DE19655440B4

DE19655440B4 - Fixing of bearing bolt in valve rocker levers - involves annealing bolt ends to obtain their spreadability

Info

Publication number: DE19655440B4
Application number: DE1996155440
Authority: DE
Inventors: Albrecht Gröner
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH
Current assignee: GSK Vaccines GmbH
Priority date: 1996-04-01
Filing date: 1996-04-01
Publication date: 2013-09-05
Anticipated expiration: 2016-04-02

Abstract

The method concerns fixing of a bearing bolt (4) in a bore (7) in a housing, in particular, a valve rocker lever (1) produced by casting or deep drawing. To produce a required material and/or form-based joint with the bore, the bolt is spreadable at least at one end (8). The bolt is through-hardened. Prior to a spreading operation, the bolt and/or the bore at the ends (8, 10) are subjected to annealing at a temperature below the point at which pearlite transformation into austenite begins during heating. The bolt is fixed by material displacement in the direction of the housing and/or the bolt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur bei erniedrigten Temperaturen.The present invention relates to methods for propagating influenza viruses in cell culture at reduced temperatures.

Alle Influenza-Impfstoffe, die seit den 40er Jahren bis heute als zugelassene Impfstoffe zur Behandlung von Mensch und Tier angewandt werden, bestehen aus einem oder mehreren Virusstämmen, die in embzyonierten Hühnereiern vermehrt worden waren. Diese Viren werden aus der Allantoisflüssigkeit infizierter Hühnereier isoliert und deren Antigene entweder als intakte Viruspartikel oder als durch Detergentien und/oder Lösungsmittel desintegrierte Viruspartikel – sog. Spaltimpfstoff- oder als isolierte, definierte Virusproteine – sog. Subunit-Impfstoff – als Impfstoff angewandt. In allen zugelassenen Impfstoffen sind die Viren durch den Fachmann bekannte Verfahren inaktiviert. Auch die Vermehrung lebend attenuierte Viren, die in Versuchsvaccinen erprobt werden, erfolgt in embzyonierten Hühnereiern.All influenza vaccines that have been used as approved human and animal vaccines since the 1940s to date consist of one or more virus strains that have been propagated in embycomed chicken eggs. These viruses are isolated from the allantoic fluid of infected chicken eggs and their antigens either as intact virus particles or as by detergents and / or solvent disintegrated virus particles - so-called. Split vaccine or isolated, defined viral proteins - so-called. Subunit vaccine - used as a vaccine. In all approved vaccines, the viruses are inactivated by methods known to those skilled in the art. The multiplication of live attenuated viruses, which are being tested in experimental vaccines, takes place in embycomed chicken eggs.

Die Benutzung embryonierter Hühnereier zur Impfstoff-Produktion ist zeit-, arbeits- und kostenintensiv. Die Eier – aus tierärztlich überwachten, gesunden Hühnerherden – müssen vor der Infektion bebrütet werden, üblicherweise 12 Tage. Vor der Infektion müssen die Eier hinsichtlich lebender Embryonen selektiert werden, da nur diese Eier zur Virusvermehrung geeignet sind. Nach der Infektion werden die Eier erneut bebrütet, üblicherweise 2 bis 3 Tage. Die zu diesem Zeitpunkt noch lebenden Embryonen werden in der Kälte abgetötet und die Allantoisflüssigkeit wird dann durch Absaugen aus den einzelnen Eiern gewonnen. Durch aufwendige Reinigungsverfahren werden Substanzen aus dem Hühnerei, die zu unerwünschten Nebenwirkungen des Impfstoffes führen, von den Viren getrennt, und die Viren konzentriert. Da Eier nicht steril (pathogenfrei) sind, ist es außerdem erforderlich, Pyrogene und alle eventuell vorhandenen Pathogene zu entfernen und/oder zu inaktivieren. Zur Erhöhung der Virusausbeute wird die Vermehrung der Influenzaviren in Hühnereiern in der Regel bei erniedrigten Temperaturen durchgeführt (ca. 34°C), Auch Viren, die respiratorische Erkrankungen hervorrufen, können in Zellkultur vermehrt werden. Auch hierbei werden zum Teil erniedrigte Temperaturen verwendet (ca. 33°C), die jedoch keinen Einfluß auf die Qualität eines gegebenenfalls erhältlichen Impfstoffs haben, sondern lediglich die Vermehrung begünstigen.The use of embryonated chicken eggs for vaccine production is time, labor and cost intensive. The eggs - from veterinarily supervised, healthy chicken herds - must be incubated before the infection, usually 12 days. Before infection, the eggs must be selected for live embryos, as only these eggs are suitable for virus replication. After infection, the eggs are incubated again, usually 2 to 3 days. The embryos still alive at this time are killed in the cold and the allantoic fluid is then extracted by suction from the individual eggs. Through elaborate cleaning procedures substances from the hen's egg, which lead to unwanted side effects of the vaccine, separated from the virus, and concentrated the virus. Since eggs are not sterile (pathogen-free), it is also necessary to remove and / or inactivate pyrogens and any pathogens that may be present. To increase the virus yield, the multiplication of the influenza viruses in chicken eggs is usually carried out at reduced temperatures (about 34 ° C.). Also, viruses which cause respiratory diseases can be propagated in cell culture. Here, too, partly lowered temperatures are used (about 33 ° C), which, however, have no influence on the quality of an optionally available vaccine, but only favor the propagation.

Viren anderer Impfstoffe wie z. B. Tollwutviren, Mumps-, Masern-, Röteln-Viren, Polioviren und FSME-Viren können in Zellkultuxen vermehrt werden. Da Zellkulturen, ausgehend von geprüften Zellbänken, pathogenfrei sind und im Gegensatz zu Hühnereiern ein definiertes Virusvermehrungssystem darstellen, das (theoretisch) in beinahe unbegrenzter Menge zur Verfügung steht, ermöglichen sie unter Umständen auch im Fall von Influenzaviren eine wirtschaftliche Virusvermehrung. Eine wirtschaftliche Impfstoffproduktion wird eventuell auch dadurch erreicht, daß die Virus-Isolierung und -Reinigung aus einem definierten, sterilen Zellkulturmedium einfacher erscheint als aus der stark proteinhaltigen Allantoisflüssigkeit.Viruses of other vaccines such. Rabies viruses, mumps, measles, rubella viruses, polioviruses and TBE viruses can be propagated in cell cultures. Since cell cultures, based on tested cell banks, are pathogen-free and, in contrast to chicken eggs, represent a defined virus propagation system which (theoretically) is available in almost unlimited quantities, they may also make economic virus replication possible in the case of influenza viruses. Economical vaccine production may also be achieved by making virus isolation and purification easier from a defined, sterile cell culture medium than from the high protein allantoic fluid.

Die Isolierung und Vermehrung von Influenzaviren in Eiern führt zu einer Selektion bestimmter Phenotypen, von denen sich die Mehrzahl vom klinischen Isolat unterscheidet. Im Gegensatz dazu steht die Isolierung und Vermehrung der Viren in Zellkultur bei der keine passagenabhängige Selektion eintritt (Oxford, J. S. et al., J. Gen. Virology 72 (1991), 185–189; Robertson, J. S. et al., J. Gen. Virology 74 (1993) 2047–2051). Für einen wirksamen Impfstoff ist deshalb die Virusvermehrung in Zellkultur auch unter diesem Aspekt der in Eiern vorzuziehen.The isolation and multiplication of influenza viruses in eggs results in the selection of certain phenotypes, most of which differ from the clinical isolate. In contrast, the isolation and proliferation of viruses in cell culture does not involve passage-dependent selection (Oxford, JS et al., J. Gen. Virology 72 (1991), 185-189, Robertson, JS et al., J. Gen Virology 74 (1993) 2047-2051). Therefore, for an effective vaccine, viral replication in cell culture is preferable to eggs in this aspect as well.

Es ist bekannt, daß Influenzaviren sich in Zellkulturen vermehren lassen. Neben Hühnerembryozellen und Hamsterzellen (BHK21-F und HKCC) sind MDBK-Zellen, sowie insbesondere MDCK-Zellen als geeignete Zellen zur in vitro-Vermehrung von Influenzaviren beschrieben worden (Kilbourne, E. D., in: Influenza, Seiten 89–110, Plenum Medicak Book Company-New York und London, 1987). Voraussetzung für eine erfolgreiche Infektion ist die Zugabe von Proteasen zum Infektionsmedium, vorzugsweise Trypsin oder ähnliche Serinproteasen, da diese Proteasen extrazellulär das Vorläuferprotein des Hämagglutinin [HA₀] in das aktive Hämagglutinin [HA₁ und HA₂] spalten. Nur gespaltenes Hämagglutinin führt zur Adsorption der Influenzaviren an Zellen mit nachfolgender Virusaufnahme in die Zelle (Tobita, K. et al., Med. Microbiol. Immunol., 162 (1975), 9–14; Lazarowitz, S. G. & Choppin, P. W., Virology, 68 (1975) 440–454; Klenk, H.-D. et al., Virology 68 (1975) 426–439) und somit zu einem weiteren Vermehrungszyklus des Virus in der Zellkultur.It is known that influenza viruses can be propagated in cell cultures. In addition to chicken embryo cells and hamster cells (BHK21-F and HKCC), MDBK cells, and in particular MDCK cells have been described as suitable cells for the in vitro propagation of influenza viruses (Kilbourne, ED, in: Influenza, pages 89-110, Plenum Medicak Book Company-New York and London, 1987). Prerequisite for a successful infection is the addition of proteases to the infection medium, preferably trypsin or similar serine proteases, since these proteases extracellularly cleave the precursor protein of hemagglutinin [HA ₀ ] into the active hemagglutinin [HA ₁ and HA ₂ ]. Only cleaved hemagglutinin leads to the adsorption of the influenza viruses to cells with subsequent virus uptake into the cell (Tobita, K. et al., Med. Microbiol Immunol., 162 (1975), 9-14, Lazarowitz, SG & Choppin, PW, Virology , 68 (1975) 440-454; Klenk, H.-D. et al., Virology 68 (1975) 426-439) and thus to a further multiplication cycle of the virus in the cell culture.

Im Patent US 4 500 513 wurde die Vermehrung von Influenzaviren in Zellkulturen adhärent wachsender Zellen bei Temperaturen im Bereich von 34–37°C beschrieben.In the patent US 4,500,513 the proliferation of influenza viruses in cell cultures of adherently growing cells at temperatures in the range of 34-37 ° C has been described.

Nach Zellvermehrung wird das Nährmedium entfernt und frisches Nährmedium bei gleichzeitiger oder kurz darauf folgender Infektion der Zellen mit Influenzaviren zu den Zellen gegeben. Eine vorgegebene Zeit nach der Infektion wird Protease (z. B. Trypsin) zugesetzt, um eine optimale Virusvermehrung zu erhalten. Die Viren werden geerntet, gereinigt und zu inaktiviertem oder attenuiertem Impfstoff verarbeitet. Eine wirtschaftliche Influenzavirus-Vermehrung als Voraussetzung für eine Impfstoff-Produktion läßt sich mit der im genannten Patent beschriebenen Methodik jedoch nicht leisten, da der Medienwechsel, die nachfolgende Infektion sowie die später erfolgende Zugabe von Trypsin mehrmaliges Öffnen der einzelnen Zellkulturgefäße erfordert und somit sehr arbeitsintensiv ist. Ferner steigt die Gefahr einer Kontamination der Zellkultur durch unerwünschte Mikroorganismen und Viren mit jeder Manipulation der Kulturgefäße. Eine kostengünstigere Alternative stellt die Zellvermehrung in dem Fachmann bekannten Fermenter-Systemen dar, wobei die Zellen adhärent auf Microcarriern wachsen. Das für das Anwachsen der Zellen auf den Microcarriern erforderliche Serum (üblicherweise fötales Kälberserum) enthält jedoch Trypsin-Inhibitoren, so daß auch bei dieser Produktionsmethode ein Mediumwechsel auf serumfreies Medium notwendig ist, um die Spaltung des Influenzahämaglutinins durch Trypsin und damit eine ausreichend hohe Virusvermehrung zu erzielen. Somit erfordert auch diese Methodik mehrfaches Öffnen der Kulturgefäße und bringt so die erhöhte Gefahr der Kontamination mit sich.After cell proliferation, the nutrient medium is removed and fresh nutrient medium is added to the cells during simultaneous or subsequent infection of the cells with influenza viruses. A given time After infection, protease (eg, trypsin) is added to obtain optimal virus replication. The viruses are harvested, purified and processed into inactivated or attenuated vaccine. However, economic influenza virus replication as a prerequisite for vaccine production can not be afforded by the method described in the cited patent, since the change of media, the subsequent infection and the subsequent addition of trypsin require repeated opening of the individual cell culture vessels and is thus very labor-intensive , Furthermore, the risk of contamination of the cell culture by unwanted microorganisms and viruses increases with each manipulation of the culture vessels. A more cost-effective alternative is cell proliferation in fermenter systems known to those skilled in the art, which cells grow adherently on microcarriers. However, the required for the growth of cells on the microcarriers serum (usually fetal calf serum) contains trypsin inhibitors, so that even with this production method, a medium change to serum-free medium is necessary to the cleavage of Influenzahämaglutinins by trypsin and thus a sufficiently high virus replication achieve. Thus, this method also requires multiple opening of the culture vessels and thus brings with it the increased risk of contamination.

Im Stand der Technik wurden mehrere Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in MDCK-Zellen beschrieben (siehe Merten et al. 1996, Adv. Exp. Med. Biol., 397, 141–51; Portari Mancini & Yano 1993, Rev. Bioquim. Univ. S. Paulo, 29, 89–95; Kaverin et al. 1995, J. Virol., 69, 2700–2703; Boycott et al. 1994, Virology, 203, 313–319; Govorkova et al. 1995, J. Inf. Diseases, 172, 250–253; Tree et al. 2001, Vaccine, Vol. 19, 3444–3450; und Nakamura et al. 1980, J. Jpn. Assn. Infect. Dis., 54, 306–312). Ähnliche Verfahren werden auch in WO 96/15231 und WO 96/15232 beschrieben. Tannock et al. 1985, Vaccine, 3, 333–338 und Herrero-Uribe et al. 1983 J. Gen. Virol., 64, 471–475 beschreiben eine Vermehrung von Influenzaviren in Hühnerzellen bzw. in humanen diploiden MRC-5 Zellen. In diesen Verfahren werden bei der Vermehrung der Viren Temperaturen im Bereich von 33–37°C verwendet.Several methods of propagating influenza viruses in MDCK cells have been described in the art (see Merten et al., 1996, Adv. Exp. Med. Biol., 397, 141-51, Portari Mancini & Yano 1993, Rev. Bioquim., Univ S. Paulo, 29, 89-95; Kaverin et al., 1995, J. Virol., 69, 2700-2703; Boycott et al., 1994, Virology, 203, 313-319; Govorkova et al. Inf. Diseases, 172, 250-253; Tree et al 2001, Vaccine, Vol. 19, 3444-3450; and Nakamura et al., 1980, J. Jpn. Assn. Infect. Dis., 54, 306-312). , Similar procedures are also used in WO 96/15231 and WO 96/15232 described. Tannock et al. 1985, Vaccine, 3, 333-338 and Herrero-Uribe et al. 1983 J. Gen. Virol., 64, 471-475 describe an increase of influenza viruses in chicken cells or in human diploid MRC-5 cells. In these methods, temperatures in the range of 33-37 ° C are used in the propagation of viruses.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Verfügung zu stellen, die eine einfache und wirtschaftliche Influenzavirus-Vermehrung in Zellkultur ermöglichen und zu einem hochwirksamen Impfstoff führen.The present invention is therefore based on the object to provide methods that allow a simple and economical Influenzavirus propagation in cell culture and lead to a highly effective vaccine.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.This object is achieved by providing the embodiments described in the claims.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines Influenzaimpfstoffs, bei dem man

(a) durch Influenzaviren infizierbare MDCK-Zellen in Zellkultur kultiviert, wobei die MDCK-Zellen adhärent wachsen,
(b) die Zellen in einem serumfreien Medium mit Influenzaviren infiziert,
(c) die Zellen nach der Infektion im Bereich von 30–33°C zur Virusvermehrung kultiviert,
(d) die vermehrten Viren 2 bis 10 Tage nach der Infektion erntet und isoliert,
(e) die Influenzaviren zu einem Impfstoff formuliert.

The invention thus provides a process for the preparation of an influenza vaccine, in which

(a) cultivating influenza virus-infectable MDCK cells in cell culture, wherein the MDCK cells grow adherently,
(b) infecting cells in a serum-free medium with influenza viruses,
(c) the cells are cultured after infection in the range of 30-33 ° C for virus replication,
(d) harvesting and isolating the increased viruses 2 to 10 days after the infection,
(e) formulating the influenza viruses into a vaccine.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden die Zellen nach der Infektion mit den Influenzaviren bei einer Temperatur von 32–33°C zur Virusvermehrung kultiviert.In a preferred embodiment of the method, the cells are cultured after infection with the influenza viruses at a temperature of 32-33 ° C for virus replication.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird zu den kultivierten Zellen vor, während oder nach der Infektion mit Influenzaviren eine Protease, vorzugsweise eine Serinprotease, wie z. B. Trypsin, gegeben.In a further preferred embodiment, the cultured cells before, during or after infection with influenza viruses, a protease, preferably a serine protease, such. As trypsin given.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Ernten und Isolieren der Influenzaviren 2 bis 7 Tage nach der Infektion.In a further preferred embodiment, the harvesting and isolation of the influenza viruses takes place 2 to 7 days after the infection.

In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt der Impfstoff in Schritt (e) gegebenenfalls in Kombination mit Stoffen vor, die die Immunantwort verstärken.In yet another preferred embodiment, the vaccine in step (e) is optionally in combination with substances that enhance the immune response.

Die Influenzaviren können dabei als intakte Viruspartikel, als attenuierte Viren, oder als desintegrierte Viruspartikel vorliegen. Alternativ dazu kann der Impfstoff isolierte Proteine des Influenzavirus enthalten.The influenza viruses can be present as intact virus particles, as attenuated viruses, or as disintegrated virus particles. Alternatively, the vaccine may contain isolated influenza virus proteins.

Es wurde überraschend gefunden, daß durch die Vermehrung der Influenzaviren in infizierten Zellen bei erniedrigten Temperaturen Viren erhalten werden, die eine wesentlich höhere Wirksamkeit als Impfstoff aufweisen als solche Viren, die durch Vermehrung bei 37°C gewonnen werden. Die Vermehrung bei 37°C, der üblicherweise verwendeten Temperatur zur Influenzavermehrung in Zellkultur, führt zwar zu verhältnismäßig hohen Virusausbeuten in kurzer Zeit. Jedoch besitzen die so erzeugten Viren im Vergleich zu Viren, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, eine geringe Wirksamkeit als Impfstoff.It has surprisingly been found that viruses are obtained by the multiplication of the influenza viruses in infected cells at low temperatures, which have a much higher efficacy than vaccine than those viruses which are obtained by propagation at 37 ° C. The increase at 37 ° C, the commonly used temperature for Influenzavermehrung in cell culture, leads too proportionately high virus yields in a short time. However, the viruses thus produced have low efficacy as a vaccine compared to viruses produced by the method of the invention.

Bei den Zellen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Vermehrung der Influenzaviren verwendet werden, kann es sich prinzipiell um jede beliebige Art von adhärent wachsenden MDCK-Zellen handeln, die sich in Zellkultur kultivieren lassen und die durch Influenzaviren infizierbar sind.The cells which are used in the method according to the invention for the multiplication of influenza viruses can in principle be any type of adherently growing MDCK cells which can be cultured in cell culture and which are infectable by influenza viruses.

Für die Kultivierung der Zellen in dem erfindungsgemäßen Verfahren können die dem Fachmann bekannten üblichen Methoden zur Zellkultur verwendet werden, insbesondere solche, die bereits bekannt sind für die Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur.For the cultivation of the cells in the method according to the invention, the usual cell culture methods known to the person skilled in the art may be used, in particular those already known for the multiplication of influenza viruses in cell culture.

Die Kultivierung der Zellen erfolgt in der Regel bei einem geregelten pH-Wert der vorzugsweise im Bereich von pH 6,6 bis pH 7,8, insbesondere im Bereich von pH 6,8 bis pH 7,3 liegt.The cultivation of the cells is generally carried out at a controlled pH, which is preferably in the range of pH 6.6 to pH 7.8, in particular in the range of pH 6.8 to pH 7.3.

Ferner kann vorteilhafterweise der pO₂-Wert geregelt werden und liegt dann in der Regel zwischen 25% und 95%, insbesondere zwischen 35% und 60% (bezogen auf die Luftsättigung).Furthermore, advantageously, the pO ₂ value can be regulated and is then usually between 25% and 95%, in particular between 35% and 60% (based on the air saturation).

Werden adhärent wachsende Zellen verwendet, hängt die optimale Zelldichte für die Infektion von der jeweiligen Zellinie ab.If adherently growing cells are used, the optimal cell density for the infection depends on the particular cell line.

Die Infektion der Zellen mit Influenzaviren erfolgt vorzugsweise bei einer m. o. i. (multiplicity of infektion) von ca. 0,0001 bis 10, vorzugsweise von 0,002 bis 0,5.The infection of the cells with influenza viruses is preferably carried out at an m. o. i. (multiplicity of infection) of about 0.0001 to 10, preferably from 0.002 to 0.5.

Die Zugabe einer Protease, die die Spaltung des Vorläuferproteins des Hämagglutinins [HA₀] und somit die Adsorption der Viren an die Zellen bewirkt, kann erfindungsgemäß kurz vor, gleichzeitig mit oder kurz nach der Infektion der Zellen mit Influenzaviren erfolgen. Erfolgt die Zugabe gleichzeitig mit der Infektion, so kann die Protease entweder direkt zu der zu infizierenden Zellkultur zugegeben werden oder beispielsweise als Konzentrat gemeinsam mit dem Virus-Inokulat. Wird ein serumhaltiges Medium zur Kultivierung verwendet, sollte dieses vor der Proteasezugabe entfernt werden. Die Protease ist vorzugsweise eine Serinprotease, und besonders bevorzugt Trypsin.The addition of a protease which causes the cleavage of the precursor protein of the hemagglutinin [HA ₀ ] and thus the adsorption of the viruses to the cells, according to the invention can be carried out shortly before, simultaneously with or shortly after the infection of the cells with influenza viruses. If the addition occurs simultaneously with the infection, the protease can either be added directly to the cell culture to be infected or, for example, as a concentrate together with the virus inoculate. If a serum-containing medium is used for culture, it should be removed before adding the protease. The protease is preferably a serine protease, and more preferably trypsin.

Wird Trypsin verwendet, so beträgt die zugesetzte Endkonzentration im Kulturmedium vorteilhafterweise 1 bis 200 μg/ml, vorzugsweise 5 bis 50 μg/ml, und besonders bevorzugt 5 bis 30 μg/ml.If trypsin is used, the added final concentration in the culture medium is advantageously 1 to 200 μg / ml, preferably 5 to 50 μg / ml, and particularly preferably 5 to 30 μg / ml.

Nach der Infektion wird die infizierte Zellkultur zur Vermehrung der Viren weiter kultiviert, insbesondere bis ein maximaler cytophatischer Effekt bzw. eine maximale Virusantigenmenge nachgewiesen werden kann.After infection, the infected cell culture is further cultured to increase the virus, especially until a maximum cytopathic effect or a maximum virus antigen amount can be detected.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt das Ernten und Isolieren der vermehrten Influenzaviren 2 bis 10 Tage, vorzugsweise 2 bis 7 Tage, nach der Infektion. Hierzu werden beispielsweise die Zellen bzw. Zellreste mittels dem Fachmann bekannten Methoden vom Kulturmedium getrennt, z. B. durch Separatoren oder Filter. Nachfolgend erfolgt die Konzentrierung der im Kulturmedium vorhandenen Influenzaviren nach dem Fachmann bekannten Methoden, wie z. B. Gradientenzentrifugation, Filtration, Präzipitation u. ä.In a preferred embodiment of the method, the harvesting and isolation of the increased influenza viruses takes place 2 to 10 days, preferably 2 to 7 days, after the infection. For this purpose, for example, the cells or cell residues are separated from the culture medium by methods known to those skilled in the art, for. B. by separators or filters. Subsequently, the concentration of influenza viruses present in the culture medium by the skilled person known methods, such as. B. gradient centrifugation, filtration, precipitation u. ä.

Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhältlichen Influenzaviren können nach bekannten Methoden zu einem Impfstoff für die Anwendung am Menschen oder Tier formuliert werden. Wie bereits oben erläutert, haben derartige Influenzaviren eine höhere Wirksamkeit als Impfstoff als Influenzaviren, die durch Vermehrung bei 37°C in Zellkultur erhalten werden.The influenza viruses obtainable by the process according to the invention can be formulated by known methods into a vaccine for human or animal use. As already explained above, such influenza viruses have a higher efficacy than vaccine than influenza viruses obtained by propagation at 37 ° C. in cell culture.

Die Immunogenität bzw. Effektivität der gewonnenen Influenzaviren als Impfstoff kann nach dem Fachmann bekannten Methoden, z. B. durch den vermittelten Schutz im Belastungsversuch oder als Antikörpertiter virusneutralisierender Antikörper bestimmt werden.The immunogenicity or effectiveness of the influenza virus obtained as a vaccine can by methods known in the art, for. B. determined by the mediated protection in the load test or as antibody titers of virus-neutralizing antibodies.

Die erzeugte Virus- bzw. Antigenmenge kann beispielsweise durch die Bestimmung der Menge an Hämagglutinin nach dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen. Es ist beispielsweise bekannt, daß gespaltenes Hämagglutinin an Erythrozyten verschiedener Spezies, z. B. an Hühnererythrozyten, bindet. Dies ermöglicht eine einfache und schnelle Quantifizierung der produzierten Viren bzw.. des gebildeten Antigens durch entsprechende Nachweismethoden.The amount of virus or antigen produced can be carried out, for example, by determining the amount of hemagglutinin according to methods known to the person skilled in the art. It is known, for example, that split hemagglutinin can be administered to erythrocytes of various species, e.g. B. on chicken erythrocytes, binds. This allows a simple and rapid quantification of the viruses produced or of the antigen formed by appropriate detection methods.

Durch Vergleichsversuche im Tiermodell konnte nachgewiesen werden, daß erfindungsgemäße Influenzaviren einen wesentlich höheren Titer neutralisierender Antikörper hervorrufen als bei 37°C vermehrte Viren und dadurch einen wesentlich besseren Schutz gegenüber Influenzavirusinfektion vermittelten. Der Titer neutralisierender Antikörper war beispielsweise in Versuchen mit Mäusen als Tiermodell 2 Wochen nach Vaccination um mindestens den Faktor 4 höher als der Titer neutralisierender Antikörper nach Impfung mit Influenzaviren, die bei 37°C vermehrt worden waren. 4 Wochen nach der Impfung war der Titer neutralisierender Antikörper mindestens um den Faktor 17 höher z. T. bis zu 27 mal höher. Wurde eine Revaccination durchgeführt, konnte der Titer neutralisierender Antikörper sogar um einen Faktor von über 60 höher sein bei Verwendung erfindungsgemäßer Influenzaviren im Vergleich zu Influenzaviren, die bei 37°C vermehrt wurden. Dementsprechend kann die Überlebensrate von Tieren in einem Belastungsversuch mit einer Applikation von 1000 LD₅₀ (Letale Dosis 50%) von 1/10 auf mindestens 8/10, vorzugsweise auf 9/10 und besonders bevorzugt auf 10/10 (100%) gesteigert werden.By comparison experiments in animal models could be demonstrated that influenza viruses of the invention cause a significantly higher titers of neutralizing antibodies than at 37 ° C increased Viruses and thus a much better protection against Influenzavirusinfektion mediated. The titer of neutralizing antibodies, for example, in experiments with mice as an animal model 2 weeks after vaccination by at least a factor of 4 higher than the titre of neutralizing antibodies after vaccination with influenza viruses, which had been propagated at 37 ° C. 4 weeks after vaccination, the titre neutralizing antibody was at least 17 times higher z. T. up to 27 times higher. If a revaccination was performed, the titre of neutralizing antibodies could even be higher by a factor of more than 60 when using influenza viruses according to the invention in comparison with influenza viruses which were increased at 37 ° C. Accordingly, the survival rate of animals in an exercise trial with an application of 1000 LD ₅₀ (lethal dose 50%) can be increased from 1/10 to at least 8/10, preferably to 9/10 and particularly preferably to 10/10 (100%) ,

Offenbart werden ferner Vakzinen, die die aus dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Influenzaviren enthalten. Derartige Vakzinen können gegebenenfalls die für Impfstoffe üblichen Zusatzstoffe enthalten, insbesondere Stoffe, die die Immunantwort verstärken, d. h. sogenannte Adjuvantien, z. B. Hydroxide verschiedener Metalle, Bestandteile von Bakterienzellwänden, Öle oder Saponine, und darüber hinaus gängige pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe.Also disclosed are vaccines containing the influenza viruses obtainable from the process of the invention. Such vaccines may optionally contain the usual additives for vaccines, especially substances that enhance the immune response, d. H. so-called adjuvants, z. As hydroxides of various metals, components of bacterial cell walls, oils or saponins, and moreover common pharmaceutically acceptable carriers.

Die Viren können in den Vakzinen als intakte Viruspartikel, insbesondere als lebend attenuierte Viren vorliegen. Hierzu werden Viruskonzentrate auf den gewünschten Titer eingestellt und entweder lyophilisiert oder in flüssiger Form stabilisiert.The viruses can be present in the vaccines as intact virus particles, in particular as live attenuated viruses. For this purpose, virus concentrates are adjusted to the desired titre and either lyophilized or stabilized in liquid form.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Vakzinen desintegrierte, d. h. inaktivierte, oder intakte, jedoch inaktivierte Viren enthalten. Hierzu wird die Infektiosität der Viren mittels chemischer und/oder physikalischer Methoden (z. B. durch Detergentien oder Formaldehyd) zerstört. Der Impfstoff wird anschließend auf die gewünschte Antigenmenge eingestellt und nach eventueller Zumischung von Adjuvantien oder nach eventueller Impfstoffformulierung, z. B. als Liposome, Microspheres oder ”slow release”-Formulierungen, abgefüllt.In a further preferred embodiment, the vaccines according to the invention can be disintegrated, ie. H. contain inactivated, or intact but inactivated viruses. For this purpose, the infectivity of the viruses is destroyed by means of chemical and / or physical methods (eg by detergents or formaldehyde). The vaccine is then adjusted to the desired amount of antigen and after any admixture of adjuvants or after any vaccine formulation, eg. B. as liposomes, microspheres or "slow release" formulations filled.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann schließlich die erfindungsgemäße Vakzine als Subunit-Impfstoff vorliegen, d. h. sie kann definierte, isolierte Virusbestandteile, vorzugsweise isolierte Proteine des Influenzavirus enthalten. Diese Bestandteile können nach dem Fachmann bekannten Methoden aus den Influenzaviren isoliert werden.In a further preferred embodiment, the vaccine according to the invention may finally be present as a subunit vaccine, i. H. it may contain defined, isolated virus components, preferably isolated proteins of the influenza virus. These components can be isolated from the influenza viruses by methods known to those skilled in the art.

Der Unterschied, daß die Influenzaviren, die bei niedrigeren Temperaturen hergestellt wurden, eine höhere Antigenität besitzen, als Viren, die nach herkömmlichen Methoden bei höheren Temperaturen hergestellt wurden, kann für diagnostische Zwecke verwendet werden.The difference that the influenza viruses produced at lower temperatures have higher antigenicity than viruses produced by conventional methods at higher temperatures can be used for diagnostic purposes.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Es ist zu beachten, dass die Beispiele 2–5 keine Ausführungsformen der Erfindung darsteller sondern lediglich zum leichteren Verständnis der Erfindung dienen.The examples illustrate the invention. It should be noted that Examples 2-5 are not embodiments of the invention but are merely for ease of understanding of the invention.

Beispiel 1example 1

Vermehrung von Influenzaviren in MDCK-Zellen bei 33°CPropagation of influenza viruses in MDCK cells at 33 ° C

MDCK-Zellen (ATCC CCL 34) wurden in Zellkulturflaschen vermehrt (Eagle's MEM [EMEM] mit 2% FKS, Inkubation bei 37°C für 4 Tage). Der entstandene dichte Zellrasen wurde mit Trypsin-Lösung von der Gefäßwand abgelöst, die Zellen vereinzelt und das Zellkonzentrat in serumhaltigem Medium resuspendiert. Die Zellen wurden mit einer Zelldichte von 5 × 10⁵ Zellen/ml in Rollflaschen (200 ml/Flasche) ausgesät und bei 4 Upm bei 37°C inkubiert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit Influenzaviren infiziert. Dazu wurde das Medium über dem dichten Zellrasen entfernt und durch serumfreies EMEM ersetzt. Influenzavirus A/PR/8/34 wurde mit einer m. o. i. (multiplicity of infection) von 0,1 und Trypsin in einer Endkonzentration von 25 μg/ml zum Medium zugegeben. Je zwei Rollflaschen wurden bei 37°C bzw. bei 33°C inkubiert. Die Virusvermehrung als Antigenmenge (gemessen als Hämagglutin-Einheiten) und als Infektiosität (gemessen im CCID₅₀-Test wurde bestimmt und ist in Tabelle I wiedergegeben. Tabelle I Vermehrung von Influenza A/PR/8/34 in Rollflaschen (MDCK-Zellinie) nach Inkubation bei 37°C und 33°C, gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten und Infektiosität (CCID₅₀) HA-Gehalt CCID₅₀/ml [log₁₀] 2 dpi 3 dpi 4 dpi 4 dpi 37°C 1:128 1:512 1:1024 6,4 33°C 1:64 1:256 1:1024 5,7 dpi = Tage nach InfektionMDCK cells (ATCC CCL 34) were propagated in cell culture flasks (Eagle's MEM [EMEM] with 2% FCS, incubation at 37 ° C for 4 days). The resulting dense cell lawn was removed from the vessel wall with trypsin solution, the cells were separated and the cell concentrate was resuspended in serum-containing medium. The cells were seeded at a cell density of 5 x 10 ⁵ cells / ml in roller bottles (200 ml / bottle) and incubated at 4 rpm at 37 ° C. After two days, the cells were infected with influenza viruses. For this, the medium above the dense cell lawn was removed and replaced with serum-free EMEM. Influenza virus A / PR / 8/34 was added to the medium with a multiplicity of infection of 0.1 and trypsin at a final concentration of 25 μg / ml. Two roller bottles each were incubated at 37 ° C. or at 33 ° C. The virus replication as antigen level (measured as hemagglutin units) and as infectivity (measured in the CCID ₅₀ test was determined and is shown in Table I. Table I Increase of influenza A / PR / 8/34 in roller bottles (MDCK cell line) after incubation at 37 ° C and 33 ° C, measured as antigen content (HA units and infectivity (CCID ₅₀ ) HA content CCID ₅₀ / ml [log ₁₀ ] 2 dpi 3 dpi 4 dpi 4 dpi 37 ° C 1: 128 1: 512 1: 1024 6.4 33 ° C 1:64 1: 256 1: 1024 5.7 dpi = days after infection

Die angegebenen Verhältnisse bedeuten, daß eine 1:X-Verdünnung der Virusernte noch hämagglutinierende Eigenschaften besitzt. Die hämmagglutinierenden Eigenschaften können bespielsweise bestimmt werden wie in Mayer et al., Virologische Arbeitsmethoden, Band I (1974), Seite 260 bis 261 oder in Grist, Diagnostic Methods in Clinical Virology, Seite 72 bis 75 beschrieben, durchgeführt werden.The indicated ratios mean that a 1: X dilution of the virus harvest still has haemagglutinating properties. The hemagglutinating properties can be determined by way of example as described in Mayer et al., Virologische Arbeitsmethoden, Vol. I (1974), pages 260 to 261 or in Grist, Diagnostic Methods in Clinical Virology, pages 72 to 75.

Die Bestimmung des CCID₅₀-Wertes kann z. B. nach der Methode erfolgen, die in Paul, Zell- und Gewebekultur (1980), S. 395 beschrieben ist.The determination of the CCID ₅₀ value can, for. Example, by the method described in Paul, cell and tissue culture (1980), p 395.

Beispiel 2Example 2

Herstellung einer Zellinie, die an das Wachstum in Suspension angepaßt und durch Influenzaviren infizierbar istPreparation of a cell line adapted to growth in suspension and infectable by influenza viruses

Eine Zellinie, die an das Wachstum in Suspensionskultur angepaßt ist und durch Influenzaviren infizierbar ist wurde ausgehend von MDCK-Zellen (ATCC CCL34 MDCK (NBL-2)), die nur wenige Passagen oder über mehrere Monate im Labor vermehrt worden waren, selektioniert. Diese Selektion erfolgte durch Vermehrung der Zellen in Rollflaschen, die sich mit 16 Upm (anstatt ca. 3 Upm wie für Rollflaschen mit adhärent wachsenden Zellen üblich) drehten. Nach mehreren Passagen der im Medium suspendiert vorliegenden Zellen wurden in Suspension wachsende Zellstämme gewonnen. Diese Zellstämme wurden mit Influenzaviren infiziert und die Stämme ausgewählt, die die höchste Virusausbeute erbrachten. Eine Erhöhung der Rate an in Suspension wachsenden Zellen wähnend der ersten Passagen bei 16 Upm wird durch die Zugabe von dem Fachmann bekannten Selektionssystemen wie Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin, oder Alanosin und Adenin, einzeln oder in Kombination, über 1 bis 3 Passagen erreicht. Die Selektion von in Suspension wachsenden Zellen ist auch in anderen bewegten, dem Fachmann bekannten, Zellkultursystemen wie Rührflaschen möglich. Ein Beispiel für Zellen, die an das Wachstum in Suspension angepaßt sind und durch Influenzaviren infizierbar sind, ist die Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219).A cell line adapted to growth in suspension culture and infectable by influenza viruses was selected from MDCK cells (ATCC CCL34 MDCK (NBL-2)) that had been propagated in the laboratory only a few passages or several months. This selection was carried out by proliferation of the cells in roller bottles, which rotated at 16 rpm (instead of about 3 rpm as usual for roller bottles with adherently growing cells). After several passages of cells suspended in the medium, growing cell strains were obtained in suspension. These cell strains were infected with influenza viruses and selected the strains that yielded the highest virus yield. An increase in the rate of cells growing in suspension during the first passages at 16 rpm is achieved by the addition of selection systems known to those skilled in the art, such as hypoxanthine, aminopterin and thymidine, or alanosine and adenine, alone or in combination, over 1 to 3 passages. The selection of cells growing in suspension is also possible in other agitated cell culture systems known to those skilled in the art, such as stirring bottles. An example of cells adapted to growth in suspension and infectable by influenza viruses is the cell line MDCK 33016 (DSM ACC2219).

Beispiel 3Example 3

Vermehrung von Influenzaviren in MDCK 33016-Zeller bei 33°CPropagation of influenza viruses in MDCK 33016 cell at 33 ° C

Die in Suspension wachsende Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) wurde in Isove's Medium mit einer Splittingrate von 1:8 bis 1:12 zwei mal wöchentlich in einer Rollflasche, die sich mit 16 Upm drehte, bei 37°C vermehrt. 4 Tage nach Umsetzen war eine Zellzahl von etwa 7,0 × 10⁵ Zellen/ml erreicht. Gleichzeitig mit der Infektion der nun 4 Tage alten Zellkultur mit dem Influenzastamm A/PR/8/34 (m. o. i. = 0,1) wurde die Zellkultur mit Trypsin (25 μg/ml Endkonzentration) versetzt, bei 37°C bzw. 33°C weiter inkubiert und die Virusvermehrung über 3 Tage bestimmt (Tab. II.) Tabelle II Vermehrung von Influenza A/PR/8/34, gemessen als Antigengehalt (RA-Einheiten) in Rollflaschen (MDCK-Zellinie MDCK 33016) nach Infektion einer Zellkultur ohne Mediumwechsel bei einer Inkubationstemperatur von 37°C bzw. 33°C HA-Gehalt nach Tagen nach Infektion (dpi) 1 dpi 2 dpi 3 dpi 37°C 1:64 1:512 1:1024 33°C 1:16 1:128 1:1024 The suspension growing cell line MDCK 33016 (DSM ACC2219) was propagated in Isove's medium at a splitting rate of 1: 8 to 1:12 twice a week in a roller bottle rotating at 16 rpm at 37 ° C. Four days after transplantation, a cell number of about 7.0 × 10 ⁵ cells / ml was achieved. Simultaneously with the infection of the now 4-day-old cell culture with the influenza strain A / PR / 8/34 (moi = 0.1), trypsin (25 μg / ml final concentration) was added to the cell culture, at 37 ° C and 33 ° C, respectively incubated and virus multiplication determined over 3 days (Table II.). Table II Increase of influenza A / PR / 8/34, measured as antigen content (RA units) in roller bottles (MDCK cell line MDCK 33016) after infection of a cell culture without medium change at an incubation temperature of 37 ° C or 33 ° C HA content after days after infection (dpi) 1 dpi 2 dpi 3 dpi 37 ° C 1:64 1: 512 1: 1024 33 ° C 1:16 1: 128 1: 1024

Beispiel 4Example 4

Vermehrung verschiedener Influenzastämme in MDCK 33016-Zellen (DSM ACC 2219) bei 33°CPropagation of various influenza strains in MDCK 33016 cells (DSM ACC 2219) at 33 ° C

Die Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC 2219) wurde in Iscove's Medium mit einer Splittingrate von 1:8 bis 1:12 zwei mal wöchentlich in einer Rollflasche, die sich mit 16 Upm drehte, bei 37°C vermehrt. 4 Tage nach Umsetzen war eine Zellzahl von etwa 7,0 × 10⁵ bis 10 × 10⁵ Zellen/ml erreicht. Gleichzeitig mit der Infektion der nun 4 Tage alten Zellkultur mit verschiedenen Influenzastämmen (m. o. i ≈ 0,1) wurde die Zellkultur mit Trypsin (25 μg/ml Endkonzentration) versetzt, bei 33°C weiter inkubiert und die Virusvermehrung am 5. Tage nach der Infektion bestimmt (Tab. III). Tabelle III Vermehrung von Influenzastämmen, gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten) in Rollflaschen (MDCK-Zellinie MDCK 33016) nach Infektion einer Zellkultur ohne Mediumwechsel HA-Gehalt 5-Tage nach Infektion Influenzastamm HA-Gehalt A/Singapore 1:1024 A/Sichuan 1:256 A/Shanghai 1:256 A/Guizhou 1:128 A/Beijing 1:512 B/Beijing 1:256 B/Yamagata 1:512 A/PR/8/34 1:1024 A/Equi 1/Prag 1:512 A/Equi 2/Miami 1:256 A/Equi 2/Fontembleau 1:128 A/Swine/Gent 1:512 A/Swine/Iowa 1:1024 A/Swine/Arnsberg 1:512 The cell line MDCK 33016 (DSM ACC 2219) was propagated in Iscove's medium at a splitting rate of 1: 8 to 1:12 twice a week in a roller bottle rotating at 16 rpm at 37 ° C. Four days after transplantation, a cell count of about 7.0 × 10 ⁵ to 10 × 10 ⁵ cells / ml was achieved. Simultaneously with the infection of the now 4 days old cell culture with different influenza strains (mo i ≈ 0.1), the cell culture was treated with trypsin (25 μg / ml final concentration), incubated further at 33 ° C. and the virus multiplication on the 5th day after the Infection determined (Table III). Table III Increase of influenza strains, measured as antigen content (HA units) in roller bottles (MDCK cell line MDCK 33016) after infection of a cell culture without medium change HA content 5 days after infection influenza strain HA content A / Singapore 1: 1024 A / Sichuan 1: 256 A / Shanghai 1: 256 A / Guizhou 1: 128 A / Beijing 1: 512 B / Beijing 1: 256 B / Yamagata 1: 512 A / PR / 8/34 1: 1024 A / Equi 1 / Prague 1: 512 A / Equi 2 / Miami 1: 256 A / Equi 2 / Fontembleau 1: 128 A / Swine / Gent 1: 512 A / Swine / Iowa 1: 1024 A / Swine / Arnsberg 1: 512

Beispiel 5Example 5

Herstellung eines experimentellen Influenza-ImpfstoffesProduction of an experimental influenza vaccine

Humanpathogene Influenzaviren führen nach einer Inokulation in Mäuse üblicherweise nicht zu deren Infektion mit pathologischen Prozessen, so daß Schutzversuche mit Mäusen experimentell sehr schwierig darstellbar sind. Der Influenzavirusstamm A/PR/8/34 ist jedoch mäuseadaptiert und verursacht nach intranasaler Applikation eine disosabhängige Mortalität bei Mäusen.Human pathogenic influenza viruses usually do not lead to their infection with pathological processes after inoculation into mice, so that experimental experiments with mice are experimentally very difficult to represent. The influenza virus strain A / PR / 8/34, however, is mouse-adapted and causes a disos-dependent mortality in mice after intranasal administration.

Aus Influenzavirus A/PR/8/34 aus Beispiel 3 (A/PR/8 bei 37°C bzw. 33°C vermehrt) wurde ein experimenteller Impfstoff hergestellt. Die Influenzaviren in Zellkulturmedium wurden von Zellen und Zellbruchstücken durch niedertourige Zentrifugation (2,000 g, 20 min, 4°C) getrennt und durch eine Saccharosegradientenzentrifugation gereinigt (10 bis 50% (Gew./Gew.) linearer Saccharosegradient, 30,000 g, 2 h, 4°C) Die Influenzavirus-haltige Bande wurde gewonnen, mit PBS pH 7,2 1:10 verdünnt, bei 20,000 Upm sedimentiert und der Niederschlag in PBS aufgenommen (Volumen: 50% des ursprünglichen Zellkulturmediums). Die Influenzaviren wurden mit Formaldehyd inaktiviert (zweimalige Zugabe von 0,025% einer 35%igen Formaldehydlösung im Abstand von 24 h, Inkubation bei 20°C unter Rühren).From influenza virus A / PR / 8/34 from Example 3 (A / PR / 8 at 37 ° C and 33 ° C, respectively) an experimental vaccine was prepared. The influenza viruses in cell culture medium were from cells and cell debris separated by low-speed centrifugation (2,000 g, 20 min, 4 ° C) and purified by sucrose gradient centrifugation (10 to 50% (w / w) linear sucrose gradient, 30,000 g, 2 h, 4 ° C) The influenza virus-containing band was recovered, diluted 1:10 with PBS pH 7.2, pelleted at 20,000 rpm, and the precipitate taken up in PBS (volume: 50% of the original cell culture medium). The influenza viruses were inactivated with formaldehyde (0.025% addition of a 35% formaldehyde solution at intervals of 24 h, incubation at 20 ° C. with stirring).

Je 10 NMRI-Mäuse, 18 bis 20 g schwer, wurden mit je 0,3 ml dieser inaktivierten Versuchsimpfstoffe am Tag 0 und Tag 28 durch subcutane Injektion geimpft. 2 und 4 Wochen nach der Impfung sowie 1 und 2 Wochen nach der Revaccination wurde den Tieren Blut zur Bestimmung des Titers neutralisierender Antikörper gegen A/PR/8/34 entnommen. Zur Bestimmung der Schutzrate wurden die Mäuse 2 Wochen nach Revaccination (6 Wochen nach Versuchsbeginn) durch intranasale Applikation von 1000 LD₅₀ (Letale Dosis 50%) belastet. Die Ergebnisse des Versuches sind in Tabelle IV zusammengefaßt: Tabelle IV Wirksamkeit von Versuchsvaccinen: für Vaccine A wurde das Influenzavirus A/PR/8/34 bei 37°C und für Vaccine B bei 33°C vermehrt. Untersucht wurden die Titer neutralisierender Antikörper gegen A/PR/8 sowie die Schutzrate nach Belastung der Mäuse Titer neutralisierender Antikörper/ml* Schutzrate Anzahl lebend/gesamt 2 w pvacc 4 w pvacc 1 w prevacc 2 w prevacc 37°C <28 56 676 1620 1/10 33°C 112 1549 44670 112200 9/10 * Wochen nach Vaccination (w pvacc) bzw. Wochen nach Revaccination (w prevacc)10 NMRI mice weighing 18 to 20 g each were inoculated with 0.3 ml each of these inactivated experimental vaccines on day 0 and day 28 by subcutaneous injection. At 2 and 4 weeks post vaccination and at 1 and 2 weeks post-revaccination, animals were bled to determine the titer of neutralizing antibodies to A / PR / 8/34. To determine the protection rate, the mice were challenged 2 weeks after revaccination (6 weeks after the start of the test) by intranasal administration of 1000 LD ₅₀ (lethal dose 50%). The results of the experiment are summarized in Table IV: For vaccine A, the influenza virus A / PR / 8/34 was propagated at 37 ° C and for vaccine B at 33 ° C. The titers of neutralizing antibodies against A / PR / 8 and the protection rate after loading of the mice were investigated Titre of neutralizing antibody / ml * Protection rate number alive / total 2 w pvacc 4 w pvacc 1 w prevacc 2 w prevacc 37 ° C <28 56 676 1620 1.10 33 ° C 112 1549 44670 112200 9.10 * Weeks after vaccination (w pvacc) or weeks after revaccination (w prevacc)

Die Versuche belegen, daß Influenzaviren, die bei 37°C in Zellkultur mit hoher Antigenausbeute (HA-Titer) vermehrt worden waren, in der Maus nur geringe neutralisierende Antikörper-Titer induzierten und kaum Schutz vermittelten, während Influenzaviren, die bei 33°C in Zellkultur mit ebenfalls hoher Antigenausbeute (HA-Titer) vermehrt worden waren, in der Maus sehr hohe neutralisierende Antikörper-Titer induzierten und zu sehr gutem Schutz führten.The experiments show that influenza viruses, which were propagated at 37 ° C in cell culture with high antigenic yield (HA titers), induced in the mouse only low neutralizing antibody titers and hardly mediated protection, while influenza viruses, which at 33 ° C in Cell culture were also increased with high antigen yield (HA titers) were induced in the mouse very high neutralizing antibody titers and led to very good protection.

Beispiel 6Example 6

Vermehrung von Influenzaviren in MDCK-Zellen bei 33°C und Wirksamkeit des gewonnenen ImpfstoffesPropagation of influenza viruses in MDCK cells at 33 ° C and efficacy of the vaccine obtained

Die Zellinie MDCK (ATCC CL34) wurde in Eagle's MEM (EMEM) mit 2% FKS mit einer Splittingrate von 1:8 bis 1:12 zwei mal wöchentlich in einer Zellkulturflasche bei 37°C vermehrt. 4 Tage nach Umsetzen war ein dichter Zellrasen entstanden. Nach Wechsel des Mediums auf serumfreies EMEM wurde die Zellkultur mit Influenza 2/Beijing (m. o. i. = 0,1) infiziert, Trypsin in einer Endkonzentration von 25 μg/ml zum Medium zugegeben und die infizierten Zellkulturflaschen entweder bei 37°C oder bei 33°C inkubiert. 4 Tage nach der Infektion war der HA-Gehalt in beiden Versuchsansätzen 256 HA-Einheiten. Nach niedertouriger Zentrifugation zur Entfernung von Zellen/Zellresten wurden die Viren im Überstand mit Formaldehyd inaktiviert (zweimalige Zugabe von 0,025% einer 35%igen Formaldehydlösung im Abstand von 24 h, Inkubation bei 20°C unter Rühren). Als Adjuvans wurde bei jedem Versuchsglied Aluminiumhydroxid (10% Endkonzentration einer 2%igen Al(OH)₃-Lösung) zugegeben. Mit diesen Versuchsimpfstoffen wurden pro Versuchsglied jeweils 3 Meerschweinchen (400 bis 500 g) mit 0,2 ml intraplantar vacciniert und 4 Wochen danach mit demselben Impfstoff revacciniert. Zur Untersuchung der Wirksamkeit des Impfstoffes wurden 2, 4 und 6 Wochen nach der Impfung Blutproben entnommen und im Hämagglutinationshemmtest und Serumneutralisationstest geprüft (vgl. Tabelle V). Tabelle V Wirksamkeit von Versuchsimpfstoffen aus Influenza B/Beijing nach Vermehrung des Virus bei 37°C und 33°C in Zellkultur: Untersucht wurden die serologischen Parameter Hämagglutinationshemmung und neutralisierende Antikörper (Durchschnittswerte von 3 Meerschweinchen Hämagglutinationshemmung Titer Neutralisierende Antikörper Titer 2 w pvacc* 4 w pvacc 6 w pvacc 2 w pvacc 4 w pvacc 6 w pvacc 37°C 85 341 1024 851 1290 6760 33°C 85 341 853 3890 22400 117490 * w pvacc = Wochen nach Impfung (6 w pvacc = 2 Wochen nach RevaccinationThe cell line MDCK (ATCC CL34) was propagated in Eagle's MEM (EMEM) with 2% FCS at a splitting rate of 1: 8 to 1:12 twice a week in a cell culture flask at 37 ° C. 4 days after transplanting, a dense cell lawn was formed. After changing the medium to serum-free EMEM, the cell culture was infected with Influenza 2 / Beijing (moi = 0.1), trypsin added to the medium at a final concentration of 25 μg / ml and the infected cell culture flasks either at 37 ° C or at 33 ° C incubated. Four days after infection, the HA content in both experimental approaches was 256 HA units. After low-speed centrifugation to remove cells / cell residues, the viruses were inactivated in the supernatant with formaldehyde (twice 0.025% of a 35% formaldehyde solution at intervals of 24 h, incubation at 20 ° C with stirring). As adjuvant, aluminum hydroxide (10% final concentration of a 2% Al (OH) ₃ solution) was added to each test subject. With these experimental vaccines, 3 guinea pigs (400 to 500 g) were intraplantar vaccinated with 0.2 ml per test subject and revaccinated 4 weeks later with the same vaccine. To test the efficacy of the vaccine, blood samples were taken 2, 4 and 6 weeks after vaccination and tested in the hemagglutination inhibition test and serum neutralization test (see Table V). Table V Efficacy of test vaccines from influenza B / Beijing after propagation of the virus at 37 ° C and 33 ° C in cell culture: The serological parameters haemagglutination inhibition and neutralizing antibodies (mean values of 3 guinea pigs Hemagglutination inhibition titer Neutralizing antibody titer 2 w pvacc * 4 w pvacc 6 w pvacc 2 w pvacc 4 w pvacc 6 w pvacc 37 ° C 85 341 1024 851 1290 6760 33 ° C 85 341 853 3890 22400 117490 * w pvacc = weeks after vaccination (6 w pvacc = 2 weeks after revaccination

Claims

Process for the preparation of an influenza vaccine, in which (a) cultivating influenza virus-infectable MDCK cells in cell culture, wherein the MDCK cells grow adherently, (b) infecting cells in a serum-free medium with influenza viruses, (c) the cells are cultured after infection in the range of 30-33 ° C for virus replication, (d) harvesting and isolating the increased viruses 2 to 10 days after the infection, (e) formulating the influenza viruses into a vaccine.

The method of claim 1, wherein the cells are cultured after infection with influenza viruses at a temperature of 32-33 ° C for virus replication.

A method according to any one of claims 1 to 2, wherein a protease is added to the cultured cells before, during or after the infection with influenza viruses.

The method of claim 3, wherein the protease is a serine protease.

The method of claim 4, wherein the serine protease is trypsin.

A method according to any one of claims 1-5, wherein the harvesting and isolation of the influenza viruses occurs 2 to 7 days after infection.

A method according to any one of claims 1-6, wherein the vaccine in step (e) is optionally in combination with substances which enhance the immune response.

The method of claim 7, wherein the influenza viruses are present as intact virus particles.

The method of claim 7, wherein the influenza viruses are present as attenuated viruses.

The method of claim 7, wherein the influenza viruses are present as disintegrated virus particles.

The method of claim 10, wherein the vaccine contains isolated influenza virus proteins.