierende Semaphorine zu H-Sema-L und M-Sema-L in anderen Spezies können innerhalb der Sema-Domäne eine Aminosäureidentität größer als 40% im Bezug auf H-Sema-L aufweisen. Bei den nahe verwandten Wirbeltieren (Säuger, Vögel) können sogar Aminosäureidentitäten über 70% angetroffen werden.Corresponding semaphorins for H-Sema-L and M-Sema-L in other species can have an amino acid identity greater than 40% im within the Sema domain With reference to H-Sema-L. In the closely related vertebrates (mammals, Birds) even amino acid identities over 70% can be found.

Es handelt sich um eine neue Subfamilie von Semaphorinen mit größerer Aminosäureidentität zu dem viralen AHV-Sema als zu den bisher bekannten humanen bzw. murinen Semaphorinen, und mit einer für humane Semaphorine bisher nicht bekannten C-terminalen Struktur. Diese neuen Semaphorine (Mitglieder der Subfamilie) zeichnen sich dadurch aus, daß sie aufgrund ihrer Domänen struktur in die Untergruppe IV fallen und/oder die gleiche phylogenetische Gruppe fallen wie H-Sema-L und M-Sema-L und/oder im Bezug auf die gesamte Aminosäuresequenz zu H-Sema-L eine Aminosäureidentität von mindestens 15 bis 20%, vorzugsweise 25 bis 30%, besonders bevorzugt 35 bis 40% oder eine größere Identität aufweisen und/oder im Bezug auf die Sema-Domäne eine Aminsäureidentität mit H-Sema-L von mindestens 40%, vorzugsweise größer 50%, besonders bevorzugt größer 60% aufweisen.It is a new subfamily of semaphorines with a larger Amino acid identity to the viral AHV-Sema than to the previously known human or murine semaphorins, and with one for human semaphorins previously unknown C-terminal structure. These new semaphorins (members of the subfamily) are characterized by the fact that, due to their domains structure fall into subgroup IV and / or the same phylogenetic group fall like H-Sema-L and M-Sema-L and / or in relation to the whole Amino acid sequence for H-Sema-L an amino acid identity of at least 15 to 20%, preferably 25 to 30%, particularly preferably 35 to 40% or one have greater identity and / or with respect to the Sema domain one Amic acid identity with H-Sema-L of at least 40%, preferably greater than 50%, particularly preferably greater than 60%.

Den Semaphorinen dieser Subfamilie kommt auch eine andersartige biochemische Funktion zu. Eine neue Funktion dieser Semaphorine liegt in der Modulation des Immunsystems.The semaphorins of this subfamily also have a different kind of biochemical one Function too. A new function of these semaphorines is the modulation of the Immune system.

Das nächste Verwandte von H-Sema-L ist das virale AHV-Semaphorin (AHV-Sema). Dieses ist von ähnlicher Größe, besitzt aber im Gegensatz zum H-Sema-L keine Transmembrandomäne. Das AHV-Sema wird vermutlich von virusinfizierten Zellen sezerniert, um den H-Sema-L äquivalenten Rezeptor (Semaphorin von Typ L im Streifengnu) im natürlichen Wirt (Streifengnu) zu blockieren, und so dem Angriff des Immunsystems zu entgehen. Ferner ist eine Funktion als repulsives Agens (Chemorepellent) für Zellen des Immunsystems denkbar.The closest relative of H-Sema-L is the viral AHV-Semaphorin (AHV-Sema). This is of a similar size, but unlike the H-Sema-L, it has none Transmembrane domain. The AHV-Sema is believed to be caused by virus-infected cells secreted to the H-Sema-L equivalent receptor (Semaphorin of type L im Blue wildebeest) in the natural host (blue wildebeest), and thus the attack of the To escape immune system. It also functions as a repulsive agent (Chemorepellent) conceivable for cells of the immune system.

Die biochemische Funktion der neuen Semaphorine vom Typ L und deren Derivate ist als generell immunmodulierend und/oder entzündungsmodulierend anzusehen. Einerseits können sie
The biochemical function of the new semaphorins of type L and their derivatives is generally to be regarded as immunomodulating and / or inflammation-modulating. On the one hand, they can

A) as the immune response inhibiting molecules either locally, e.g. B. as a transmembrane protein on the surface of cells or over greater distances, e.g. When secreted by processing (e.g. proteases) or alternative splicing, e.g. B. by diffusion in the tissue, develop their effect as a chemorepellent and / or immunosuppressant. For example, the expression of these new semaphorins of the type L can e.g. B. on the surface of the cells of the vascular endothelia prevent leukocyte attachment and their migration through the vascular wall. The new semaphorines can play a role in maintaining barrier effects, e.g. B. to prevent infections in particularly "important" or exposed organs, for example to maintain the blood-brain barrier, placental circulation and / or other immunologically privileged locations (e.g. pancreatic islets) and / or to protect against autoimmune diseases get.
In addition, the new semaphorins and / or their derivatives can also be involved in repulsive signals in various tissues, for example for cells of the immune system (e.g. leukocytes) as protection against inadvertent activation of defense mechanisms.
B) You can also use the new semaphorines and / or their derivatives Functions as accessory molecules. On the cell surface it can be expressed, for example, through the interaction with cells of the Immune system involved in the activation of defense mechanisms be.

Dadurch ergeben sich mehrere Verwendungsmöglichkeiten für die neuen Sempahorine vom Typ L und deren Derivaten, sowie den für diese Proteine kodierenden Nukleinsäuren.This creates several uses for the new ones Sempahorins of type L and their derivatives, as well as those for these proteins coding nucleic acids.

Funktion A):
Es handelt sich um ein immunsuppressives und/oder entzündungshemmendes Prinzip: Zahlreiche potentielle Anwendungsmöglichkeiten liegen in den Bereichen Organtransplantation, Entzündungstherapie, Immuntherapie und Gentherapie.Function A):
It is an immunosuppressive and / or anti-inflammatory principle: There are numerous potential applications in the areas of organ transplantation, inflammation therapy, immunotherapy and gene therapy.

Beispielsweise können mit Hilfe der Semaphorin-kodierenden DNA oder Derivaten derselben nicht-humane, transgene Tiere hergestellt werden. Eine Anwendungsmöglichkeit dieser Tiere liegt in der Hemmung der Transplantatabstoßung in transgenen Modellen für Organtransplantationen. Beispielsweise können transgene, gegen Abstoßung geschützte tierische Organe für Xenotransplantationen hergestellt werden. Dies sollte z. B. auch zusammen mit anderen Transgenen (z. B. Komplementregulatoren wie DAF oder CD59) möglich sein. Eine weitere Anwendung liegt in der Herstellung von nicht-humanen Knock-out Tieren, beispielsweise von Knock-out Mäusen: Durch Knock-out des Mausgens M-Sema-L können z. B. weitere Funktionen des Gens aufgefunden werden. Sie stellen auch potentielle Modellsysteme für entzündliche Erkrankungen dar, falls die Mäuse ohne Semaphorin-Gen lebensfähig sind. Sollte M-Sema-L wichtig für die Immunmodulation sein, so sind vermehrt solche Mäuse zu erwarten.For example, with the help of the semaphorin-coding DNA or derivatives the same non-human, transgenic animals can be produced. One Application of these animals lies in the inhibition of Transplant rejection in transgenic models for organ transplants. For example, transgenic animal organs protected against rejection for xenografts. This should e.g. B. also together with other transgenes (e.g. complement regulators such as DAF or CD59) are possible be. Another application is in the production of non-human knockouts Animals, for example from knock-out mice: by knocking out the mouse gene M-Sema-L can e.g. B. other functions of the gene can be found. they provide also represent potential model systems for inflammatory diseases, if the mice are viable without the semaphorin gene. Should be important for the M-Sema-L Be immune modulation, then more such mice are to be expected.

Weiterhin können nicht-humane Knock-in-Tiere, beispielsweise Mäuse, hergestellt werden. Dabei wird z. B. M-Sema-L durch normales/verändertes H-Sema-L oder verändertes M-Sema-L (z. B. Integration der neuen Semaphorin-Subtypen unter der Kontrolle von konstitutiven und/oder induzierbaren Promotoren) ersetzt. Solche Tiere können z. B. für die Suche nach weiteren Funktionen der neuen Semaphorine, z. B. Funktionen des humanen Gens oder Derivaten dieser Gene dienen oder zum Auffinden von immunmodulierenden Wirkstoffen benutzt werden.Furthermore, non-human knock-in animals, for example mice, can be produced will. It is z. B. M-Sema-L through normal / changed H-Sema-L or Changed M-Sema-L (e.g. integration of the new Semaphorin subtypes under the Control of constitutive and / or inducible promoters) replaced. Such Animals can e.g. B. for the search for further functions of the new semaphorine, z. B. Functions of the human gene or derivatives of these genes are used or for Finding immune modulating agents can be used.

Herstellung z. B. rekombinant von Immunsuppressiven, anderen löslichen Proteinen oder Peptiden die sich von der Aminosäuresequenz der Semaphorine vom Typ L, z. B. von H-Sema-L oder den entsprechenden Nukleinsäuren, z. B. Genen ableiten; auch Agonisten mit struktureller Ahnlichkeit sind möglich. Diese immunsuppressiven Wirkstoffe/Agonisten können bei Autoimmunerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen und/oder Organtransplantationen eingesetzt werden.Manufacture e.g. B. recombinant of immunosuppressive, other soluble proteins or peptides which differ from the amino acid sequence of the semaphorins of type L, z. B. from H-Sema-L or the corresponding nucleic acids, e.g. B. Derive genes; agonists with structural similarities are also possible. These immunosuppressive ones Active ingredients / agonists can be used in autoimmune diseases and inflammatory Diseases and / or organ transplants are used.

Gentherapie mit Semaphorinen vom Typ L, z. B. mit Sequenzen, die für H-Sema-L oder deren Derivate kodieren mittels viraler oder nichtviraler Methoden. Einsatz bei Autoimmunerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen, der Transduktion von Organen sowie vor/während/nach Transplantationen zur Verhinderung der Transplantatabstoßung.Gene therapy with L-type semaphorins, e.g. B. with sequences coding for H-Sema-L or their derivatives encode using viral or non-viral methods. Use at Autoimmune diseases and inflammatory diseases, the transduction of Organs as well as before / during / after transplants to prevent the Transplant rejection.

Eine Ausführungsform ist ein Verfahren, bei dem die neuen Semaphorine, für diese Semaphorine kodierende DNA und Derivate derselben, insbesondere H-Sema-L, für H-Sema-L kodierende DNA und Derivate derselben in einem Verfahren zum Screening Wirkstoffen, insbesondere immunmodulierenden Wirkstoffen, eingesetzt werden.One embodiment is a method in which the new semaphorins, for this Semaphorine-coding DNA and derivatives thereof, in particular H-Sema-L, for DNA encoding H-Sema-L and derivatives thereof in a process for Screening agents, especially immunomodulating agents, used will.

Funktion B):
H-Sema-L ist ein akzessorisches Molekül, das an der Zelloberfläche exprimiert wird und an der Interaktion mit Zellen, z. B. des Immunsystems, z. B. als akzessorisches Molekül in der Aktivierung von Signalwegen, beteiligt ist. Ein virales Gen bzw. das Genprodukt eines viralen oder anderen pathogenen Gens/Genproduktes z. B. mikrobilogischen Ursprunges könnte z. B. als kompetitiver Inhibitor dieses akzessorischen Moleküls wirken. Eine Anwendung für die neuen Semaphorine liegt bei dieser Funktion ebenfalls im Bereich der Organtransplantation, Entzündungstherapie, Immuntherapie und/oder Gentherapie. Function B):
H-Sema-L is an accessory molecule that is expressed on the cell surface and is involved in the interaction with cells, e.g. B. the immune system, e.g. B. as an accessory molecule in the activation of signaling pathways involved. A viral gene or the gene product of a viral or other pathogenic gene / gene product e.g. B. microbiological origin could e.g. B. act as a competitive inhibitor of this accessory molecule. One application for the new semaphorins in this function is also in the area of organ transplantation, inflammation therapy, immunotherapy and / or gene therapy.

Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Semaphorine in einem Verfahren zum Screening von antagonistischen Wirkstoffen/Inhibitoren verwendet werden, die dann z. B. zur Blockade des Rezeptors eingesetzt werden können. Lösliche und/oder sezernierte H-Sema-L Antagonisten/Inhibitoren können beispielsweise chemische Substanzen sein oder die neuen Semaphorine bzw. Derivate derselben (z. B. Teile/verkürzte Formen derselben, beispielsweise ohne Membrandomäne oder als Ig-Fusionsproteine oder von ihnen abgeleitete Peptide, die geeignet sind den korrespondierenden Rezeptor zu blockieren). Auf diese Weise identifizierte, spezifische Antagonisten und/oder Inhibitoren können beispielsweise kompetitiv wirken und bei der Hemmung der Abstoßung z. B. in transgenen Modellen für Organtransplantationen und bei Autoimmunerkrankungen, entzündlichen Erkrankungen und Organtransplantationen eingesetzt werden.For example, the semaphorins according to the invention can be used in one process used to screen for antagonistic agents / inhibitors that then z. B. can be used to block the receptor. Soluble and / or secreted H-Sema-L antagonists / inhibitors can, for example be chemical substances or the new semaphorins or derivatives thereof (e.g. parts / abbreviated forms thereof, for example without a membrane domain or as Ig fusion proteins or peptides derived therefrom which are suitable to block the corresponding receptor). In this way identified specific antagonists and / or inhibitors can, for example, be competitive act and in the inhibition of rejection z. B. in transgenic models for Organ transplants and in autoimmune diseases, inflammatory Diseases and organ transplants are used.

DNA, die für die erfindungsgemäßen Semaphorine kodiert bzw. deren mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden erzeugten Derivate können beispielsweise für die Herstellung nicht-humaner, transgener Tiere verwendet werden. Eine Überexpression von H-Sema-L kann in diesen transgenen Tieren zu vermehrter Anfälligkeit für Autoimmunerkrankungen und/oder entzündlichen Erkrankungen führen. Die transgenen Tiere eignen sich damit zum Screening von neuen, spezifischen, immunmodulierenden Wirkstoffe.DNA which codes for the semaphorins according to the invention or whose with the aid of Molecular biological methods generated derivatives can, for example, for the Production of non-human, transgenic animals can be used. One Overexpression of H-Sema-L can be increased in these transgenic animals Susceptibility to autoimmune diseases and / or inflammatory diseases to lead. The transgenic animals are therefore suitable for screening new, specific, immunomodulating agents.

Diese DNA kann ebenso für die Herstellung von nicht-humanen Knock-out Tieren, beispielsweise Knock-out Mäusen, bei denen das Mausgen M-Sema-L ausgeschaltet wird, verwendet werden. Solche Knock-out Tiere können für die Suche nach weiteren biochemischen Funktionen des Gens eingesetzt werden. Sie stellen auch potentielle Modellsysteme für entzündliche Erkrankungen dar, falls die Mäuse ohne das M-Sema-L Gen lebensfähig sind.This DNA can also be used for the production of non-human knock-out animals, for example knock-out mice in which the mouse gene M-Sema-L turned off can be used. Such knock-out animals can be used for the Search for further biochemical functions of the gene can be used. she also represent potential model systems for inflammatory diseases, if the Mice without the M-Sema-L gene are viable.

Diese DNA kann ebenso zur Herstellung von nicht-humanen Knock-in-Tieren beispielsweise Mäusen verwendet werden. Dabei wird das M-Sema-L-Gen durch ein verändertes M-Sema-L Gen/cDNA oder ein gegebenenfalls verändertes, z. B. mutiertes Semaphorin Typ L Gen/cDNA einer anderen Spezies, z. B. von H-Sema-L ersetzt. Solche transgenen Tiere können für die Suche nach weiteren Funktionen der erfindungsgemäßen Semaphorine verwendet werden. This DNA can also be used to produce non-human knock-in animals for example mice can be used. The M-Sema-L gene is thereby through a modified M-Sema-L gene / cDNA or an optionally modified, e.g. B. mutated Semaphorin type L gene / cDNA of another species, e.g. B. from H-Sema-L replaced. Such transgenic animals can be used to search for additional functions of the semaphorins according to the invention can be used.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Semaphorinen vom Typ L und deren Derivaten, sowie der für diese Proteine kodierenden Gene/cDNAs und deren Derivaten und/oder mit Hilfe dieser Semaphorine identifizierter Wirkstoffe zur Herstellung von Arzneimitteln. Beispielsweise können Arzneimittel hergestellt werden, die in der Gentherapie angewendet werden können und die Agonisten und/oder Antagonisten der Expression von Semaphorinen vom Typ L, beispielsweise von H-Sema-L, enthalten. Dazu können virale und/oder nichtvirale Methoden verwendet werden. Diese Arzneimittel können z. B. bei Autoimmunerkrankungen und entzündliche Erkrankungen, Organtransplantationen vor und/oder während und/oder nach der Transplantation zur Verhinderung der Abstoßung eingesetzt werden.The invention also relates to the use of L and type semaphores their derivatives, as well as the genes / cDNAs coding for these proteins and their Derivatives and / or active substances identified with the help of these semaphorins for Manufacture of medicines. For example, drugs can be manufactured that can be used in gene therapy and the agonists and / or antagonists of the expression of semaphorins of type L, for example from H-Sema-L included. These can be viral and / or non-viral Methods are used. These drugs can e.g. B. at Autoimmune and inflammatory diseases, organ transplants before and / or during and / or after the transplant to prevent the Repulsion can be used.

Verwendung der neuen Semaphorine, insbesondere von H-Sema-L und von Genen/cDNAs derselben in Verfahren zum Screening von neuen Wirkstoffen. Modifizierte Proteine und/oder Peptide, die sich von H-Sema-L und/oder M-Sema-L ableiten, können zur Suche nach dem entsprechenden Rezeptor und/oder dessen Antagonisten bzw. Agonist in funktionellen Tests, beispielsweise mittels Expressionskonstrukten von H-Sema-L und Homologen eingesetzt werden. Die für die neuen Semaphorine kodierenden Gene, cDNAs und deren Derivate können auch als Hilfsmittel in der Molekularbiologie eingesetzt werden.Use of the new semaphorins, especially H-Sema-L and von Genes / cDNAs of the same in processes for the screening of new active substances. Modified proteins and / or peptides that differ from H-Sema-L and / or M-Sema-L derive, can search for the corresponding receptor and / or its Antagonists or agonists in functional tests, for example by means of Expression constructs of H-Sema-L and homologues can be used. The genes, cDNAs and their derivatives coding for the new semaphorins can also be used as tools in molecular biology.

Versuchsbedingungen, die in den Beispielen Anwendung finden:Test conditions that are used in the examples:

Verwendete PCR-Programme:
Used PCR programs:

Taq52-60 (mit Ampli-Taq®-Polymerase, Perkin Elmer,)@Taq52-60 (with Ampli-Taq® polymerase, Perkin Elmer,) @ 96°C/60s96 ° C / 60s 1 Zyklus1 cycle 96°C/15s-52°C/20s-70°C/60s96 ° C / 15s-52 ° C / 20s-70 ° C / 60s 40 Zyklen40 cycles 70°C/60s70 ° C / 60s 1 Zyklus1 cycle

Taq60-30@Taq60-30 @ 96°C/60s96 ° C / 60s 1 Zyklus1 cycle 96°C/15s-60°C/20s-70°C/30s96 ° C / 15s-60 ° C / 20s-70 ° C / 30s 35 Zyklen35 cycles 70°C/60s70 ° C / 60s 1 Zyklus1 cycle

Taq60-60@Taq60-60 @ 96°C/60s96 ° C / 60s 1 Zyklus1 cycle 96°C/15s-60°C/20s-70°C/60s96 ° C / 15s-60 ° C / 20s-70 ° C / 60s 35 Zyklen35 cycles 70°C/60s70 ° C / 60s 1 Zyklus1 cycle

Taq62-40@Taq62-40 @ 96°C/60s96 ° C / 60s 1 Zyklus1 cycle 96°C/15s-62°C/20s-70°C/40s96 ° C / 15s-62 ° C / 20s-70 ° C / 40s 35 Zyklen35 cycles 70°C/60s70 ° C / 60s 1 Zyklus1 cycle

Verwendete Reaktionsbedingungen für PCR mit Taq-Polymerase:
50 µl Reaktionsansätze mit 100-200 ng Template, 200 µM dNTP, 0,2-0,4 µM je Primer, 2.5 U Ampli-Taq®, 5 µl des mitgelieferten 10× Reaktionspuffers.Reaction conditions used for PCR with Taq polymerase:
50 µl reaction mixtures with 100-200 ng template, 200 µM dNTP, 0.2-0.4 µM per primer, 2.5 U Ampli-Taq®, 5 µl of the 10 × reaction buffer supplied.

Verwendete Programme für:
Programs used for:

1. XL62-6 (with Expand-Long Template PCR System®, Boehringer Mannheim)
94 ° C / 60s 1 cycle 94 ° C / 15s-62 ° C / 30s-68 ° C / 6 min 10 cycles 94 ° C / 15s-62 ° C / 30s-68 ° C / (6 min + 15 s / cycle) 25 cycles 68 ° C / 7 min 1 cycle
2. XL62-12 (with Expand-Long Template PCR System, Boehringer Mannheim)
94 ° C / 60s 1 cycle 94 ° C / 15s-62 ° C / 30s-68 ° C / 12 min 10 cycles 94 ° C / 15s-62 ° C / 30s-68 ° C / (6 min + 15s / cycle) 25 cycles 68 ° C / 7 min 1 cycle

Reaktionsbedingungen für PCR mit Expand-Long Template PCR System 50 µl Reaktionsansätze mit 100-200 ng Template, 500 µM dNTP, 0,2-0,4 µM je Primer, 0,75 µl Enzym-Mix, 5 µl des mitgelieferten 10× Reaktionspuffers Nr. 2. Reaction conditions for PCR with the Expand-Long Template PCR System 50 µl reaction mixtures with 100-200 ng template, 500 µM dNTP, 0.2-0.4 µM each Primer, 0.75 µl enzyme mix, 5 µl of the supplied 10 × reaction buffer no. 2.

example 1

Ausgehend von Sequenzen des AHV-Sema (Ensser u. Fleckenstein (1995), J. General Virol. 76: 1063-1067) wurden PCRs und RACE-PCRs durchgeführt. Als Ausgangsmaterial hierfür diente humane cDNA aus Plazenta-Gewebe, an welche Adapter zur RACE-Amplifikation ligiert wurden (Marathon™-cDNA Amplification Kit, Clontech Laboratories GmbH, Tullastraße 4, 69126 Heidelberg). Zunächst wurde mittels spezifischer Primer (Nr. 121234 + Nr. 121236, Tabelle 6) ein PCR-Fragment mit einer Länge von etwa 800 bp (Basenpaaren) amplifiziert (PCR-Programm:
(Taq60-60)). Dieses wurde kloniert und sequenziert (Dye-Deoxy-Terminator Sequenzierungs-Kit, Applied Biosystems, Brunnenweg 13, Weilderstadt). Die Sequenzierung des PCR-Produkts ergab eine Sequenz, die eine hohe Homologie zu der DNA-Sequenz von AHV-Sema aufweist, identisch zu der Sequenz der beiden ESTs.Starting from sequences of the AHV-Sema (Ensser and Fleckenstein (1995), J. General Virol. 76: 1063-1067), PCRs and RACE-PCRs were carried out. The starting material for this was human cDNA from placenta tissue to which adapters for RACE amplification were ligated (Marathon ™ -cDNA Amplification Kit, Clontech Laboratories GmbH, Tullastrasse 4, 69126 Heidelberg). First, a PCR fragment with a length of about 800 bp (base pairs) was amplified using specific primers (No. 121234 + No. 121236, Table 6) (PCR program:
(Taq60-60)). This was cloned and sequenced (Dye-Deoxy-Terminator Sequencing Kit, Applied Biosystems, Brunnenweg 13, Weilderstadt). The sequencing of the PCR product revealed a sequence which has a high degree of homology to the DNA sequence of AHV Sema, identical to the sequence of the two ESTs.

Ein PCR-Fragment von 600 bp wurde mit dem Primerpaar (Nr. 121237 + Nr. 121239, Tabelle 6) identifiziert. Es zeigte sich, das es sich um Klone mit DNA-Sequenzen des selben Gens handelte.A PCR fragment of 600 bp was with the primer pair (No. 121237 + No. 121239, Table 6) identified. It turned out that these are clones with DNA sequences of the same gene acted.

Example 2

Das 800 bp PCR-Fragment aus Beispiel 1 wurde radioaktiv markiert (Random-Priming nach der Methode von {Feinberg (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13}, mit ³²P-α-dCTP) und als Sonde für einen Multi-Tissue Northern-Blot (Human Multiple Tissue Northern Blot II, Clontech), der mRNA-Proben aus den Geweben Milz, Thymus, Prostata, Testis, Ovarien, Dünndarm, Dickdarm und Leukozyten (PBL) enthält, verwendet. Dabei zeigte sich deutlich die Expression einer mRNA mit einer Länge von etwa 3.3 kb in Milz und Keimdrüsen (Hoden, Eierstöcken), sowie schwächer in Thymus und Darm. Eine Hybridisierung eines Master-Blots (Dotblot mit RNA aus zahlreichen Geweben (Human RNA Master Blot™, Clontech) bestätigte dieses Ergebnis und zeigte auch eine starke Expression in Plazenta-Gewebe. The 800 bp PCR fragment from Example 1 was radioactively labeled (random priming according to the method of {Feinberg (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13}, with ³² P-α-dCTP) and as a probe for a multi -Tissue Northern Blot (Human Multiple Tissue Northern Blot II, Clontech), which contains mRNA samples from the tissues spleen, thymus, prostate, testis, ovaries, small intestine, large intestine and leukocytes (PBL) is used. The expression of an mRNA with a length of about 3.3 kb was clearly evident in the spleen and gonads (testes, ovaries), and weaker in the thymus and intestines. Hybridization of a master blot (dot blot with RNA from numerous tissues (Human RNA Master Blot ™, Clontech) confirmed this result and also showed strong expression in placenta tissue.

Example 3

Eine cDNA-Bibliothek aus humaner Milz, kloniert in dem Bakteriophagen Lambda gt10 (Human Spleen 5' STRETCH PLUS cDNA, Clontech) wurde mit dieser Sonde durchsucht und ein Lambda-Klon identifiziert. Die in diesem Klon inserierte cDNA mit einer Länge von 1.6 kb wurde mittels PCR (Expand™ Long Template PCR System, Boehringer Mannheim GmbH, Sandhofer Straße 116, 68305 Mannheim) amplifiziert wobei die vektorspezifischen Primer Nr. 207608 + Nr. 207609 (Tabelle 6) verwendet wurden (flankierend der EcoRI-Klonierungsstelle) und das erhaltene PCR-Fragment sequenziert. Dieser Klon enthielt das 5' Ende der cDNA und erweiterte die bekannte cDNA Sequenz auch nach 3'. Ausgehend von den neuen Teilsequenzen der cDNA wurden neue Primer für die RACE-PCR entwickelt (Nr. 232643, Nr. 232644, Nr. 233084, Tabelle 6). Zusammen mit einer verbesserten Thermocyclertechnik (PTC-200 von MJ-Research, Biozym Diagnostik GmbH, 31833 Hess. Oldendorf) mit deutlich besseren Leistungsdaten (Heiz- und Kühlrate) wurde ein 3'-RACE PCR-Produkt amplifiziert wobei die Primer Nr. 232644 bzw. Nr. 232643 und AP1 verwendet wurden und in den Vektor pCR2.1 (Invitrogen, De Schelp 12, 9351 NV Leek, Niederlande) kloniert. Das 3'-RACE PCR-Produkt wurde Sequenziert und auf diese Weise das 3'Ende der cDNA identifiziert. Eine RACE-Amplifikation nach 5' (Primer Nr. 131990 bzw. Nr. 233084 und AP1) erweiterte das 5' Ende der cDNA um wenige Nukleotide und bestätigte den im identifizierten Lambda-Klon gefundenen Aminoterminus des H-Sema-L.A cDNA library from human spleen cloned in the bacteriophage lambda gt10 (Human Spleen 5 'STRETCH PLUS cDNA, Clontech) was tested with this probe searched and identified a lambda clone. The cDNA inserted in this clone with a length of 1.6 kb was carried out by means of PCR (Expand ™ Long Template PCR System, Boehringer Mannheim GmbH, Sandhofer Strasse 116, 68305 Mannheim) amplified with the vector-specific primer No. 207608 + No. 207609 (Table 6) were used (flanking the EcoRI cloning site) and the obtained PCR fragment sequenced. This clone contained the 5 'end of the cDNA and extended the known cDNA sequence also after 3 '. Starting from the new Partial sequences of the cDNA, new primers for the RACE-PCR were developed (No. 232643, No. 232644, No. 233084, Table 6). Along with an improved Thermocyclertechnik (PTC-200 from MJ-Research, Biozym Diagnostik GmbH, 31833 Hess. Oldendorf) with significantly better performance data (heating and cooling rate) a 3'-RACE PCR product was amplified using primers no. 232644 and no. 232643, respectively and AP1 were used and in the vector pCR2.1 (Invitrogen, De Schelp 12, 9351 NV Leek, The Netherlands) cloned. The 3'-RACE PCR product was sequenced and in this way identified the 3 'end of the cDNA. A RACE amplification after 5 '(primer no. 131990 or no. 233084 and AP1) the 5' end of the cDNA by a few nucleotides and confirmed the lambda clone identified in found amino terminus of H-Sema-L.

Example 4

Ausgehend von einem kurzen murinen EST (Zuordnungs-Nr. AA260340) und einem daraus abgeleiteten Primer Nr. 260813 (Tabelle 6) und dem H-Sema-L spezifischen Primern Nr. 121234 (Tabelle 6) wurde mittels PCR (Bedingungen: Taq52-60) ein DNA-Fragment mit einer Länge von ca. 840 bp muriner cDNA amplifiziert und in den Vektor pCR2.1 kloniert. Das dieses DNA-Fragment enthaltende Gen wurde M-Sema-L genannt. Mit dem erhaltenen M-Sema-L DNA-Fragment eine cDNA-Bank aus Mäuse-Milz (Mouse Spleen 5' STRETCH cDNA, Clontech) untersucht, wobei bereits mehrere Klone identifiziert werden konnten.Starting from a short murine EST (Assignment No. AA260340) and a derived therefrom primer no. 260813 (Table 6) and the H-Sema-L specific Primers No. 121234 (Table 6) was entered using PCR (conditions: Taq52-60) DNA fragment with a length of approx. 840 bp murine cDNA is amplified and transferred to the Vector pCR2.1 cloned. The gene containing this DNA fragment was Called M-Sema-L. A cDNA library with the M-Sema-L DNA fragment obtained from mouse spleen (Mouse Spleen 5 'STRETCH cDNA, Clontech) examined, where several clones have already been identified.

PCR (Taq60-30) mit den Primern Nr. 260812, Nr. 260813 aus muriner, endothelialer cDNA lieferte ein PCR-Fragment mit einer Länge von 244 Basenpaaren. Die PCR-Ergebnisse zeigten, daß eine deutliche basale Expression in murinen Endothelzellen vorhanden ist, welche nach Stimulation mit dem Zytokin Interferon-y und Lipopolysacchariden zurückgeht.PCR (Taq60-30) with primers No. 260812, No. 260813 from murine, endothelial cDNA yielded a PCR fragment with a length of 244 base pairs. the PCR results showed that there was significant basal expression in murine Endothelial cells are present, which after stimulation with the cytokine interferon-y and lipopolysaccharides are decreasing.

Example 5

Untersuchungen zur Chromosomalen Lokalisation mittels Fluoreszenz in-situ Hybridisierung zeigten, daß H-Sema-L auf Chromosom 15q23 lokalisiert ist. Chromosomal benachbart liegen der Locus für das Bardet-Biedl-Sydrom und Tay-Sachs Erkrankung (Hexosaminidase A).Investigations of chromosomal localization using fluorescence in-situ Hybridization showed that H-Sema-L is located on chromosome 15q23. The locus for Bardet-Biedl syndrome and Tay-Sachs disease (hexosaminidase A).

Example 6

Die genomische Intron-Exon Struktur des H-Sema-L Gens ist zum größten Teil aufgeklärt.The genomic intron-exon structure of the H-Sema-L gene is for the most part enlightened.

Durch PCR-Amplifikation konnte bisher fast der vollständige genomische Locus des H-Sema-L kloniert und charakterisiert werden. Insgesamt konnten bereits mehr als 9100 bp der genomischen Sequenz bestimmt werden und so die Intron-Exon-Struktur des Gens weitgehend aufgeklärt werden.So far, almost the complete genomic locus of the H-Sema-L can be cloned and characterized. In total, more than 9100 bp of the genomic sequence can be determined and so the Intron-exon structure of the gene can be largely elucidated.

Example 7

Expressionsklonierungen:
Da kein kompletter Klon des Semaphoringens aus der Lambda-gt10 cDNA-Bank isoliert werden konnte, und auch mittels PCR ein vollständiger Klon nicht zu erhalten war, wurde der kodierende Bereich der cDNA in 2 überlappenden Subfragmenten mittels PCR (XL62-6) mit Hilfe der Primer Nr. 240655 und Nr. Expression cloning:
Since no complete clone of the semaphoring gene could be isolated from the lambda gt10 cDNA library, and a complete clone could not be obtained by means of PCR either, the coding region of the cDNA was determined in 2 overlapping subfragments by means of PCR (XL62-6) using the Primer No. 240655 and No.

121339 für das N-terminale DNA-Fragment, sowie den Primern Nr. 240656 (enthält HindIII und PmeI Schnittstellen) und Nr. 121234 für das C-terminale DNA-Fragment amplifiziert. Die erhaltenen DNA-Fragmente (Subfragmente) wurden in den Vektor pCR21 kloniert. Die beiden Subfragmente wurden komplett sequenziert und schließlich die vollständige H-Sema-L CDNA durch Insertion eines 0.6 kb C-terminalen SstI-HindIII Restriktions-Fragments in das mit den Restriktionsenzymen SstI und HindIII geschnittene, das N-terminale DNA-Fragment enthaltende Plasmid, hergestellt. Aus diesem Plasmid pCR2.1-H-Sema-L (gemäß Sequenz in Tabelle 7) wurde das komplette Gen mittels der EcoRI-Schnittstelle (in pCR2.1) und HindIII-Schnittstelle (in Primer Nr. 240656, Tabelle 6) herausgeschnitten und in einen entsprechend geschnittenen, konstitutiven Expressionsvektor pCDNA3.1(-)MycHisA (Invitrogen) ligiert. Aus dem resultierenden rekombinanten Plasmid pCDNA3.1(-)H-Sema-L-MycHisA (gemäß Sequenz in Tabelle 8) wurde das EcoRI-ApaI Fragment (ohne Myc-His-Tag) herausgeschnitten und in den induzierbaren Vektor pIND ligiert (Ecdyson-Inducible Mammalian Expression System, Invitrogen), der zuvor ebenfalls mit EcoRI-ApaI geschnitten worden war. Das rekombinante Plasmid wurde mit pIND-H-Sema-L-EA (Sequenz gemäß Tabelle 9) bezeichnet. Ein EcoRI-PmeI-Fragment (mit Myc-His-Tag) aus pCDNA3.1(-)H-Sema-L-Myc-HisA (Sequenz gemäß Tabelle 9) wurde in einen mit EcoRI-EcoRV geschnittenen Vektor pIND eingesetzt. Das rekombinante Plasmid wurde mit pIND-H-Sema-L-EE (Sequenz gemäß Tabelle 10) bezeichnet.121339 for the N-terminal DNA fragment, as well as primers No. 240656 (contains HindIII and PmeI sites) and No. 121234 for the C-terminal DNA fragment amplified. The obtained DNA fragments (subfragments) were in the vector pCR21 cloned. The two subfragments were completely sequenced and finally the complete H-Sema-L CDNA by inserting a 0.6 kb C-terminal SstI-HindIII restriction fragment into the one with the restriction enzymes SstI and HindIII cut plasmid containing the N-terminal DNA fragment, manufactured. From this plasmid pCR2.1-H-Sema-L (according to the sequence in Table 7) was the complete gene using the EcoRI cleavage site (in pCR2.1) and HindIII cleavage site (in primer no. 240656, Table 6) cut out and inserted into a appropriately cut, constitutive expression vector pCDNA3.1 (-) MycHisA (Invitrogen) ligated. From the resulting recombinant plasmid pCDNA3.1 (-) H-Sema-L-MycHisA (according to the sequence in Table 8) became the EcoRI-ApaI fragment (without Myc-His-Tag) cut out and ligated into the inducible vector pIND (Ecdyson-Inducible Mammalian Expression System, Invitrogen), previously also cut with EcoRI-ApaI. The recombinant plasmid was with pIND-H-Sema-L-EA (sequence according to Table 9). An EcoRI-PmeI fragment (with Myc-His-Tag) from pCDNA3.1 (-) H-Sema-L-Myc-HisA (sequence according to Table 9), pIND was cut into a vector cut with EcoRI-EcoRV used. The recombinant plasmid was generated with pIND-H-Sema-L-EE (sequence according to Table 10).

Ein Fusionsgen von H-Sema-L mit Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) wurde hergestellt durch Ligation des mit PCR amplifizierten EGFP-Leserahmens (aus dem Vektor pEGFP-C1 (Clontech), mit Hilfe der Primer Nr. 243068 + Nr. 243069, Taq52-60) in die PmeI-Schnittstelle des Plasmids pCDNA3.1(-)H-Sema-L-MycHisA wodurch das Plasmid pCDNA3.1(-)H-Sema-L-GFP-MycHisA (Sequenz gemäß Tabelle 11) erhalten wurde.A fusion gene of H-Sema-L with Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) was made by ligation of the PCR amplified EGFP reading frame (from the vector pEGFP-C1 (Clontech), using primer no. 243068 + no. 243069, Taq52-60) into the PmeI site of the plasmid pCDNA3.1 (-) H-Sema-L-MycHisA which creates the plasmid pCDNA3.1 (-) H-Sema-L-GFP-MycHisA (sequence according to Table 11) was obtained.

Example 8

Zur Herstellung von H-Sema-L spezifischen Antikörpern wurden cDNA-Fragmente von H-Sema-L in prokaryotische Expressionsvektoren integriert, in E. coli exrimiert und die Semaphorin-Derivate aufgereinigt. Die Semaphorin-Derivate wurden als Fusionsproteine mit einem His-Taq exprimiert. Dementsprechend wurden Vektoren verwendet, die die Sequenz für ein His-Taq enthalten und eine Integration des Semaphorin cDNA-Fragments im Leserahmen ermöglichten. Ein N-terminales 6×Histidin-Tag ermöglicht z. B. eine Aufreinigung mittels Nickel-Chelat-Affinitäts chromatographie (Q)iagen GmbH, Max-Volmer Straße 4, 40724 Hilden):
For the production of H-Sema-L-specific antibodies, cDNA fragments of H-Sema-L were integrated into prokaryotic expression vectors, expressed in E. coli and the semaphorin derivatives were purified. The Semaphorin derivatives were expressed as fusion proteins with a His-Taq. Accordingly, vectors were used which contain the sequence for a His-Taq and enable integration of the Semaphorin cDNA fragment in the reading frame. An N-terminal 6 × histidine tag enables e.g. B. purification by means of nickel chelate affinity chromatography (Q) iagen GmbH, Max-Volmer Straße 4, 40724 Hilden):

1. The part of the H-Sema-L cDNA coding for amino acids 179-378 was amplified by PCR with primers no. 150788 and no. 150789 and this DNA fragment into the vector pQE30 (Qiagen), which was previously with the Restriction enzymes BamHI and HindIII had been cut, ligated (Construct pQE30-H-Sema-L-BH (sequence according to Table 12)).
2. The segment of the C-terminal amino acids 480-666 coding H-Semal-L cDNA was obtained with the restriction enzymes SstI and HindIII from the Plasmid pCR 2.1 cut and into the vector pQE31 (Qiagen), which was previously had been cut with SstI and HindIII ligated (construct pQE31-H-Sema-L-SH (sequence according to Table 13)).

Die korrekte Integration der Sequenzen im richtigen Leserahmen wurde durch DNA-Sequenzierung überprüft. Die Fusionsproteine, bestehend aus einem N-terminalen 6×Histidin-Taq und einem Teil des Semaphorins H-Sema-L wurden mittels Ni²⁺-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die aufgereinigten Fusionsproteine wurden zur Immunisierung von verschiedenen Tieren (Hase, Huhn, Maus) benutzt. The correct integration of the sequences in the correct reading frame was checked by DNA sequencing. The fusion proteins, consisting of an N-terminal 6 × histidine Taq and part of the semaphorin H-Sema-L, were ^{purified by means of Ni 2+} affinity chromatography. The purified fusion proteins were used to immunize various animals (rabbits, chickens, mice).

Tabelle 2 Table 2

cDNA-Sequenz von H-Sema-L (2636 Nukleotide) (SEQ ID NO.: 1) cDNA sequence of H-Sema-L (2636 nucleotides) (SEQ ID NO .: 1)

Tabelle 3 Table 3

Sequenz der cDNA von M-Sema-L (partiell, 1195 Nukleotide) (SEQ ID NO.: 2) Sequence of the cDNA of M-Sema-L (partial, 1195 nucleotides) (SEQ ID NO .: 2)

Tabelle 4 Table 4

Aminosäuresequenz von H-Sema-L (666 Aminosäuren) (SEQ ID NO.: 3) Amino acid sequence of H-Sema-L (666 amino acids) (SEQ ID NO .: 3)

Tabelle 5 Table 5

(Partielle) Aminosäuresequenz von M-Sema-L (394 Aminosäuren, entspricht Position 1-396 von H-Sema-L) (SEQ ID NO.: 4) (Partial) amino acid sequence of M-Sema-L (394 amino acids, corresponds to position 1-396 of H-Sema-L) (SEQ ID NO .: 4)

Tabelle 6 Table 6

Synthetische Oligonukleotide, (Eurogentec, Seraing, Belgien) Synthetic oligonucleotides, (Eurogentec, Seraing, Belgium)

Tabelle 7 Table 7

Sequenz des rekombinanten Plasmids pCR2.1-H-Sema-L (SEQ ID NO.: 34) Sequence of the recombinant plasmid pCR2.1-H-Sema-L (SEQ ID NO .: 34)

Tabelle 8 Table 8

Sequenz des rekombinanten Expressionsplasmids pCDNA3.1(-)H-Sema-L-MycHisA (SEQ ID NO.: 35) Sequence of the recombinant expression plasmid pCDNA3.1 (-) H-Sema-L-MycHisA (SEQ ID NO .: 35)

Tabelle 9 Table 9

Sequenz des rekombinanten Plasmids pIND-H-Sema-L-EA (SEQ ID NO.: 36) Sequence of the recombinant plasmid pIND-H-Sema-L-EA (SEQ ID NO .: 36)

Tabelle 10 Table 10

Sequenz des rekombinanten Plasmids pIND-H-Sema-L-EE (SEQ ID NO.: 37) Sequence of the recombinant plasmid pIND-H-Sema-L-EE (SEQ ID NO .: 37)

Tabelle 11 Table 11

Sequenz des rekombinanten Plasmids pCDNA3.1(-)H-Sema-L-GFP-MycHisA (SEQ ID NO.: 38) Sequence of the recombinant plasmid pCDNA3.1 (-) H-Sema-L-GFP-MycHisA (SEQ ID NO .: 38)

Tabelle 12 Table 12

Sequenz des rekombinanten Plasmids pQE30-H-Sema-L-BH (SEQ ID NO.: 39) Sequence of the recombinant plasmid pQE30-H-Sema-L-BH (SEQ ID NO .: 39)

Tabelle 13 Table 13

Sequenz des rekombinanten Plasmids pQE31-H-Sema-L-SH (SEQ ID NO.: 40) Sequence of the recombinant plasmid pQE31-H-Sema-L-SH (SEQ ID NO .: 40)

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims

1. Semaphorins of type L (Sema-L) containing N-terminal signal peptide and a characteristic Sema domain, characterized in that these proteins have an immunoglobulin-like domain and a transmembrane domain in the C-terminal region.

2. Semaphorins according to claim 1, characterized in that the proteins an amino acid identity of at least 40% im in the area of the Sema domain Have reference to the Sema domain of H-Sema-L.

3. Semaphorin according to one or more of claims 1 and 2, characterized characterized in that the protein has the partial amino acid sequence according to Table 5 contains (murine semaphorin (M-Sema-L)).

4. Semaphorin, characterized in that the protein (human Semaphorin (H-Sema-L)) has the amino acid sequence according to Table 4.

5. Splice variant of a semaphore according to one or more of the claims 1 to 4.

6. splice variant of a semaphore according to claim 5, characterized characterized in that the protein is no or no complete Contains transmembrane domain.

7. Semaphorin according to one or more of claims 1 to 6, characterized characterized in that the protein is post-translationally processed.

8. Semaphorin according to one or more of claims 1 to 7, characterized characterized in that the protein is glycosylated.

9. Semaphorin according to one or more of claims 1 to 7, characterized characterized in that the protein does not contain a signal peptide.

10. DNA coding for semaphorins of type L according to one or more of Claims 1 to 9.

11. DNA according to claim 10, containing the genes of the semaphorins of type L.

12. DNA according to claim 11, containing the gene of H-Sema-L or its Derivatives.

13. DNA according to claim 11, containing the gene of M-Sema-L or its Derivatives.

14. DNA according to claim 10, containing the cDNA of the semaphorins of type L.

15. DNA according to claim 14, containing the cDNA of H-Sema-L or their Derivatives.

16. cDNA of H-Sema-L according to Table 2.

17. DNA according to claim 14, containing the cDNA of M-Sema-L or their Derivatives.

18. Partial cDNA of M-Sema-L according to Table 3.

19. Plasmid containing DNA coding for semaphorins of type L.