DE19720153A1 - DNA analysis of blood for diagnostic testing - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur DNS-Analytik von Blut und ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.The invention relates to a method for DNA analysis of blood and a means for performing the method. The field of application of the invention is medical diagnostics.
Es gilt heute als gesichert, daß mindestens 5000 Krankheiten genetisch bedingt, das heißt erblich übertragbar, sind. Etwa 450 Erbkrankheiten sind aufgrund der Entschlüsselung der zugrunde liegenden Gene und ihrer krankheitsauslösenden Defekte (Genmutationen) einer Diagnostik zugänglich (JAMA: Statement on use of DNA testing for presymptomatic identification of cancer risk 271, 785 (1994)). Die meisten dieser Erbkrankheiten sind monogen (gleichbedeutend mit der Zuordnung nur eines einzelnen Gens zu einer bestimmten Krankheit) und umfassen relativ seltene Krankheiten, die im frühen Kindesalter auftreten und als unheilbar gelten. Dazu gehören beispielsweise Mukoviszidose, Muskeldystrophie oder das Fragile(X) Syndrom (BioEssays: Trinucleotide repeat expansion and human genetic diseases 16, 277 (1994)).It is now considered certain that at least 5000 diseases are genetic, that is, inheritable. Approximately 450 hereditary diseases are due to the decoding of the underlying genes and their disease-causing defects (Gene mutations) available for diagnosis (JAMA: Statement on use of DNA testing for presymptomatic identification of cancer risk 271, 785 (1994)). Most of these are inherited disorders monogenic (synonymous with the assignment of only one individual Gens to a specific disease) and include relative rare diseases that occur in early childhood and are considered incurable. These include, for example Cystic fibrosis, muscular dystrophy or the Fragile (X) syndrome (BioEssays: Trinucleotide repeat expansion and human genetic diseases 16, 277 (1994)).
In den letzten 5 Jahren hat sich überraschend herausgestellt, daß auch eine Vielzahl von sogenannten Volkserkrankungen vererbt werden können. Dazu gehören solche häufig vorkommenden Krankheiten wie Hypertonie und Arteriosklerose, Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Diabetes, Alzheimer u. a. Die meisten dieser Krankheiten können bei rechtzeitiger Diagnose erfolgreich therapiert werden. Damit haben sich die Anwendungsmöglichkeiten der Gendiagnostik dramatisch erweitert. Familiäre Hyper cholesterinämie (FH) zum Beispiel ist eine der am häufigsten auftretenden autosomal dominanten Erbkrankheiten (etwa 1 von 500 Menschen, Arterosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology: Vol. 15, 12 (1995)) mit einem starken Risiko für Herzinfarkt. Ein Gentest für FH würde Hochrisikopatienten frühzeitig erfassen und einer gezielten medikamentösen Therapie mit Cholesterinsenkern zuführen, die das Infarktrisiko deutlich senkt. Davon wären in Deutschland mehrere 100.000 Menschen betroffen. Ähnliche Betrachtungen gelten für die Früherkennung von Krebsrisikopatienten. Der Gentest ist die genaueste Vorsorgemaßnahme, da er die Ursache, nicht das Symptom, der Krankheit bestimmt. Wir sprechen in diesem Zusammenhang von der präsymptomatischen, also vorbeugenden genetischen Diagnostik. In den USA belaufen sich wirtschaftliche Betrachtungen zum Gen testmarkt auf etwa 7 Milliarden Dollar für die kommenden 5-10 Jahre.In the past 5 years it has surprisingly turned out that also a variety of so-called common diseases can be inherited. These include those that occur frequently Diseases such as hypertension and arteriosclerosis, breast cancer, Colon cancer, diabetes, Alzheimer's and a. Most of these Diseases can be successful with timely diagnosis be treated. With that, the application possibilities genetic diagnostics dramatically expanded. Family hyper Cholesterolemia (FH) for example is one of the most common occurring autosomal dominant hereditary diseases (about 1 in 500 people, arterosclerosis, thrombosis, and vascular Biology: Vol. 15, 12 (1995)) with a high risk for Heart attack. A genetic test for FH would make high-risk patients early detection and targeted drug therapy with cholesterol-lowering drugs that significantly reduce the risk of heart attack lowers. There would be several 100,000 people in Germany affected. Similar considerations apply to early detection cancer risk patients. The genetic test is the most accurate Precautionary measure because it is the cause, not the symptom, of Disease determined. In this context we speak of the presymptomatic, i.e. preventive genetic diagnostics. In the United States, there are economic considerations on the gene test market at around $ 7 billion for the next 5-10 Years.
Die molekulargenetische Gendiagnostik wird in folgenden Schritten durchgeführt (Nature Medicine: Analysis of mismatch repair genes in hereditary non-polyposis colorectal cancer patients 2, 169 (1996)):Molecular genetic genetic diagnostics is described in the following Steps performed (Nature Medicine: Analysis of mismatch repair genes in hereditary non-polyposis colorectal cancer patients 2, 169 (1996)):
- 1. Aus einer Blutprobe wird DNS isoliert;1. DNA is isolated from a blood sample;
- 2. Mittels Polymerasen-Ketten-Reaktion (PCR) wird ein die Mutation enthaltender DNS-Abschnitt amplifiziert;2. By means of polymerase chain reaction (PCR) is a DNA section containing mutation amplified;
- 3. Der mutierte und der normale DNS-Abschnitt werden durch gelelektrophoretische Trennverfahren und/oder Southern Blots miteinander verglichen.3. The mutated and the normal DNA section are through gel electrophoretic separation processes and / or Southern blots compared with each other.
- 4. In besonderen Fällen muß der DNS-Abschnitt zur Identifizierung einer unbekannten Mutation sequenziert werden.4. In special cases, the DNS section must Identification of an unknown mutation can be sequenced.
Als Ausgangsmaterial zur Präparation reiner DNS in der molekularbiologischen Forschung ist Vollblut üblich. Zur Reinigung derartiger DNS ist eine Mindestmenge an Blut von 5-10 ml notwendig.As starting material for the preparation of pure DNA in the whole blood is common in molecular biological research. For Purification of such DNA is a minimum amount of blood of 5-10 ml necessary.
Üblicherweise wird die DNS nach folgendem Schema (Proc. Natl. Acad. Sc.: Analysis of human Y-chromosome-specific reiterated DNA in chromosome variants 74, 1245 (1977)) gereinigt, das von den Laboren noch unterschiedlich verifiziert wird:The DNS is usually based on the following scheme (Proc. Natl. Acad. Sc .: Analysis of human Y chromosome-specific reiterated DNA in chromosome variants 74, 1245 (1977)) cleaned, which is still verified differently by the laboratories becomes:
- - ca. 10 ml EDTA Blut werden im Puffer lysiert, der 1% Triton x-100 enthält;- Approx. 10 ml EDTA blood are lysed in the buffer, the 1% Triton contains x-100;
- - 10 min Zentrifugation;- 10 min centrifugation;
- - Aufnahme des Pellets in 1 ml 0,9% NaCl;- Take up the pellet in 1 ml 0.9% NaCl;
- - Lyse in 10% SDS plus EDTA;- lysis in 10% SDS plus EDTA;
- - Zugabe von Na-perchlorat;- addition of Na perchlorate;
- - Zugabe von Chloroform/Octanol zur Herausbildung von 2 Phasen;- Add chloroform / octanol to form 2 phases;
- - 20 min Zentrifugation;- 20 min centrifugation;
- - obere Phase plus 5 ml Chloroform;- upper phase plus 5 ml chloroform;
- - 5 min Zentrifugation;- 5 min centrifugation;
- - obere Phase abnehmen;- remove the upper phase;
- - mit Isopropanol die DNS fällen und mit Glasstab aufwickeln;- Precipitate the DNA with isopropanol and wind up with a glass rod;
- - in kaltem Alkohol waschen;- wash in cold alcohol;
- - in NaCl/Na-citrat über Nacht lösen;- dissolve in NaCl / Na citrate overnight;
- - Umfällen mit Alkohol, zentrifugieren, trocknen und bei -20°C aufbewahren.- Reprecipitate with alcohol, centrifuge, dry and at -20 ° C store.
Der Nachteil dieses bisher in der klinischen Diagnostik angewandten Verfahrens besteht darin, daß generell 5-10 ml EDTA-Blut des Patienten (immer Venenblut!) innerhalb von 48 Std. kühl gelagert in das genetische Labor transportiert werden müssen.The disadvantage of this so far in clinical diagnostics applied method is that generally 5-10 ml EDTA blood of the patient (always venous blood!) Within 48 Hours stored in a cool place in the genetic laboratory have to.
Das erfordert gewöhnlich einen Express-Probentransport bevorzugt auf Eis, dem sich die 2 tägige DNS-Isolierung anschließt. Der eigentliche Gentest mit der PCR beginnt also erst etwa 4 Tage nach Blutabnahme in der Arztpraxis. Das bedeutet, daß beispielsweise die Diagnose für den Gentest Mukoviszidose frühestens nach 14 Arbeitstagen gestellt werden kann. Schickt der Arzt das Blut nicht sofort nach Entnahme per Express ein, so gerinnt das Blut häufig, wodurch eine ordentliche DNS-Isolierung unmöglich wird.This usually requires express sample transportation preferably on ice, which is the 2 day DNA isolation connects. So the actual genetic test with the PCR begins only about 4 days after taking blood in the doctor's office. The means that, for example, the diagnosis for the genetic test Cystic fibrosis can be made after 14 working days at the earliest can. The doctor does not send the blood immediately after taking it Express, the blood often clots, causing a proper DNS isolation becomes impossible.
Von der Firma Fitzco, Inc., Maple Plain, MN, USA ist ein FTA® Gene Guard System für Blutproben zur DNA-Analyse mittels PCR bekannt, das ein komplexes System für die Kollektion, den Transport, die Lagerung und Reinigung von DNA darstellt. Es umfaßt ein Reinigungsreagenz, einen Kollektions- und Reinigungskit sowie eine Stanze. Dieses System ist jedoch relativ teuer, da es für jeden Patienten dieses speziell kostenaufwendig vorbehandelten Trägers bedarf.An FTA® is from Fitzco, Inc., Maple Plain, MN, USA Gene Guard System for blood samples for DNA analysis using PCR known that a complex system for the collection, the Transport that represents storage and purification of DNA. It includes a cleaning reagent, a collection and Cleaning kit and a punch. However, this system is relatively expensive as it is specific to each patient expensive pretreated carrier is required.
Die Erfindung hat deshalb das Ziel, den Gentest für die medizinische Diagnostik zu verbessern. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, ein schnelles, unkompliziertes und kostensparendes Verfahren zur Erfassung von Blutproben durch den Hausarzt und selbstversorgenden Patienten und ihrer Weiterverarbeitung zu entwickeln. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Mittel zum Transport und zur Lagerung von Blutproben bereitzustellen.The invention therefore has the aim of carrying out the genetic test for improve medical diagnostics. You have the task the basis, a fast, uncomplicated and cost-saving Procedure for collecting blood samples by the family doctor and self-sufficient patients and their further processing develop. Another object of the invention is a means of transporting and storing blood samples to provide.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.The invention is implemented according to the claims.
Das Verfahren zur DNS-Analytik im Blut beruht auf der überraschenden Erkenntnis, daß eine vorhandene Blutmenge 0,05 ml Blut pro cm² eines Flächenträgers nicht übersteigen darf, da ansonsten die PCR gehemmt wird. Dies ist darauf zurückzuführen, daß Blutproteine, wie z. B. Hämoglobin, Metallionen wie Fe oder Zn tragen, welche die PCR hemmen.The procedure for DNA analysis in the blood is based on the surprising finding that an existing amount of blood 0.05 ml Blood per cm² of a surface area must not exceed, because otherwise the PCR is inhibited. This is due to, that blood proteins, such as. B. hemoglobin, metal ions such as Fe or Wear Zn which inhibit the PCR.
Erfindungsgemäß wird das zu untersuchende Blut zum Transport bzw. zur Lagerung auf einen saugfähigen, porösen Flächenträger aufgebracht, dieser Flächenträger wird zur Analyse mit Wasser inkubiert und die erhaltene Blutzellsuspension wird konzentriert. Das geschieht vorzugsweise durch schnelle Zentrifugation, besonders bevorzugt für 3 Minuten bei 14.000×g. Man erhält einen festen Pellet, der weiter verarbeitet wird; der Überstand wird zu über 90% verworfen.According to the invention, the blood to be examined is used for transport or for storage on an absorbent, porous surface support applied, this surface carrier is used for analysis with water incubated and the blood cell suspension obtained concentrated. This is preferably done by fast Centrifugation, particularly preferably for 3 minutes at 14,000 × g. A solid pellet is obtained which is processed further; over 90% of the supernatant is discarded.
Anschließend versetzt man den Pellet mit einem chelierenden Agens und erhitzt bis zu 100°C. In einer bevorzugten Ausführungsvariante erfolgt dieses Erhitzen in zwei Etappen; in einem ersten Schritt auf 50 bis 60°C und anschließend auf 100 °C. Erfindungsgemäß kann das Erhitzen auch sofort auf 100°C erfolgen. Überraschend bewirkt erst dieses Erhitzen auf 100°C nach der Chelexchromatographie eine optimale DNS-Ausbeute für die nachfolgende PCR.The pellet is then mixed with a chelating agent Agent and heated up to 100 ° C. In a preferred one This heating is carried out in two stages; in a first step to 50 to 60 ° C and then to 100 ° C. According to the invention, the heating can also be carried out immediately to 100.degree respectively. Surprisingly, this heating to 100 ° C is the only effect after chelex chromatography an optimal DNA yield for the subsequent PCR.
Danach wird wiederum zentrifugiert und die als Überstand erhaltene DNS-Lösung wird, ggf. nach weiterer Lagerung bei -20° C, in an sich üblicher Weise analysiert.Then it is centrifuged again and the supernatant DNA solution obtained is, if necessary after further storage at -20 ° C, analyzed in a conventional manner.
Die wesentliche Funktion des chelierenden Agens besteht darin, daß polyvalente Metallionen gebunden werden und die DNS bei der Temperaturbehandlung geschützt wird. Die spätere PCR-Behandlung wird dadurch optimiert. Gemäß der Erfindung kann jedes handelsübliche chelierende Agens eingesetzt werden.The essential function of the chelating agent is that polyvalent metal ions are bound and the DNA in the Temperature treatment is protected. The later PCR treatment is thereby optimized. According to the invention, any commercial chelating agent can be used.
Als Flächenträger werden Papier, Zellulose, Kunststoffolien, Baumwolle oder Leinen verwendet. Bevorzugt ist der Einsatz von Filterpapier, speziell von Filterpapier, wie es in der klinischen Routinediagnostik, z. B. als Guthriepapier, Verwendung findet. Ebenfalls bevorzugt ist Whatman-Blotting- Papier, wie es bei Southern, Northern und analogen Techniken gebraucht wird.Paper, cellulose, plastic films, Cotton or linen used. The use of is preferred Filter paper, especially filter paper as it is in the clinical routine diagnostics, e.g. B. as Guthrie paper, Is used. Whatman blotting is also preferred. Paper like Southern, Northern and analog techniques is needed.
Dieses Papier ist zweckmäßigerweise in Form einer Karte ausgebildet, welche mehrere kreisförmige Felder zur Aufnahme der Blutproben aufweist, eine Anweisung zum Gebrauch der Karte sowie Felder für Angaben zum Patienten, zum behandelnden Arzt und zum Datum enthält (Abb. 1).This paper is expediently designed in the form of a card which has several circular fields for taking the blood samples, contains instructions for using the card and fields for information on the patient, the doctor treating the patient and the date ( Fig. 1).
Das als Flächenträger eingesetzte Filterpapier weist bevorzugt eine Aufnahmefähigkeit von 0,03-0,05 ml Blut/cm² auf.The filter paper used as a surface support preferably has an absorption capacity of 0.03-0.05 ml blood / cm².
Gegenstand der Erfindung ist auch das Mittel zum Transport bzw. zur Lagerung von Blut für die DNS-Analyse, umfassend saugfähige, poröse Flächenträger wie Papier, Zellulose, Kunststoffolie, Baumwolle oder Leinen. The invention also relates to the means for transport or for storing blood for DNA analysis, comprising absorbent, porous surface supports such as paper, cellulose, Plastic film, cotton or linen.
Das bevorzugte Mittel ist Filterpapier, speziell Filterpapier mit einer Aufnahmefähigkeit von 0,03-0,05 ml Blut/cm².The preferred medium is filter paper, especially filter paper with an absorption capacity of 0.03-0.05 ml blood / cm².
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung von auf einem saugfähigen, porösen Flächenträger aufgebrachtem Blut zur DNS-Analytik, bevorzugt von papiergetrocknetem Blut.The invention also relates to the use of an absorbent, porous surface carrier applied blood DNA analysis, preferably of paper-dried blood.
Das neue erfindungsgemäße Verfahren bietet folgende Vorteile gegenüber dem üblichen Verfahren zur DNS-Gewinnung aus frischem Vollblut:The new method according to the invention offers the following advantages compared to the usual method for DNA extraction from fresh Whole blood:
- 1. Die Patientenproben können per Normalpost im Briefumschlag als papiergetrocknete Blutspots für den Gentest eingesandt werden. Expresszustellung und Probenkühlung entfallen. Der Gentest kann also überregional angeboten werden1. The patient samples can be sent in normal envelopes sent in as paper-dried blood spots for the genetic test will. Express delivery and sample cooling are no longer necessary. Of the Genetic testing can therefore be offered nationwide
- 2. Venenblut ist nicht mehr erforderlich. Der Patient kann selbst Fingerblut einsenden.2. Vein blood is no longer required. The patient can send in finger blood yourself.
- 3. Die nicht verwendeten Blutspots auf den vorgezeichneten Papierkreisen können für archivarische Zwecke aufbewahrt werden.3. The unused blood spots on the mapped ones Paper circles can be kept for archival purposes will.
- 4. Der DNS-Extrakt kann innerhalb von 2 Stunden gewonnen werden und ist direkt einsetzbar für die PCR.4. The DNA extract can be obtained within 2 hours and can be used directly for PCR.
- 5. Die Erstellung einer Gentestdiagnose (Mutations- und Deletionsscreening) verkürzt sich von ca. 14 Tagen mit Beginn der Blutabnahme in der Arztpraxis bei konventionellem Vollblut auf ca. 7 Tage bei papiergetrocknetem Blut, d. h. um fast die Hälfte.5. The creation of a genetic test diagnosis (mutation and Deletion screening) is shortened from about 14 days at the beginning blood draw in the doctor's office for conventional whole blood to about 7 days for paper-dried blood, d. H. to almost that Half.
Im Vergleich zu anderen Trägern (Firma Fitzco) ist eine kostenaufwendige Vorbehandlung des erfindungsgemäßen Trägers nicht erforderlich. Überraschend ist das Verfahren ohne spezielle und teure Reagenzien (Puffersysteme) für die Papierbehandlung bzw. Blutextraktion durchführbar. Desweiteren sind keine speziellen Stanzen zur Entfernung der Blutspots und auch keine speziellen PCR-Röhrchen vonnöten, wodurch der Preis einer DNS-Isolierung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren um mehr als das 10-fache gesenkt werden kann (DNS-Isolierung nach Fitzco, Inc.: pro Patient ca. 3 Dollar, DNS-Isolierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ca. 0,20 DM/Patient). Das bedeutet darüber hinaus, daß das erfindungsgemäße Verfahren in jedem Labor für die jeweilige PCR eingesetzt werden kann.Compared to other carriers (company Fitzco) is one costly pretreatment of the carrier according to the invention not mandatory. The process is surprising without special and expensive reagents (buffer systems) for the Paper treatment or blood extraction can be carried out. Furthermore are not special punches for removing the blood spots and also no special PCR tubes are required, which reduces the price a DNA isolation according to the inventive method more than 10 times lower (DNA isolation after Fitzco, Inc .: Approximately $ 3 per patient, DNA isolation after inventive method about 0.20 DM / patient). That means in addition, that the inventive method in each Laboratory for the respective PCR can be used.
Mit der Erfindung wird also ein einfaches, schnelles und sicheres Verfahren zur Herstellung eines DNS-Extraktes aus papiergetrocknetem Blut für die Durchführung von Gentests zur Verfügung gestellt. Auch kritische Mengen DNA können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen werden. Da kein spezieller Probentransport erforderlich ist und die Diagnose in ca. 7 Tagen nach Blutentnahme in der Arztpraxis gestellt werden kann, ist eine wesentliche Voraussetzung gegeben, um den erfindungsgemäßen Gentest insbesondere der niedergelassenen Ärzteschaft anbieten zu können, in deren Händen die Verantwortung für Früherkennung und Vorsorge liegt. Der erste Schritt, die Blutprobenbereitstellung für den Gentest durch den "Hausarzt", ist unkompliziert, sicher, schnell und preiswert, und kann selbst vom Patienten zu Hause durchgeführt werden.With the invention is a simple, fast and safe process for the production of a DNA extract paper dried blood for genetic testing Provided. Critical amounts of DNA can also be used with the method according to the invention can be obtained. Since not a special one Sample transport is required and the diagnosis in approx. 7 Days after taking blood in the doctor's office, is an essential prerequisite for the Genetic test according to the invention, in particular of the established To be able to offer the medical profession, in whose hands the Responsibility for early detection and prevention lies. The first Step, the blood sample provision for the genetic test by the "General Practitioner" is uncomplicated, safe, quick and inexpensive, and can be performed at home by the patient.
Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.The invention is intended to be described below using an exemplary embodiment are explained in more detail.
Einfaches Filterpapier wird mit Kreisen eines Durchmessers von 1 cm versehen. Die Kreise werden mit je ca. 0,04 ml Blut, das beliebig aus Finger, Vene, Ferse oder Ohr entnommen werden kann, benetzt. Venenblut ist nicht erforderlich. Das Papier muß so beschaffen sein, daß es etwa 0,03-0,05 ml Blut per cm² aufsaugen kann. Aus dem Blutspot werden 3-4 mm Papierstreifen ausgeschnitten und in ein kleines Eppendorfröhrchen gelegt (für Vergleichszwecke können 3-10 Mikroliter frisches Vollblut direkt in ein Eppendorfröhrchen pipettiert werden). Dann wird 1 ml Wasser zugegeben und bei leichtem Schwenken des Röhrchens auf einer Wippe 20 min inkubiert. Anschließend werden die Blutzellen für 3 min bei 14.000×g zentrifugiert. Der Überstand wird bis auf 20-30 Mikroliter verworfen. Zum Niederschlag werden 0,18 ml 5% Chelex 100 der Firma Bio-Rad, Richmond, USA, (BioTechniques: Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR based typing from forensic material 513, 506 (1991)) bis auf ein Gesamtvolumen von 0,2 ml unter Schütteln zugegeben. Anschließend wird bei 56°C für 20 min auf einem Vortex-Schüttler, danach bei 100°C für 8 min geschüttelt. Die Suspension wird dann bei 14.000×g für 3 min zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig abgenommen und bei -20°C aufbewahrt. Direkt aus dieser Lösung werden in den PCR Ansatz 1-15 Mikroliter per 25 Mikroliter Ansatzvolumen pipettiert. Zum Vergleich wurde das Verfahren, wie oben ausgeführt, mit 3-10 Mikroliter Vollblut durchgeführt. Für Vergleichszwecke wurden ein Mutationsscreening für Mukoviszidose, ein Deletionsscreening für Muskeldystrophie Typ Duchenne/Becker und ein Mutationsscreening für Familiäre Hypercholesterinämie parallel mit papiergetrocknetem bzw. mit Vollblut aus Probanden durchgeführt. Die Ergebnisse sind identisch.Simple filter paper is made with circles of a diameter of 1 cm. The circles are filled with approx. 0.04 ml of blood each can be removed from your finger, vein, heel or ear can, wetted. Venous blood is not required. The paper has to be such that there is approximately 0.03-0.05 ml of blood per cm² can soak up. The blood spot becomes 3-4 mm strips of paper cut out and placed in a small Eppendor tube (for For comparison purposes, 3-10 microliters of fresh whole blood be pipetted directly into an Eppendor tube). Then 1 ml of water are added and the tube is gently swirled incubated on a seesaw for 20 min. Then the Centrifuge blood cells for 3 min at 14,000 x g. Of the Supernatant is discarded to 20-30 microliters. To the Precipitation is 0.18 ml of 5% Chelex 100 from Bio-Rad, Richmond, USA, (BioTechniques: Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR based typing from forensic material 513, 506 (1991)) up to a total volume of 0.2 ml Added shaking. Then it is at 56 ° C for 20 min a vortex shaker, then at 100 ° C for 8 min shaken. The suspension is then at 14,000 x g for 3 min centrifuged. The supernatant is carefully removed and at Store at -20 ° C. Directly from this solution are in the PCR Batch 1-15 microliters per 25 microliter batch volume pipetted. For comparison, the procedure was as above performed with 3-10 microliters of whole blood. For For comparison purposes, a mutation screening for Cystic fibrosis, a deletion screening for muscular dystrophy type Duchenne / Becker and a mutation screening for families Hypercholesterolemia in parallel with paper-dried or with Whole blood performed from subjects. The results are identical.
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11572581B2 (en) | 2002-06-07 | 2023-02-07 | DNA Genotek, Inc. | Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum |
| US11002646B2 (en) | 2011-06-19 | 2021-05-11 | DNA Genotek, Inc. | Devices, solutions and methods for sample collection |
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