DE19703734A1 - Anordnung und Verfahren zur nicht-invasiven Bestimmung und/oder Erzeugung funktioneller und/oder morphologischer Eigenschaften von Zellen des Auges im lebenden Organismus - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Anordnung und ein Verfahren zur nicht-invasiven Bestimmung und/oder Erzeugung funktioneller und/oder morphologischer Eigenschaften von Zellen des Auges im lebenden Organismus, vorzugsweise von Nervenzellen der Netzhaut auch kleiner Säugetiere. Die Erfindung ist insbesondere auch für die Untersuchung, Therapie und/oder selektive Modifizierung fluoreszensmarkierter Zellen des Auges oder entsprechender Transplantate verwendbar. Weitere bevorzugte Einsatzgebiete der Erfindung sind z. B. tierexperimentelle Untersuchungen oder auch nicht-diagnostisch bzw. nicht-therapeutisch indizierte Untersuchungsmaßnahmen an den genannten Zellen, z. B. im Zusammenhang mit Tauglichkeitsfeststellungen oder der Analyse pharmakologischer Effekte von Wirkstoffen auf diese Zellen.

Zur Bestimmung funktioneller und/oder morphologischer Eigenschaften von z. B. fluoreszensmarkierten Ganglienzellen der Netzhaut ist es üblich, ein Flachpräparat der Retina herzustellen und mit bekannten mikroskopischen Techniken zu untersuchen. Dieses Verfahren ist für Langzeitstudien an Ganglienzellen der Netzhaut eines bestimmten Individuums ungeeignet.

Zur Untersuchung des Auges sind ophthalmologische Geräte bekannt, in denen Anordnungen auf der Basis des konfokalen Laser-Scanning-Prinzips verwendet werden. Bei derartigen Geräten (z. B. DE 34 22 144 oder WO 9000025) wird der Untersuchungsbereich in einem Zeilen- und Spaltenraster zeitsequentiell mit Laser-Licht abgetastet, das auf einen Brennfleck-Querschnitt von z. B. 500 nm Durchmesser fokussierbar ist. Zur Fokussierung dient ein Objektiv, das das Abtastlicht mit einer geringen, der Schichtdicke des Untersuchungsbereiches entsprechenden Schärfentiefe fokussiert. Das an den abgetasteten Objektflächen reflektierte Licht durchläuft in Richtung auf die Lichtquelle einen Teil des Beleuchtungs-Strahlenganges, wo es mittels eines Strahlteilers ausgekoppelt und einer Detektor-Anordnung für die Intensitätsmessung zugeführt wird. In konfokaler Anordnung mit der Brennebene des Objektivs ist zwischen der Strahlenteiler- Einrichtung und der Detektor-Anordnung eine Lochblende vorgesehen, durch die nur solches Licht hindurchtreten kann, das aus dem Schärfentiefenbereich des Objektivs stammt. Ausführungsformen derartiger Geräte sind z. B. als Laser-Ophthalmoskop (DE 84 18 069), konfokales Rasterophthalmoskop (EP424947) oder als Spaltlampenmikroskop in Kombination mit einer konfokalen Abtasteinrichtung (DE 195 41 477) bekannt. Spaltlampenmikroskope und auch die in der DE 84 18 069 beschriebene Anordnung werden im allgemeinen nur für Beobachtungen im Bereich der vorderen Augenabschnitte (Cornea, Vorderkammer und Augenlinse) eingesetzt, während das Rasterophthalmoskop (EP424947) der Untersuchung des Augenhintergrundes dient. Für die Anpassung des Rasterophthalmoskop gemäß EP424947 an das optische System des zu untersuchenden Auges dient je eine in den Beleuchtungs- und in den Beobachtungsstrahlengang dieses Gerätes integrierte optische Einrichtung. Diese beiden Zusatzeinrichtungen erhöhen den apparativen Aufwand und erschweren bzw. verhindern die Anpassung derartiger Geräte an die Untersuchung des Augenhintergrundes von Probanden, die unterschiedlichen Säugerarten angehören.

Z.B. aus der DE 44 22 071, die eine Anordnung zur Bestimmung der Netzhaut-Blutströmungs­ geschwindigkeit betrifft, ist es auch bekannt, den Beleuchtungs- und Beobachtungsstrahlengang mittels einer Kontaktlinse an das vom Auge gebildete optische System anzupassen, insbesondere um die Hornhautbrechkraft zu kompensieren. Eine individuell abgestimmte Anpassung setzt bei diese- Lösung jedoch das Vorhandensein einer sehr umfangreichen Palette von Kontaktlinsen voraus.

Zur Beobachtung der Netzhaut sind auch optische Anordnungen vom Typ der Funduskamera bekannt, die in vorwählbaren Spektralbereichen arbeiten, um z. B. Untersuchungen mit fluoreszenzmarkierten Blutgefäßen durchführen zu können (DE 43 26 716).

Um durch Atem- und Pulsbewegungen bedingte Bewegungsunschärfen bei der konfokalen Abbildung von Hornhautstrukturen des menschlichen Auges zu vermeiden, kann eine Anordnung gemäß DE 296 12 466 eingesetzt werden. Bei dieser Anordnung vom Typ eines Lichtspalt- oder konfokalen Biomikroskopes wird die Hornhaut des zu untersuchenden Auges mittels einer raumfesten Niedervakuum-Saugschale lagefixiert. Die Saugschale weist im Bereich des Beleuchtungs- und Beobachtungsstrahlenganges eine Öffnung auf. Zusätzlich ist der Abstand zwischen dieser Öffnung und dem Teil des Abbildungssystems, das dem zu untersuchenden Auge zugewandt ist, mittels eines Mikrometerantriebs einstellbar. Aus Fig. 1 der DE 296 12 466 ergibt sich, daß der Raumbereich zwischen der Frontlinse des Fokussierungsobjektivs und der Hornhaut mit einem sogenannten optischen Kontaktmittel ausgefüllt ist. Für größere Arbeitsabstände, wie sie z. B. für die Beobachtung des Augenhintergrundes benötigt werden, ist dies nicht realisierbar. Die Anordnung gemäß DE 296 12 466 ist nicht für die Beobachtung des Augenhintergrundes vorgesehen und weist daher auch keine Möglichkeit zur Kompensation der Brechkraft von Hornhaut und Linse auf.

Insgesamt zeigt sich, daß bei Untersuchungen am Auge bisher keine Verfahren mit einem Darstellungsvermögen in der Größenordnung einzelner Zellen, vor allem Nervenzellen der Netzhaut eingesetzt wurden. Daraus ergibt sich die Aufgabe, eine den optischen Eigenschaften des zu untersuchenden bzw. zu bestrahlenden Objekts leicht anpaßbare Anordnung und ein zugehöriges Verfahren zu schaffen, um die nicht-invasive Bestimmung und/oder Erzeugung funktioneller und/oder morphologischer Eigenschaften von Zellen des Auges im lebenden Organismus zu ermöglichen. Da die Erfindung insbesondere auch im tierexperimentellen Bereich verwendbar sein soll, besteht eine spezielle Teilaufgabe darin, unerwünschte Einflüsse infolge Eigenbewegung des zu untersuchenden bzw. zu bestrahlenden Objekts mindestens teilweise auszuschalten und die Identifizierung funktioneller und/oder morphologischer Eigenschaften der Zellen zu verbessern.

Diese Aufgabe wird mit einer Anordnung gemäß Anspruch 1 und einem Verfahren gemäß Anspruch 11 gelöst. Die Verwendung im tierexperimentellen Einsatz wird durch eine spezielle, das Untersuchungsobjekt fixierende und in der optischen Achse der Anordnung ausrichtende Halterung gelöst. Die verwendete Kontaktlinse mit negativer Brechkraft erfüllt mehrere Funktionen. Sie verlagert bei einer Beleuchtungs- oder Bestrahlungseinheit mit einem ansonsten zu kurzbrennweitigen Objektiv dessen Fokus in Richtung auf den Augenhintergrund. Die Kontaktlinse ermöglicht ferner in Kombination mit Immersionsflüssigkeiten unterschiedlicher Brechkraft, die in den Spalt zwischen Hornhaut und Kontaktlinse eingebracht sind, eine leichte Anpaßbarkeit der Untersuchungs-/Bestrahlungseinrichtung an die optischen Eigenschaften des Augen. Durch Wahl der Spaltbreite, insbesondere ihrer Änderung in Radialrichtung, kann zusätzlich eine Korrektur des Strahlverlaufs erfolgen, sofern dies nötig ist. Eine sehr wichtige Funktion der Kontaktlinse besteht darin, daß der Immersionsspalt eine nachhaltige Applizierung von Augenpharmaka ermöglicht und bei Immersionsflüssigkeiten mit geeigneter Viskosität infolge seiner Stoßdämpferfunktion den nachteiligen Einfluß von zumindest Mikrobewegungen reduziert.

In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung können sich die Spektralbereiche von Beleuchtungs-, Bestrahlungs- und Abbildungslicht teilweise oder vollständig unterscheiden.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist ein Bildspeicher zur pixelweisen Speicherung des Bildes der Zellen vorgesehen. Der Inhalt des Bildspeichers kann ausgelesen und einer Einrichtung zur elektronischen Filterung bzw. Bildverarbeitung zugeführt werden.

Weitere vorteilhafte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Anordnung und des Verfahrens, mit denen insbesondere unerwünschte Einflüsse infolge Eigenbewegung des zu untersuchenden bzw. zu bestrahlenden Objekts mindestens teilweise ausgeschaltet und die Identifizierung funktioneller und/oder morphologischer Eigenschaften der Zellen verbessert werden können, sowie deren Vorteile ergeben sich unmittelbar aus den Ansprüchen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbeispielen näher erläutert. In der zugehörigen Zeichnung ist in Fig. 1 eine Anordnung gemäß der Erfindung sowie der Verlauf des Beobachtungsstrahlenganges für den Fall einer tierexperementellen Untersuchung an retinalen Ganglienzellen des Rattenauges 1 schematisch dargestellt.

Die retinalen Ganglienzellen werden durch retrograde Injektion fluoreszierender Latexbeads in den Colicus superior bzw. durch direkte Applikation des Fluoreszenzmarkers 4Di-Asp auf den durchtrennten Nervus opticus markiert. Zur Positionierung und Fixierung des Rattenauges relativ zur Beobachtungsoptik wurde ein Tier narkotisiert und sein Kopfbereich mittels nicht­ traumatischer Kopfhalter auf einem Auflicht-Mikroskoptisch mit Feinpositionier-Einrichtungen fixiert. Kopfhalter und Mikroskoptisch sind in Fig. 1 nicht dargestellt. Um die Iris offenzuhalten, wurden relaxierende Augentropfen eingesetzt. Die Hornhaut wurde mittels Ophthalmoskopie-Gel vor Austrocknung und Irritationen geschützt und zusätzlich mit der bikonkaven Kontaktlinse 2 abgedeckt. Infolge der negativen Brechkraft der Kontaktlinse 2 wird der Fokus des hochauflösenden Objektivs 3 von der gestrichelt dargestellten Position in der vorderen Augenkammer in Richtung auf die Retina verlagert. Der Deflektor 4, die Konfokalblende 5 und der Photodetektor 6 sind Komponenten eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopes. Die Signale des Photodetektors 6 werden von einer Rechnereinheit 7 ausgewertet und mittels des Monitors 8 visualisiert.

Claims (13)

1. Anordnung zur nicht-invasiven Bestimmung und/oder Erzeugung funktioneller und/oder morphologischer Eigenschaften von Zellen des Auges im lebenden Organismus, auch in einem Transplantat, mit

• - mindestens einer optischen Einheit vom Typ eines Mikroskops mit zusätzlicher konfokaler Scanningeinheit zur Beleuchtung und Beobachtung bzw. Abbildung dieser Zellen
• - und/oder mindestens einer optischen Einheit zur Bestrahlung der Zellen, wobei in die Zellen Substanzen zur strukturellen und/oder funktionellen Zellmarkierung wie Fluoreszensmarker u. dgl. oder im Spektralbereich des Beleuchtungs- und/oder Bestrahlungsstrahles optisch aktivierbare Pharmaka appliziert sind,
• - einer Justier- und Fixiervorrichtung für das Beobachtungsobjekt,
• - einer Kontaktlinse (2) mit negativer Brechkraft, die auf der Hornhaut des Auges (1) aufliegt oder spaltbreit von ihr beabstandet ist, wobei dieser Spalt mindestens teilweise mit einer Immersionsflüssigkeit mit vorgebbarem Brechungsindex und vorgebbarer Viskosität ausgefüllt ist, die Augenpharmaka wie relaxierende Augentropfen und/oder Ophthalmoskopie-Gel enthält.

2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel zur Justierung und Fixierung der Augenposition vorgesehen sind.

3. Anordnung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,daß die Breite des vorgenannten Spaltes von der Achse der Kontaktlinse (2) aus radial zu- oder abnimmt.

4. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Spektralbereiche von Beleuchtungs-, Abbildungs- und Bestrahlungslicht teilweise oder vollständig unterscheiden.

5. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Bildspeicher zur pixelweisen Speicherung des Zellbildes vorgesehen ist.

6. Anordnung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhalt des Bildspeichers ausgelesen und einer Einrichtung zur elektronischen Filterung bzw. Bildverarbeitung zugeführt wird.

7. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kraft- und/oder Positionsmeßgeber zur Bestimmung der vom Auge (1) auf die Kontaktlinse (2) oder eine andere Kontaktfläche ausgeübten Kraft und/oder zur Bestimmung der Augenposition vorgesehen ist.

8. Anordnung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Kraft- und/oder Positionsmeßgeber-Signale zeitsynchron zur Fokus-Position des Beleuchtungs- und/oder Bestrahlungsstrahles im Beobachtungsgebiet aufgezeichnet werden.

9. Anordnung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Kraft- und/oder Positionsmeßgeber-Signale einer Auswertungs- und Steuereinheit zugeführt werden, die bei Abweichung dieser Signale von vorgebbaren Verläufen oder bei Überschreiten vorgebbarer Grenzwerte Mittel zur mindestens teilweisen Intensitätsreduzierung des Beleuchtungs-, Abbildungs- und/oder Bestrahlungsstrahles ansteuert.

10. Anordnung nach Anspruch 7 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einrichtung zur Speicherung derjenigen Fokus-Positionen des Beleuchtungs- und/oder Bestrahlungsstrahles vorgesehen ist, bei denen eine Intensitätsreduzierung erfolgte, sowie Mittel vorgesehen sind, um bei nachfolgenden Abtastzyklen des Beleuchtungs- und/oder Bestrahlungsstrahles die Intensität des Beleuchtungs-, Abbildungs- und/oder Bestrahlungsstrahles

• a) an anderen als den gespeicherten Orten mindestens teilweise zu reduzieren oder
• b) an den gespeicherten Orten mindestens teilweise zu erhöhen.

11. Verfahren zur nicht-invasiven Bestimmung und/oder Erzeugung funktioneller und/oder morphologischer Eigenschaften von Zellen des Auges im lebenden Organismus, auch in einem Transplantat, mittels einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei vor Verwendung der Anordnung in die Zellen Substanzen zur strukturellen und/oder funktionellen Zellmarkierung oder im Spektralbereich des Beleuchtungs- und/oder Bestrahlungsstrahles optisch aktivierbare Pharmaka appliziert werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als zellfunktionsabhängige Marker Ca2+-Marker verwendet werden.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als zellfunktionsabhängige Marker Zelltodmarker verwendet werden.